WO2024071987A1 - 미세 유체 혼합용 구조체 및 이를 구비한 미세 유체 혼합 장치 - Google Patents

미세 유체 혼합용 구조체 및 이를 구비한 미세 유체 혼합 장치 Download PDF

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WO2024071987A1
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강병권
나기수
김동표
김경진
양주성
최강현
김욱일
이주영
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포항공과대학교 산학협력단
에스티팜 주식회사
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    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
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    • B01F33/30—Micromixers
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to a structure for microfluidic mixing and a microfluidic mixing device equipped with the same.
  • Nanotechnology has attracted great attention in the field of drug delivery due to its advantages such as specific cell targeting, enhanced permeation and retention (EPR) effect, and reduced cytotoxicity, and has overcome the limitations of conventional delivery methods by overcoming biological barriers in organs.
  • EPR enhanced permeation and retention
  • cytotoxicity and has overcome the limitations of conventional delivery methods by overcoming biological barriers in organs.
  • precise control of size is important depending on the specific disease and target organ for effective treatment, which is relevant to good manufacturing practice (GMP) and clinical trials.
  • GMP manufacturing practice
  • microfluidic technology has emerged as an essential approach to enable high mass transfer and precise system control.
  • the present invention is to solve the above problems, and the purpose of the present invention is to provide a structure for microfluidic double vortex mixing that integrates micro Dean vortices to generate two symmetrical counter-rotating enhanced vortices.
  • Another object of the present invention is to provide a structure for dual vortex mixing that can continuously produce polymer and lipid-based nanoparticles while enabling ultra-fast mixing within the mixer by forming two symmetrical vortices of very high intensity through a 3D hemispherical baffle. (DVM) is provided.
  • DVM 3D hemispherical baffle.
  • Another object of the present invention is to provide a microfluidic mixing structure with a 3D baffle structure capable of ultra-high-speed mixing using a 3D printer, and to provide an integrated structure for mass production of nanoparticles by connecting the microfluidic mixing structure and a flow distributor. /To provide an assembled microfluidic mixing device.
  • a microfluidic mixing structure for mixing a first fluid and a second fluid while moving them in a first direction, comprising an inlet through which the first fluid and the second fluid flow, and the first fluid.
  • a first mixing unit including a first body having a first space in which the fluid and the second fluid are mixed, and a first mixing unit disposed on the rear side of the first mixing unit when viewed in the first direction and mixing in the first mixing unit.
  • a second mixing unit including a second body having a second space through which the mixed fluid flows, wherein the first space of the first mixing unit and the second space of the second mixing unit are moved in the first direction.
  • the first mixing section and the second mixing portion includes a curved surface that is symmetrical with respect to the center of the width direction when viewed in the first direction.
  • the first space of the first mixing section and the second space of the second mixing section may include either an oval or a semicircular cross section when viewed in the first direction.
  • the first space of the first mixing section and the second space of the second mixing section may be formed in a hemispherical shape.
  • the second mixing unit may be located above the first mixing unit in a vertical direction, and the inlet of the first mixing unit may be arranged to face upward.
  • the first space of the first mixing section and the second space of the second mixing section may have the same inlet and outlet areas.
  • the cross-sectional areas of the central portions of the first space of the first mixing section and the second space of the second mixing section are larger than the areas of the inlet and outlet of the first space and the second space, respectively. It can be formed to be large.
  • the first space of the first mixing part and the second space of the second mixing part are such that the inlet and the outlet of each space are a pair of circular arcs of the same diameter facing each other and facing each other. It may be formed in a closed curve shape.
  • a third mixing part including a third body disposed on the rear side of the third mixing part and having a third space through which the mixed fluid passing through the second mixing part flows. can do.
  • the third mixing part may have the same shape as at least one of the first mixing part and the second mixing part.
  • the third space of the third mixing part may be disposed on the opposite side of the second space of the second mixing part based on an imaginary line extending in the first direction.
  • a first fluid inlet pipe through which the first fluid passes so that the first fluid flows into the inlet of the first mixing section, and a second fluid so that the second fluid flows into the inlet of the first mixing section. It includes a second fluid inlet pipe passing through, wherein the first fluid inlet pipe and the second fluid inlet pipe are arranged to be perpendicular to each other, and one of the first fluid inlet pipe and the second fluid inlet pipe extends in the first direction. It can be arranged to extend to.
  • the third space of the third mixing unit may have an outlet oriented upward, and a mixed fluid discharge pipe extending in the first direction may be connected to the outlet of the third space.
  • the first body, the second body, and the third body may be formed as a module integrated into one body.
  • a mixing unit is provided, and the one body has a first fluid supply passage connected to a first fluid supply pipe for supplying the first fluid into the one body and a first fluid supply passage for supplying the second fluid into the one body.
  • a second fluid supply passage is provided to which a second fluid supply pipe is connected, and the first fluid supply passage and the second fluid supply passage supply the first fluid and the second fluid to the plurality of first mixing units. It may be formed to branch into plural ways.
  • the module integrated into one body includes 1, 2, 4, or 8 pairs of mixing passages therein, and each of the plurality of pairs of mixing passages includes two first mixing portions and two first mixing passages.
  • the second mixing section and the two third mixing sections may be formed as a pair.
  • one or more of the above-described microfluidic mixing structures a first fluid supplier for supplying the first fluid to each of the one or more microfluidic mixing structures;
  • a microfluidic mixing device is provided, including a second fluid supplier for supplying the second fluid to each of the one or more microfluidic mixing structures.
  • it may further include a flow distributor for distributing the first fluid and the second fluid supplied from the first fluid supplier and the second fluid supplier to the one or more microfluidic mixing structures.
  • the 3D hemispherical baffle microfluidic mixing structure according to the present invention already shows a rapid mixing efficiency of more than 99% when passing through the three hemispherical baffle structures under a wide range of flow rate conditions, and produces uniform nanoparticles (Size: ⁇ 100 nm, PDI: ⁇ 0.1) can be manufactured.
  • a microfluidic mixing device for mass production is designed by mounting an equal flow distribution device on an optimized mixing structure and integrating 4, 8, and 16 baffle mixers using a 3D printing technique. It can be manufactured through two methods, an integrated type and an assembled type using an external flow distributor, so the assembled/integrated mass-produced microfluidic mixing device equipped with a flow distributor and 16 mixing structures manufactured in this way is low-cost and easy to use. -It provides on-demand structural deformability, simplicity of fabrication, and reproducibility, and can narrow the gap between academic research and industrial application by solving clinical and industrial productivity needs.
  • the structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention exhibits fast mixing characteristics even at a relatively low flow rate of several mL/min, and has a PDI value below 0.1 and very uniform lipids in the size (50 to 100 nm) range.
  • liposomes and polymer nanoparticles can be produced.
  • lipid nanoparticles loaded with SARS-CoV-2 spike mRNA were investigated and protein expression was verified in vitro and in vivo using firefly luciferase (FLuc) mRNA, respectively, showing equivalent performance to a commercial toroidal mixer system. there is.
  • the strong in-situ dispersion of nanoparticles utilizing the power of three-dimensional expansion flow minimizes the occurrence of physical sticking or agglomeration, maintains consistent production performance without internal clogging during half-day work, and facilitates quality control of drugs. do.
  • microfluidic mixer The development of a user-friendly microfluidic mixer is necessary to enable efficient mixing even under low flow conditions while maintaining long-term operation.
  • the inventor of the present invention adopted a three-dimensional channel structure according to an embodiment of the present invention that generates a very robust vortex to promote ultra-fast mixing and achieve effective dispersion of nanoparticles.
  • the structure and mixing device for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention demonstrate the ability to generate highly uniform nanoparticles with a controllable size as confirmed in in vitro and in vivo studies.
  • the ability to prevent clogging during continuous operation combined with laboratory-scale optimization and the potential for parallel industrial production, allows the structure and mixing device for microfluidic mixing according to one embodiment of the present invention to be used for nanoparticle-based therapeutics, diagnostics, and targeted drugs. It can be positioned as a versatile and scalable tool that will have a significant impact on the evolution of delivery.
  • the structure and mixing device for microfluidic mixing according to an optimized embodiment of the present invention designed through computational fluid dynamics (CFD) simulation are commercial toroids manufactured by injection molding in terms of particle characteristics and protein expression in vitro and in vivo. It shows performance equivalent to that of a mixer. In addition, it minimizes dead volume and disperses the manufactured nanoparticles using a strong vortex effect, preventing clogging more than 60 times compared to a toroidal mixer, and maintaining consistent particle characteristics even after 12 hours of continuous operation.
  • CFD computational fluid dynamics
  • microfluidic mixing structure and mixing device which has a baffle length of only 3.9 mm, enables more efficient optimization by utilizing low flow conditions and prevents clogging even during long-term operation, enabling laboratory-scale nanoparticle optimization. and can serve as a starting point for parallelized scale-up devices for industrial production.
  • Figure 1 shows a microfluidic mixing device for mass production equipped with a single microfluidic mixing structure and an equal flow distributor for producing various nanoparticles (lipid nanoparticles, liposomes, polymer nanoparticles) based on a 3D printer according to an embodiment of the present invention.
  • This is a concept diagram.
  • Figure 2 is a perspective view of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a side view of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a plan view of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is experimental data for the design and CFD-based optimization of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5(a) is a conceptual circuit diagram showing the change in vortex generation formed in the channel due to a change in the baffle structure.
  • Figure 5(b) Complete schematic and detailed components of the structure for microfluidic mixing
  • Figure 5(c) Flow intensity between single vortex mixer (SVM) and non-vortex mixing mixer (NVM) with the same specifications as the structure for microfluidic mixing. and dead volume size comparison graph.
  • Figure 5(d) is a graph showing the mixing efficiency of the microfluidic mixing structure (DVM), a single vortex mixer, and a non-vortex mixing mixer of the present invention at a flow rate of 9 ml/min.
  • DVM microfluidic mixing structure
  • FIG 6 shows the velocity profile and turbulence motion according to the single vortex mixer (SVM) and non-vortex generating mixer (NVM) structures having the same specifications as the 3D hemispherical microfluidic mixing structure (double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention.
  • Energy (TKE) and dead volume of the baffle micromixer volume of each baffle 0.19 mm 3 , baffle width 200 ⁇ m, ethanol 0.9 mL/min, water 8.1 mL/min, dark blue: dead volume).
  • Figure 7 shows 0.9 mL of ethanol according to the single vortex mixer (SVM) and non-vortex mixing mixer (NVM) structures having the same specifications as the 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention. /min, water 8.1 mL /min) This is a graph comparing the degree of mixing according to mixing time.
  • SVM single vortex mixer
  • NVM non-vortex mixing mixer
  • Figure 8 shows various baffle dimensions of a single vortex mixer (SVM) and a non-vortex mixing mixer (NVM) having the same specifications as a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention.
  • SVM single vortex mixer
  • NVM non-vortex mixing mixer
  • the degree of mixing at 5 ms the calculated values of turbulent kinetic energy and dead volume (ethanol 0.9 mL/min, water 8.1 mL/min, dark blue: dead volume).
  • Figure 9 is a diagram showing the generation of double vortices according to the flow rates of ethanol and water when the flow rate ratio is 3 in a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention.
  • DVM double vortex mixer
  • FIG 10 is a diagram showing the generation of double vortices according to the flow rates of ethanol and water when the flow rate ratio is 6 in a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention.
  • DVM double vortex mixer
  • FIG 11 is a diagram showing the generation of double vortices according to the flow rates of ethanol and water when the flow rate ratio is 9 in a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention.
  • DVM double vortex mixer
  • Figure 12 shows a 3D hemispherical microfluidic mixing structure DVM (Dual Vortex Mixer) (left) according to an embodiment of the present invention produced by digital light processing (DLP) 3D printing without a tube connection and a 3D hemispherical microfluidic mixing structure connected to a tube. This is a photo of the structure (right).
  • DVM Deviceic Vortex Mixer
  • Figure 13 shows gas chromatography (GC) analysis results obtained to evaluate leaching after injecting ethanol and water into a 3D hemispherical microfluidic mixing structure for 12 hours according to an embodiment of the present invention (ethanol 0.9 mL/min; water 8.1 mL/min).
  • GC gas chromatography
  • Figure 15 shows the numerical Z-avg size and size of (a) PCL, (b) PEG-PLGA nanoparticles, (c) POPC liposomes, and (d) high concentration of Firefly luciferase (FLuc) mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (mRNA-LNPs).
  • FLuc Firefly luciferase
  • mRNA-LNPs mRNA-encapsulated lipid nanoparticles
  • Figure 16 is a photograph comparing in vitro and in vivo protein expression of mRNA-LNPs produced using different mixers.
  • mRNA-LNPs with the same preparation conditions are directly purified after production using a microfluidic mixing structure and a commercial toroidal mixer according to an embodiment of the present invention, or 1:1 or 1:2 mixing using PBS. In-line dilution was performed at flow rate ratio.
  • mRNA-LNPs containing SARS-CoV-2 spike mRNA were utilized for in vitro applications, and mRNA-LNPs containing FLuc mRNA were used for in vivo biodistribution studies.
  • SARS-CoV-2 diluted to the same concentration were used for in vitro and in vivo biodistribution studies.
  • Figure 17 is a schematic diagram of the assembly type of a 3D printed microfluidic mixing structure.
  • Figure 18 is a graph of continuous production of TPE nanoparticles for long-term use verification.
  • e Quantified ratio between the weight of clogged nanoparticles and the volume of the single structure.
  • Figure 20 is a nanoparticle contact angle of a 3D printed microfluidic mixing structure and a toroidal mixer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 21 is an actual working image for continuous production of 3D printed (a) microfluidic mixing structure according to an embodiment of the present invention and (b) TPE nanoparticles using a toroidal mixer.
  • Figure 22 is a real-time observation value Z of TPE nanoparticles generated through (a) a microfluidic mixing structure (DVM), (b) SVM, (c) NVM, and (d) toroidal mixer according to an embodiment of the present invention. -avg size and PDI value.
  • DVM microfluidic mixing structure
  • SVM SVM
  • NVM NVM
  • toroidal mixer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 23 shows the weight of nanoparticles blocked inside the microfluidic mixing structure quantified using UV-vis.
  • Figure 24 is a conceptual diagram of an integrated mass production device by parallelizing a flow distributor and a 3D microfluidic mixing structure for nanoparticle production.
  • (a), (b), (c) Conceptual diagram of the 3D printed integrated microfluidic mixing structure (4/8/16N-DVM) equipped with an equal flow distributor and a photo of the manufactured device.
  • (d) After supplying rhodamine B staining solution and methylene blue staining solution, UV spectrum (665 nm) analysis of solutions collected from each outlet, total flow rate 36 mL/min.
  • Figure 25 is a configuration diagram of four structures for microfluidic mixing formed in parallel and integrated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 26 is a conceptual diagram of an assembled mass-produced mixing device with an external flow distributor and multiple 4N-DVMs. This is a conceptual diagram of (a) 3-piece-assembled 8N-DVM and (b) 5-piece-assembled 16N-DVM.
  • Figure 27 is a configuration diagram of eight structures for microfluidic mixing formed in parallel and integrated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 28 is a configuration diagram of 16 microfluidic mixing structures formed in parallel and integrated according to an embodiment of the present invention.
  • a component being “in front,” “rear,” “above,” or “below” another component means that it is in direct contact with the other component, unless there are special circumstances. This includes not only those placed at the “bottom” but also cases where another component is placed in the middle.
  • the fact that a component is "connected" to another component includes not only being directly connected to each other, but also indirectly connected to each other, unless there are special circumstances.
  • Figure 1 shows a single microfluidic mixing structure for producing various nanoparticles (lipid nanoparticles, polyplexes, polymer nanoparticles) based on a 3D printer according to an embodiment of the present invention, and microfluidic mixing for mass production equipped with an equal flow distributor.
  • Figure 2 is a perspective view of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a side view of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a plan view of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 1 is a conceptual diagram of a microfluidic mixing structure 10 and a mixing device 100 for single and mass production to produce uniformly sized drug delivery nanoparticles.
  • the microfluidic mixing structure 10 can be manufactured with a 3D printer using photocurable resin, and has a built-in hemispherical baffle structure. Hemispherical baffle structures measuring several hundred micrometers (900 ⁇ m) are arranged alternately at the top and bottom to induce low pressure and rapid mixing of the whirlpool flow. This rapid mixing makes it easy to manufacture various nanoparticles uniformly and smallly, and the reproducibility of particle manufacturing is also excellent.
  • the microfluidic mixing structure 10 includes a first mixing unit 20, a second mixing unit 30, and a third mixing unit 40. It can be included.
