JP2022178879A - 脂質ナノ粒子 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、脾臓樹状細胞に高効率で送達可能な遺伝子送達キャリアとなる脂質ナノ粒子を提供することを課題とする。【解決手段】ｐＨ感受性カチオン性脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質とを含有しており、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、前記ｐＨ感受性カチオン性脂質の含有量の割合が１０～２５モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の含有量の割合が０．５～１．７５モル％であり、個数平均粒子径が１５０ｎｍ以上である、脂質ナノ粒子。【選択図】なし

Description

本発明は、脾臓樹状細胞に高効率に送達可能な遺伝子送達キャリアとして有用な脂質ナノ粒子に関する。

遺伝子治療薬として臨床応用が注目されているモダリティの一つとして、ｍＲＮＡ医薬が挙げられる。ｍＲＮＡ医薬とは、生体成分であるｍＲＮＡを人工的に合成し生体内に投与することで、疾患治療等に望ましいタンパク質を発現させる、次世代型の医薬品である。ｍＲＮＡは、ゲノムへの挿入変異リスクを持たず、遺伝子を同定できれば配列を即座に設計することができ、理論上あらゆるタンパク質を発現可能であることから、広範な疾患領域へ応用可能な医薬品分子として注目されている。そのため、特にワクチンとしてのｍＲＮＡは、がんの個別化治療や、感染症領域でのウイルス変異やパンデミックへの迅速な対応へ、大きく貢献すると考えられる（非特許文献１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン開発において、米国Ｍｏｄｅｒｎａ社がウイルスゲノムＤＮＡ配列の公開から僅か４２日後に治験薬（ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子製剤）の最初のロットを出荷した事実からも、ｍＲＮＡワクチンが感染症対策に対して迅速に対応可能な技術であることが実証された。

ワクチンには、一般的に免疫賦活化作用が必要とされている。一方で、一本鎖ＲＮＡは、主にエンドソームに局在するToll-like receptor 7/8（ＴＬＲ７/８）により認識され、Ｉ型インターフェロン応答を誘起する。すなわち、ｍＲＮＡは、自然免疫機構を介した強い免疫原性を持つ。そこで、ｍＲＮＡワクチンでは、ｍＲＮＡが、標的タンパク質の発現と免疫賦活作用の双方の役割を果たしている（非特許文献２及び３）。

ｍＲＮＡやｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）等の核酸を封入し、標的細胞へ送達するためのキャリアとして、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が利用されている。例えば、核酸を効率的に標的細胞内へ送達するためのキャリアとなる脂質ナノ粒子として、生理的ｐＨでは電気的に中性であり、弱酸性ｐＨ環境下ではカチオン性に変化するｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子が報告されている（特許文献１）。血中で正電荷を帯びる脂質ナノ粒子は、血漿タンパク質と非特異的な相互作用を起こして、細網内皮系により速やかに血中から消失する。これに対して、ｐＨ感受性カチオン性脂質を構成脂質として含む脂質ナノ粒子は、血中の中性条件下では電荷を帯びず、エンドソーム内の弱酸性条件下では正電荷を帯びて効率的にエンドソーム脱出を行うことができる。

全身投与型のｍＲＮＡワクチンとして、ＲＮＡ－ｌｉｐｏｐｌｅｘ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）がBioNTech社により報告されている（非特許文献２）。ＲＮＡ－ＬＰＸは、1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane（ＤＯＴＭＡ）と1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（ＤＯＰＥ）とが１：１（モル比）の脂質組成で、単純水和法又はエタノール希釈法で調製されたリポソームを用いて、ＤＯＴＭＡに含まれる第４級アンモニウムの数とｍＲＮＡのリン酸の数の比であるＮ／Ｐ比が１．３／２となるようにリポソームとｍＲＮＡを混合することによって、調製される。ＲＮＡ－ＬＰＸは、遺伝子発現を指標として非常に高い脾臓選択性を示し、特に脾臓樹状細胞で高い遺伝子発現を示す。ＲＮＡ－ＬＰＸは、２０２１年２月現在、メラノーマ、前立腺がん、ヒトパピローマウイルス１６型陽性頭頸部がん、トリプルネガティブ乳がん、及び卵巣がんに対する適用として、現在第Ｉ相臨床試験が実施されている（非特許文献３）。その他、ＣＯＶＩＤ－１９（Corona virus disease-19）の予防ワクチンとして２０２０年１２月１１日に、世界初となるｍＲＮＡ医薬品としてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）に緊急使用許可されたＴｏｚｉｎａｍｅｒａｎは、ＬＮＰ型製剤である（非特許文献４）。

国際公開第２０１８／２３０７１０号 国際公開第２０１８／１９０４２３号

Pardi et al., NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, 2018, vol. 17, p.261-279. Kranz et al., Nature, 2016, vol.534, p.396-401. Sahin et al., Nature, 2020, vol.585, p.107-112. Polack et al., The New ENGLAND JOURNAL of MEDICINE, 2020, vol. 383(27), p.2603-2615. Sato et al., Journal of Controlled Release, 2019, vol.295, p.140-152. Stroock et al., Science, 2002, vol.295, p.647-651. Hajj et al., Nano Letters, 2020, vol.20, p. 5167-5175.

ＲＮＡ－ＬＰＸは、全身投与型ｍＲＮＡがんワクチンとして先行している。しかし、免疫細胞を始めとした肝実質細胞以外の細胞への効率的な核酸送達を可能とするシステムの報告は未だ少なく、効率に関しても改善の余地がある。

本発明は、脾臓樹状細胞に高効率で送達可能な遺伝子送達キャリアとなる脂質ナノ粒子を提供することを目的とする。

本発明者らは、ｓｉＲＮＡ等の遺伝子発現用の核酸を封入する脂質ナノ粒子の構成脂質にｐＨ感受性カチオン性脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質を含有させ、かつ脂質ナノ粒子の大きさを個数平均粒子径１５０ｎｍ以上に調整することによって、脾臓樹状細胞への遺伝子発現効率を高められることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の脂質ナノ粒子等を提供するものである。
［１］ ｐＨ感受性カチオン性脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質とを含有しており、
脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、前記ｐＨ感受性カチオン性脂質の含有量の割合が４０～７０モル％であり、
脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の含有量の割合が０．５～１．７５モル％であり、
個数平均粒子径が１５０ｎｍ以上である、脂質ナノ粒子。
［２］ 個数平均粒子径が、６００ｎｍ以下である、前記［１］の脂質ナノ粒子。
［３］ 前記ｐＨ感受性カチオン性脂質が、下記一般式（Ｉ－１）

