JPWO2018190423A1 - 流路構造体およびこれを用いた脂質粒子ないしミセル形成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をX方向と、このX方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をY方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をy0とした場合に、Y方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Y方向(略+Y方向、略−Y方向)に、1/2y0以上1y0未満の一定高さh1,h2...を有し、かつX方向に一定幅x1,x2...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔d1,d2...をもって少なくとも2つ以上設けられていることで形成されていることを特徴とするものである。
すなわち、上記課題を解決する本発明は、ナノサイズの脂質粒子ないしミセルを形成するための流路構造体であって、当該流路構造体は、その上流側において、互いに独立した、第1の流動体を導入する第1導入路と、第2の流動体を導入する第2導入路とが、それぞれ一定長を有して合流し、その下流側に向かって1つの希釈流路を形成しており、
前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をX方向と、このX方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をY方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をy0とした場合に、Y方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Y方向(略+Y方向、略−Y方向)に、1/2y0以上1y0未満の一定高さh1,h2...を有し、かつX方向に一定幅x1,x2...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔d1,d2...をもって少なくとも2つ以上設けられていることで形成されていることを特徴とするものである。
はじめに本発明の流路構造体について説明する。
本発明の流路構造体は、概略的に述べれば、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に一定幅の略矩形状の構造子(バッフル)を両側面より互い違いに配置したような二次元的構造の流路構造体である。従来の三次元ミキサー構造とは異なり、このような、二次元的なマイクロ流路での希釈は、分子拡散に依存するものとなる。すなわち、図1に示すように、原料となる脂質溶液の希釈速度が速いほど生成する脂質粒子のサイズが小さいものとなる。従って、構造子(バッフル)の幅や長さ、配置を調整することによって、原料溶液の希釈速度を制御することができ、従来よりも粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子を形成することが可能である。
図2に示すような基本構造を有する流路構造体において、所望のナノサイズの脂質粒子を作製するために必要とされる、構造子40の個数の影響性を調べた。
流路幅y0=200μm、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...、=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmを一定として、構造子40の個数をそれぞれ6、10、20、100個とした流路構造体を作製した。これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:3、または1:9の流量比で、所定の総流量となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。結果を図4に示す。図4に示すように、いずれの条件によってもナノサイズの脂質粒子を形成することができたが、特に構造子40の個数が10個以上あれば、20〜100nm範囲の目的サイズの粒子を制御性よく形成することが可能であった。
図2に示すような基本構造を有する流路構造体において、所望のナノサイズの脂質粒子を作製するために必要とされる、隣接する構造子40間の間隔d1,d2...を影響性を調べた。
流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の幅h1,h2...(Y方向長さ)=150μm、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...、=100μmを一定として、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...をそれぞれ100μm、200μm、500μm、1mmとした流路構造体を作製した。これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:3、または1:9の流量比で、所定の総流量となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。