  • the first mixing unit 20 includes a first body having an inlet 23 through which the first fluid and the second fluid flow and a first space 21 where the first fluid and the second fluid are mixed. can do.
  • the first fluid may be an anti-solvent and the second fluid may be an anti-solvent.
  • the second mixing unit 30 is disposed on the rear side of the first mixing unit 20 when viewed in the first direction, that is, the x-axis direction in FIG. 2, so that the mixed fluid mixed in the first mixing unit 20 is It may include a second body having a flowing second space 31.
  • the first body and the second body are formed as a single body 12.
  • the first body and the second body may be formed as separate structures, and then the first space and the second space may be combined to enable fluid communication.
  • the first space 21 of the first mixing unit 20 and the second space 31 of the second mixing unit 30 are based on the virtual center line (C in FIG. 3) extending in the first direction. are disposed on opposite sides of each other, and the flow direction of the mixed fluid flowing from the outlet 25 of the first mixing section 20 to the inlet 33 of the second mixing section 30 is opposite to the first direction, for example.
  • the direction is vertical, and the first mixing section 20 and the second mixing section 30 may include a curved surface that is left and right symmetrical about the center of the width direction when viewed in the first direction.
  • the third mixing section 40 is disposed on the rear side of the second mixing section 30 when viewed in the first direction and forms a third space 41 through which the mixed fluid passing through the second mixing section 30 flows. It may include a third body having a. In one embodiment of the invention, the first to third bodies are formed as a single body (12).
  • the third space 41 of the third mixing unit 40 may be disposed on the opposite side of the second space 31 of the second mixing unit 30 based on an imaginary line extending in the first direction. there is.
  • the first space 21 of the first mixing unit 20 and the second space 31 of the second mixing unit 30 have an oval or semicircular cross section when viewed in the first direction. It can include either one.
  • the first space 21 of the first mixing unit 20, the second space 31 of the second mixing unit 30, and the third space 41 of the third mixing unit 40 are It can be formed in a hemispherical shape.
  • the second mixing unit 30 is located above the first mixing unit 20 and the third mixing unit 40 in the vertical direction, and the inlet 23 of the first mixing unit 20 is It is arranged to face upward.
  • the inlet 43 of the space 41 has the same inlet and outlet areas.
  • the first space 21 of the first mixing unit 20, the second space 31 of the second mixing unit 30, and the third space of the third mixing unit 40 ( The cross-sectional area of the central portion of 41) is larger than the areas of each of the inlets 23, 33, 43 and outlets 25, 35, 45 of the first space 21, the second space 31, and the third space 41. It is formed to be large.
  • the outlet 25 of the first space 21 of the first mixing unit 20 and the second space 31 of the second mixing unit 30 are a pair of the same diameter.
  • the arcs of can be formed in a closed curve shape with the arcs facing each other.
  • the structure 10 for microfluidic mixing includes a first fluid inlet pipe 52 and a second fluid inlet pipe 54.
  • the first fluid inlet pipe 52 is formed to pass the first fluid so that the first fluid flows into the inlet of the first mixing section 20, and the second fluid inlet pipe 54 is formed to pass through the first mixing section 20. It is formed so that the second fluid passes through the inlet.
  • the first fluid inlet pipe 52 and the second fluid inlet pipe 54 are arranged to be perpendicular, and any of the first fluid inlet pipe 52 and the second fluid inlet pipe 54 One is arranged to extend in the first direction.
  • the first fluid inlet pipe 52 extends in the first direction, that is, the x-axis direction.
  • the third space 41 of the third mixing unit 40 has an outlet 45 oriented upward, and the outlet 45 of the third space 41 has a mixed fluid extending in the first direction.
  • a discharge pipe 56 is connected.
  • the first body, the second body, and the third body may be formed as a module integrated into one body 12.
  • the body 12 in the form of an integrated module can be formed by a 3D printer.
  • the first to third bodies may be composed of separate bodies and then combined.
  • the inventor of the present invention focused on three aspects in developing a new micro-mixing structure that can maintain ultra-high-speed mixing performance for a long period of time.
  • the internal baffle structure within the channel forms a secondary flow, improving mixing efficiency under consistent flow conditions.
  • Second, using a circular channel with a lower dead volume compared to a square channel improves mixing efficiency and facilitates continuous operation.
  • the vortex generated inside the reactor further improves the mixing efficiency and has a beneficial effect on the dispersion of nanoparticles, preventing adhesion and agglomeration.
  • the inventor of the present invention hypothesized that by using a circular channel and creating a greater number of secondary flows within it, a more active vortex could be created, thereby maximizing mixing efficiency and enabling long-term operation.
  • the amount of secondary flow formed can be controlled by adjusting the flow speed and intensity in the secondary flow direction according to the primary flow along the axis.
  • Figure 5 is experimental data for the design and CFD-based optimization of a structure for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5(a) is a conceptual circuit diagram showing the change in vortex generation formed in the channel due to a change in the baffle structure.
  • Figure 5(b) Complete schematic and detailed components of the structure for microfluidic mixing
  • Figure 5(c) Flow between single vortex mixer (SVM) and non-vortex mixing mixer (NVM) with the same specifications as the structure for microfluidic mixing.
  • 5(d) is a graph showing the mixing efficiency of the microfluidic mixing structure (DVM) of the present invention, a single vortex mixer, and a non-vortex mixing mixer under a flow rate condition of 9 ml/min.
  • DVM microfluidic mixing structure
  • each flow element generates dean vortices of varying intensity along the axial axis.
  • the integration of the components is driven by counter-pressure gradients, experiencing rapid flows along the wall boundaries due to centrifugal forces within the counter-geometry of the structure.
  • the resulting distribution appears as a visible secondary flow, characterized by a doubly symmetric recirculating vortex diagonal to the primary flow.
  • Figure 6 is a velocity profile according to a single vortex mixer (SVM) and a non-vortex generating mixer (NVM) structure having the same specifications as a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (double vortex mixer: DVM) according to an embodiment of the present invention; Turbulence kinetic energy (TKE) and dead volume of the baffle micromixer (volume of each baffle 0.19 mm 3 , baffle width 200 ⁇ m, ethanol 0.9 mL/min, water 8.1 mL/min, dark blue: dead volume).
  • SVM single vortex mixer
  • NVM non-vortex generating mixer
  • Figure 7 shows 0.9 mL of ethanol according to the single vortex mixer (SVM) and non-vortex mixing mixer (NVM) structures having the same specifications as the 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention. /min, water 8.1 mL /min) This is a graph comparing the degree of mixing according to mixing time.
  • SVM single vortex mixer
  • NVM non-vortex mixing mixer
  • NVM non-vortex mixer
  • SVM single vortex mixer
  • DVM double vortex mixer
  • TKE turbulent kinetic energy
  • Figure 8 shows various baffle dimensions of a single vortex mixer (SVM) and a non-vortex mixing mixer (NVM) having the same specifications as a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention. , calculated values of mixing degree, turbulence kinetic energy, and dead volume at 5 ms (ethanol 0.9 mL/min, water 8.1 mL/min, dark blue: dead volume).
  • SVM single vortex mixer
  • NVM non-vortex mixing mixer
  • the spacing between baffles may be 50 to 300 ⁇ m
  • the baffle diameter may be 600 to 1200 ⁇ m
  • the ratio of the spacing between baffles:baffle diameter may be about 2 to 24.
  • FIGS. 9 to 11 are diagrams showing the generation of double vortices according to the flow rates of ethanol and water when the flow rate ratios are 3, 6, and 9, respectively, in a 3D hemispherical microfluidic mixing structure (DVM: double vortex mixer) according to an embodiment of the present invention.
  • DVM double vortex mixer
  • the optimized DVM achieved a TKE of 78.9 m 2 s -2 , exceeding SVM by more than 3.5 times and NVM by more than 38 times, and the dead volume was also 8.09 x 10 -3 mm 3 . This was more than twice smaller than other models (see (d) in Figure 5).
  • FRR 3, 6, 9
  • ethanol flow ⁇ 0.9 ml/min at FRR 3 exhibited a pronounced double vortex that was intensified at higher FRR and used for actual nanoparticle production.
  • the flow rate ratio may be in the range of 1:1 to 1:9. At this time, the flow rate may be 0.9 mL/min or more for the first fluid and 2.7 mL/min or more for the second fluid.
  • Figure 12 shows a 3D hemispherical microfluidic mixing structure according to an embodiment of the present invention manufactured by digital light processing (DLP) 3D printing without a tube connection, that is, a Dual Vortex Mixer (DVM) (left) and a 3D hemispherical microfluid connected to a tube. This is a photo of the mixing structure (right).
  • Figure 13 is a gas chromatography (GC) analysis result obtained to evaluate leaching after injecting ethanol and water into a 3D hemispherical microfluidic mixing structure for 12 hours according to an embodiment of the present invention. (ethanol 0.9 mL / min ; water 8.1 mL/min )
  • the final selected DVM can be produced using 3D printing resin.
  • the chemical stability of the DVM manufactured in this way was further verified through continuous injection of an alcohol-based solvent for 12 hours and confirmed through GC analysis.
  • 3D printing can not only easily fabricate three-dimensional structures, but can also selectively utilize resins to achieve high chemical stability in organic solvents used to manufacture nanoparticles after curing.
  • digital light processing (DLP) printing is widely known for achieving high resolution and is widely utilized to fabricate microfluidic channels with sizes less than 1 mm.
  • the inventors of the present invention have developed a poly(methyl methacrylate) (PMMA)-based resin that provides high stability for long-term operation and prevents device deformation under high pressure conditions when used in combination with ethanol, which is commonly used in the production of lipid-based nanoparticles. selected.
  • PMMA poly(methyl methacrylate)
  • the DVM device manufactured using this resin was confirmed to have no leaching even after long-term ethanol injection for 12 hours using gas chromatography (GC), which is used to generate lipid-based nanoparticles.
  • GC gas chromatography
  • the structure and mixing device for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention have the mechanical and chemical properties necessary for simple sample preparation and long-term continuous production of optimized particles during the optimization process of nanoparticle properties. .
  • Figure 15 shows the numerical Z-avg size and size of (a) PCL, (b) PEG-PLGA nanoparticles, (c) POPC liposomes, and (d) high concentration of Firefly luciferase (FLuc) mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (mRNA-LNPs).
  • FLuc Firefly luciferase
  • mRNA-LNPs mRNA-encapsulated lipid nanoparticles
  • Q figure of merit
  • DVM is a versatile platform for producing lipid- and polymer-based drug delivery nanoparticles with high uniformity and controllable size.
  • PCL polycaprolactone
  • PEG-PLGA poly(ethylene glycol)-b-poly(lactide-co-glycolide)
  • POPC 3-phosphocholine
  • mRNA-LNPs mRNA-encapsulated lipid nanoparticles
  • nanoparticles fall within the optimal range of stable, physiologically important nanoparticles and generally conform well to international nanoparticle specifications.
  • the relatively large capacity DVM with a submillimeter diameter enables ultrafast mixing within the channel, indicating that high concentrations of precursors can be systematically controlled within the microfluidic mixer.
  • the performance of the DVM device surpasses that of other microfluidic devices, especially considering its outstanding figure of merit (Q) value.
  • exceptionally high Q values ranging from 0.22 to 0.45 were calculated (see Figures 14(c) and 15(c) and (f)). This value exceeds the previously reported 0.4, indicating the outstanding performance and superiority of DVM in terms of nanoparticle size and uniformity.
  • the DVM platform By utilizing the low FRR frequently used in nanoparticle manufacturing, the DVM platform according to one embodiment of the present invention can reduce the concentration process of liposome solutions for clinical use and reduce drug release from liposomes during the purification step. It should be noted that the interaction between drug and carrier may be potentially insufficient due to the relatively large internal volume of the DVM compared to the reported micromixers. To solve this problem, the inventors of the present invention took advantage of the ability of LNPs to encapsulate firefly luciferase mRNA (FLuc-mRNA) and demonstrated that nanoparticles produced from DVM can transport large amounts of nucleic acids.
  • FLuc-mRNA firefly luciferase mRNA
  • Figure 16 is a photograph comparing in vitro and in vivo protein expression of mRNA-LNPs produced using different mixers.
  • mRNA-LNPs with the same preparation conditions are directly purified after production using a microfluidic mixing structure and a commercial toroidal mixer according to an embodiment of the present invention, or 1:1 or 1:2 mixing using PBS. In-line dilution was performed at a flow rate ratio.
  • mRNA-LNPs containing SARS-CoV-2 spike mRNA were utilized for in vitro applications, and mRNA-LNPs containing FLuc mRNA were used for in vivo biodistribution studies.
  • the inventors of the present invention selected SARS-CoV-Spike-mRNA for in vitro studies and FLuc-mRNA for in vivo biodistribution evaluation ((a in Figure 16) ) reference)
  • the toroidal mixer has a much smaller internal volume per structure compared to the DVM, about 23.7 times smaller. (The volume per toroidal mixer internal structure was calculated based on examples disclosed in the patent.) However, to perform an accurate comparative performance analysis, it is generally assumed that both DVM and toroidal mixer under the same manufacturing conditions, including in-line dilution in PBS. Three different formulations were performed using flow rate ratios (3 mL/min for lipid solution; 9 mL/min for mRNA solution). In addition, after formulation, concentration adjustment and diafiltration for purification were performed. The properties of purified LNP samples were compared after protein expression in vitro and in vivo.
  • Table 1 Comparison of DVM and commercial toroidal mixers in purified mRNA-LNP properties under identical formulation conditions.
  • the ratios shown in the “Inline Dilution” section represent the flow rate ratios of the total LNP solution and PBS (pH 7.4).
  • Figure 17 is a schematic diagram of the assembly type of a 3D printed microfluidic mixing structure.
  • the inventor of the present invention configured the previously compared SVM and NVM devices into an assembly type DVM, as shown in FIG. 20, so that the inside of the device can be seen to illustrate the performance of DVM continuity.
  • Figure 18 is a graph of continuous production of TPE nanoparticles for long-term use verification.
  • e Quantified ratio between the weight of clogged aggregate and the volume of the single structure.
  • FITC-based fluorescent molecules are chosen because they have strong luminescence in solution.
  • existing FITC emits fluorescence in the molecular state in solution, so it is not effective for long-term imaging and tracking.
  • Tetraphenylethylene (TPE) molecule one of the aggregation-induced emission (AIE) molecules, was chosen for visualization and quantification of clogging tests because it allows direct visualization of nanoparticles trapped and remaining inside the channel and does not lose photoluminescence even over long periods of time.
  • DVM produced highly uniform TPE nanoparticles with a minimum size of 77 nm when FRR was increased to 9, followed by 80 nm in the toroidal mixer, 92 nm in the slow mixing SVM, and 95 nm in the NVM. .(see Figure 18 (a), Figure 19)
  • Figure 20 is a nanoparticle contact angle of a 3D printed microfluidic mixing structure and a toroidal mixer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 21 is an actual working image for the continuous production of TPE nanoparticles using a 3D printed microfluidic mixing structure and a toroidal mixer according to an embodiment of the present invention.
  • the solution was injected using two HPLC pumps with real-time pressure measurement function to monitor the pressure change inside the micromixer based on the upper experimental conditions.
  • Figure 22 is a real-time observation value Z of TPE nanoparticles generated through (a) a microfluidic mixing structure (DVM), (b) SVM, (c) NVM, and (d) toroidal mixer according to an embodiment of the present invention. -avg size and PDI value.
  • DVM microfluidic mixing structure
  • SVM SVM
  • NVM NVM
  • toroidal mixer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 23 shows the weight of nanoparticles blocked inside the microfluidic mixing structure quantified using UV-vis.
  • the prefabricated SVM and NVM reactors began to leak at 166 and 120 minutes, respectively.
  • the pressure difference in the DVM was limited to 15 psi (after 460 minutes), and despite continuous pump operation for a total of 12 hours, the pressure inside the mixer remained low again, close to the initial level. Additionally, after 12 hours of continuous operation, the PDI consistently displayed values below 0.1 while the particle size varied up to 5 nm. To visualize and measure the relative blockage to the DVM, the DVM was activated once again utilizing a new reactor at 166 min, the maximum run time of the remaining reactors.
  • the micromixer was redissolved with deionized water flowing for 1 min at a slow flow rate to remove the remaining solution without any effect on the clogged aggregates. .
  • the degree of blockage of the micromixer was confirmed using a microscope ( Figure 18(d)).
  • a similarly operated DVM was found to have a clogging reduction rate more than 10 times lower than that of other types of baffles, and a clogging rate that was about 62 times lower than that of a toroidal mixer (Figure 18(e). ) and Figure 23).