［式（Ｉ－１）中、Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_{１０－１４}アルキル基、１若しくは２個の不飽和結合を有する直鎖状のＣ_{１０－２０}アルケニル基、又は－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）（Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_５－１０アルキル基である）であり；ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して、６～１０の整数を示し；ｐ１及びｑ１は、ｐ１＋ｑ１＝３～８を満たす０以上の整数を示し；ｒ１は０又は１を示し；Ｒ^１３及びＲ^１４はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_１－３アルキル基又はアリールＣ_１－３アルキル基である、若しくは、Ｒ^１３及びＲ^１４が互いに連結して、ピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は窒素原子がＣ_１－３アルキル基で置換されていてもよいピペラジン環を形成する］
で表される、前記［１］又は［２］の脂質ナノ粒子。
［４］ さらに、ステロール及びリン脂質からなる群より選択される１種以上を含有している、前記［１］～［３］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［５］ 核酸を含有する、前記［１］～［４］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［６］ 前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、前記［５］の脂質ナノ粒子。
［７］ 前記核酸が、ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡである、前記［５］の脂質ナノ粒子。
［８］ 前記核酸が、脾臓樹状細胞内で発現させる遺伝子である、前記［５］～［７］のいずれかの脂質ナノ粒子。
［９］ 前記［１］～［８］のいずれかの脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
［１０］ がんワクチン療法に用いられる、前記［９］の医薬用組成物。
［１１］ 免疫賦活化のために用いられる、前記［９］の医薬用組成物。
［１２］ 前記［５］～［８］のいずれかの脂質ナノ粒子であって、脾臓樹状細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した脂質ナノ粒子を、被験動物（但し、ヒトを除く）へ投与し、前記被験動物の脾臓樹状細胞内で前記外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子の発現方法。
［１３］ 前記［５］～［８］のいずれかの脂質ナノ粒子を、流路構造体を用いて製造する方法であって、
前記脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液と、前記核酸を含有する水溶液とから、前記流路構造体中で脂質ナノ粒子を形成させる形成工程と、
前記形成工程で得られた脂質ナノ粒子を含む溶液を、ｐＨ６．８～７．６の緩衝液中で透析する透析工程と、
を有し、
前記流路構造体が、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成しており、
前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をｙ_０とした場合に、Ｙ方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に、１／２ｙ_０以上１ｙ_０未満の一定高さｈ_１、ｈ_２...を有し、かつＸ方向に一定幅ｘ_１、ｘ_２...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔ｄ_１、ｄ_２...をもって少なくとも２つ以上設けられていることで形成されており、
前記第１導入路より前記脂質溶液を、前記第２導入路より前記核酸を含有する水溶液を、それぞれ導入し、
前記核酸を含有する水溶液が、塩化ナトリウム濃度が２８０ｍＭ以上であり、かつ酸性である、脂質ナノ粒子の製造方法。
［１４］ 前記核酸を含有する水溶液の塩化ナトリウム濃度が、５００ｍＭ以下である、前記［１３］の脂質ナノ粒子の製造方法。
［１５］ 前記［１３］又は［１４］の脂質ナノ粒子の製造方法に使用するキットであって、
脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分を含有する脂質組成物の乾燥物、及び
塩化ナトリウムを含有し、水に溶解して塩化ナトリウム濃度が２８０ｍＭ以上の水溶液を調製するための乾燥物
を備える、脂質ナノ粒子製造用キット。
［１６］ さらに、エタノール、リン酸生理食塩水、及び核酸からなる群より選択される１種以上を含有する、前記［１５］の脂質ナノ粒子製造用キット。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、封入された遺伝子を脾臓樹状細胞内で高発現させることができる。このため、当該脂質ナノ粒子は、がんワクチン療法や遺伝子治療に用いられる脾臓樹状細胞特異的遺伝子送達キャリアとして有用である。

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造に用いられる流路構造体の一実施形態における構造を模式的に示す図面である。 実施例１において、試験区Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子の物性の測定結果を統計解析し、脂質ナノ粒子の大きさ（ζ平均粒子径）に有意に影響を与える因子の交互作用プロファイルを示した図である。 実施例１において、試験区Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子を投与したマウスの、肝臓及び脾臓におけるＮｌｕｃ発現量（タンパク質１ｍｇ当たり）の測定結果を示した図である。 実施例１において、試験区Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓中の樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージにおける脂質ナノ粒子の細胞内取り込み量の測定結果を示した図である。 実施例１において、試験区Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓中の樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージにおけるＮｌｕｃ発現量の測定結果を示した図である。 実施例２において、試験区Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓中の樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージにおける脂質ナノ粒子の細胞内取り込み量の測定結果を示した図である。 実施例２において、試験区Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓中の樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージにおけるＮｌｕｃ発現量の測定結果を示した図である。 実施例１及び２において、試験区Ａ－１～Ａ－１４と試験区Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓中の樹状細胞におけるＮｌｕｃ発現量の測定結果を示した図である。 実施例１及び２において、試験区Ａ－１～Ａ－１４と試験区Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子を投与したマウスにおける、脾臓樹状細胞への脂質ナノ粒子の取り込み量とＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量との関係（Ａ）、及び脾臓樹状細胞におけるＮｌｕｃ遺伝子発現量とＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量との関係（Ｂ）を示した図である。 実施例３において、試験区Ａ－１１、Ａ－１５、及びＡ１－１６の脂質ナノ粒子を投与したマウスにおける、脾臓樹状細胞への脂質ナノ粒子の取り込み量とＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量との関係（Ａ）、及び脾臓樹状細胞におけるＮｌｕｃ遺伝子発現量とＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量との関係（Ｂ）を示した図である。 実施例３において、試験区Ａ－１１、Ａ－１５、及びＡ１－１６の脂質ナノ粒子を４℃で保存した場合の、ζ平均粒子径（ｎｍ）（Ａ）とＲＮＡ封入率（％）（Ｂ）の経時的変化を示した図である。 実施例４において、ＯＶＡ－ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ）を予め投与した後、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下移植したマウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例４において、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下移植した後、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを投与したマウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例４において、２回目のＥ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞移植を行ったマウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例４において、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下移植した後、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを投与したマウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例５において、各脂質ナノ粒子を投与したマウスの、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び鼠径部リンパ節におけるＮｌｕｃ発現量を測定した結果を示した図である。 実施例５において、各脂質ナノ粒子を投与したマウスの、脾臓樹状細胞全体に対するＥＧＦＰ陽性細胞の割合（％）（Ａ）、脾臓樹状細胞のＥＧＦＰ平均蛍光強度（Ｂ）、及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量（Ｃ）の測定結果を示した図である。 実施例６において、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下移植した後、各脂質ナノ粒子を投与したマウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示した図である。

以下、本発明の実施態様について具体的に説明する。本願明細書において、「Ｘ１～Ｘ２（Ｘ１とＸ２は、Ｘ１＜Ｘ２を満たす実数）」は、「Ｘ１以上Ｘ２以下」を意味する。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、個数平均粒子径が１５０ｎｍ以上である。免疫細胞は、比較的大きな細胞外物質を取り込むマクロピノサイトーシスやファゴサイトーシス経路が発達している。本発明に係る脂質ナノ粒子は、個数平均粒子径が１５０ｎｍ以上と大きいことにより、脾臓樹状細胞へ高効率で取り込まれる。本発明に係る脂質ナノ粒子の個数平均粒子径は、１５０ｎｍ以上であれば特に限定されるものではなく、１５０～７００ｎｍが好ましく、１５０～６００ｎｍがより好ましく、２００～６００ｎｍがさらに好ましく、３００～６００ｎｍがよりさらに好ましく、４００～６００ｎｍが特に好ましい。

なお、脂質ナノ粒子の平均粒子径とは、特に記載のない限り、動的光散乱法（Dynamic light scattering：ＤＬＳ）により測定された個数平均粒子径を意味する。動的光散乱法による測定は、市販のＤＬＳ装置等を用いて常法により行うことができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子の多分散度指数（ＰｄＩ）は０．０１～０．７程度、好ましくは０．０１～０．５程度、さらに好ましくは０．０１～０．２程度である。ゼータ電位は１ｍＶ～２０ｍＶの範囲、好ましくは５ｍＶ～１５ｍＶの範囲とすることができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、ｐＨ感受性カチオン性脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質とを含有している。脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するｐＨ感受性カチオン性脂質の含有量の割合は４０～７０モル％であり、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するポリアルキレングリコール修飾脂質の含有量の割合は０．５～１．７５モル％である。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、構成する脂質成分としてｐＨ感受性カチオン性脂質を有することにより、血中滞留性とエンドソーム脱出能の両方に優れている。本発明に係る脂質ナノ粒子における脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するｐＨ感受性カチオン性脂質の含有量の割合（［ｐＨ感受性カチオン性脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、４０～７０モル％であれば特に限定されるものではなく、４０～６５モル％が好ましく、４０～６０モル％がより好ましい。

本発明に係る脂質ナノ粒子を構成するｐＨ感受性カチオン性脂質は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成するｐＨ感受性カチオン性脂質が２種類以上である場合、ｐＨ感受性カチオン性脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、ｐＨ感受性カチオン性脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。

ｐＨ感受性カチオン性脂質としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される脂質（以下、「ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）」ということがある）が好ましく用いられる。

一般式（Ｉ）において、ａは３～５の整数を示すが、好ましくは４である。
ｂは０又は１を示す。ｂが０の場合には-O-CO-基が存在せず、単結合であることを意味する。

一般式（Ｉ）において、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立に下記一般式（Ａ）で表される基を示す。一般式（Ａ）において、ｑは１～９の整数を示し；ｒは０又は１を示し；ｓは１～３の整数を示し；ｔは０又は１を示し；ｕは１～８の整数を示し；ｃは０又は１を示し；ｖは４～１２の整数を示す。ただし、ｂとｃが同時に０となる場合には、ｑが３～５の整数であり、ｒ及びｔが１であり、ｓが１であり、かつｕ＋ｖが６～１０の整数である場合を除く。

ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）としては、脂質ナノ粒子の安定性の点から、Ｒ^１及びＲ^２の炭化水素鎖が比較的長鎖であることが好ましい。具体的には、ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）では、Ｒ^１及びＲ^２は、炭素数２０以上の基であること、すなわち、一般式（Ａ）において、ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｃ＋ｖは１９以上の整数であることが好ましい。なかでも、ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）としては、ｑ＋２ｒ＋ｓ＋２ｔ＋ｕ＋ｃ＋ｖが１９～３３の整数であることが好ましく、１９～３１の整数であることがより好ましく、２１～３１の整数であることがさらに好ましく、２１～２７の整数であることがよりさらに好ましい。

ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）のＲ^１及びＲ^２としては、一般式（Ａ）において、ｒが１であり、ｔが０であり、ｑが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｓ＋ｕが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基；ｒが０であり、ｔが１であり、ｑ＋ｓが５～１１の整数、好ましくは６～１０の整数であり、ｕが５～８の整数であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１６以上の整数である基；ｒ及びｔが０であり、ｑ＋ｓ＋ｕが１３～２３の整数、好ましくは１５～２１であり、ｃが１であり、ｖが４～１２の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１８以上の整数である基；ｒ及びｔが０であり、ｑ＋ｓ＋ｕが１３～２３の整数、好ましくは１５～２１であり、ｃが１であり、ｖが６～１０の整数であり、ｑ＋ｓ＋ｕ＋ｖが１８以上の整数である基；が好ましい。

ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）では、Ｒ^１及びＲ^２は、一般式（Ａ）で表される基であればよく、互いに異なる基であってもよいが、同じ基であるほうが好ましい。

一般式（Ｉ）において、Ｘは、下記一般式（Ｂ）で表される基又は５～７員非芳香族ヘテロ環基を示す。Ｘが示す５～７員非芳香族ヘテロ環基は、炭素原子により(O-CO)b-に結合する。

一般式（Ｂ）中、ｄは０～３の整数を示す。ｄが０の場合には-(CH_２)-基が存在せず、単結合であることを意味する。

一般式（Ｂ）中、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立にＣ_１－４アルキル基（炭素数１～４のアルキル基）又はＣ_２－４アルケニル基（炭素数１～４のアルケニル基）を示す。Ｒ^３及びＲ^４が示すＣ_１－４アルキル基又はＣ_２－４アルケニル基は、１個又は２個の水素原子がフェニル基で置換されていてもよい。

Ｃ_１－４アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基が挙げられる。Ｃ_２－４アルケニル基としては、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチルビニル基、２－メチル－1－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基が挙げられる。

一般式（Ｂ）中、Ｒ^３及びＲ^４は、互いに結合して５～７員非芳香族ヘテロ環を形成していてもよい。Ｒ^３及びＲ^４が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環としては、例えば、１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－モルホリニル基、及び１－ピペラジニル基が挙げられる。Ｒ^３及びＲ^４が互いに結合して形成される５～７員非芳香族ヘテロ環は、環中の１個又は２個の水素原子がＣ_１－４アルキル基又はＣ_２－４アルケニル基に置換されていてもよい。該環中の２個の水素原子がＣ_１－４アルキル基又はＣ_２－４アルケニル基に置換されていている場合、互いに同じ基により置換されていてもよく、互いに異なる基により置換されていてもよい。

一般式（Ｉ）において、Ｘが５～７員非芳香族ヘテロ環基である場合、該ヘテロ環基に含まれるヘテロ原子としては、窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子などを挙げることができる。該ヘテロ環基中のヘテロ環を構成するヘテロ原子は、１個でもよく、同一又は異なるヘテロ原子が２個以上でもよい。該ヘテロ環基中のヘテロ環は、飽和のヘテロ環であってもよく、１個又は２個以上の二重結合が含まれていてもよいが、ヘテロ環が芳香環となることはない。

ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）のｐＫａは特に限定されないが、例えば４．０～９．０程度、好ましくは４．５～８．５程度、より好ましくは６～８程度で選択することができ、この範囲のｐＫａを与えるように各置換基の種類を選択することが好ましい。

ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ）は、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は一般式（Ｉ）の範囲に包含される任意の脂質を容易に製造することができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子が含有するｐＨ感受性カチオン性脂質としては、なかでも下記一般式（Ｉ－１）で表される脂質（以下、「ｐＨ感受性カチオン性脂質（Ｉ－１）」ということがある）が好ましい。

一般式（Ｉ－１）において、ｐ１及びｑ１は、ｐ１＋ｑ１＝３～８を満たす０以上の整数を示し、ｒ１は０又は１を示す。ｒ１が０の場合、ｐ１及びｑ１は、ｐ１＋ｑ１＝３～５を満たす０以上の整数であることが好ましく、ｐ１＋ｑ１＝４を満たす０以上の整数であることが特に好ましい。ｒ１が１の場合、ｐ１が３～５の整数であり、ｑ１が０～２の整数であることが好ましく、ｐ１が４であり、ｑ１が０～２の整数であることが特に好ましい。

一般式（Ｉ－１）において、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、６～１０の整数を示す。一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、ｎ１及びｎ２は、６、８、又は１０が好ましく、６がより好ましい。

一般式（１）において、Ｒ^１３及びＲ^１４はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_１－３アルキル基又はアリールＣ_１－３アルキル基である。直鎖状のＣ_１－３アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。アリールＣ_１－３アルキル基としては、フェニルＣ_１－３アルキル基が好ましく、フェニルメチル基（ベンジル基）が特に好ましい。

一般式（１）において、Ｒ^１３及びＲ^１４は、互いに連結して、ピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は窒素原子がＣ_１－３アルキル基で置換されていてもよいピペラジン環を形成してもよい。Ｒ^１３及びＲ^１４により形成されるピペラジン環の窒素原子が有していてもよいＣ_１－３アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられ、メチル基が好ましい。一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、ｒ１が０の場合には、Ｒ^１３及びＲ^１４が、共にｎ－プロピル基であるか、互いに連結してピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、ピペラジン環、又は窒素原子がメチル基で置換されたピペラジン環を形成している化合物が好ましく、Ｒ^１３及びＲ^１４が、共にｎ－プロピル基であるか、互いに連結してモルホリン環を形成している化合物がより好ましい。

一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは、４．５～７．５が好ましく、５．０～７．１がより好ましく、５．５～６．５がさらに好ましい。例えば、一般式（Ｉ－１）中、Ｒ^１３及びＲ^１４が共にｎ－プロピル基であるｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは、６．２５程度であり、Ｒ^１３及びＲ^１４が互いに連結してモルホリン環を形成しているｐＨ感受性カチオン性脂質のｐＫａは、５．８５程度である（非特許文献５）。

一般式（１）において、Ｒ^１１及びＲ^１２は、それぞれ独立に、直鎖状のＣ_{１０－１４}アルキル基、１若しくは２個の不飽和結合を有する直鎖状のＣ_{１０－２０}アルケニル基、又は－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）（Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_５－１０アルキル基である）である。一般式（１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質のうち、足場となるＲ^１１及びＲ^１２が、比較的中鎖のアルキル基、アルケニル基、又は分岐鎖状アルキル基であることにより、足場の流動性が高くなり、脾臓樹状細胞への導入効率がより良好となり、かつ毒性もより低く抑えられる。

直鎖状のＣ_{１０－１４}アルキル基（炭素数１０～１４のアルキル基）としては、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基が挙げられる。Ｒ^１１又はＲ^１２が直鎖状のＣ_{１０－１４}アルキル基の場合、一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に直鎖状のＣ_{１０－１４}アルキル基であることが好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ独立に、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、又はｎ－トリデシル基であることがより好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共にｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、又はｎ－トリデシル基であることがさらに好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共にｎ－トリデシル基であることがよりさらに好ましい。