なお、参考のために、同一流路幅の流路構造体において構造子40を有していないもの、および従来知られるカオティックミキサーを用いて同様の試験を行った。なお、カオティックミキサーは前記非特許文献1に記載された内容に従い同じもの(直径200μmの流路中に幅50μm、深さ31μmのカオティックミキサーを69サイクル配置したもの)を作成して使用した(非特許文献1における関連部分の記載はその関連により本明細書中に包含される。)。結果を図5に示す。図5に示すように、いずれの条件によってもナノサイズの脂質粒子を形成することができたが、特に隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...が500μm以下であれば、10〜100nm範囲の目的サイズの粒子を制御性よく形成することが可能であった。
図2に示すような基本構造を有する流路構造体において、所望のナノサイズの脂質粒子を作製するために必要とされる、各構造子40の高さ(Y方向長さ)h1、h2...の影響性を調べた。
流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmを一定として、各構造子40の高さ(Y方向長さ)h1、h2...を70、100、150μmとした流路構造体を作製した。これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:3、または1:9の流量比で、所定の総流量となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。なお、参考のために、同一流路幅の流路構造体において構造子40を有していないもの、および従来知られるカオティックミキサー(実施例2で用いたものと同様)を用いて同様の試験を行った。結果を図6に示す。図6に示すように、各構造子40の高さ(Y方向長さ)h1、h2...が100μmであれば、10〜100nm範囲の目的サイズの粒子を制御性よく形成することが可能であった。
図2に示すような基本構造を有する流路構造体において、所望のナノサイズの脂質粒子を作製するために必要とされる、構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...、の影響性を調べた。
流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmを一定として、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...を50、70、100μmとした流路構造体を作製した。これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:3、または1:9の流量比で、所定の総流量となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。なお、参考のために、同一流路幅の流路構造体において構造子40を有していないもの、および従来知られるカオティックミキサー(実施例2で用いたものと同様)を用いて同様の試験を行った。結果を図7に示す。図7に示すように、いずれの条件によってもナノサイズの脂質粒子を形成することができたが、特に構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...が100μmあれば、10〜100nm範囲の目的サイズの粒子を制御性よく形成することが可能であった。
図8に示すようように本発明に係る基本構造を有する流路構造体(流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)と共に、(1)同様の高さを有するが幅の大きい単一の構造子40を片側壁面側に設けたような形状、(2)同様の高さを有する構造子40を片側壁面側のみに複数設けたような形状、(3)構造子40を両壁面側に複数設けるがそれぞれが対称に配置され、各構造子の高さが半分である形状の流路構造体をそれぞれ準備し、所望のナノサイズの脂質粒子を作製する上での構造子の配置の影響性を調べた。結果を図9に示す。図9に示すように、本発明に係る基本構造を有するもののみが、目的サイズの脂質粒子を制御性よく形成することが可能であった。
本発明に係る基本構造を有する流路構造体における脂質溶液の希釈状態をシミュレーションするため、脂質溶液の水混和性有機溶媒であるエタノールと、希釈溶媒としての水とを、流量比1:3で総流量50μl/分にて、流路構造体に流して、汎用性物理シミュレーションソフト COMSOL Multiphysicsによりその流れをシミュレーションした。その結果を図10に示す。図10に示すように、構造子の存在によって、脂質溶液の希釈分散化が図られていること、特に、その個数が10個目においてはかなり均質に分散が進んでいることが裏付けられた。
本発明に係る基本構造を有する流路構造体における、第1導入路10と第2導入路20との合流点31より最初の構造子40の上流側端部41までの距離x0の長短による脂質粒子の粒径への影響性を調べるために、本発明に係る基本構造を有する流路構造体において、その距離x0を30、50、65、80、100mmにそれぞれ変更した流路構造体を作製した。なお、これらの流路構造体の流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmは、共通するものとした。