  • Figure 24 is a conceptual diagram of an integrated mass production device by parallelizing a flow distributor and a 3D microfluidic mixing structure for nanoparticle production.
  • (a), (b), (c) Conceptual diagram of a 3D printed integrated microfluidic mixing structure (4/8/16N-DVM) equipped with an equal flow distributor and a photo of the manufactured device.
  • (d) After supplying rhodamine B staining solution and methylene blue staining solution, UV spectrum (665 nm) analysis of solutions collected from each outlet, total flow rate 36 mL/min.
  • Figure 25 is a configuration diagram of four structures for microfluidic mixing formed in parallel and integrated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 26 is a conceptual diagram of an assembled mass-produced mixing device with an external flow distributor and multiple 4N-DVMs. This is a conceptual diagram of (a) 3-piece assembled 8N-DVM and (b) 5-piece assembled 16N-DVM.
  • the inventor of the present invention arranged the optimized 3D baffle single structure for manufacturing nanoparticles in parallel as shown in Figures 24 and 25, and integrated a flow distributor that equally supplies anti-solvent and pro-solvent to this device.
  • a mixing device for mass production of nanoparticles was designed.
  • the integrated flow distribution device produced with a 3D printer is directly connected to the mixer, which has the great advantage of reducing flow distribution deviation.
  • the flow distribution device has a length of 0.05 ⁇ Re ⁇ D (Re: Reynolds number, D: hydraulic diameter) (ACS Sustainable. Chem.
  • an integrated mixing device for mass production with four single devices in parallel was manufactured to calculate the distribution deviation factor (MF) value for each mixer according to the flow rate optimized for lipid nanoparticle production and the total flow rate.
  • MF distribution deviation factor
  • the previously manufactured integrated mixing device for mass production is easy to manufacture and has the advantage of high distribution efficiency because there are no errors occurring during the assembly process.
  • the inventor of the present invention separately manufactured a 4N-DVM baffle mixing device and an equal flow distributor (70, 70') that have a simple structure to complement each other and allow partial replacement of components, and mass-produced them in an assembled manner.
  • a mixing device (100', 100”) was additionally manufactured ( Figure 26 (a), (b)).
  • the detailed dimensions of the finally manufactured external flow distributor were calculated as shown in Table 3.
  • Nanoparticle production devices with hemispherical structures are connected to each end of each of the 16 equal flow distributors that supply the pro-solvent and anti-solvent (8 each for the upper and lower layers) and manufactured as an integrated device using a 3D printer.
  • the integrated mass production mixer maintains the physical properties of the nanoparticles (size, particle uniformity, surface charge, and drug encapsulation efficiency) and enables manufacturing at a flow rate of 17.2 L per hour.
  • the integrated manufacturing method of single devices (1x) and mass production devices (4x, 8x 16x) using 3D printers shows the possibility of a customized manufacturing method for small and large-scale production needs.
  • Figure 27 is a configuration diagram of 8 structures for microfluidic mixing formed in parallel and integrally according to an embodiment of the present invention
  • Figure 28 is a configuration diagram of 16 structures for microfluidic mixing according to an embodiment of the present invention formed in parallel and integrally. This is the configuration diagram.
  • the structure for microfluidic mixing may be configured as shown in FIG. 26, but may also be manufactured with a plurality of mixers in one module as shown in FIGS. 27 and 28.
  • Ethyl alcohol Ethyl alcohol
  • THF tetrahydrofuran
  • ACN acetonitrile
  • TPE 1,1,2,2-tetraphenylethylene
  • Chol Triton Purchased 100.
  • Sigma-Aldrich 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2 -Dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG 2000) was purchased from Avanti Polar Lipids, Inc.
  • the 3D printing device was designed using computer design (CAD) and software (Autodesk Inventor). To facilitate high-pressure injection of two different solutions, 5 mm threads (1/16 ′′, 1/4-28 Flat-Bottom) were introduced at the injection site with a gap longer than the theoretical flow stabilization length of 10. This modification allowed for a smooth connection to the XP-235 fitting (IDEX Health & Science).
  • the CAD files were then printed via a digital light processing (DLP)-based 3D printer (Pico 2 HD, Asiga) using a commercial resin (PlasCLEAR). Each layer was printed at 25 ⁇ m and laminated through photocuring.
  • Isopropanol (IPA) was used to remove residual uncured resin inside the printed device, and then the IPA was further removed by flushing air through a mixer. This process was repeated until no resin was observed at each inlet and outlet. Finally, the cleaned device was post-cured using a UV chamber (Asiga Flash), which transformed the resin into a fully polymerized object.
  • IPA Isopropanol
  • ⁇ is the fluid density
  • v is the fluid linear velocity
  • p is the pressure
  • ⁇ is the fluid dynamic viscosity
  • g is the gravitational acceleration.
  • the governing equations were solved using appropriate boundary conditions (no-slip boundary conditions on the channel walls, mass flow rate at the inlet, discharge conditions at the outlet, and zero normal gradients for all flow variables except pressure).
  • the equations were discretized based on the finite volume method, and commercialized numerical software FLUENT 2022 R2 (ANSYS, INC.) was used for numerical analysis.
  • the SST shear stress transfer
  • k- ⁇ standard turbulence model which merges the k- ⁇ turbulence and k- ⁇ turbulence models, was used in the calculations.
  • the fluid properties used were the density and viscosity of ethyl alcohol (790 kg m 3 , 0.0012 kg m -1 s -1 ) and water (998.2 kg m 3 , 0.001003 kg m -1 s -1 ).
  • the portion of the computational domain where the velocity magnitude falls below 5% of the maximum velocity at any given time is marked as dead volume.
  • PCL was dissolved in THF at a concentration of 1 mg/mL, and deionized water was used to precipitate PCL nanoparticles.
  • PCL precursor solution and deionized water were injected using two 20 mL syringes (Air-Tite Products, Inc.). Each syringe was attached to a separate syringe pump (PHD Ultra, Harvard Apparatus), and the flow rate of each pump was controlled using an FRR range of 3 to 9. Each syringe is connected to an antisolvent and polymer inlet, respectively.
  • PEG 5k-PLGA 55k was dissolved in ACN at a high concentration of 50 mg/ml.
  • Deionized water was used as an antisolvent for precipitation of PEG-PLGA nanoparticles, and the same method as described above was followed for injection.
  • aqueous buffer saline, 154mM NaCl
  • SM-102/DSPC/Chol/DMG-PEG 2000 was dissolved in ethanol at a ratio of 50/10/38.5/1.5 to produce a lipid solution with a total concentration of 20 mg/mL.
  • a 3M concentration of sodium acetate solution was diluted to a 25mM concentration with nuclease-free water (NFW).
  • the pH of the sodium acetate buffer was adjusted to 5.5 using 100mM acetic acid solution.
  • the lipid solution and sodium acetate buffer were passed through a 0.22- ⁇ m syringe filter.
  • FLuc mRNA was then dissolved in sodium acetate buffer.
  • mRNA-LNPs were purified using the same upstream method used for liposomes.
  • Each mRNA-LNP preparation was combined with equal molar ratios of lipids to reach a final mRNA concentration of 0.04 mg/ml.
  • the comparative commercial device included a toroidal mixer (NanoAssemblr Ignite, Precision NanoSystems).
  • a centrifugal filter device (Amicon ® Ultra-15) was used for diafiltration to achieve a fully buffered environment. Briefly, the sample to be purified was placed inside the device, the remaining space was filled with a buffer solution, and centrifugation was repeated at 3,500 rpm for 40 minutes until the pH of the solution outside the membrane reached 7.4.
  • LNPs loaded with SARS-CoV-Spike-mRNA were diluted to achieve an mRNA concentration of 0.02 mg/ml.
  • LNPs loaded with FLuc-mRNA underwent the same purification process, and the final concentration of mRNA was set at 0.04 mg/ml.
  • HEK 293T cells ATCC, American Type Culture Collection
  • Cell extracts were separated by 4 ⁇ 15% gradient SDS-PAGE (4 ⁇ 15% Mini-PROTEAN TGXTM Precast Protein Gels, Bio-Rad).
  • Cell lysate proteins were transferred from the gel to a 0.2 ⁇ m PVDF membrane (Mini-format, Bio-Rad) and incubated with recombinant 2019-nCoV spike antibody (SARS-COV-2 Spike RBD Polyclonal Antibody, Elabscience) and GAPDH antibody (sc-47724, Santa Immunoblotting was performed using Cruz Biotechnology. Analysis was performed with a Western blot imaging system (ChemiDoc MP Imaging System, Bio-Rad) using Western ECL solution (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad).
  • each mouse was injected with 100 ⁇ L of luciferin (D-Luciferin, GoldBio) at a concentration of 15 mg mL -1 into both abdominal cavities and images were taken using IVIS Spectrum (PerkinElmer, USA). specified point in time. After acquiring images for up to 6 days, a region of interest (ROI) was defined around the injection site and total flux values were calculated.
  • luciferin D-Luciferin, GoldBio
  • DLS analysis was performed using a Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, Ltd.) to evaluate the strength-dependent size distribution of the synthesized nanoparticles. All liposome-free measurements were performed using polymer or lipid solutions at concentrations less than 10% to eliminate the potential influence of solvent on the observed particle size changes. In the case of liposomes, DLS analysis was performed before the dialysis process due to the high instability of nanoparticles. For mRNA-LNPs, the encapsulation efficiency of mRNA was characterized using the Quant-it TM RiboGreen assay (ThermoFisher Scientific).
  • LNPs were diluted using TE (Tris EDTA) buffer to a concentration ranging from 4 to 7 ng ⁇ L.
  • Diluted LNPs treated with TE buffer to maintain the LNP structure or 1% v/v Triton X-100 to destroy the structure and release mRNA were diluted 100-fold and reacted with an equal volume of RiboGreen solution.
  • Free mRNA and total mRNA in the formulations were determined using a microplate reader (Hidex Sense, Hidex Oy) with 500 nm excitation and 520 nm emission.
  • TPE TPE at a concentration of 1 mg/mL was dissolved in acetone.
  • Deionized water was used as an anti-solvent for continuous nanoparticle production.
  • the beaker was sealed using parafilm and foil to prevent solvent evaporation.
  • One HPLC pump PR-Class, Teledyne SSI
  • Another HPLC pump (LC-10AD, Shimadzu) was connected to the TPE solution.
  • the outlet of the HPLC pump was connected to 1/4" PTFE tubing through a 316 stainless steel reducer (SS-400-6-1BT, Swagelok). The end of each tubing was additionally connected to 3.
  • a .mm stainless needle luer-lock tubing connector (KT503s, Needle Store) was fitted to the inlet of the toroidal mixer.
  • the HPLC pump was set to operate at a TPE solution flow rate of 0.9 mL/min and a deionized water flow rate of 0.9 mL/min. 8.1 mL/min.
  • the pressure of the HPLC pump was continuously monitored in real time to calculate the pressure difference, and the nanoparticles generated at the outlet were collected into different vials for further DLS analysis.
  • Microfluidic systems are promising in the field of drug delivery due to their ability to produce uniform and size-controllable nanoparticles with high reproducibility, enabling a variety of applications in research and clinical settings.
  • current micromixers severely lack features that enable rapid, efficient mixing under minimal flow conditions while preventing clogging and enabling simple scalability for on-demand production.
  • continuous device operation can produce nanoparticles that maintain consistent properties for hours.
  • the inventor of the present invention developed a mixer that utilizes a three-dimensional structure to maximize the vortex effect within a microfluidic system, enabling high-speed mixing between solutions and efficient dispersion of nanoparticles.
  • the user-friendly DVM platform provides nearly equivalent performance to commercial mixers in terms of particle properties and protein expression, but in a much smaller volume.
  • microfluidic mixers proposed so far that can be easily fabricated using photolithography use flow rates in the range of tens to hundreds of ⁇ L/min, which can be difficult in terms of productivity.
  • monolithic hydrodynamic focusing or vortex focusing mixers require flow rates higher than tens of ml/min for rapid mixing, resulting in significant reagent consumption during optimization.
  • the use of high FRR in these mixers may result in a concentration process following nanoparticle generation.
  • the DVM proposed by the inventor of the present invention is a platform that operates at a flow rate of several mL/min to bridge the gap between microfluidic mixers.
  • a relatively large volume micromixer can be used in reverse to control high concentrations of precursors and effectively prevent clogging. Integrating anti-fouling materials and manufacturing components can further reduce adhesion, so research in this area is needed.
  • the small 3.9 mm nanoparticle production section allows parallelization of the scale-up process to create a monolithic single mass-produced module. This approach provides greater flow uniformity distribution compared to using an assembly-based external flow distributor. With the DVM platform, the inventors expect to accelerate a wide range of nanoparticle-based medical applications by enabling selective optimization and production of particle properties in the form of monolithic modular units.

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Abstract

미세 유체 혼합용 구조체 및 이를 구비한 미세 유체 혼합 장치가 개시된다. 본 발명의 일 측면에 따른 미세 유체 혼합용 구조체는, 제 1 유체 및 제 2 유체를 제 1 방향으로 이동시키면서 혼합시키기 위한 미세 유체 혼합용 구조체로서, 상기 제 1 유체 및 제 2 유체가 유입되는 유입구를 구비하고 상기 제 1 유체 및 상기 제 2 유체가 혼합되는 제 1 공간을 구비한 제 1 몸체를 포함하는 제 1 혼합부 및 상기 제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 후방측에 배치되어 상기 제 1 혼합부에서 혼합된 혼합 유체가 유동하는 제 2 공간을 구비하는 제 2 몸체를 포함하는 제 2 혼합부를 포함하되, 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 상기 제 1 방향으로 연장된 가상의 선을 기준으로 서로 반대편에 배치되고, 상기 제 1 혼합부의 배출구로부터 상기 제 2 혼합부의 유입구로 유입되는 혼합 유체의 흐름 방향은 상기 제 1 방향에 엇갈리는 방향이며, 상기 제 1 혼합부 및 상기 제 2 혼합부는 상기 제 1 방향으로 볼 때 폭방향 중심을 기준으로 좌우 대칭인 곡면을 포함한다.

Description

미세 유체 혼합용 구조체 및 이를 구비한 미세 유체 혼합 장치
본 발명은 미세 유체 혼합용 구조체 및 이를 구비한 미세 유체 혼합 장치에 관한 것이다.
나노기술은 특정 세포 표적화, 향상된 투과 및 유지(EPR) 효과, 세포 독성 감소 등의 장점으로 인해 약물 전달 분야에서 큰 주목을 받고 있으며, 장기 내 생물학적 장벽을 극복하여 기존 전달 방법의 한계를 넘어섰다. 일관된 치료 효능을 극대화하려면 GMP(우수제조관리기준) 및 임상 시험과 관련된 효과적인 치료를 위한 특정 질병 및 표적 기관에 따라 크기에 대한 정밀한 제어가 중요하다. 이러한 목표를 추구하기 위해 미세유체 기술의 적용은 높은 물질 전달과 정밀한 시스템 제어를 가능하게 하는 필수 접근 방식으로 등장하였다.