１若しくは２個の不飽和結合を有する直鎖状のＣ_{１０－２０}アルケニル基（炭素数１０～２０のアルケニル基）としては、直鎖状のＣ_{１０－２０}アルキル基（炭素数１０～２０のアルキル基）のうち、アルキル鎖の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基であればよく、直鎖状のＣ_{１０－２０}アルキル基の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基が好ましく、直鎖状のＣ_{１３－１８}アルキル基（炭素数１３～１８のアルキル基）の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基がより好ましい。炭素数１０～２０のアルキル基としては、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－エイコシル基が挙げられる。直鎖状のＣ_{１３－１８}アルキル基の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基としては、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、又はｎ－オクサデシル基の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基であることがより好ましく、５－トリデセニル基、６－トリデセニル基、７－トリデセニル基、８－トリデセニル基、９－トリデセニル基、５－テトラデセニル基、６－テトラデセニル基、７－テトラデセニル基、８－テトラデセニル基、９－テトラデセニル基、６－ペンタデセニル基、７－ペンタデセニル基、８－ペンタデセニル基、９－ペンタデセニル基、１０－ペンタデシル基、６－ヘキサデセニル基、７－ヘキサデセニル基、８－ヘキサデセニル基、９－ヘキサデセニル基、１０－ヘキサデシル基、６－ヘプタデセニル基、７－ヘプタデセニル基、８－ヘプタデセニル基、９－ヘプタデセニル基、１０－ヘプタデセニル基、１１－ヘプタデセニル基、１２－ヘプタデセニル基、９，１２－ヘプタデセニル基、７－オクタデセニル基、８－オクタデセニル基、９－オクタデセニル基、１０－オクタデセニル基、１１－オクタデセニル基、７－ノナデセニル基、８－ノナデセニル基、９－ノナデセニル基、１０－ノナデセニル基、１１－ノナデセニル基、８－エイコセニル基、９－エイコセニル基、１０－エイコセニル基、１１－エイコセニル基、１２－エイコセニル基等が挙げられる。

Ｒ^１１又はＲ^１２が直鎖状のＣ_{１０－２０}アルケニル基の場合、一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に直鎖状のＣ_{１０－２０}アルケニル基であることが好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ独立に、直鎖状のＣ_{１３－１８}アルキル基の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基であることがより好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ独立に、６－ヘキサデセニル基、７－ヘキサデセニル基、８－ヘキサデセニル基、９－ヘキサデセニル基、１０－ヘキサデシル基、６－ヘプタデセニル基、７－ヘプタデセニル基、８－ヘプタデセニル基、９－ヘプタデセニル基、１０－ヘプタデセニル基、１１－ヘプタデセニル基、１２－ヘプタデセニル基、９，１２－ヘプタデセニル基、７－オクタデセニル基、８－オクタデセニル基、９－オクタデセニル基、１０－オクタデセニル基、又は１１－オクタデセニル基であることがさらに好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ独立して、６－ヘプタデセニル基、７－ヘプタデセニル基、８－ヘプタデセニル基、９－ヘプタデセニル基、１０－ヘプタデセニル基、１１－ヘプタデセニル基、１２－ヘプタデセニル基、又は９，１２－ヘプタデセニル基であることがよりさらに好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に８－ヘプタデセニル基であることが特に好ましい。

－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）（Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_５－１０アルキル基である）としては、例えば、－ＣＨ（－Ｃ_５Ｈ_１１）（－Ｃ_７Ｈ_１５）、－ＣＨ（－Ｃ_６Ｈ_１３）（－Ｃ_８Ｈ_１７）、－ＣＨ（－Ｃ_７Ｈ_１５）（－Ｃ_９Ｈ_１９）、－ＣＨ（－Ｃ_８Ｈ_１７）（－Ｃ_１０Ｈ_２１）等が挙げられる。Ｒ^１１又はＲ^１２が－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）の場合、一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）であることが好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２がそれぞれ独立に、－ＣＨ（－Ｃ_５Ｈ_１１）（－Ｃ_７Ｈ_１５）、－ＣＨ（－Ｃ_６Ｈ_１３）（－Ｃ_８Ｈ_１７）、－ＣＨ（－Ｃ_７Ｈ_１５）（－Ｃ_９Ｈ_１９）、又は－ＣＨ（－Ｃ_８Ｈ_１７）（－Ｃ_１０Ｈ_２１）であることがより好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に－ＣＨ（－Ｃ_６Ｈ_１３）（－Ｃ_８Ｈ_１７）であることがさらに好ましい。

一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ独立して直鎖状のＣ_{１３－１８}アルキル基の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基のいずれかの基である、又はＲ^１１及びＲ^１２が、それぞれ独立してｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、若しくはｎ－トリデシル基であり、かつｐが３～５である化合物が好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ独立して直鎖状のＣ_{１３－１８}アルキル基の中間付近の炭素原子間飽和結合の１個又は２個が不飽和結合となった基のいずれかの基であり、かつｐが３～５である化合物がより好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ独立して、６－ヘプタデセニル基、７－ヘプタデセニル基、８－ヘプタデセニル基、９－ヘプタデセニル基、１０－ヘプタデセニル基、１１－ヘプタデセニル基、１２－ヘプタデセニル基、又は９，１２－ヘプタデセニル基であり、かつｐが３～５である化合物がさらに好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に８－ヘプタデセニル基であり、かつｐが３～５である化合物がよりさらに好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に８－ヘプタデセニル基であり、Ｒ^１３及びＲ^１４が共にメチル基であり、かつｐが４である化合物が特に好ましい。

一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質としては、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ独立して－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）であり、かつｐが３～５である化合物であることも好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が、それぞれ独立に、－ＣＨ（－Ｃ_５Ｈ_１１）（－Ｃ_７Ｈ_１５）、－ＣＨ（－Ｃ_６Ｈ_１３）（－Ｃ_８Ｈ_１７）、－ＣＨ（－Ｃ_７Ｈ_１５）（－Ｃ_９Ｈ_１９）、又は－ＣＨ（－Ｃ_８Ｈ_１７）（－Ｃ_１０Ｈ_２１）であり、かつｐが３～５である化合物がより好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に－ＣＨ（－Ｃ_６Ｈ_１３）（－Ｃ_８Ｈ_１７）であり、かつｐが３～５である化合物がさらに好ましく、Ｒ^１１及びＲ^１２が共に－ＣＨ（－Ｃ_６Ｈ_１３）（－Ｃ_８Ｈ_１７）であり、かつｐが４である化合物がよりさらに好ましい。

一般式（Ｉ－１）で表されるｐＨ感受性カチオン性脂質は、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した方法により容易に製造することができる。この製造方法を参照し、原料化合物、試薬、及び反応条件などを適宜選択することにより、当業者は一般式（Ｉ－１）の範囲に包含される任意の脂質を容易に製造することができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、構成する脂質成分としてポリアルキレングリコール修飾脂質を有することにより、脂質ナノ粒子の表面がポリアルキレングリコールで修飾される。親水性ポリマーであるポリアルキレングリコールによる表面修飾は、脂質ナノ粒子の血中滞留性などの安定性を高めることができるが、脂質表面におけるポリアルキレングリコール密度が高すぎると、界面の安定化能が高く、脂質ナノ粒子の粒子径が小さくなりやすい。本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するポリアルキレングリコール修飾脂質の含有量の割合（［ポリアルキレングリコール修飾脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）が０．５～１．７５モル％であることにより、安定性が高く、かつ個数平均粒子径が１５０ｎｍ以上と比較的大きい。

本発明に係る脂質ナノ粒子における脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するポリアルキレングリコール修飾脂質の含有量の割合は、０．５～１．７５モル％であれば特に限定されるものではなく、０．５～１．６モル％が好ましく、０．５～１．５モル％がより好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成するポリアルキレングリコール修飾脂質は、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子を構成するポリアルキレングリコール修飾脂質が２種類以上である場合、ポリアルキレングリコール修飾脂質の量は、脂質ナノ粒子を構成する脂質分子のうち、ポリアルキレングリコール修飾脂質に相当する脂質分子の合計量を意味する。

ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレングリコール、ポリヘキサメチレングリコールなどを用いることができる。ポリアルキレングリコールの分子量は、例えば３００～１０，０００程度、好ましくは５００～１０，０００程度、さらに好ましくは１，０００～５，０００程度である。

例えば、脂質のポリエチレングリコールによる修飾には、ステアリル化ポリエチレングリコール（例えばステアリン酸ＰＥＧ４５（ＳＴＲ－ＰＥＧ４５）など）を用いることができる。その他、Ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－２０００]－１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、ｎ－［カルボニル－メトキシポリエチレングリコール－５０００］－１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル-メトキシポリエチレングリコール－７５０］－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、Ｎ－［カルボニル-メトキシポリエチレングリコール－２０００］－１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）などのポリエチレングリコール誘導体などを用いることもできるが、ポリアルキレングリコール修飾脂質はこれらに限定されることはない。