各流路構造体に、脂質溶液として10mg/mlのリン脂質/エタノール溶液を0.1ml/分、希釈溶媒として生理食塩水を0.9ml/分の流量(総流量1.0ml/分にて流し、形成される脂質粒子の粒径を比較した。なお、図11は、この総流量にて脂質溶液および希釈溶媒を流した場合の合流点31よりの距離と到達に要する時間との関係を模式的に示すものである。得られた結果を図12に示す。図12に示すように、距離x0が80mm以上(通過時間約0.1秒以上)であると得られる脂質粒子の粒径が大きくなってしまった。一方、距離x0が65mm以下(通過時間約0.08秒以下)であれば良好な粒径のものが得られた。
本発明に係る基本構造を有する流路構造体(流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)に対して、脂質組成が、pH応答性カチオン性脂質(YSK05)、コレステロール、ポリエチレングリコール脂質(YSK05/コレステロール/mPEG2k−DMG が、70/30/1−3 (mol%)の割合)の脂質溶液(エタノール中8mM脂質濃度)と、希釈媒体としてのsiRNA溶液(25mM酢酸緩衝液、pH4.0)とを流量比1:3、総流速500μl/分にて流して、pH応答性カチオン性脂質(YSK05)、コレステロール、ポリエチレングリコール脂質、siRNAで構成される脂質粒子の作成を試みた。その結果、図13に示すように、粒径が100nm以下でサイズ均一性の高い脂質ナノ粒子が形成されることが確認できた。
本発明に係る流路構造体において、所望のナノサイズの脂質粒子を作製するために必要とされる、流路幅y0の影響性を調べた。
図16(a)に示すように本発明に係る基本構造を有する流路構造体(流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)と共に、(1)流路幅y0=400μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=300μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmと、上述の基本構造の流路構造体よりも流路幅は広いが、流路幅y0と各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)との比率は4:3と同様である流路構造体、(2)流路幅y0=400μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=350μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmと、上述の基本構造の流路構造体よりも流路幅が広く、また、流路幅y0と各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)との比率は8:7とされた流路構造体をそれぞれ準備した。
これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:9の流量比で、所定の総流量となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。なお、参考のために、同一流路幅の流路構造体において構造子40を有していないもの、結果を図16に示す。図6(b)、(c)に示すように、流路幅y0を400μmにしても粒径制御性に大きな影響はなかった。また流路幅y0と各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)との比率は4:3のものの方が、比率8:7のものよりやや粒径制御性について良好な結果が得られた。
本発明に係る流路構造体において、各構造子の傾斜の影響性を調べた。
流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmという基本構成を有する流路構造体において、図17(a)に模式的に示すように、各構造子の壁面と流路方向(X方向)との間のなす角度θが、40°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、または140°(90°±50°)として構成した流路構造体を作製した。
これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:3または1:9の流量比で、総流量が50、100、または500μl/分となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。結果を図17(b)、(c)に示す。図17(b)、(c)に示すように、各構造子の壁面が流路方向(X方向)に90°±50°の程度の範囲内で傾斜したものであっても、同様に所定の粒径を有する脂質粒子を形成可能であり、また流量条件によって脂質粒子の粒径を制御可能であることが確認できた。
本発明に係る流路構造体において、流体の導入路の数の影響性を調べた。本発明に係る基本構造を有する流路構造体(それぞれ1つずつの第1導入路10および第2導入路20を有する。流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)とは、図18(a)に模式的に示すように中央の第1導入路10に対して、両側から2つの第2流体導入路20a、20bが合流する形状を有する以外は、前記基本構造を有する流路構造体と同じ構造を有する流路構造体を別途用意した。