그러나 미세유체공학을 통한 지속적인 나노입자 생산은 용액 혼합, 응집 및 물리화학적 특성의 일관성에 영향을 미치는 문제를 제기한다. 표적 크기에서 벗어나는 입자는 원하지 않는 기관이나 세포에 축적되어 독성을 유발할 수 있다. 부작용을 최소화하기 위해서는 용액 간 혼합 효율을 극대화하여 매우 균일한 나노입자를 구현하는 것이 미세유체 혼합기의 설계 과정에서 매우 중요하다. 기존의 포토리소그래피는 낮은 균일성으로 인해 용매 선택성과 흐름 문제로 인해 응용 분야의 생산성이 제한되었다. 사출 성형은 비용이 많이 들고 접근성이 떨어지는 대안이다. 3D 프린팅은 용매 안정성과 다양한 모놀리식 (일체형) 디자인을 제공하여 유망하다. 그러나 해상도가 낮을수록 정밀하며 높은 재현성을 갖는 제작을 위해 큰 채널을 설계해야 하므로 혼합 효율성이 떨어진다. 이러한 제한으로 인해 혼합 효율을 극복하기 위해서는 높은 유속에서의 가동이 필요하며 이는 입자 최적화과정에서의 과량의 시약을 소모한다. 믹서 내부의 배플은 느린 혼합 한계를 극복하고 2차 흐름을 유도하여 혼합을 향상시키는 또 다른 대안으로 적용된다. 그러나 널리 사용되는 2D 배플은 데드 볼륨(Dead Volume) 및 나노입자 흡착이 발생하기 쉽고 믹서의 성능을 저하시킨다. 막힘은 미세 유체의 낮은 생산성이라는 근본적인 문제를 해결하는 데 중요한 스케일 업에 중요한 과제를 추가로 제기한다. 혼합기나 흐름 분배기 내부에 흡착된 응집된 나노입자는 각 배출구의 압력 불규칙성을 유발하고, 고르지 않은 흐름 분포로 인해 스케일업 장치 내에서 일관된 특성을 갖는 나노입자의 생산 효율성이 급격히 감소한다. 따라서, 초고속 혼합이 가능하면서도 장기간 운전 시에도 막힘을 방지하여 편리한 스케일 업(scale-up)이 가능한 새로운 믹서의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 마이크로 딘 소용돌이를 통합하여 두 개의 대칭 역회전 강화 소용돌이를 생성하는 미세유체 이중 소용 돌이 혼합용 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 3D 반구형 배플을 통해 매우 높은 강도의 두 개의 대칭 소용돌이를 형성하여 믹서 내에서 초고속 혼합을 가능하게 하는 동시에 폴리머 및 지질 기반 나노입자를 지속적으로 생성할 수 있는 듀얼 볼텍스 혼합용 구조체(DVM)을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 3D 프린터를 이용하여 초고속 혼합이 가능한 3D 배플 (baffle) 구조의 미세유체 혼합용 구조체를 제공하고, 미세 유체 혼합용 구조체와 유량 분배기를 연결하여 나노입자 대량생산을 위한 일체형/조립형 미세 유체 혼합 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 제 1 유체 및 제 2 유체를 제 1 방향으로 이동시키면서 혼합시키기 위한 미세 유체 혼합용 구조체로서, 상기 제 1 유체 및 제 2 유체가 유입되는 유입구를 구비하고 상기 제 1 유체 및 상기 제 2 유체가 혼합되는 제 1 공간을 구비한 제 1 몸체를 포함하는 제 1 혼합부 및 상기 제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 후방측에 배치되어 상기 제 1 혼합부에서 혼합된 혼합 유체가 유동하는 제 2 공간을 구비하는 제 2 몸체를 포함하는 제 2 혼합부를 포함하되, 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 상기 제 1 방향으로 연장된 가상의 선을 기준으로 서로 반대편에 배치되고, 상기 제 1 혼합부의 배출구로부터 상기 제 2 혼합부의 유입구로 유입되는 혼합 유체의 흐름 방향은 상기 제 1 방향에 엇갈리는 방향이며, 상기 제 1 혼합부 및 상기 제 2 혼합부는 상기 제 1 방향으로 볼 때 폭방향 중심을 기준으로 좌우 대칭인 곡면을 포함하는, 미세 유체 혼합용 구조체가 제공된다.
이 때, 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 상기 제 1 방향으로 볼 때 타원형 및 반원형 단면 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 반구형으로 형성될 수 있다.
이 때, 상기 제 2 혼합부는 상하 방향으로 상기 제 1 혼합부보다 상측에 위치되고, 상기 제 1 혼합부의 상기 유입구는 상측 방향을 향하도록 배치될 수 있다.
이 때, 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 각각의 유입구 및 유출구의 면적이 동일하게 형성될 수 있다.
이 때, 제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 제 2 공간의 중앙부의 단면적은 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 공간은 각각의 유입구 및 유출구의 면적보다 크도록 형성될 수 있다.
이 때, 제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 제 2 공간은 각 공간의 상기 유입구 및 상기 유출구는 동일한 지름의 한 쌍의 원호가 서로 마주보며 맞접한 폐곡선 형상으로 이루어질 수 있다.
이 때, 상기 제 1 방향으로 볼 때, 상기 제 3 혼합부의 후방측에 배치되어 상기 제 2 혼합부를 지난 혼합 유체가 유동하는 제 3 공간을 구비하는 제 3 몸체를 포함하는 제 3 혼합부를 더 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제 3 혼합부는 상기 제 1 혼합부 및 상기 제 2 혼합부 중 적어도 어느 하나와 동일한 형상으로 이루어질 수 있다.
이 때, 상기 제 3 혼합부의 상기 제 3 공간은 상기 제 1 방향으로 연장된 가상의 선을 기준으로 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간의 반대편에 배치될 수 있다.
이 때, 상기 제 1 혼합부의 상기 유입구로 상기 제 1 유체가 유입되도록 상기 제 1 유체가 지나는 제 1 유체 유입관 및 상기 제 1 혼합부의 상기 유입구로 상기 제 2 유체가 유입되도록 상기 제 2 유체가 지나는 제 2 유체 유입관을 포함하고, 상기 제 1 유체 유입관 및 상기 제 2 유체 유입관은 직교하도록 배치되고, 상기 제 1 유체유입관 및 상기 제 2 유체 유입관 중 어느 하나는 상기 제 1 방향으로 연장되도록 배치될 수 있다.
이 때, 상기 제 3 혼합부의 상기 제 3 공간은 상측 방향으로 배향된 유출구를 구비하며, 상기 제 3 공간의 유출구에는 제 1 방향으로 연장된 혼합 유체 배출관이 연결될 수 있다.
이 때, 상기 제 1 몸체, 상기 제 2 몸체 및 상기 제 3 몸체는 하나의 몸체로 일체화된 모듈로 형성될 수 있다.
이 때, 상기 하나의 몸체로 일체화된 모듈 내부에는 복수의 제 1 혼합부, 상기 복수의 제 1 혼합부에 각각 연결된 복수의 제 2 혼합부 및 상기 복수의 제 2 혼합부에 각각 연결된 복수의 제 3 혼합부가 구비되고, 상기 하나의 몸체에는 상기 제1 유체를 상기 하나의 몸체 내부로 공급하기 위한 제 1 유체 공급관이 연결되는 제 1 유체 공급 유로 및 상기 제 2 유체를 상기 하나의 몸체 내부로 공급하기 위한 제 2 유체 공급관이 연결되는 제 2 유체 공급 유로가 구비되고, 상기 제 1 유체 공급 유로 및 상기 제 2 유체 공급 유로는 상기 복수의 제 1 혼합부로 상기 제 1 유체 및 상기 제 2 유체를 공급하도록 복수로 분기되도록 형성될 수 있다.
이 때, 상기 하나의 몸체로 일체화된 모듈은 그 내부에 1, 2, 4 또는 8 쌍의 혼합 유로를 포함하고, 상기 복수 쌍의 혼합 유로 각각은 2개의 상기 제 1 혼합부, 2개의 상기 제 2 혼합부 및 2개의 상기 제 3 혼합부가 한 쌍으로 이루어지도록 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 하나 이상의 전술한 미세 유체 혼합용 구조체; 상기 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체 각각으로 상기 제 1 유체를 공급하기 위한 제 1 유체 공급기; 상기 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체 각각으로 상기 제 2 유체를 공급하기 위한 제 2 유체 공급기를 포함하는, 미세 유체 혼합 장치가 제공된다.
이 때, 상기 제 1 유체 공급기 및 상기 제 2 유체 공급기로부터 상기 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체로 공급되는 제 1 유체 및 제 2 유체를 분배하기 위한 유량 분배기를 더 포함할 수 있다.
상기의 구성에 따라, 본 발명에 따른 3D 반구형 배플 미세 유체 혼합용 구조체는 폭넓은 유속 조건하에서 3개의 반구형 배플 구조를 지날 때 이미 99 % 이상의 빠른 혼합 효율을 나태내고, 균일한 나노입자 (Size: ≤100 nm, PDI: ≤0.1) 제조가 가능하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 대량 생산용 미세 유체 혼합 장치는 최적화된 혼합용 구조체에 균등유량 분배 장치를 장착하여 설계하고 이를 3D인쇄기법으로 4개, 8개, 16개 배플 혼합기를 통합한 일체형과 외부 유량 분배기를 이용한 조립형, 두가지 방법을 통하여 제작될 수 있어, 이와 같이 제작된 유량 분배기 및 16개 혼합용 구조체가 장착된 조립형/일체형 대량생산용 미세 유체 혼합 장치는 저비용, 온-디맨드형 구조 변형성, 제작의 간편성, 재현성을 제공하고 임상적 및 산업적 생산성 요구를 해결하여 학술적 연구 및 산업적 응용의 격차를 좁힐 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체는 상대적으로 수 mL/min 의 낮은 유속에서도 빠른 혼합 특성을 나타내며, 0.1 아래의 PDI 값과 크기(50~100 nm) 범위에서 매우 균일한 지질, 리포솜 및 고분자 나노입자를 생성할 수 있다. 특히, SARS-CoV-2 스파이크 mRNA가 탑재된 지질 나노입자를 조사하여 Firefly luciferase (FLuc) mRNA를 각각 사용하여 시험관 내 및 생체 내에서 단백질 발현을 검증하여 상용 토로이달 믹서 시스템과 동등한 성능을 나타낼 수 있다. 또한, 3차원 확장 흐름의 힘을 활용한 나노 입자의 강력한 현장 분산은 물리적으로 들러붙음이나 응집의 발생을 최소화하고, 반나절 작업의 내부 막힘없이 일관된 생산 성능을 유지하며, 약물의 품질 관리를 용이하게 한다.
장기간 작동을 유지하면서 저유량 조건에서도 효율적인 혼합이 가능하려면 사용자 친화적인 미세유체 혼합기의 개발이 필요하다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명의 발명자는 매우 견고한 소용돌이를 생성하는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 채널 구조를 채택하여 초고속 혼합을 촉진하고 나노입자의 효과적인 분산을 달성하였다. 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 혼합 장치는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 확인된 바와 같이 제어 가능한 크기로 매우 균일한 나노입자를 생성하는 성능을 보여준다. 또한, 지속적인 작동 중에 막힘을 방지하는 능력과 실험실 규모의 최적화 및 병행 산업 생산의 잠재력이 결합되어 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 혼합 장치는 나노입자 기반 치료법, 진단 및 표적 약물 전달 발전에 중요한 영향을 미치는 다재다능하고 확장 가능한 도구로 자리매김할 수 있다.
전산유체역학(CFD) 시뮬레이션을 통해 설계된 최적화된 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 혼합 장치는 in vitro 및 in vivo에서 입자 특성과 단백질 발현 측면에서 사출 성형으로 제작된 상용 토로이달 믹서와 동등한 성능을 보여준다. 또한, 데드 볼륨(Dead Volume)을 최소화하고 강력한 소용돌이 효과를 이용해 제조된 나노입자를 분산시켜 토로이달 믹서 대비 60배 이상 막힘 현상을 방지하고 12시간 연속 작동에도 일관된 입자 특성을 유지한다. 배플 길이가 3.9mm에 불과한 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 혼합 장치는 저유량 조건을 활용하여 보다 효율적인 최적화를 가능하게 하고 장기간 작동 중에도 막힘을 방지하여 실험실 규모의 나노입자 최적화 및 산업 생산을 위한 병렬화된 스케일업 장치의 출발점 역할을 할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D프린터 기반 다양한 나노입자 (지질 나노입자, 리포좀, 고분자 나노입자) 생산용 단일 미세 유체 혼합용 구조체와 균등 유량분배기를 장착한 대량생산용 미세 유체 혼합 장치의 개념도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 측면도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 평면도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 설계 및 CFD 기반 최적화를 위한 실험 데이터로서, 도 5(a) 배플 구조의 변화로 인해 채널 내에 형성된 소용돌이 생성의 변화를 보여주는 개념적 회로도, 도 5(b) 미세 유체 혼합용 구조체의 완전한 회로도 및 세부 구성 요소 도 5(c) 미세 유체 혼합용 구조체와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 간의 흐름 강도 및 데드 볼륨 크기 비교 그래프. 도 5(d) 9 ml/min의 유속 조건에서 본 발명의 미세 유체 혼합용 구조체(DVM), 단일 와류 혼합기, 와류 미생성 혼합기의 혼합 효율을 도시한 그래프이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(이중 와류 혼합기)와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 구조에 따른 속도 프로파일, 난류 운동 에너지(TKE) 및 배플 마이크로 믹서의 데드 볼륨(각 배플의 부피 0.19 mm3, 배플 폭 200 μm, 에탄올 0.9 mL /min , 물 8.1 mL /min , 진한 파란색: 데드 볼륨)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 구조에 따른 에탄올 0.9 mL /min , 물 8.1 mL /min )의 혼합시간에 따른 혼합정도 비교 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 의 다양한 배플 치수에 대한, 5ms에서의 혼합 정도, 난류 운동 에너지 및 데드 볼륨의 계산값(에탄올 0.9 mL /min, 물 8.1 mL /min, 진한 파란색: 데드 볼륨)이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)에서 유량비 3일 때, 에탄올과 물의 유량에 따른 이중 와류 발생 도면이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)에서 유량비 6일 때, 에탄올과 물의 유량에 따른 이중 와류 발생 도면이다.
도 11는 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)에서 유량비 9일 때, 에탄올과 물의 유량에 따른 이중 와류 발생 도면이다.
도 12은 튜브 연결 없이 디지털 광처리(DLP) 3D 프린팅으로 제작한 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체 DVM(Dual Vortex Mixer)(왼쪽) 와 튜브에 연결된 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(오른쪽) 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체에 에탄올과 물을 12시간 동안 주입한 후 침출을 평가하기 위해 얻은 가스 크로마토그래피(GC) 분석 결과(에탄올 0.9 mL /min ; 물 8.1 mL /min )이다.
도 14은 다목적 나노입자 생산을 통한 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체 성능 검증 그래프이다. (a) PCL 나노입자, (b) PEG-PLGA 나노입자, (c) POPC 리포솜 및 (d) mRNA-LNP의 정규화된 크기 분포는 독립적인 분석(n=3) 으로부터 평균화되었음, 그래프에 표시된 비율은 전구체 용액의 유량 대 반용매의 유량에 해당(단위: mL /min )한다.
도 15은 (a) PCL, (b) PEG-PLGA 나노 입자, (c) POPC 리포솜 및 (d) 고농도의 Firefly luciferase (FLuc) mRNA 캡슐화 지질 나노 입자 (mRNA-LNP)의 숫자 Z-avg 크기 및 PDI 값. (e) (d)에서 FLuc mRNA의 캡슐화 효율. (f) 직경(d)과 다분산 지수(PDI)의 곱의 역수로 정의되는 성능 지수(Q) 값이다.
도 16는 서로 다른 혼합기를 사용하여 생성된 mRNA-LNP의 시험관 내 및 생체 내 단백질 발현 비교 사진이다. (a) 동일한 제제 조건을 가진 mRNA-LNP는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 상업용 토로이달 믹서를 사용하여 생산 후 직접 정제하거나 PBS를 사용하여 1:1 또는 1:2의 유속 비율로 인라인 희석을 실시하였음. SARS-CoV-2 스파이크 mRNA를 포함하는 mRNA-LNP는 시험관 내 적용에 활용되었으며, FLuc mRNA를 포함하는 mRNA-LNP는 생체 내 생체분포 연구에 사용되었음 (b) 동일한 농도로 희석된 SARS-CoV-2 스파이크 mRNA-LNP의 세포 처리 후 웨스턴 블롯 결과. (스파이크 단백질: 190 kDa, GADPH: 37 kDa). (c) 수컷 BALB/c 마우스에 FLuc mRNA-LNP를 정맥 주사한 후 특정 시점의 생물발광 이미징. (d) 수컷 BALB/c 마우스 그룹의 각 제제에 대한 총 발광 값의 정량화.
도 17은 3D 프린팅된 미세 유체 혼합용 구조체의 조립 유형의 개략도이다.
도 18은 장기간 사용 검증을 위한 TPE 나노입자의 연속 생산 그래프이다. (a) 서로 다른 미세 유체 혼합용 구조체에 의해 생성된 동일한 유속 조건을 갖는 초기 TPE 나노입자의 표준화된 크기 분포. (b) 미세 유체 혼합용 구조체 내부의 압력차에 대한 실시간 분석 및 (c) 나노입자의 평균 크기. (d) 분해된 구조체 내에서 동일한 자외선 조사 강도 하에서 막힌 TPE 나노입자의 형광 시각화. (e) 막힌 나노입자의 무게와 단일 구조의 부피 사이의 정량화된 비율.
도 19는 다양한 유속 비율(FRR = 3,6,9)에서 (a) 정규화된 크기 분포와 (b) DVM을 통한 TPE 나노입자의 PDI 값과 수치화된 Z-avg 크기. 미세 유체 혼합용 구조체(아세톤 0.9mL /min , DI 물 8.1mL /min)의 고정 유속 조건에서 (c) 정규화된 크기 분포 및 (d) 수치화된 Z-avg 크기 및 PDI 값이다.