本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質のうち、ｐＨ感受性カチオン性脂質及びポリアルキレングリコール修飾脂質以外の脂質としては、一般的にリポソームを形成する際に使用される脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えば、リン脂質、ステロール、糖脂質、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、カルジオリピン、プラスマロゲン、セラミドホスフォリルグリセロールホスファート、ホスファチジン酸等のグリセロリン脂質；スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルエタノールアミン等のスフィンゴリン脂質；などを挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然物由来のリン脂質を用いることもできる。グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質における脂肪酸残基は、特に限定されないが、例えば、炭素数１２～２４の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、炭素数１４～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基が好ましい。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸などの脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。これらのグリセロ脂質又はスフィンゴ脂質が２以上の脂肪酸残基を有する場合、全ての脂肪酸残基が同一の基であってもよく、互いに異なる基であってもよい。

ステロールとしては、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロールなどが挙げられる。糖脂質としては、例えば、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；などが挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸などの炭素数１２～２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。

本発明に係る脂質ナノ粒子の構成脂質としては、ｐＨ感受性カチオン性脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質に加えて、中性脂質を含むことが好ましく、リン脂質及びステロールからなる群より選択される１種以上を含むことがより好ましく、リン脂質及びコレステロールを含むことがさらに好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子が構成脂質として、リン脂質とステロールの両方を含む場合、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するリン脂質の含有量の割合（［リン脂質の量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、５～４０モル％が好ましく、５～３０モル％がより好ましく、５～２０モル％がさらに好ましく、５～１５モル％がよりさらに好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子が構成脂質として、リン脂質とステロールの両方を含む場合、脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対するステロールの含有量の割合（［ステロールの量（ｍｏｌ）］／（［脂質ナノ粒子を構成する全脂質の量（ｍｏｌ）］）×１００％）は、５～４０モル％が好ましく、１０～４０モル％がより好ましく、１５～４０モル％がさらに好ましく、２０～４０モル％がよりさらに好ましい。

本発明に係る脂質ナノ粒子には、必要に応じて適宜の表面修飾などを行うことができる。
本発明に係る脂質ナノ粒子は、表面を親水性ポリマー等で修飾することにより、血中滞留性を高めることができる。これらの修飾基で修飾された脂質を脂質ナノ粒子の構成脂質として使用することにより、表面修飾を行うことができる場合もある。

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造にあたり、血中滞留性を高めるための脂質誘導体として、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体などを利用することもできる。また、血中滞留性を高めるための親水性ポリマーとして、ポリアルキレングリコールのほかにデキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどを表面修飾に用いることもできる。

また、本発明に係る脂質ナノ粒子の核内移行を促進するために、例えば、脂質ナノ粒子を３糖以上のオリゴ糖化合物で表面修飾することもできる。３糖以上のオリゴ糖化合物の種類は特に限定されないが、例えば、３～１０個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができ、好ましくは３～６個程度の糖ユニットが結合したオリゴ糖化合物を用いることができる。中でも、好ましくはグルコースの３量体ないし６量体であるオリゴ糖化合物を用いることができ、さらに好ましくはグルコースの３量体又は４量体であるオリゴ糖化合物を用いることができる。より具体的には、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースなどを好適に用いることができ、これらのうち、グルコースがα1-4結合したマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘキサオースがさらに好ましい。特に好ましいのはマルトトリオース又はマルトテトラオースであり、最も好ましいのはマルトトリオースである。オリゴ糖化合物による脂質ナノ粒子の表面修飾量は特に限定されないが、例えば、総脂質量に対して１～３０モル％程度、好ましくは２～２０モル％程度、より好ましくは５～１０モル％程度である。

オリゴ糖化合物で脂質ナノ粒子を表面修飾する方法は特に限定されないが、例えば、脂質ナノ粒子をガラクトースやマンノースなどの単糖で表面を修飾したリポソーム（国際公開第２００７／１０２４８１号）が知られているので、この刊行物に記載された表面修飾方法を採用することができる。上記刊行物の開示の全てを参照により本願明細書の開示として含める。

また、本発明に係る脂質ナノ粒子には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、脂質ナノ粒子の血液中での滞留性を向上させ、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質ナノ粒子を脱出させて、封入された核酸を脾臓樹状細胞内でより効率よく発現させることができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチドなどからなる群から選ばれる１種又は２種以上の物質を含んでいてもよい。正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの飽和若しくは不飽和脂肪族アミンなどを挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸などを挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチドなどが挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に分散した形態として一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、球状ミセル、又は不定型の層状構造物などを挙げることができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、脂質膜で覆われた粒子内部に、標的の細胞内に送達する目的の成分を内包していることが好ましい。本発明に係る脂質ナノ粒子が粒子内部に内包する成分としては、内包可能な大きさであれば特に限定されるものではない。本発明に係る脂質ナノ粒子には、核酸、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物など任意の物質を封入することができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる成分としては、核酸が好ましい。核酸としては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）やホスホロチオエートＤＮＡなど）であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよく、線状であってもよく、環状であってもよい。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸としては、特に脾臓樹状細胞への導入効率が良好であることから、ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であることが好ましい。

本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内で発現させるための外来遺伝子を含むことが好ましく、細胞内に取り込まれることによって外来遺伝子を細胞内で発現させるために機能する核酸であることがより好ましい。当該外来遺伝子は、標的細胞（好ましくは脾臓樹状細胞）のゲノムＤＮＡ中に本来含まれている遺伝子であってもよく、ゲノムＤＮＡ中に含まれていない遺伝子であってもよい。このような核酸としては、発現させる目的の遺伝子をコードする塩基配列からなる核酸を含む遺伝子発現ベクターが挙げられる。当該遺伝子発現ベクターは、導入された細胞内において、染色体外遺伝子として存在するものであってもよく、相同組換えによりゲノムＤＮＡ中に取り込まれるものであってもよい。

本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されるものではなく、一般的に遺伝子治療等で使用されるベクターを用いることができる。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる遺伝子発現ベクターとしては、プラスミドベクター等の核酸ベクターであることが好ましい。プラスミドベクターは、環状のままであってもよく、予め線状に切断した状態で本発明に係る脂質ナノ粒子に封入させてもよい。遺伝子発現ベクターは、発現させる対象の遺伝子の塩基配列情報に基づいて、一般的に使用される分子生物学的ツールを利用して常法により設計でき、公知の各種の方法で製造することができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内で翻訳して発現させるペプチド又はタンパク質をコードするｍＲＮＡであることも好ましい。当該ｍＲＮＡがコードするペプチド等は、標的細胞（好ましくは脾臓樹状細胞）のゲノムＤＮＡ中に本来含まれている遺伝子がコードするタンパク質又はその部分タンパク質であってもよく、標的細胞のゲノムＤＮＡ中に遺伝子が含まれていないタンパク質又はその部分タンパク質であってもよい。当該ｍＲＮＡは、導入された標的細胞内で翻訳可能であれば、その構造は特に限定されるものではないが、天然のｍＲＮＡと同様の構造を有していることが好ましい。当該構造としては、例えば、５’キャップ構造、３’ポリＡ構造、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域等が挙げられる。本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させるｍＲＮＡは、標的細胞内で発現させる目的のペプチド等のアミノ酸配列情報や当該ペプチド等をコードする塩基配列情報に基づいて、一般的に使用される分子生物学的ツールを利用して常法により設計でき、公知の各種の方法で製造することができる。

本発明に係る脂質ナノ粒子に内包させる核酸は、標的細胞内に存在する標的遺伝子の発現を制御する機能性核酸であることも好ましい。当該機能性核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させるｓｉＲＮＡ発現ベクターとなるｐＤＮＡであってもよい。ｓｉＲＮＡ発現ベクターとしては、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターから調製することができ、また、これを適宜改変してもよい。

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、当業者に利用可能な任意の方法を採用することができる。一例を挙げれば、全ての脂質成分をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって脂質膜を形成した後、当該脂質ナノ粒子に封入させる成分、例えば核酸等を含む水系溶媒を乾燥した上記の混合物に添加し、さらにホモジナイザーなどの乳化機、超音波乳化機、又は高圧噴射乳化機などにより乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質ナノ粒子の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルターなどを用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。

水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質ナノ粒子を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）などを加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質ナノ粒子を安定に長期間保存するには、凝集抑制などの物理的安定性の面から水系溶媒中の電解質を極力排除することが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面からは水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０～８．０程度）に設定し、及び／又は窒素バブリングなどにより溶存酸素を除去することが望ましい。