この2つの第2流体導入路20a、20bを有する流路構造体において、第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路20a、20bより生理食塩水を、全体として脂質:生理食塩水の流量比が1:3となるように、かつ第2導入路20aと第2導入路20bからのそれぞれ導入される生理食塩水の流量比を1:1、3:1、1:3、9:1、1:9となるように調整しながら導入し、脂質粒子の脂質粒子の粒径を調べた。
また、参考のために、それぞれ1つずつの第1導入路10および第2導入路20本発明に係る基本構造を有する流路構造体において、上記と同様にして、第1導入路10より脂質溶液を、第2導入路20より生理食塩水を、全体として脂質:生理食塩水の流量比が1:3、1:5、1:7、1:9、1:20となるように調整しながら導入し、脂質粒子の脂質粒子の粒径を調べた。結果を図18(b)、(c)に示す。
図18(b)は、2つの第2流体導入路20a、20bを有する流路構造体において第2導入路20aと第2導入路20bからのそれぞれ導入される生理食塩水の流量比の変化における脂質粒子の粒径の影響を示したグラフである。図18(b)に示す結果からは、この2つの第2流体導入路20a、20bを有する流路構造体において、第2導入路20aと第2導入路20bからのそれぞれ導入される生理食塩水の流量比の変化は、得られる脂質粒子の粒径にそれほど大きな影響を与えないという結果が得られた。
図18(c)は、2つの第2流体導入路20a、20bを有する流路構造体と、1つの第2導入路20を有する流路構造体を用いた場合における脂質粒子の粒径の影響を示したグラフである。図18(c)に示す結果からは、第2流体導入路2を複数(2つ)としたことで、第1および第2流体導入路をそれぞれ1つしか有しない流路構造体と比べて、低流量において生成する脂質粒子の粒径の標準偏差が減少し、粒径のばらつきが少なくことが示された。併せて同じ脂質:生理食塩水の流量比(1:3)であると得られる脂質粒子の粒径も小さくなる傾向があることが示された。
本発明に係る流路構造体において、流体の導入路の数の影響性を、流路構造体の屈曲した流路部位の形状(各構造子の形状、配置)の異なる態様において調べた。
すなわち、流路構造体として実施例11に用いたものと同様の(1)1つの第1導入路10とその両側から2つの第2流体導入路20a、20bが合流する形状を有し、屈曲した流路部位に関しては本発明に係る前記基本構造(流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)である流路構造体、(2)1つの第1導入路10とその両側から2つの第2流体導入路20a、20bが合流する形状を有し、屈曲した流路部位に関しては、流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=100μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmである流路構造体、(3)1つの第1導入路10とその両側から2つの第2流体導入路20a、20bが合流する形状を有し、屈曲した流路部位に関しては、流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=500μmである流路構造体、(4)本発明に係る基本構造を有する流路構造体(それぞれ1つずつの第1導入路10および第2導入路20を有する。流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)、さらに(5)参考のために、前記(4)の流路構造体と同一流路幅の流路構造体において構造子40を有していないもの、を用意した。
これら5つの流路構造体において、第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路20a、20bより生理食塩水を、全体として脂質:生理食塩水の流量比が1:3となるように、かつ前記(1)〜(3)の流路構造体においては、第2導入路20aと第2導入路20bからのそれぞれ導入される生理食塩水の流量比を1:1、3:1、1:3、9:1、1:9となるように調整しながら、総流量を50μl/分として導入して、脂質粒子を生成し、得られた脂質粒子の粒径を調べた。得られた結果を図19、図20に示す。
図19に示すように、第2流体導入路2を複数(2つ)有する前記(1)〜(3)の流体構造体を用いた場合、第1および第2流体導入路をそれぞれ1つしか有しない前記(4)の流路構造体と比べて、いずれも得られる脂質粒子の粒径、標準偏差ともに小さくなった。また、図19および図20に示すように、第2導入路20aと第2導入路20bからのそれぞれ導入される生理食塩水の流量比によって、前記(2)および(3)の流路構造体を用いた場合は粒径が比較的変化すること示された。他方、前記(1)の流路構造体を用いた場合には流量比よって粒径が大きな影響を受けないことが示された。