도 20은 3D 프린팅된 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체와 토로이달 믹서의 나노입자 접촉각이다.
도 21은 3D 프린팅된 (a) 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체와 (b) 토로 이달 믹서를 이용한 TPE 나노입자의 연속 생산을 위한 실제 작업 이미지이다.
도 22는 (a) 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체(DVM), (b) SVM, (c) NVM 및 (d) Toroidal 믹서를 통해 생성된 TPE 나노입자의 실시간 관찰 수치 Z-avg 크기 및 PDI 값이다.
도 23은 UV-vis를 이용하여 정량화된 미세 유체 혼합용 구조체 내부에 막힌 나노입자의 무게이다.
도 24은 유량 분배기와 나노입자제조용 3D 미세 유체 혼합용 구조체의 병렬화에 의한 일체형 대량생산용 장치 개념도이다. (a),(b),(c) 균등 유량 분배기가 장착된 3D프린팅 일체형 미세유체 혼합용 구조체 (4/8/16N-DVM)의 개념도 및 제작된 장치의 사진. (d),(e) 로다민 B 염색용액과 메틸렌 블루 염색용액을 공급한다음, 각 출구에서 채취한 용액들의 UV 스펙트럼 (665 nm)분석, 총유속 36 mL/min. 마) 4N-DVM장치의 총 유속에 따른 분배편차 (MF; maldistribution factor) (에탄올 유속 : 물 유속 = 1 : 9)이다.
도 25은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 4개가 병렬로 일체로 형성된 구성도이다.
도 26는 외부 유량 분배기와 복수의 4N-DVM의 조립형 대량생산 혼합 장치 개념도. (a) 3조각-조립형 8N-DVM, (b) 5조각-조립형16N-DVM의 개념도이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 8개가 병렬로 일체로 형성된 구성도이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 16개가 병렬로 일체로 형성된 구성도이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 도면에서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 단어와 용어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 않고, 자신의 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 발명자가 용어와 개념을 정의할 수 있는 원칙에 따라 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
그러므로 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 해당하고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것이 아니므로 해당 구성은 본 발명의 출원시점에서 이를 대체할 다양한 균등물과 변형예가 있을 수 있다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 설명하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
어떤 구성 요소가 다른 구성 요소의 "전방", "후방", "상부" 또는 "하부"에 있다는 것은 특별한 사정이 없는 한 다른 구성 요소와 바로 접하여 "전방", "후방", "상부" 또는 "하부"에 배치되는 것뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 구성 요소가 배치되는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소와 "연결"되어 있다는 것은 특별한 사정이 없는 한 서로 직접 연결되는 것뿐만 아니라 간접적으로 서로 연결되는 경우도 포함한다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 혼합 장치를 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D프린터 기반 다양한 나노입자 (지질 나노입자, 폴리플렉스, 고분자 나노입자) 생산용 단일 미세 유체 혼합용 구조체와 균등 유량분배기를 장착한 대량생산용 미세 유체 혼합 장치의 개념도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 사시도이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 측면도이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 평면도이다.
도 1은 균일한 크기의 약물전달용 나노입자를 생산하기 위한 단일 및 대량생산용 미세유체 혼합용 구조체(10) 및 혼합 장치(100)의 개념도이다. 미세유체 혼합용 구조체(10)는 광경화수지를 이용한 3D 프린터로 제작될 수 있고, 반구 형태의 배플 구조가 내장되어 있다. 수백 마이크로 크기 (900μm) 크기의 반구형 배플 구조가 위 아래로 교차로 배치되어 낮은 압력과 빠른 형태의 회오리 흐름 혼합을 유도한다. 이러한 빠른 혼합은 다양한 나노입자를 균일하고 작게 제조하는데 용이하며 입자 제조의 재현성 또한 뛰어나다.
도 2 내지 도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체(10)는 제 1 혼합부(20), 제 2 혼합부(30) 및 제 3 혼합부(40)를 포함할 수 있다.
제 1 혼합부(20)는 제 1 유체 및 제 2 유체가 유입되는 유입구(23)를 구비하고 제 1 유체 및 상기 제 2 유체가 혼합되는 제 1 공간(21)을 구비한 제 1 몸체를 포함할 수 있다. 이 때, 예를 들어, 제 1 유체는 친용매일 수 있고, 제 2 유체는 반용매일 수 있다.
그리고, 제 2 혼합부(30)는 제 1 방향, 즉 도 2에서 x축 방향으로 볼 때 제 1 혼합부(20)의 후방측에 배치되어 제 1 혼합부(20)에서 혼합된 혼합 유체가 유동하는 제 2 공간(31)을 구비하는 제 2 몸체를 포함할 수 있다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서, 제 1 몸체와 제 2 몸체가 단일의 몸체(12)로 형성된다. 이 때, 다른 예로서, 제1 몸체 및 제 2 몸체는 별개의 구조체로 형성된 후 제 1공간 및 제 2 공간이 유체 소통 가능하게 결합될 수도 있다.
이 때, 제 1 혼합부(20)의 제 1 공간(21) 및 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31)은 제 1 방향으로 연장된 가상의 중심선(도 3의 C)을 기준으로 서로 반대편에 배치되고, 제 1 혼합부(20)의 유출구(25)로부터 제 2 혼합부(30)의 유입구(33)로 유입되는 혼합 유체의 흐름 방향은 제 1 방향에 엇갈리는 방향, 예를 들어 수직한 방향이며, 제 1 혼합부(20) 및 상기 제 2 혼합부(30)는 상기 제 1 방향으로 볼 때 폭방향 중심을 기준으로 좌우 대칭인 곡면을 포함할 수 있다.
또한, 제 3 혼합부(40)는 제 1 방향으로 볼 때, 제 2 혼합부(30)의 후방측에 배치되어 제 2 혼합부(30)를 지난 혼합 유체가 유동하는 제 3 공간(41)을 구비하는 제 3 몸체를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 제 1 몸체 내지 제 3 몸체는 단일의 몸체(12)로 형성된다.
이 때, 제 3 혼합부(40)의 제 3 공간(41)은 제 1 방향으로 연장된 가상의 선을 기준으로 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31)의 반대편에 배치될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 혼합부(20)의 제 1 공간(21) 및 상기 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31)은 제 1 방향으로 볼 때 타원형 및 반원형 단면 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 실시예에서, 제 1 혼합부(20)의 제 1 공간(21) 및 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31) 및 제 3 혼합부(40)의 제 3 공간(41)은 반구형으로 형성될 수 있다.
본 실시예에서, 제 2 혼합부(30)는 상하 방향으로 제 1 혼합부(20) 및 제 3 혼합부(40)보다 상측에 위치되고, 제 1 혼합부(20)의 유입구(23)는 상측 방향을 향하도록 배치된다.
이 때, 제 1 혼합부(20)의 제 1 공간(21)의 유출구(25) 및 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31)의 유입구(33) 및 유출구(35), 그리고 제 3 공간(41)의 유입구(43)는 유입구 및 유출구의 면적이 동일하게 형성된다.
또한, 제 1 방향으로 볼 때 제 1 혼합부(20)의 제 1 공간(21) 및 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31) 및 제 3 혼합부(40)의 제 3 공간(41)의 중앙부의 단면적은 제 1 공간(21), 제 2 공간(31) 및 제 3 공간(41)의 각각의 유입구(23, 33, 43) 및 유출구(25, 35, 45)의 면적보다 크도록 형성된다.
도 2 내지 도 4를 참조하면, 제 1 방향으로 볼 때 제 1 혼합부(20)의 제 1 공간(21)의 유출구(25) 및 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31)의 유입구(33), 제 2 혼합부(30)의 제 2 공간(31)의 유출구(35)과 제 3 혼합부(40)의 제 3 공간(41)의 유입구(43)는 동일한 지름의 한 쌍의 원호가 서로 마주보며 맞접한 폐곡선 형상으로 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서, 미세 유체 혼합용 구조체(10)는, 제 1 유체 유입관(52) 및 제 2 유체 유입관(54)을 구비한다. 제 1 유체 유입관(52)은 제 1 혼합부(20)의 유입구로 제 1 유체가 유입되도록 제 1 유체가 지나도록 형성되고, 제 2 유체 유입관(54)은 제 1 혼합부(20)의 유입구로 제 2 유체가 유입되도록 제 2 유체가 지나도록 형성된다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 유체 유입관(52) 및 제 2 유체 유입관(54)은 직교하도록 배치되고, 제 1 유체 유입관(52) 및 제 2 유체 유입관(54) 중 어느 하나는 상기 제 1 방향으로 연장되도록 배치된다. 본 실시예에서는 제 1 유체 유입관(52)이 제 1 방향, 즉 x축 방향으로 연장된다.
또한, 제 3 혼합부(40)의 제 3 공간(41)은 상측 방향으로 배향된 유출구(45)를 구비하며, 제 3 공간(41)의 유출구(45)에는 제 1 방향으로 연장된 혼합 유체 배출관(56)이 연결된다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 몸체, 제 2 몸체 및 제 3 몸체는 하나의 몸체(12)로 일체화된 모듈로 형성될 수 있다. 본 실시예에서 하나의 일체화된 모듈 형태의 몸체(12)는 3D 프린터에 의하여 형성될 수 있다. 다만, 제 1 내지 제 3 몸체는 별개의 몸체로 구성된 후 결합될 수도 있다.
본 발명의 발명자는 초고속 혼합 성능을 장기간 유지할 수 있는 새로운 마이크로 혼합용 구조체 개발에 있어 세 가지 측면에 중점을 두었다. 첫째, 채널 내의 내부 배플 구조는 2차 흐름을 형성하여 일관된 흐름 조건에서 혼합 효율을 향상시킨다. 둘째, 사각 채널에 비해 데드 볼륨이 낮은 원형 채널을 사용하면 혼합 효율이 향상되고 연속 작동이 용이하다. 마지막으로 반응기 내부에서 발생하는 와류는 혼합 효율을 더욱 향상시키고 나노입자의 분산에 유익한 영향을 미쳐 접착 및 응집을 방지한다.
본 발명의 발명자는 원형 채널을 사용하되, 그 안에 더 많은 수의 2차 흐름을 생성함으로써 더 활발한 와류를 생성하여 혼합 효율을 극대화하고 장기간 작동을 가능하게 할 수 있다는 가설을 세웠다. 형성된 2차 흐름의 양은 축을 따른 1차 흐름에 따라 부수 흐름 방향의 유속과 강도를 조정하여 조절할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체의 설계 및 CFD 기반 최적화를 위한 실험 데이터로서, 도 5(a) 배플 구조의 변화로 인해 채널 내에 형성된 소용돌이 생성의 변화를 보여주는 개념적 회로도, 도 5(b) 미세 유체 혼합용 구조체의 완전한 회로도 및 세부 구성 요소, 도 5(c) 미세 유체 혼합용 구조체와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 간의 흐름 강도 및 데드 볼륨 크기 비교 그래프, 도 5(d) 9 ml/min의 유속 조건에서 본 발명의 미세 유체 혼합용 구조체(DVM), 단일 와류 혼합기, 와류 미생성 혼합기의 혼합 효율을 도시한 그래프이다.
도 5(a) 내지 도 5(d)를 참조하면, 추가 흐름 방향을 도입할 수 있는 일관된 채널 높이를 갖는 2D 배플의 경우 단일 소용돌이의 형성은 흐름 강도의 미묘한 변화에 따라 결정될 수 있다. 반원통형 배플은 유체 흐름 방향의 명확한 변화를 유도하지 않았으므로 소용돌이 형성을 억제한다. 대조적으로, 입방체 배플은 각진 구조로 인해 지배적인 흐름 축에 수직인 추가 흐름을 유도하여 단일 소용돌이를 생성한다. 그러나 3D 반구형 배플 구조를 도입했을 때 좁은 채널을 통한 응집성 흐름의 후속 배출에는 지배적인 흐름 방향에 대해 대각선 측면에 대칭이지만 뚜렷한 미세 곡률 반경을 가진 횡단 경로 형상이 필요하다. 결과적으로, 각 유동 요소는 축방향 축을 따라 다양한 강도로 딘 와류(dean vortices)를 생성한다. 구성 요소의 통합은 구조물의 반대 형상 내에서 원심력으로 인해 벽 경계를 따라 빠른 흐름을 경험하면서 역압 구배에 의해 추진된다. 결과 분포는 눈에 보이는 2차 흐름으로 나타나며, 1차 흐름에 대해 대각선 방향의 이중 대칭 재순환 와류를 특징으로 한다.
3D 반구형 시스템의 모델링 및 CFD 연구
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(이중 와류 혼합기:DVM)와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 구조에 따른 속도 프로파일, 난류 운동 에너지(TKE) 및 배플 마이크로 믹서의 데드 볼륨(각 배플의 부피 0.19 mm3 , 배플 폭 200 μm, 에탄올 0.9 mL /min , 물 8.1 mL /min , 진한 파란색: 데드 볼륨)을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 구조에 따른 에탄올 0.9 mL /min , 물 8.1 mL /min )의 혼합시간에 따른 혼합정도 비교 그래프이다.
도 6 및 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 전산유체역학(CFD) 시뮬레이션을 기반으로 다양한 구조의 포괄적인 수치 비교를 수행하기 위해 각각 주입 영역과 출구를 포함하는 상위 3개의 가상 채널 모델을 모두 동일한 부피와 구조 폭으로 설계했다. 이러한 모델은 반원통형 배플이 있는 비와류 믹서(NVM), 입방체 배플이 있는 단일 와류 믹서(SVM), 반구형 배플이 있는 이중 와류 믹서(DVM)로 구성된다. 지질 나노입자 합성 시뮬레이션을 위해 에탄올과 물이 선택되었다. 본 발명의 발명자는 와류 강도, 배플 내 데드 볼륨의 형성 및 시간 경과에 따른 혼합 효율을 나타내는 난류 운동 에너지(TKE)를 기반으로 이러한 마이크로 혼합기를 평가했습니다. 강화된 2차 유동으로 인해 DVM은 SVM 및 NVM 난류 운동 에너지를 능가했으며 데드 볼륨의 최소화로 최고의 혼합 성능을 나타내었다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)와 동일한 사양을 갖는 단일 와류 혼합기(SVM) 및 와류 비생성 혼합기(NVM) 의 다양한 배플 치수에 대한, 5ms에서의 혼합 정도, 난류 운동 에너지 및 데드 볼륨의 계산값이다.(에탄올 0.9 mL /min, 물 8.1 mL /min, 진한 파란색: 데드 볼륨)
도 8을 참조하면, 이중 와류 혼합기의 추가 최적화에는 동일한 유속에서 다양한 배플 치수를 사용하여 TKE, 데드 볼륨 및 혼합 정도를 평가하는 작업이 포함되었다. 본 발명의 발명자는 배플 폭을 줄이면 급속한 감소 및 팽창 효과로 인해 혼합이 향상된다는 것을 발견하였다. 구조적 직경은 배플 자체의 효과뿐만 아니라 내부 용적의 조정에도 영향을 미친다. 직경이 증가함에 따라 동일한 흐름 조건에서 단일 배플 구조의 체류 시간이 극적으로 증가한다. 이는 동일한 체류 시간 내에 채널을 통과하는 배플 구조의 수의 감소로 이어지며, 배플 사이의 근본적인 영향을 평가하기 어렵게 만든다. 반면, 상대적으로 직경이 작은 영역에서는 통과하는 배플 구조의 수가 증가하지만, 한 배플에서 다음 배플로 전환하는 동안 상대 증폭 효과가 감소한다. 추가적으로, 구조 내에서 딘 와류의 기울기가 감소하여 2차 흐름에 대한 와류의 강도가 감소한다. 그 결과, 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 전체 믹서 부피에 대한 체류 시간과 각 구조의 효과의 조합을 최대화하는 직경 900μm가 최종적으로 선택되었다. 바람직하게, 배플 사이 간격은 50~300μm , 배플 지름은 600 ~ 1200 μm 일 수 있으며, 배플 사이 간격 : 배플 지름의 비는 2 ~ 24 정도 일 수 있다.
도 9 내지 11는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(DVM:이중 와류 혼합기)에서 유량비 3, 6, 및 9일 때, 에탄올과 물의 유량에 따른 이중 와류 발생 도면이다.