本発明に係る脂質ナノ粒子は、流路を用いたアルコール希釈法により製造することができる。製造に使用する流路としては、２液の瞬間混合を達成可能な三次元マイクロミキサー内蔵マイクロ流路であってもよいが、粒径制御性が高いナノサイズの脂質粒子形成システムを形成できることから、特許文献２に記載されているような、原料溶液を流すマイクロサイズの流路に、流路幅に対して一定幅のバッフル（邪魔板）を両側面より互い違いに配置した単純な二次元的構造の流路構造体を用いることが好ましい。

具体的には、図１に示すような流路構造体（以下、「本発明の流路構造体」ということがある。）を使用することが好ましい。その上流側（図面左側）おいて、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路１０と、第２の流動体を導入する第２導入路２０とが、それぞれ一定長を有して合流し、その下流側に向かって１つの希釈流路３０を形成している。前記希釈流路３０は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位５０を有し、当該屈曲した流路部位５０は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をｙ_０とした場合に、Ｙ方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に、１／２ｙ_０以上１ｙ_０未満の一定高さｈ_１、ｈ_２...を有し、かつＸ方向に一定幅ｘ_１、ｘ_２...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子４０が、一定間隔ｄ_１、ｄ_２...をもって少なくとも２つ以上設けられていることで形成されているものである。すなわち、前記構造子４０が存在する部位においては、Ｘ方向において一定長さｘ_１、ｘ_２...の間、希釈流路の流路幅ｙ_１、ｙ_２...が１／２ｙ_０以下、特に１／２ｙ_０以下１／４０ｙ_０以上に規制されることとなる。

なお、本発明の流路構造体は、概念的には、図１に例示し上記に説明したように、マイクロサイズの流路に略矩形状のバッフルを両側面より互い違いに配置したような形状であるが、実際上では、このように流路上に別体的なバッフルを配置することによって構成されるものに限られるものではない。すなわち、このようなバッフルを配置することで形成される流路に相応するように同様な形状の流路が形成される限り、構造子４０の構成としては特に限定されるものではなく、前記したような構造子４０を構成するように、流路構造体の壁面を（ほぼ一定肉厚を保ちながら）所定形状に屈曲させつつ、一体的に形成して、前記に規定したような屈折し縮拡する二次元構造の流路形状を構成するものであってもよく、本発明の流路構造体には、当然にこのような態様が含まれるものである。このような二次元構造の流路は、例えば、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、紫外線硬化性樹脂、金属ないしガラス質材料等を用いた射出成型、注型成形、三次元プリンターを用いた成型等によって比較的容易に形成し得るものである。

第１導入路１０と第２導入路２０が合流した後の希釈流路３０の流路幅ｙ_０は、形成しようとするナノサイズの脂質粒子の粒径の大きさによっても、ある程度左右されるが、代表的には２０～１０００μｍ程度、より好ましくは１００～２００μｍ程度とされることが好ましい。所望するナノサイズ、具体的には例えば約１０～１００ｎｍの粒径範囲内のサイズの粒径の脂質粒子を得る上では、上記したような範囲内の流路幅ｙ_０で脂質溶液を希釈媒体で希釈することがある程度必要な条件である。

また、各構造子４０の高さｈ_１、ｈ_２...（Ｙ方向長さ）としては、それより上流側における希釈流路３０の流路幅ｙ_０に対して１／２ｙ_０以上１ｙ_０未満、好ましくは１／２ｙ_０以上３９／４０ｙ_０以下、さらに好ましくは１／２ｙ_０以上３／４ｙ_０以下のものとされ、当該各構造子４０が存在することにより、それより上流側における希釈流路３０の流路幅ｙ_０から、流路幅ｙ_１、ｙ_２...を１／２ｙ_０未満で０よりも大きい幅に縮小させるものとされる。なお、屈曲した流路部位５０において複数設けられる当該構造子４０のそれぞれの高さｈ_１、ｈ_２...は、必ずしも同一なものである必要はなく、上記した所定の条件を満たす限り、それぞれ異なるものであってもよい。これによって形成される流路幅ｙ_１、ｙ_２...もそれぞれ異なるものであってもよい。例えば、下流方向に行くに従って、各構造子４０のそれぞれの幅ｈ_１、ｈ_２...が漸次長くなり、流路幅ｙ_１、ｙ_２...が狭められるような態様であってもよい。各構造子４０の高さｈ_１、ｈ_２...（Ｙ方向長さ）が所定のものであって、これらの存在する部位の流路幅ｙ_１、ｙ_２...が１／２ｙ_０未満の幅に絞られることで、分子拡散の効率が向上する。

得ようとする脂質粒子の大きさや、構造子４０の数、各ミキサー構造子４０の幅（Ｘ方向長さ）ｘ_１、ｘ_２...、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ_１、ｄ_２...等のその他の条件によっても左右され、特に限定されるものでもないが、具体的には例えば、上流の希釈流路の流路幅ｙ_０が２００μｍであった場合に、当該構造子４０のそれぞれの高さｈ_１、ｈ_２...は１００μｍ～２００μｍ未満とされることが望ましい。従って、各構造子４０が存在する位置での流路幅ｙ_１、ｙ_２...は、１／２ｙ_０未満で０よりも大きい幅である、１００μｍ未満程度とされる。

また、各構造子４０の幅（Ｘ方向長さ）ｘ_１、ｘ_２...、としては、得ようとする脂質粒子の大きさや、構造子４０の数、各構造子４０の高さｈ_１、ｈ_２...（Ｙ方向長さ）、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ_１、ｄ_２...等のその他の条件によっても左右されるが、上流の希釈流路の流路幅ｙ_０に対し、１／１０ｙ_０以上５ｙ_０以下程度の長さとされることが好ましい。具体的には例えば、上流の希釈流路の流路幅ｙ_０が、２０～１０００μｍ、代表的には２００μｍであった場合に、当該構造子４０のそれぞれの幅ｘ_１、ｘ_２...は２０μｍ～１０００μｍ程度とされることが望ましい。各構造子４０のそれぞれの幅ｘ_１、ｘ_２...は、必ずしも同一なものである必要はなく、上記した所定の条件を満たす限り、それぞれ異なるものであってもよい。例えば、下流方向に行くに従って漸次幅ｘ_１、ｘ_２...が長くなるような態様であってもよい。

また、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ_１、ｄ_２...としては、得ようとする脂質粒子の大きさや、構造子４０の数、各構造子４０の高さｈ_１、ｈ_２...（Ｙ方向長さ）、各構造子４０の幅（Ｘ方向長さ）ｘ_１、ｘ_２...、等のその他の条件によっても左右されるが、上流の希釈流路の流路幅ｙ_０に対し、１／１０ｙ_０以上５ｙ_０以下程度の長さとされることが好ましい。具体的には例えば、上流の希釈流路の流路幅ｙ_０が、２０～１０００μｍ、代表的には２００μｍであった場合に、隣接する各構造子４０間の間隔ｄ_１、ｄ_２...は２０μｍ～１０００μｍ程度とされることが望ましい。隣接する各構造子４０間の間隔ｄ_１、ｄ_２...は、必ずしも同一なものである必要はなく、上記した所定の条件を満たす限り、それぞれ異なるものであってもよい。例えば、下流方向に行くに従って漸次間隔ｄ_１、ｄ_２...が狭くなるような態様であってもよい。

なお、本発明の流路構造体において、上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とした場合、前記したように各構造子４０は、両側壁面より交互に、流路中心側に向かって略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に延長されており、流路方向（Ｘ方向）に略直角に抗する壁面を有するものであるが、この角度としては必ずしも厳密に９０°である必要はなく、ある程度傾斜したものであっても有効な構成となり得るものであり、特に限定されるものではないが、具体的には例えば、３０～１５０°程度、より望ましくは４０～１４０°、特に望ましくは８０～１００°の範囲であれば許容されるものである。さらに、各構造子４０の流路中心側の角部の形状としてもある程度の丸みは許容されるものであり、特に限定されるものではないが、例えばＲ５０μｍ以下、より望ましくはＲ２０μｍ以下であれば許容される場合もあり得る。しかしながら、より制御性高く均一なナノサイズの脂質粒子を得る上では、これらの許容差はできるだけ少ない方が望ましい。また、図１に示す実施形態においては、流路構造体における上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向であるＸ方向は便宜上で直線状に表わされているが、このＸ方向はあくまで希釈流路の軸線方向を示すものであって、実際上では、このような直線状なものに限られるものではなく、例えばある曲率をもって湾曲したものであってもよい。なお、このような場合には、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向であるＹ方向は、その単位長さの部位でのＸ方向と垂直な方向を指すこととなる。