前記実施例6と同様に、本発明に係る基本構造を有する流路構造体における脂質溶液の希釈状態をシミュレーションするため、脂質溶液の水混和性有機溶媒であるエタノールと、希釈溶媒としての水とを、流量比1:3で、流路構造体に流して、汎用性物理シミュレーションソフト COMSOL Multiphysicsによりその流れをシミュレーションした。なお、総流量の違いによる希釈過程を調べるため、総流量を100μl/分と500μl/分に設定した。得られた結果を図21に示す。図21に示すように、総流量が大きい方が構造子によってより迅速な希釈がなされることが示された。
(1)本発明に係る基本構造を有する流路構造体における脂質溶液の希釈状態、および、(2)前記実施例10で用いたものと同様に中央の第1導入路10に対して、両側から2つの第2流体導入路20a、20bが合流する形状を有する以外は、前記基本構造を有する流路構造体と同じ構造を有する流路構造体における脂質溶液の希釈状態をシミュレーションするため、脂質溶液の水混和性有機溶媒であるエタノールと、希釈溶媒としての水とを、流量比1:3で、総流量が50μl/分で流路構造体に流して、前記実施例6と同様に汎用性物理シミュレーションソフト COMSOL Multiphysicsによりその流れをシミュレーションした。なお、2つの第2流体導入路20a、20bを有する前記(2)の流路構造体において、第2流体導入路20aと第2流体導入路20bより導入するエタノールの流量は均等で1:1とした。得られたの結果を図22に示す。図22に示すように、第2流体導入路2を複数(2つ)とした流路構造体の方が、第1および第2流体導入路をそれぞれ1つしか有しない流路構造体と比べて、より迅速な希釈がなされることが示された。
本発明に係る流路構造体において、流路構造体の流路深さ(三次元的な広がり)の影響性を調べた。
本発明に係る基本構造(流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の幅h1,h2...(Y方向長さ)=150μm、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...、=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)をいずれも有し、流路の深さ(図2,3における紙厚方向)が100μm(流路深さ/流路幅=0.5)の流路構造体と、流路の深さが200μm(流路深さ/流路幅=1)の流路構造体を作製した。これらの流路構造体の第1導入路10より脂質溶液(エタノール中の10mg/ml ホスファチジルコリン溶液)を、第2導入路より生理食塩水を、1:3、または1:9の流量比で、所定の総流量となるように調整しながら導入し、脂質粒子の形成を行い、得られた脂質粒子の粒径を調べた。得られた結果を図23に示す。図23に示されるように、流路の深さが2倍になっても粒径制御性に変化はみられなかった。
本発明に係る流路構造体による高分子ミセルの形成が、脂質粒子の形成の形成と同様に可能であるかを調べた。
本発明に係る基本構造を有する流路構造体(流路幅y0=200μm、構造子40の個数=100、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、幅(X方向長さ)x1,x2=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μm)に対して、両親媒性ブロック共重合体であるポリスチレン(PS)−ポリエチレンオキシド(PO)ブロック共重合体(PS47-PEO46-PS47 、数平均分子量(Mn)=約12000)のテトラヒドロフラン溶液(テトラヒドロフラン1ml中1mgのポリマー濃度)と、希釈媒体としての超純水とを流量比(ポリマー溶液:水)=1:10、総流速10,50、100、300、500μl/分にて流して、高分子ミセルの作成を試みた。その結果、図24に示すように、脂質粒子と同じように、粒径が100nm以下でサイズ均一性の高い高分子ミセルを形成できること、また流量条件によってミセルの粒径を制御可能であることが確認できた。
図25(a)に示すような構造を有する流路構造体において、核酸・ポリカチオン複合体を封入してなる所望のナノサイズの脂質粒子の形成を試みた。
使用した流路構造体は、図25(a)に示すように、上流側に核酸・ポリカチオン複合体からなるコア粒子を形成するための前処理工程用の屈曲した流路部位と有する流路構造体部(以下、「前処理用流路構造体部」と称する。)、その下流側に、本工程である脂質粒子を形成するための屈曲した流路部位を有する流路構造体部(以下、「本工程用流路構造体部」と称する。)を接続した構造を有し、前処理用流路構造体部の下流導出口が、本工程用流路構造体部の第2導入路(希釈媒体導入路)に連結された形態を有するものとされた。
なお、本工程用流路構造体部の流路条件は、流路幅y0=200μm、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...、=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmを一定として、構造子40の個数を20個とし、他方、前処理工程用流路構造体部の流路条件も、流路幅y0=200μm、各構造子40の高さh1、h2...(Y方向長さ)=150μm、各構造子40の幅(X方向長さ)x1,x2...、=100μm、隣接する各構造子40間の間隔d1,d2...=100μmを一定として、構造子40の個数を20個として、流路構造体を作製した。