도 9 내지 11를 참조하면, 최적화된 DVM은 78.9m2 s-2의 TKE를 달성하여 SVM을 3.5배 이상 초과하고 NVM을 38배 이상 크게 초과했으며, 데드 볼륨도 8.09 x 10-3mm3이다. 이는 다른 모델보다 두 배 이상 작았다(도 5의 (d) 참조). 대칭적인 이중 와류를 형성하는 유속은 서로 다른 유속비(FRR = 3, 6, 9)로 설정되었다. 도 9 내지 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, FRR 3에서 에탄올 흐름 ≥0.9 ml/min은 더 높은 FRR에서 강화되고 실제 나노입자 생산에 사용되는 뚜렷한 이중 소용돌이를 나타내었다. 바람직하게 유량비는 1:1 내지 1: 9 범위 내 일수 있다. 이 때, 유속은 제 1 유체의 경우 0.9 mL/min 이상, 제 2 유체는 2.7 mL/min 이상일 수 있다.
도 12은 튜브 연결 없이 디지털 광처리(DLP) 3D 프린팅으로 제작한 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체, 즉 DVM(Dual Vortex Mixer)(왼쪽) 와 튜브에 연결된 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체(오른쪽) 사진이다. 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체에 에탄올과 물을 12시간 동안 주입한 후 침출을 평가하기 위해 얻은 가스 크로마토그래피(GC) 분석 결과이다.(에탄올 0.9 mL /min ; 물 8.1 mL /min )
도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 최종 선정된 DVM은 3D 프린팅 레진을 이용하여 제작될 수 있다. 이와 같이 제작된 DVM은, 도 16을 참조하여 알 수 있는 바와 같이, 12시간 동안 연속적인 알코올 기반 용매 주입을 통해 화학적 안정성이 더욱 검증되었고, GC 분석을 통해 확인되었다.
3D 반구형 구조체 제작
3D 프린팅은 3차원 구조를 쉽게 제작할 수 있을 뿐만 아니라 경화 후 나노입자 제조에 사용되는 유기 용매에서 높은 화학적 안정성을 달성하기 위해 수지를 선택적으로 활용할 수 있다. 다양한 인쇄 방법 중에서 디지털 광처리(DLP) 인쇄는 고해상도를 달성하는 것으로 널리 알려져 있으며 크기가 1mm 미만인 미세유체 채널을 제작하는 데 광범위하게 활용된다. 본 발명의 발명자는 지질 기반 나노입자 생산에 일반적으로 사용되는 에탄올과 함께 사용할 때 장기간 작동을 위해 높은 안정성을 제공하고 고압 조건에서 장치 변형을 방지하는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 기반 수지를 선택하였다. 도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 선택된 수지를 사용하여 반구형 배플 구조와 입구 사이의 10mm 유체 안정화 섹션과 피팅을 위한 5mm 입구 및 출구 섹션을 포함하여 DVM 장치의 전체 구조(장치당 45분)를 신속하게 제작하였다. 이는 DLP 인쇄를 통해 매우 정확한 치수로 제작될 수 있다.
또한, 이 수지를 이용하여 제작한 DVM 장치는, 도 13을 참조하면, 지질 기반 나노입자 생성에 사용되는 가스 크로마토그래피(GC)를 이용하여 12시간의 장기간 에탄올 주입 후에도 침출이 없음이 확인되었다.
따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 혼합 장치는 나노입자 특성의 최적화 과정에서 간단한 샘플 준비와 최적화된 입자의 장기간 연속 생산에 필요한 기계적 및 화학적 특성을 보유하고 있음을 확인할 수 있다.
약물전달용 나노입자 생산
도 14은 다목적 나노입자 생산을 통한 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 반구형 미세 유체 혼합용 구조체 성능 검증 그래프이다. (a) PCL 나노입자, (b) PEG-PLGA 나노입자, (c) POPC 리포솜 및 (d) mRNA-LNP의 정규화된 크기 분포는 독립적인 분석(n=3) 으로부터 평균화되었음, 그래프에 표시된 비율은 전구체 용액의 유량 대 반용매의 유량에 해당한다.(단위: mL /min )
도 15은 (a) PCL, (b) PEG-PLGA 나노 입자, (c) POPC 리포솜 및 (d) 고농도의 Firefly luciferase (FLuc) mRNA 캡슐화 지질 나노 입자 (mRNA-LNP)의 숫자 Z-avg 크기 및 PDI 값이고, (e) (d)에서 FLuc mRNA의 캡슐화 효율이고, (f) 직경(d)과 다분산 지수(PDI)의 곱의 역수로 정의되는 성능 지수(Q) 값이다.
DVM은 높은 균일성과 제어 가능한 크기를 갖춘 지질 및 폴리머 기반 약물 전달 나노입자를 생산하기 위한 다목적 플랫폼이다. 이 플랫폼의 기능을 입증하기 위해, 도 14을 참조하면, 본 발명의 발명자는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PEG-PLGA) 나노입자, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-를 선택했다. 3-포스포콜린(POPC) 리포솜과 mRNA 캡슐화 지질 나노입자(mRNA-LNP)가 FDA 승인 대표 물질이다. 고함량 폴리머를 전체적으로 제어하기에는 효율성이 부족하여 낮은 유속 범위에서 확산 혼합을 수행하면 마이크론 크기의 큰 응집체가 생성될 수 있다. 광범위한 농도 조건 제어를 입증하기 위해 PCL은 일반적인 미세유체 접근법을 사용하여 1 mg /ml의 농도로 설정되었으며, PEG-PLGA는 관리할 수 없는 50 mg /ml의 고농도에서 나노입자를 합성하도록 설정되었다. 동적 광산란(DLS) 분석을 사용하여 빠른 혼합을 통해 직경이 50 nm ~ 100 nm이고 다분산 지수(PDI)가 최대 0.10 이하인 재현성이 높은 나노입자를 생성했다.(도 14의 (a), (b) 참조)
이러한 나노입자는 안정적이고 생리학적으로 중요한 나노입자의 최적 범위에 속하며 일반적으로 국제 나노입자 사양에 매우 적합하다. 특히, 서브밀리미터 직경의 비교적 대용량 DVM은 채널 내에서 초고속 혼합을 가능하게 하며, 이는 미세유체 혼합기 내에서 고농도의 전구체를 체계적으로 제어할 수 있음을 나타낸다.
DVM 장치의 성능은 특히 뛰어난 성능 지수(Q) 값을 고려할 때 다른 미세 유체 장치의 성능을 능가한다. 리포솜 직경(d)과 다분산도의 곱의 역수를 나타내는 Q 값, 즉 Q = d-1 PDI-1은 DVM을 통해 생성된 각 나노입자에 대해 지속적으로 0.15를 초과한다. 특히, POPC 리포솜의 경우, 0.22에서 0.45 범위의 예외적으로 높은 Q 값이 계산되었다(도 14 (c) 및 도 15 (c) 및 (f) 참조). 이 값은 이전에 보고된 0.4를 초과하며, 이는 나노입자 크기와 균일성 측면에서 DVM의 뛰어난 성능과 우수성을 나타낸다. 나노입자 제조에 자주 사용되는 낮은 FRR을 활용함으로써 본 발명의 일 실시예에 따른 DVM 플랫폼은 임상 사용을 위한 리포솜 용액의 농축 과정을 줄이고 정제 단계 동안 리포솜에서 약물 방출을 감소시킬 수 있다. 보고된 마이크로 믹서에 비해 DVM의 내부 부피가 상대적으로 크기 때문에 약물과 담체 사이의 상호 작용이 잠재적으로 불충분할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이 문제를 해결하기 위해 본 발명의 발명자는 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(FLuc-mRNA)를 캡슐화하는 LNP의 능력을 활용하고 DVM에서 생성된 나노입자가 많은 양의 핵산을 운반할 수 있음을 입증하였다. FLuc-mRNA의 93% 이상이 각 샘플에서 성공적으로 캡슐화되었으며, 이는 미세유체 믹서가 대용량으로 만들어졌음에도 불구하고 이온화된 지질과 mRNA 사이에 충분한 정전기적 인력이 생성되었음을 나타낸다.(도 14의 (d), 도 15의 (d) 및 (e) 참조)
시험관 내/생체 내에서 mRNA-LNP의 단백질 발현
도 16는 서로 다른 혼합기를 사용하여 생성된 mRNA-LNP의 시험관 내 및 생체 내 단백질 발현 비교 사진이다. (a) 동일한 제제 조건을 가진 mRNA-LNP는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 및 상업용 토로이달 믹서를 사용하여 생산 후 직접 정제하거나 PBS를 사용하여 1:1 또는 1:2의 유속 비율로 인라인 희석을 실시하였다. SARS-CoV-2 스파이크 mRNA를 포함하는 mRNA-LNP는 시험관 내 적용에 활용되었으며, FLuc mRNA를 포함하는 mRNA-LNP는 생체 내 생체분포 연구에 사용되었다. (b) 동일한 농도로 희석된 SARS-CoV-2 스파이크 mRNA-LNP의 세포 처리 후 웨스턴 블롯 결과이다. (스파이크 단백질: 190 kDa, GADPH: 37 kDa). (c) 수컷 BALB/c 마우스에 FLuc mRNA-LNP를 정맥 주사한 후 특정 시점의 생물발광 이미징이다. (d) 수컷 BALB/c 마우스 그룹의 각 제제에 대한 총 발광 값의 정량화이다.
DVM을 사용하여 제조된 mRNA-LNP의 우수한 특성은 이미 입증되었다. 그러나 DVM의 우수성을 강조하기 위해서는 DVM에서 생산된 mRNA-LNP가 상용화된 믹서를 통해 동일한 제제보다 분산성과 같은 단순한 특성뿐만 아니라 in vitro 또는 in vivo에서 정량적인 단백질 발현을 나타내는지 확인하기 위한 추가적인 검증이 필요하다. 도 16를 참조하면, 이러한 검증을 위한 비교군으로 매우 높은 특성을 갖는 mRNA-LNP를 생성할 수 있어 상업적으로 널리 사용되는 토로이달 믹서를 선택하였다. mRNA-LNP 제제의 정확하고 다양한 평가를 수행하기 위해 본 발명의 발명자는 시험관 내 연구에는 SARS-CoV-Spike-mRNA를, 생체 내 생체 분포 평가에는 FLuc-mRNA를 선택했다.(도 16의 (a) 참조)
토로이달 믹서는 DVM에 비해 구조당 훨씬 작은 내부 부피가 약 23.7배 더 작다. (토로이달 믹서 내부 구조당 부피는 특허에 공개된 예를 기반으로 계산되었다.) 그러나 정확한 성능 비교 분석을 수행하기 위해 PBS의 인라인 희석을 포함하여 동일한 제조 조건 하에서 DVM과 토로이달 믹서 모두에서 일반적으로 유량비(지질 용액 3 mL /min; mRNA 용액 9 mL/min)를 사용하여 세 가지 다른 제형을 수행했다. 또한, 제제화 후 농도 조정과 함께 정제를 위한 정용 여과를 실시하였다. 정제된 LNP 샘플의 특성은 시험관 내 및 생체 내에서 단백질 발현 후에 비교되었다.
나노입자 균질성의 중요성은 웨스턴 블롯 결과에서 분명해졌다. 토로이달 믹서를 사용하여 제조된 동일한 제형 각각은 유사한 물리적, 화학적 특성을 나타냈으며, DVM을 사용하여 생성된 최적화된 제형은 Q 값이 0.39로 토로이달 믹서로 생성된 최적 제형보다 약 2.4배 높은 것으로 나타났다. (표 1 참조)
표 1. 동일한 제제 조건 하에서 정제된 mRNA-LNP 특성에서 DVM과 상업용 토로이달 믹서의 비교. "인라인 희석" 섹션에 표시된 비율은 전체 LNP 용액과 PBS(pH 7.4)의 유속 비율을 나타냄
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유사한 물리화학적 특성을 갖는 제제의 경우 유사한 단백질 발현 결과가 얻어졌다. 이와 대조적으로, 유사한 크기와 캡슐화 효율에도 불구하고, 다분산 지수(PDI)에서 2배 이상의 차이를 보인 DVM을 사용한 최적화된 공정은 정량 후 약 1.8배 더 높은 단백질 발현을 보여주었다.(도 16의 (b))
서로 다른 마이크로 믹서를 거친 mRNA-LNP 제제의 생체 내 mRNA 전달 효과에 대한 비교 연구를 위해 제제화 중 mRNA 구성 요소만 변경하면서 동일한 제조 조건을 유지했다. 유사하게, 생체내 적용을 위해 DVM과 토로이달 믹서를 사용하여 제조된 제제 사이에 특성에 있어서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 근육 내(IM) 주사 후 시간 경과에 따른 발광 강도를 비교할 때 동일한 제조 공정을 사용하는 그룹 간에 비슷한 성능을 보여 유사한 결과를 나타낸다. 6시간 후에 모든 그룹에서 유사한 강도의 발광이 가장 높은 수준으로 관찰되었다. 이러한 발광 단계는 72시간 동안 지속되었으며 궁극적으로 144시간 후에 완전한 제거를 나타냈다.(도 16의 (c) 및 (d)).
시간 경과에 따른 생물발광의 결과는 DVM과 토로이달 믹서에 의해 생성된 LNP 사이의 mRNA 전달에 있어 유사한 생물학적 반응과 일관성을 나타낸다. 본질적으로, 본 발명의 발명자의 연구 결과에 따르면 더 큰 용량에도 불구하고 DVM 플랫폼이 강력한 시스템 제어를 통해 정밀한 처리 기능을 보여 시중에서 판매되는 토로이달 믹서에서 달성한 것과 유사한 mRNA-LNP 특성을 나타냄을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 발명자의 결과는 시험관 내 및 생체 내 설정 모두에서 유사한 수준의 mRNA 전달 효율을 나타낸다.
DVM의 지속적인 작동
도 17은 3D 프린팅된 미세 유체 혼합용 구조체의 조립 유형의 개략도이다.
DDS 산업에서는 일관성을 유지하는 나노입자 특성이 연속 제조에 매우 중요하다. 반응기의 성능에 영향을 미치는 주요 요인은 운전 중 믹서 내부에 생성되는 응집체인데, 이는 막힘을 유발하는 출발이다. 본 발명의 발명자는 DVM 연속성의 성능을 설명하기 위해 장치 내부를 볼 수 있도록 도 20에 도시된 바와 같이, 이전에 비교한 SVM 및 NVM 장치를 어셈블리 유형의 DVM으로 구성하였다.
도 18은 장기간 사용 검증을 위한 TPE 나노입자의 연속 생산 그래프이다. (a) 서로 다른 미세 유체 혼합용 구조체에 의해 생성된 동일한 유속 조건을 갖는 초기 TPE 나노입자의 표준화된 크기 분포. (b) 미세 유체 혼합용 구조체 내부의 압력차에 대한 실시간 분석 및 (c) 나노입자의 평균 크기. (d) 분해된 구조체 내에서 동일한 자외선 조사 강도 하에서 막힌 TPE 나노입자의 형광 시각화. (e) 막힌 골재의 무게와 단일 구조의 부피 사이의 정량화된 비율이다.
도 19는 다양한 유속 비율(FRR = 3,6,9)에서 (a) 정규화된 크기 분포와 (b) DVM을 통한 TPE 나노입자의 PDI 값과 수치화된 Z-avg 크기. 미세 유체 혼합용 구조체(아세톤 0.9mL /min , DI 물 8.1mL /min)의 고정 유속 조건에서 (c) 정규화된 크기 분포 및 (d) 수치화된 Z-avg 크기 및 PDI 값이다.
도 18 및 도 19를 참조하면, 연속 나노입자 제조 중 막힘 현상을 확인하기 위해 상업용 반응기, 투명 토로이달 믹서 및 총 4개의 반응기를 다시 비교했다. 일반적인 시각화 이미지의 경우 용액 상태에서 강력한 발광성을 갖기 때문에 FITC 기반 형광 분자가 선택된다. 반면 기존 FITC는 용액 내 분자 상태에서 형광을 방출하므로 장기간의 이미징 및 추적에는 효과적이지 않다. 응집 유도 방출(AIE) 분자 중 하나인 테트라페닐에틸렌(TPE) 분자는 채널 내부에 붙잡혀 남아 있는 나노입자를 직접 볼 수 있고 오랜 시간에도 광발광을 잃지 않기 때문에 막힘 테스트의 시각화 및 정량화로 선택되었다. DVM은 FRR을 9로 증가시켰을 때 최소 크기가 77 nm인 매우 균일한 TPE 나노입자를 생성했고, 그 다음으로는 토로이달 믹서에서 80 nm, 느린 혼합 SVM에서 92 nm, NVM에서 95 nm가 생성되었다.(도 18의 (a), 도 19 참조)
도 20은 3D 프린팅된 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체와 토로이달 믹서의 나노입자 접촉각이다.
도 20을 참조하면, TPE 나노입자와 콜로이드 용액의 습윤 거동과 혼합기의 재질이 다를 수 있으므로, 동등한 상호작용을 확인하기 위해 토로이달 반응기와 DVM 표면에서 TPE 나노입자의 접촉각을 측정했다.