また、本発明の流路構造体は、上記したように二次元的構造の流路構造体であるから、その流路の深さ方向（図１における紙厚方向）のサイズとしては、特に限定されるものではないが、例えば１０～１０００μｍ程度、より好ましくは５０～２００μｍ程度とすることが好ましい。

本発明に係る脂質ナノ粒子をアルコール希釈法により製造する際に用いられる流路としては、図１に示す流路構造体中の希釈流路３０が、三次元的な流れを生ずることができる流路であれば、特に限定されるものではない。例えば、本発明の流路構造体は、希釈流路３０の少なくともその一部において、二次元的に屈曲した流路部位５０に代えて、流路壁面に形成された溝又は微小突起によってカオティックな流れが生じるカオティックマイクロミキサー（スタッガードヘリンボーンミキサー）（非特許文献６）であってもよい。

本発明の流路構造体における希釈は、分子拡散に依存するものとなる。原料となる脂質溶液の希釈速度が速いほど、生成する脂質粒子のサイズが小さいものとなる。従って、構造子（バッフル）の幅や長さ、配置を調整することによって、原料溶液の希釈速度を制御することができ、従来よりも粒径制御性が高い脂質ナノ粒子を形成することが可能である。

本発明の流路構造体が、図１に示すように、第１の流動体を導入する第１導入路１０と、第２の流動体を導入する第２導入路２０とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成している場合には、第１導入路１０より脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液を、第２導入路２０より水溶液を、それぞれ導入する。第２導入路２０より導入する水溶液には、脂質ナノ粒子に搭載させる水溶性成分を溶解させておく。例えば、第２導入路２０より核酸を含有する水溶液（核酸含有水溶液）を導入することにより、希釈流路において、脂質溶液は核酸含有水溶液により希釈され、この過程で核酸を搭載した脂質ナノ粒子が形成される（形成工程）。

核酸含有水溶液は、脂質ナノ粒子に搭載させる目的の核酸を、水系溶媒に溶解させることにより調製できる。当該水系溶媒は、核酸を安定して溶解させることができる水系溶媒であり、かつ製造された脂質ナノ粒子が安定して分散可能であれば特に限定されるものではない。当該水系溶媒としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類；乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類；ラフィノース、メレジノースなどの三糖類；シクロデキストリンなどの多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコール；グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、1,3-ブチレングリコールなどの多価アルコール；などを加えてもよい。

核酸含有水溶液のｐＨが酸性の場合には、酸性環境下で脂質ナノ粒子が形成されることになる。このため、脂質ナノ粒子に含まれているｐＨ感受性カチオン性脂質が正電荷を帯びるため、負電荷を有する核酸との静電的相互作用により、核酸が脂質ナノ粒子に効率よく搭載される。このため、核酸を搭載した脂質ナノ粒子を形成する場合には、核酸を酸性緩衝液に溶解させて核酸含有水溶液を調製することが好ましい。酸性緩衝液のｐＨは、３．５～６．０の範囲内が好ましく、３．８～５．５の範囲内がより好ましく、３．８～５．０の範囲内がさらに好ましく、３．８～４．５の範囲内がよりさらに好ましい。酸性緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等を用いることができる。

核酸含有水溶液のｐＨが酸性の場合には、透析工程として、流路構造体で形成された脂質ナノ粒子は、ＰＢＳ等の生体内に投与可能な中性ｐＨ（ｐＨ６．８～７．６）の緩衝液で透析させることが好ましい。これにより、動物に比較的安全に投与可能な脂質ナノ粒子が得られる。

核酸含有水溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が２８０ｍＭ以上となるように調整されることが好ましい。一般的に、図１に示すような流路構造体を用いた場合には、形成される脂質ナノ粒子の粒子径は１００ｎｍ以下であり、その多くは２０ｎｍ程度である。しかし、核酸含有水溶液の塩濃度が高い場合には、核酸同士の電荷反発が緩和され、水和も阻害される結果、界面が不安定化することにより、形成される脂質ナノ粒子の粒子径が大きくなる。そして、この粒子径が増大された脂質ナノ粒子を、中性ｐＨを示す緩衝液で透析させることにより、脂質ナノ粒子同士が融合して、個数平均粒子径が３００ｎｍ以上となる大きな脂質ナノ粒子が得られる。核酸含有水溶液のＮａＣｌ濃度としては、２８０ｍＭ以上であれば特に限定されるものではなく、２８０～５００ｍＭが好ましく、２８０～４５０ｍＭがより好ましく、２８０～４２０ｍＭがさらに好ましい。

本発明の流路構造体は、互いに独立した複数の導入路を有しており、それらの導入路が、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成していればよく、３つの導入路を有していてもよい。本発明の流路構造体が３つの導入路を有する場合、第１導入路から導入された第１の流動体が、第２導入路から導入された第２の流動体と合流する前に、第３導入路から導入された第３の流動体と接触するように、第１導入路と第２導入路と第３導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成することができる。核酸を搭載した脂質ナノ粒子を製造する場合には、第１導入路より脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液を、第２導入路より核酸含有水溶液を、第３導入路より、核酸含有水溶液の調製に使用した水系溶媒を、それぞれ導入する。

必要に応じて透析された脂質ナノ粒子の水性分散物は、使用時まで、乾燥させた状態で保存することができる。脂質ナノ粒子の水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトースなどの二糖類、ラフィノース、メレジノースなどの三糖類、シクロデキストリンなどの多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトールなどの糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。また、上記水性分散物を凍結する場合には、例えば、前記の糖類やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３－ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）を用いると安定性を改善できる場合がある。

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造に使用する各種試薬等をキット化することにより、本発明に係る脂質ナノ粒子をより簡便に製造できる。例えば、核酸を搭載した脂質ナノ粒子を、前記流路構造体を用いて製造する場合には、脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分を含有する脂質組成物の乾燥物と、ＮａＣｌを含有し、水に溶解してＮａＣｌ濃度が２８０ｍＭ以上の水溶液を調製するための乾燥物とを備えるキットを脂質ナノ粒子製造用キットとすることが好ましい。脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分を含有する脂質組成物の乾燥物をエタノールに溶解させることにより、図１に示す流路構造体の第１流路に導入する脂質溶液を簡便に調製できる。また、水に溶解してＮａＣｌ濃度が２８０ｍＭ以上の水溶液を調製するための乾燥物と、水と、脂質ナノ粒子に搭載させる核酸とを混合することにより、図１に示す流路構造体の第２流路に導入する核酸含有水溶液を簡便に調製できる。当該キットは、さらに、エタノール、リン酸生理食塩水、及び核酸からなる群より選択される１種以上を含有することも好ましい。

遺伝子発現ベクターを封入した本発明に係る脂質ナノ粒子を動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入された遺伝子発現ベクターは、脾臓樹状細胞において高効率で発現する。同様に、ｍＲＮＡを封入した本発明に係る脂質ナノ粒子を動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡは、脾臓樹状細胞に導入されて翻訳され、当該ｍＲＮＡがコードしていたペプチド等が高効率で発現する。また、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを封入した本発明に係る脂質ナノ粒子を動物個体に投与すると、当該脂質ナノ粒子に封入されたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、脾臓樹状細胞において高効率で発現し、当該発現ベクターが標的とする遺伝子の発現が抑制される。

この脾臓樹状細胞に対する高選択的な遺伝子発現活性により、本発明に係る脂質ナノ粒子は、脾臓樹状細胞を標的とする遺伝子発現キャリアとして機能する。本発明に係る脂質ナノ粒子に、脾臓樹状細胞内で発現させる目的の外来遺伝子又はｍＲＮＡを封入した上で、被験動物へ投与することにより、当該被験動物の脾臓樹状細胞内で当該外来遺伝子及びｍＲＮＡが発現する。このため、本発明に係る脂質ナノ粒子は、遺伝子治療に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用であり、例えば、脾臓樹状細胞を標的とする遺伝子治療に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用である。