まず前処理工程用流路構造体部の第1導入路よりポリ−L−リジン/緩衝液(10mM HEPESバッファ中の0.1mg/ml ポリリジン、pH7.4)を、第2導入路より核酸/緩衝液(10mM HEPESバッファ中の0.1mg/ml DNA、pH7.4)を5:1の流量比で、最終的な本工程の所定の総流量となるように調整しながら導入して、核酸・ポリカチオン複合体からなるコア粒子を形成することを試みた。さらに、本工程用流路構造体部の第1導入路より脂質溶液(エタノール中の2mg/ml DOPE/DSPE−PEG/DCP(5.2:2.4:0.4)溶液)を流し、また本工程用流路構造体部の第2導入路よりは、ここに連結された前処理工程用流路構造体部より導出される被処理溶液をそのまま流して、1:5の流量比で、本工程の所定の総流量となるように調整しながら導入して、脂質粒子を形成し、得られた脂質粒子の粒径を調べた。結果を図25(b)に示す。この実施例においては、前処理工程用流路構造体部において核酸・ポリカチオン複合体であるコア粒子(粒径10〜20nm)が形成されており、最終的には、図25(b)に示すように、いずれの条件によっても当該コア粒子を封入してなるナノサイズの脂質粒子を形成することができたが、総流量が大きい方が粒径が減少することが示された。
なお、上記略号はそれぞれ以下の通りの意味を示すものである。
HEPES=4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)
DOPE=ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(Dioleoylphosphatidylethanolamine)
DSPE−PEG=ジステアリルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール(distearylphsphatidylethanolamine-polyethylenglycol)
DCP=ジセチルホスフェート(dicetylphosphate)
20 第2導入路
30 希釈流路
31 合流点
40 構造子
50 屈曲した流路部位
Claims (8)
- ナノサイズの脂質粒子ないしミセルを形成するための流路構造体であって、当該流路構造体は、その上流側において、互いに独立した、第1の流動体を導入する第1導入路と、第2の流動体を導入する第2導入路とが、それぞれ一定長を有して合流し、その下流側に向かって1つの希釈流路を形成しており、
前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をX方向と、このX方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をY方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をy0とした場合に、Y方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Y方向(略+Y方向、略−Y方向)に、1/2y0以上1y0未満の一定高さh1,h2...を有し、かつX方向に一定幅x1,x2...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔d1,d2...をもって少なくとも2つ以上設けられていることで形成されていることを特徴とする流路構造体。 - 前記流路幅y0が、20〜1000μm、各構造子の幅x1,x2...が、20〜1000μmで、各構造子間の間隔がd1,d2...20〜1000μmである請求項1に記載の流路構造体。
- 前記構造子が10〜100個設けられているものである請求項1または2に記載の流路構造体。
- 前記第1導入路と前記第2導入路との合流点より最初の構造子の上流側端部までの距離が、この間を流れる設定速度の希釈流体が0.1秒以下で通過するように、希釈流体の設定速度に応じて規定されているものである請求項1〜3のいずれか1つに記載の流路構造体。
- 前記第1導入路および/または前記第2導入路として、それぞれ複数の流路が設けられているものである請求項1〜4のいずれか1つに記載の流路構造体。
- 前記略Y方向が、流路方向(X方向)に対して40〜140°の角度で交差する方向である請求項1〜5のいずれか1つに記載の流路構造体。
- 第1の流動体を導入する第1導入路と、第2の流動体を導入する第2導入路とのいずれか一方が、その上流側に位置する前処理用流路に接続されており、この前処理用流路が、請求項1〜6において規定される流路構造体と同様の構造を有しているものであることを特徴とする請求項1〜6に記載の流路構造体。
- 脂質溶液または両親媒性物質溶液を希釈媒体で流路構造体中にて希釈することによってナノサイズの脂質粒子ないしミセルを形成する脂質粒子ないしミセル形成方法であって、前記流路構造体として請求項1〜7のいずれか一つに記載のものを用い、この流路構造体の第1導入路および第2導入路の一方より脂質溶液または両親媒性物質溶液を、他方より希釈溶媒を、総流量1μl/分〜100ml/分となるように導入することを特徴とする脂質粒子ないしミセル形成方法。
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