도 21은 3D 프린팅된 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체와 b 토로 이달 믹서를 이용한 TPE 나노입자의 연속 생산을 위한 실제 작업 이미지이다.
도 21를 참조하면, 상부 실험 조건을 기반으로 마이크로 믹서 내부의 압력 변화를 모니터링하기 위해 실시간 압력 측정 기능을 갖춘 두 개의 HPLC 펌프를 사용하여 용액을 주입했다.
도 22는 (a) 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체(DVM), (b) SVM, (c) NVM 및 (d) Toroidal 믹서를 통해 생성된 TPE 나노입자의 실시간 관찰 수치 Z-avg 크기 및 PDI 값이다.
도 23은 UV-vis를 이용하여 정량화된 미세 유체 혼합용 구조체 내부에 막힌 나노입자의 무게이다.
도 22를 참조하면, 나노입자 특성의 변화를 실시간으로 확인하기 위해 지속적인 DLS 분석도 수행했다. 모든 믹서에서 약 1시간에 걸쳐 일정한 물리적 특성을 지닌 TPE 나노입자가 생성되었다. 그러나 SVM과 NVM 및 토로이달 믹서의 압력 차이가 250psi 이상으로 급증하여 입자 특성이 극적으로 변화하는 것으로 나타났다. (도 18의 (b)에서 (c), 도 25)
이러한 높은 압력으로 인해 조립식 SVM과 NVM 반응기에서는 각각 166분과 120분에 누출이 발생하기 시작했다. 그러나 DVM의 압력차는 15psi(460분 후)까지 제한되었으며, 총 12시간 동안 연속적인 펌프 작동에도 불구하고 믹서 내부의 압력은 다시 초기 수준에 가깝게 낮게 유지되었다. 또한, 12시간 동안 지속적으로 작동한 후 PDI는 입자 크기가 최대 5nm까지 변화하는 동안 지속적으로 0.1 미만의 값을 표시했다. DVM에 대한 상대적인 막힘을 시각화하고 측정하기 위해 나머지 반응기의 최대 가동 시간인 166분에 새로운 반응기를 활용하여 DVM을 다시 한 번 활성화했다.
연속 작동 후(SVM 및 NVM에서 누출될 때까지, DVM 166분 및 12시간) 막힌 응집체에 아무런 영향을 주지 않고 남은 용액을 제거하기 위해 느린 유속으로 1분 동안 흐르는 탈이온수로 마이크로 믹서를 재분해했다. 마이크로 믹서의 막힘 정도를 현미경을 이용하여 확인하였다(도 18의 (d)).
정확한 시각화를 위해 동일한 강도의 UV 조사 하에서 배플 내부의 나노입자의 형광이 관찰되었다. SVM, NVM 및 토로이달 혼합기의 경우 훨씬 더 큰 발광 강도가 나타났으며, 특히 반응기 내부의 장애물로 인해 압력이 증가한 경우에 더욱 그렇다. 반면, 166분 동안 작동한 DVM에서는 초기 상태라고 할 만큼 막힘이 거의 발생하지 않았다. 12시간 동안 실행된 DVM은 입구 및 출구 부분과 같은 각진 부분을 제외하고는 배플 내부 반응기 벽에 나노입자를 코팅하는 것과 유사했다. 혼합기 내부에 남은 나노입자 집합체를 용해시키기 위해 아세톤을 사용하였고, 각각의 양은 330nm에서 UV-vis로 측정하였다. 단일 구조의 부피를 고려하면, 유사하게 작동되는 DVM은 다른 유형의 배플에 비해 막힘 감소율이 10배 이상 낮고, 토로이달 믹서에 비해 막힘 비율이 약 62배 더 적은 것으로 나타났다.(도 18의 (e) 및 도 23 참조).
이는 3D 프린팅으로 가능해진 상대적으로 큰 반응기 부피가 토로이달 믹서와 비교할 때 응집되는 나노입자의 부피를 낮출 수 있음을 보여준다. 또한 위에 표시된 시뮬레이션 결과를 바탕으로 강력한 와류 강도로 인해 응집체가 형성되는 것을 방지한다. 전반적으로 이는 DVM이 선택적 규모로 나노입자를 지속적으로 생산할 수 있음을 검증한다.
대량 생산을 위한 미세 유체 혼합 장치 설명
도 24은 유량 분배기와 나노입자제조용 3D 미세 유체 혼합용 구조체의 병렬화에 의한 일체형 대량생산용 장치 개념도이다. (a), (b),(c) 균등 유량 분배기가 장착된 3D프린팅 일체형 미세유체 혼합용 구조체 (4/8/16N-DVM)의 개념도 및 제작된 장치의 사진. (d),(e) 로다민 B 염색용액과 메틸렌 블루 염색용액을 공급한 다음, 각 출구에서 채취한 용액들의 UV 스펙트럼 (665 nm)분석, 총유속 36 mL/min. 마) 4N-DVM장치의 총 유속에 따른 분배편차 (MF; maldistribution factor) (에탄올 유속 : 물 유속 = 1 : 9).
도 25은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 4개가 병렬로 일체로 형성된 구성도이다.
도 26는 외부 유량 분배기와 복수의 4N-DVM의 조립형 대량생산 혼합 장치 개념도. (a) 3조각-조립형 8N-DVM, (b) 5조각-조립형16N-DVM의 개념도이다.
최근, 지질 나노입자 및 고분자 나노입자의 치료 능력이 입증됨에 따라 나노입자의 의학적 대량생산이 요구되고 있다. 이에 따라 본 발명의 발명자는 최적화된 나노입자 제조용3D 배플 단일 구조체를 도 24 및 25에 도시된 바와 같이, 병렬로 일체형으로 배열하고, 이 장치에 반용매와 친용매를 균등 공급하는 유량 분배기를 일체화하여 나노입자 대량 생산용 혼합 장치를 설계하였다. 3D프린터로 제작된 일체형 유량 분배 장치는 혼합기에 직접 연결이 되어 유량분배 편차를 줄이는데 큰 장점이 있다. 유량 분배장치는 각 분기형 관 내에 유속이 안정화와 관성에 의하여 유체가 한쪽으로 향하는 불균등 현상을 방지하기 위하여 길이는 0.05 · Re · D (Re: 레이놀즈 수, D: 수력학적 직경) (ACS Sustainable. Chem. Eng, 2018, 6, 422-429), 폭은 각 분기마다 1/√2 이 되도록 (ACS Central Science, 8, 1, 43-50, 2022) 제작되었다 (도 27 (a),(b),(C). 최종적으로 제작된 일체형 대량생산용 반응기들의 세부 치수는 표2, 3과 같이 계산되었다
표 2. 대량생산용 일체형 4/8/16N-DVM의 반용매 채널에 대한 각 구간별 세부 치수 (단위 mm)
Figure PCTKR2023014811-appb-img-000002
표 3. 대량생산용 일체형 4/8/16N-DVM의 친용매 채널에 대한 각 구간별 세부 치수 (단위 mm)
Figure PCTKR2023014811-appb-img-000003
먼저, 위 조건을 적용하여 단일 장치가 4개 병렬화된 대량생산용 일체형 혼합 장치를 제작하여 지질 나노입자 제조에 최적화된 유속과 총 유속에 따른 각 혼합기당 분배편차 인자(MF) 값을 계산하였다. 두 용액의 각 출구별 분배에 대한 정확한 정량화를 위하여, 에탄올에 로다민 B (rhodamine B) 염색약을, 물에 메틸렌 블루 (methylene Blue) 염색약을 섞어, 각 출구에서 나온 용액들의 665 nm 에서의 파장 흡수 세기를 각각 UV-vis를 이용하여 측정한 뒤 MF 값을 측정하였다. 지질 나노입자 제조에 최적화된 유속 9 mL/min에서 각 출구별 파장 흡수 세기를 측정하였을 때, 각 출구 번호에 따라서 균등 유량분배 (MF: 1.55%)를 확인하였다. 또한, 총 유량이 증가함에도 불구하고 균등 유량분배가 이뤄지고 있음을 확인하였다.
앞서 제조한 일체형 대량생산용 혼합 장치는 제작이 간편하며, 조립과정에서 발생하는 오차가 없기 때문에 분배 효율이 높다는 장점이 있다. 하지만 사용 과정에서 일부 채널에 문제가 생길 경우, 구성품의 부분적 교체가 불가하다는 단점이 존재한다. 따라서, 본 발명의 발명자는 상호보완적으로 단순한 구조를 갖으며, 구성품의 부분적 교체가 가능하도록 4N-DVM 배플 혼합 장치와, 균등 유량 분배기(70, 70’)를 별도 제작하여 조립형으로 대량 생산용 혼합 장치(100’, 100”)를 추가 제작하였다 (도 26의 (a), (b)). 최종적으로 제작된 외부 유량 분배기의 세부 치수는 표3과 같이 계산되었다.
표 4. 대량생산용 조립형 8/16N-DVM의 외부 유량 분배기 채널에 대한 각 구간별 세부 치수 (단위 mm)
Figure PCTKR2023014811-appb-img-000004
친용매와 반용매를 공급하는 각 16개의 균등 유량분배기의 각 끝부분에 반구형 구조가 내장된 나노입자 제조용 장치가 연결(위층과 아래층 각 8개씩)되어 3D프린터에 의하여 일체형으로 제조된다. 통합된 대량생산용 혼합기는 나노입자의 물리적 특성 (크기, 입자의 균일도, 표면전하, 약물 캡슐화 효율)을 유지하며 시간 당 17.2 L의 유속으로 제조를 가능하게 한다. 결과적으로, 3D프린터를 이용한 단일 장치 (1x) 및 대량생산 장치 (4x, 8x 16x)의 통합형 제조 방법은 소/대규모 생산 요구에 맞춤형 제작 방식의 가능성을 보여준다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 8개가 병렬로 일체로 형성된 구성도이고, 도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 혼합용 구조체 16개가 병렬로 일체로 형성된 구성도이다.
미세 유체 혼합용 구조체는 도 26에서와 같이 구성될 수도 있으나, 도 27 및 도 28에 구성된 바와 같이 하나의 모듈 안에 복수의 혼합기가 구비된 형태로 제작될 수도 있다.
3D 반구형 구조체 제작 및 성능검증을 위한 재료 및 방법
재료
에틸알코올(EtOH), 테트라히드로푸란(THF), 아세톤, 염화나트륨, 아세트산나트륨 용액, 아세토니트릴(ACN), 1,1,2,2-테트라페닐에틸렌(TPE), 콜레스테롤(Chol), Triton X-100을 구입했다. 시그마-알드리치에서. 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 -2000(DMG-PEG 2000)은 Avanti Polar Lipids, Inc.에서 구입했다.(헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(6-oxO-6-(운데실옥시)헥실)아미노)옥타노에이트)(SM- 102)는 XIAMEN SINOPEG BIOTECH CO., LTD에서 구입했다. 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 블록-폴리(락티드-코-글리콜리드)(PEG5k-PLGA55k)는 Creative PEGWorks에서 구입했다. SARS-CoV-Spike mRNA와 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(FLuc mRNA)는 에스티팜(주)에서 생산되었다.
3D 프린팅 장치 제작
3D 프린팅 장치는 컴퓨터 설계(CAD) 및 소프트웨어(Autodesk Inventor)를 사용하여 설계되었다. 두 가지 서로 다른 용액의 고압 주입을 용이하게 하기 위해 이론적인 흐름 안정화 길이인 10보다 긴 간격을 두고 주입 부위에 5mm 스레드(1/16 ″, 1/4-28 Flat-Bottom)를 도입했다. 이 수정을 통해 XP-235 피팅(IDEX Health & Science)에 원활하게 연결할 수 있었다. 그런 다음 CAD 파일을 상업용 레진(PlasCLEAR)을 사용하여 디지털 광 처리(DLP) 기반 3D 프린터(Pico 2 HD, Asiga)를 통해 인쇄했다. 각 층을 25μm로 인쇄하고 광경화를 통해 적층했다. 인쇄된 장치 내부의 경화되지 않은 잔여 레진을 제거하기 위해 이소프로판올(IPA)을 사용한 다음 믹서를 통해 공기를 플러시하여 IPA를 추가로 제거했다. 각 입구와 출구에서 수지가 관찰되지 않을 때까지 이 과정을 반복했다. 마지막으로, 세척된 장치는 UV 챔버(Asiga Flash)를 사용하여 후경화되었으며, 이를 통해 수지가 완전히 중합된 물체로 변형되었다.
마이크로 믹서의 전산유체역학(CFD) 시뮬레이션
혼합 정도, 난류 운동 에너지(TKE) 및 배플 내부의 데드 볼륨을 평가하기 위해 수치 전산 유체 역학(CFD) 연구가 수행되었다. 마이크로 믹서 내부의 유체 흐름은 Navier-Stokes 방정식, 다상 유체의 유체 부피(VOF) 방정식 및 질량 보존 방정식으로 설명할 수 있다. 정상상태를 가정함으로써 유체 흐름의 지배방정식은 다음과 같이 단순화될 수 있다.
ρv·∇ v = - ∇ p + μ ∇ 2 v + ρg: 나비에-스토크스 방정식
∇·v = 0: 질량 보존 방정식
여기서 ρ는 유체 밀도, v는 유체 선형 속도, p는 압력, μ는 유체 동적 점도, g는 중력 가속도이다. 지배 방정식은 적절한 경계 조건(채널 벽의 미끄럼 방지 경계 조건, 입구의 질량 유량, 출구의 유출 조건, 압력을 제외한 모든 흐름 변수에 대한 0 법선 구배)을 사용하여 해결되었다. 방정식은 유한체적법을 기반으로 이산화되었으며, 수치해석에는 상용화된 수치소프트웨어 FLUENT 2022 R2(ANSYS, INC.)를 사용하였다. 계산 에는 k-ε 난류와 k-Ω 난류 모델을 병합한 SST(전단 응력 전달) k-Ω 표준 난류 모델이 사용되었다. 유체 특성은 에틸알코올(790 kg m 3 , 0.0012 kg m -1 s -1 )과 물(998.2 kg m 3 , 0.001003 kg m -1 s -1 ) 의 밀도 및 점도를 사용하였다. 주어진 시간에 속도 크기가 최대 속도의 5% 미만으로 떨어지는 계산 영역의 부분은 데드 볼륨(Dead Volume)으로 표시된다.
PCL 나노입자의 제조
PCL은 THF에 1mg/ mL 농도로 용해시키고 PCL 나노입자의 침전을 위해 탈이온수를 사용했다. PCL 전구체 용액과 탈이온수를 2개의 20mL 주사기(Air-Tite Products, Inc.)를 사용하여 주입했다. 각 주사기는 별도의 주사기 펌프(PHD Ultra, Harvard Apparatus)에 부착되었으며, 3~9의 FRR 범위를 사용하여 각 펌프의 유속을 제어했다. 각 주사기는 각각 반용매 및 폴리머 주입구에 연결되어 있다.
PEG-PLGA 나노입자의 제조
PEG 5k -PLGA 55k를 50 mg /ml 의 고농도로 ACN에 용해시켰다. PEG-PLGA 나노입자의 침전을 위한 역용매로 탈이온수를 사용하였고, 주입에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 방법을 따랐다.
POPC 리포솜의 준비
POPC 리포솜은 수용액과 지질 용액을 혼합하여 제조되었다. POPC와 콜레스테롤을 55:45의 몰비로 총 농도 10mg·mL로 에탄올에 용해시켰다. 지질 용액과 수성 완충액(식염수, 154mM NaCl)을 지질 주입구와 역용매 주입구에 각각 주입했다. 자가 조립된 POPC 리포솜은 인접한 두 스트림의 혼합으로 인한 출구 스트림에서 수집되었으며 1,000배의 완충액(10 mM PBS, pH = 7.4)에 대해 투석 주머니(MWCO 12,000 Da, Sigma-Aldrich)를 통해 투석되어 하룻밤 동안 에탄올 잔류물을 제거했다.
특성화를 위한 mRNA-LNP 준비
제제화 후 11.5의 이온화 가능한 지질/mRNA 질량비로 0.10 mg/ mL 의 최종 mRNA 농도를 달성하도록 제조되었다. 간단히 말하면, SM-102/DSPC/Chol/DMG-PEG 2000을 에탄올에 50/10/38.5/1.5의 비율로 용해시켜 총 농도 20mg/mL의 지질 용액을 생성했다. 3M 농도의 아세트산 나트륨 용액을 뉴클레아제가 없는 물(NFW)로 25mM 농도로 희석했다. 100mM 아세트산 용액을 사용하여 아세트산나트륨 완충액의 pH를 5.5로 조정하였다. 주입하기 전에 지질 용액과 아세트산나트륨 완충액을 0.22μm 주사기 필터를 통과시켰다. 그런 다음 FLuc mRNA를 아세트산나트륨 완충액에 용해시켰다. 제제화 후, mRNA-LNP는 리포솜에 사용된 것과 동일한 상위 방법을 사용하여 정제되었다.
상용화 장치와 제조 성능 비교를 위한 mRNA-LNP 제제
각 mRNA-LNP 제제는 동일한 몰비의 지질 조합으로 최종 mRNA 농도 0.04 mg /ml에 도달했다. 비교 상용화 장치에는 토로이달 믹서(NanoAssemblr Ignite, Precision NanoSystems)가 포함되었다. 완전한 완충 환경을 달성하기 위해 원심분리 필터 장치(Amicon ® Ultra-15)를 정용여과에 사용했다. 간략히 설명하면, 정제할 시료를 장치 내부에 넣고, 남은 공간을 완충액으로 채우고, 막 외부 용액의 pH가 7.4에 도달할 때까지 3,500rpm에서 40분간 원심분리를 반복하였다. 시험관 내 사용을 위해 SARS-CoV-Spike-mRNA가 로딩된 LNP를 희석하여 0.02 mg /ml mRNA 농도를 달성했다. 생체 내 적용을 위해 FLuc-mRNA가 로딩된 LNP는 동일한 정제 과정을 거쳤으며 mRNA의 최종 농도는 0.04 mg /ml 로 설정되었다.
시험관 내 연구를 위한 세포 배양
HEK 293T 세포(ATCC, American Type Culture Collection)를 웨스턴 블롯 분석을 위해 웰당 1 x 106개 세포의 밀도로 배양했다. DVM-LNP 및 Toroidal-LNP를 포함한 SARS-CoV-2 Spike-mRNA가 포함된 샘플을 Opti-MEM(Reduced-Serum Medium, GibcoTM)에 분산시키고 웰당 3μg의 mRNA로 처리했다. 스파이크 단백질 발현은 24시간 후에 측정되었다. 형질감염 후, 각 웰을 멸균 PBS 및 200μL의 1x 용해 완충액(Cell Lysis Buffer, InvitrogenTM)으로 처리했다. 그런 다음 샘플을 분석을 위해 수집하기 전에 10분 동안 13,000rpm에서 원심분리했다.
웨스턴 블롯
세포 추출물은 4~15% gradient SDS-PAGE(4~15% Mini-PROTEAN TGXTM Precast Protein Gels, Bio-Rad)로 분리되었다. 세포 용해물 단백질을 겔에서 0.2 μm PVDF 멤브레인(Mini-format, Bio-Rad)으로 옮기고 재조합 2019-nCoV 스파이크 항체(SARS-COV-2 Spike RBD Polyclonal Antibody, Elabscience) 및 GAPDH 항체( sc-47724, Santa cruz Biotechnology)을 통하여 면역블롯팅 되었다. 분석은 Western ECL 용액(ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad)을 사용하여 Western blot 이미징 시스템(ChemiDoc MP Imaging System, Bio-Rad)으로 수행되었다.
생체내 루시퍼라제 단백질 발현
체중이 22~25g인 수컷 BALB/c 마우스를 무작위로 총 7개 그룹으로 나누었으며, 그룹당 n=3이었다. 이들 그룹에는 PBS를 받은 음성 대조군, FLuc-mRNA 함유 DVM-LNP 샘플을 받은 3개 그룹, Toroidal-LNP 샘플을 받은 3개 그룹이 포함되었다. 각 그룹에는 마우스의 오른쪽 대퇴사두근에 50μL(5μg의 mRNA 함유)를 투여했다. 각 마우스의 체중 및 생체발광을 투여 전, 투여 후 0.5시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 6일의 7개 시점에서 측정했다. 이미지 획득 전 각 마우스에게 15 mg mL-1 농도의 루시페린(D-Luciferin, GoldBio) 100 μL를 양쪽 복강에 주입한 후 IVIS Spectrum(PerkinElmer, USA)을 사용하여 이미지를 촬영했다. 지정된 시점. 최대 6일까지 영상을 얻은 후 주사 부위 주변에 관심 영역(ROI)을 정의하고 총 Flux 값을 계산했다.
나노입자의 크기 및 캡슐화 효율 특성 규명
DLS 분석은 합성된 나노입자의 강도에 따른 크기 분포를 평가하기 위해 Zetasizer Nano ZS 장비(Malvern Instruments, Ltd.)를 사용하여 수행되었다. 리포솜이 없는 모든 측정은 관찰된 입자 크기 변화에 대한 용매의 잠재적인 영향을 제거하기 위해 10% 미만 농도의 폴리머 또는 지질 용액을 사용하여 수행되었다. 리포좀의 경우 나노입자의 높은 불안정성으로 인해 투석 과정 전에 DLS 분석을 수행했다. mRNA-LNP의 경우 Quant-it TM RiboGreen 분석(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 mRNA의 캡슐화 효율을 특성화했다. 간단히 말하면, 먼저 LNP를 TE(Tris EDTA) 완충액을 사용하여 4~7ng μL 범위의 농도가 될 때까지 희석 했다. LNP 구조를 유지하기 위한 TE 완충액 또는 구조를 파괴하고 mRNA를 방출하기 위한 1% v/v Triton X-100으로 처리한 희석된 LNP를 100배 희석하여 동일한 부피의 RiboGreen 용액과 반응시켰다. 제형 내 자유 mRNA 및 총 mRNA는 500 nm 여기 및 520 nm 방출을 갖는 마이크로플레이트 판독기(Hidex Sense, Hidex Oy)를 사용하여 결정되었다.
마이크로 믹서의 장기 작동 테스트
1 mg/mL 농도의 TPE를 아세톤에 용해시켰다. 지속적인 나노입자 생산을 위한 역용매로 탈이온수를 활용했다. 용매 증발을 방지하기 위해 파라필름과 호일을 사용하여 비커를 밀봉했다. 하나의 HPLC 펌프(PR-Class, Teledyne SSI)를 탈이온수 비이커에 연결하여 높은 유속으로 주입이 가능하도록 했다. 또 다른 HPLC 펌프(LC-10AD, Shimadzu)를 TPE 용액에 연결했다. 토로이달 믹서에 연결하기 위해 HPLC 펌프의 출구를 316 스테인리스 스틸 리듀서(SS-400-6-1BT, Swagelok)를 통해 1/4" PTFE 튜빙에 연결했다. 각 튜빙의 끝은 3에 추가로 연결되었다. mm 스테인레스 니들 루어-록 튜빙 커넥터(KT503s, 니들 스토어)를 토로이달 혼합기의 입구에 맞췄다. HPLC 펌프는 TPE 용액 유속 0.9 mL /min 및 탈이온수 유속 0.9 mL로 작동하도록 설정되었다. 8.1 mL /min 작동 중 HPLC 펌프의 압력을 실시간으로 지속적으로 모니터링하여 압력 차이를 계산했으며, 출구에서 생성된 나노입자를 추가 DLS 분석을 위해 서로 다른 바이알에 수집했다.
마이크로 믹서 내부 막힘의 시각화 및 정량화
0.1 mL/min 의 흐름으로 탈이온수를 막힌 나노입자에 영향을 주지 않고 남은 용액을 씻어내기 위해 1분 동안 주입한다. 이후, 마이크로 믹서를 80 ℃ 오븐에서 30분간 건조하여 내부에 남아있는 물을 제거하였다. 내부에 남아 있는 입자는 토로이달 믹서에 대해 직접 시각화 및 정량화되었으며, 3D 프린팅된 마이크로 믹서의 경우 시각화 및 정량화 전에 분해되었다.
365 nm, 약 100 mW cm-2 ) 의 UV 하에 놓고 현미경으로 관찰하였다. 막힌 나노입자를 아세톤을 사용하여 용해시키고 정량화를 위해 바이알에 수집했다. 나노입자의 양은 파장 330nm의 아세톤에 TPE를 사용하여 보정 곡선을 통해 결정되었다.
미세유체 시스템은 높은 재현성으로 균일하고 크기 조절이 가능한 나노입자를 생산할 수 있는 능력으로 인해 약물 전달 분야에서 유망하며 연구 및 임상 환경에서 다양한 응용이 가능하다. 그러나 현재의 마이크로 믹서는 최소한의 흐름 조건에서 신속하고 효율적인 혼합을 가능하게 하는 동시에 막힘을 방지하고 주문형 생산을 위한 간단한 확장을 가능하게 하는 기능이 크게 부족한다. 보고된 확장 가능한 장치 중에서 지속적인 장치 작동으로 몇 시간 동안 일관된 특성을 유지하는 나노입자를 생성할 수 있는지 여부는 입증되지 않았다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명의 발명자는 미세 유체 시스템 내에서 소용돌이 효과를 극대화하기 위해 3차원 구조를 활용하는 혼합기를 개발하여 용액 간의 고속 혼합과 나노 입자의 효율적인 분산을 가능하게 했다. 사용자 친화적인 DVM 플랫폼은 입자 특성과 단백질 발현 측면에서 훨씬 적은 부피로 상업용 믹서와 거의 동등한 성능을 보여준다.
지금까지 제안된 포토리소그래피를 사용하여 쉽게 제작할 수 있는 대부분의 미세유체 혼합기는 수십에서 수백 μL /min 범위 의 유속을 사용하므로 생산성 측면에서 어려울 수 있다. 반면, 모놀리식 유체역학적 포커싱 또는 볼텍스 포커싱 믹서는 빠른 혼합을 위해 수십 ml/min보다 높은 유속이 필요하므로 최적화 중에 시약이 상당히 소모된다. 또한 이러한 혼합기에서 높은 FRR을 사용하면 나노입자 생성 후 농축 과정이 발생할 수 있다. 본 발명의 발명자가 제안한 DVM은 수 mL /min 의 유속으로 작동하여 미세유체 혼합기 사이의 간격을 메우는 플랫폼이다.
초고속 혼합 기능을 활용하면 상대적으로 큰 부피의 마이크로 믹서를 역으로 활용하여 고농도의 전구체를 제어하고 막힘을 효과적으로 방지할 수 있다. 오염 방지 재료와 제조 구성 요소를 통합하면 접착력을 더욱 줄일 수 있으므로 이 분야에 대한 연구가 필요하다. 또한 작은 3.9mm 나노입자 생산 섹션을 통해 확장 프로세스의 병렬화를 통해 모놀리식 단일 대량 생산 모듈을 생성할 수 있다. 이 접근 방식은 어셈블리 기반 외부 흐름 분배기를 사용하는 것에 비해 더 높은 흐름 균일 분배 효과를 제공한다. DVM 플랫폼을 통해 본 발명의 발명자는 모놀리식 모듈식 단위 형태로 입자 특성의 선택적 최적화 및 생산을 가능하게 하여 광범위한 나노입자 기반 의료 응용을 가속화할 것으로 기대한다.
본 발명의 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시예에 의해 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 제 1 유체 및 제 2 유체를 제 1 방향으로 이동시키면서 혼합시키기 위한 미세 유체 혼합용 구조체로서,
    상기 제 1 유체 및 제 2 유체가 유입되는 유입구를 구비하고 상기 제 1 유체 및 상기 제 2 유체가 혼합되는 제 1 공간을 구비한 제 1 몸체를 포함하는 제 1 혼합부 및
    상기 제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 후방측에 배치되어 상기 제 1 혼합부에서 혼합된 혼합 유체가 유동하는 제 2 공간을 구비하는 제 2 몸체를 포함하는 제 2 혼합부를 포함하되,
    상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 상기 제 1 방향으로 연장된 가상의 선을 기준으로 서로 반대편에 배치되고,
    상기 제 1 혼합부의 배출구로부터 상기 제 2 혼합부의 유입구로 유입되는 혼합 유체의 흐름 방향은 상기 제 1 방향에 엇갈리는 방향이며,
    상기 제 1 혼합부 및 상기 제 2 혼합부는 상기 제 1 방향으로 볼 때 폭방향 중심을 기준으로 좌우 대칭인 곡면을 포함하는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 상기 제 1 방향으로 볼 때 타원형 및 반원형 단면 중 어느 하나를 포함하는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 반구형으로 형성되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 혼합부는 상하 방향으로 상기 제 1 혼합부보다 상측에 위치되고,
    상기 제 1 혼합부의 상기 유입구는 상측 방향을 향하도록 배치되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간은 각각의 유입구 및 유출구의 면적이 동일하게 형성되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 제 2 공간의 중앙부의 단면적은 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 공간은 각각의 유입구 및 유출구의 면적보다 크도록 형성되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    제 1 방향으로 볼 때 상기 제 1 혼합부의 상기 제 1 공간 및 상기 제 2 혼합부의 제 2 공간은 각 공간의 상기 유입구 및 상기 유출구는 동일한 지름의 한 쌍의 원호가 서로 마주보며 맞접한 폐곡선 형상으로 이루어지는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 방향으로 볼 때, 상기 제 2 혼합부의 후방측에 배치되어 상기 제 2 혼합부를 지난 혼합 유체가 유동하는 제 3 공간을 구비하는 제 3 몸체를 포함하는 제 3 혼합부를 더 포함하는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 3 혼합부는 상기 제 1 혼합부 및 상기 제 2 혼합부 중 적어도 어느 하나와 동일한 형상으로 이루어지는 미세 유체 혼합용 구조체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 3 혼합부의 상기 제 3 공간은 상기 제 1 방향으로 연장된 가상의 선을 기준으로 상기 제 2 혼합부의 상기 제 2 공간의 반대편에 배치되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  11. 제 6항에 있어서,
    상기 제 1 혼합부의 상기 유입구로 상기 제 1 유체가 유입되도록 상기 제 1 유체가 지나는 제 1 유체 유입관 및
    상기 제 1 혼합부의 상기 유입구로 상기 제 2 유체가 유입되도록 상기 제 2 유체가 지나는 제 2 유체 유입관을 포함하고,
    상기 제 1 유체 유입관 및 상기 제 2 유체 유입관은 직교하도록 배치되고,
    상기 제 1 유체유입관 및 상기 제 2 유체 유입관 중 어느 하나는 상기 제 1 방향으로 연장되도록 배치되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 제 3 혼합부의 상기 제 3 공간은 상측 방향으로 배향된 유출구를 구비하며,
    상기 제 3 공간의 유출구에는 제 1 방향으로 연장된 혼합 유체 배출관이 연결되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  13. 제 8항에 있어서,
    상기 제 1 몸체, 상기 제 2 몸체 및 상기 제 3 몸체는 하나의 몸체로 일체화된 모듈로 형성된, 미세 유체 혼합용 구조체.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 하나의 몸체로 일체화된 모듈 내부에는 복수의 제 1 혼합부, 상기 복수의 제 1 혼합부에 각각 연결된 복수의 제 2 혼합부 및 상기 복수의 제 2 혼합부에 각각 연결된 복수의 제 3 혼합부가 구비되고,
    상기 하나의 몸체에는 상기 제1 유체를 상기 하나의 몸체 내부로 공급하기 위한 제 1 유체 공급관이 연결되는 제 1 유체 공급 유로 및 상기 제 2 유체를 상기 하나의 몸체 내부로 공급하기 위한 제 2 유체 공급관이 연결되는 제 2 유체 공급 유로가 구비되고,
    상기 제 1 유체 공급 유로 및 상기 제 2 유체 공급 유로는 상기 복수의 제 1 혼합부로 상기 제 1 유체 및 상기 제 2 유체를 공급하도록 복수로 분기되도록 형성되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 하나의 몸체로 일체화된 모듈은 그 내부에 1, 2, 4 또는 8 쌍의 혼합 유로를 포함하고,
    상기 복수 쌍의 혼합 유로 각각은 2개의 상기 제 1 혼합부, 2개의 상기 제 2 혼합부 및 2개의 상기 제 3 혼합부가 한 쌍으로 이루어지도록 형성되는, 미세 유체 혼합용 구조체.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체;
    상기 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체 각각으로 상기 제 1 유체를 공급하기 위한 제 1 유체 공급기;
    상기 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체 각각으로 상기 제 2 유체를 공급하기 위한 제 2 유체 공급기를 포함하는,
    미세 유체 혼합 장치.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 제 1 유체 공급기 및 상기 제 2 유체 공급기로부터 상기 하나 이상의 미세 유체 혼합용 구조체로 공급되는 제 1 유체 및 제 2 유체를 분배하기 위한 유량 분배기를 더 포함하는, 미세 유체 혼합 장치.
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