また、本発明に係る脂質ナノ粒子は、抗原をコードする核酸を搭載した核酸ワクチンとして特に有用である。核酸ワクチンとしては、ＤＮＡワクチンであってもよいが、ｍＲＮＡワクチンであることが好ましい。ｍＲＮＡワクチンは、細胞質への導入で充分であるため、細胞核内への導入が必要なＤＮＡワクチンよりも汎用性が高い。本発明に係る脂質ナノ粒子がｍＲＮＡワクチンの場合、当該脂質ナノ粒子を動物へ投与すると、当該動物の脾臓樹状細胞内で、当該脂質ナノ粒子に搭載されたｍＲＮＡが翻訳されて抗原タンパク質が発現する。この発現した抗原タンパク質により免疫システムが活性化される。加えて、ｍＲＮＡ自体が強い免疫原性を有しているため、ｍＲＮＡワクチンは、アジュバンド等の免疫賦活化剤を併用せずとも、抗原タンパク質に対する免疫を獲得できると期待できる。すなわち、本発明に係る脂質ナノ粒子は、がんワクチン療法や感染症治療に使用されるワクチンとして有用である。

本発明に係る脂質ナノ粒子が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。また、本発明に係る脂質ナノ粒子を動物に投与する際の投与経路は、特に限定されるものではないが、経静脈投与、経腸投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等の非経口投与であることが好ましい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜ＲＮＡを搭載した脂質ナノ粒子の製造＞
以降の実験において、核酸を搭載した脂質ナノ粒子は、図１に示すような流路構造体を含む脂質ナノ粒子製造装置（「ｉＬｉＮＰ」、ライラックファーマ社製）を用いて製造した。

核酸含有水溶液は、酢酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０）に、必要に応じてＮａＣｌを溶解させた溶液に、脂質ナノ粒子に搭載させる核酸を０．１４２ｍｇ ＲＮＡ／ｍＬとなるように溶解させて調製した。脂質ナノ粒子に搭載させる核酸としては、特に記載のない限り、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードしたｍＲＮＡ（ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡ）と、マウスに相同配列のないhuman polo-like kinase 1（ｈＰＬＫ１）標的ｓｉＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ：ｈＰＬＫ１－ｓｉＲＮＡ）を、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡ：ｈＰＬＫ１－ｓｉＲＮＡ＝１：１９（重量比）で混合したものを用いた。なお、ｈＰＬＫ１－ｓｉＲＮＡは、Ｉ型ＩＦＮ応答を引き起こさないことが明らかとなっている２’－ＯＭｅ修飾体を使用した。ｍＲＮＡ単独ではなく、ｓｉＲＮＡとの混合物として脂質ナノ粒子に搭載させたのは、ｍＲＮＡの投与量を変化させることなく、動物個体に投与する脂質ナノ粒子量を増大させて、脂質ナノ粒子の取り込み効率測定の測定感度を高めるためである。

脂質溶液は、脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分と、脂溶性蛍光色素ＤｉＯを、エタノールに溶解させることによって調製した。ＤｉＯは、全脂質成分に対して０．１モル％量添加した。ＤｉＯを脂質溶液に含有させることにより、ＤｉＯで修飾された脂質ナノ粒子が製造できた。

適量の核酸含有水溶液を２．５ｍＬ容シリンジに分取し、適量の脂質溶液を１ｍＬ容シリンジに分取し、それぞれをシリンジポンプを介して脂質ナノ粒子製造装置に接続し、酸含有水溶液と脂質溶液を流速比３：１（以降のＡ－１１組成の場合に、Ｎ／Ｐ比＝７．４）、総流速５００μＬ／分となるように、脂質ナノ粒子製造装置に導入した。

脂質ナノ粒子製造装置の希釈流路から排出された溶液を、透析膜（「Spectra/Por 4 dialysis membrane」、ＭＷＣＯ：１２，０００～１４，０００、Spectrum Laboratories社製）に移し、外水相をＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．０）に置換して４℃で２時間以上透析した。その後、外水相をＰＢＳ（－）に替えて再び４℃で２時間以上透析することによって、エタノールの除去及び脂質ナノ粒子内部の水系溶媒をＰＢＳに交換した。透析終了後に回収した溶液を、脂質ナノ粒子溶液（ＬＮＰ溶液）として用いた。

＜脂質ナノ粒子の平均粒子径とゼータ電位の測定＞
脂質ナノ粒子のＰＢＳ（－）中における平均粒子径（個数平均値、ζ平均値）及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中におけるゼータ電位を、動的光散乱法を利用した分析装置「Zetasizer Nano ZS ZEN3600」（Malvern社製）を用いて測定した。

＜脂質ナノ粒子のＲＮＡ封入率＞
脂質ナノ粒子のＲＮＡの封入率は、ＲＮＡに選択的にインターカレーションを起こして蛍光を発光する「Quant-iT（登録商標） RiboGreen（登録商標） RNA」（Thermo Fisher Scientific社製）を用いたアッセイ（Ribogreen Assay）により定量した。

ＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、１０％（ｗ／ｖ） ｔｒｉｔｏｎＸ－１００、及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎをそれぞれ、９７８．８μＬ、２０μＬ、１．２５μＬずつ混合した溶液（Ｔｒｉｔｏｎ（＋））と、ＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎをそれぞれ、９９８．８μＬ、１．２５μＬずつ混合した溶液（Ｔｒｉｔｏｎ（－））と、を用意した。
また、検量線サンプルとして、５００ｎｇ ＲＮＡ／ｍＬとなるようにＲＮＡをＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈し他ＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液をＨＥＰＥＳバッファーで適宜希釈して適当な希釈系列を調製した。
ＬＮＰ溶液は、５００ｎｇ／ｍＬとなるようにＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈した。

蛍光測定用黒色９６ウェルプレートに、検量線用サンプル及び希釈したＬＮＰ溶液を、それぞれ１００μＬ／ウェルで添加し、さらにＲｉｂｏＧｒｅｅｎの入った溶液（Ｔｒｉｔｏｎ（＋）又はＴｒｉｔｏｎ（－））を１００μＬ／ウェル添加した。当該プレートをシェーキングインキュベーター（「SI-300」、AS ONE社製）で７００ｒｐｍ、３０秒間で振盪した後、マイクロプレートリーダー（「Enspire 2300 Multilabel Reader」、Perkin Elmer社製）に設置して、各ウェル中の溶液の蛍光強度を測定した（Excitation/Emission：500/525 nm、Band width：5nm、Measurement time： 500 msec/well、Dynamic range：Autorange、Temperature：r.t.）。得られた蛍光強度から、下の式に従ってＲＮＡの封入率を算出した。検量線及び各ＬＮＰサンプルは、duplicateで測定した。

［RNA封入率（％）］＝（［Triton(+)におけるRNA濃度］－［Triton(-)におけるRNA濃度]） ／ ［Triton(+)におけるRNA濃度］×100

＜ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡの調製＞
ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡは、ＮＬｕｃ遺伝子を含むｐＤＮＡ（pUC57-amp-T7-NLuc-IRES-RFP）からin vitro転写により調製した。
まず、ｐＤＮＡ（pUC57-amp-T7-NLuc-IRES-RFP）を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した後、消化物からフェノール・クロロホルム法によりＤＮＡを精製した後、滅菌水に溶解させて、直線化したｐＤＮＡの１μｇ／μＬ溶液を得た。次いで、この直線状ｐＤＮＡを鋳型として、転写反応とポリＡ付加反応を行った。転写反応とポリＡ付加反応は、市販のキット（「mMESSAGE mMACHINETM T7 ultra transcription kit」、invitrogen社製）を用い、当該キットに付属のプロトコルに従って行った。当該キットにより、５’末端にｍ７Ｇヌクレオチドの３’ＯＨ基をＯＣＨ_３基に置換したキャップアナログが付加され、かつ３’末端にポリＡが付加されたｍＲＮＡをin vitro合成した。
反応後に得られたｍＲＮＡを、フェノール・クロロホルムにより精製した後、イソプロパノール沈殿させて回収して風乾させた後に、滅菌水に再溶解させた。この再溶解後のＲＮＡ溶液を、市販のＲＮＡ濃縮・精製用キットを用いて精製した。
in vitro合成により得られたＲＮＡは、アガロース電気泳動を行い、５’末端のキャップ構造と３’末端のポリＡが付加されていることを確認した。

＜肝臓及び脾臓のＮｌｕｃ発現量の測定＞
ＲＮＡを搭載し、ＤｉＯで標識した脂質ナノ粒子を尾静脈投与したｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを安楽死させ、肝臓及び脾臓を採取した。肝臓及び脾臓は、重量を測定した後に凍結させ、－８０℃で保管した。なお、脾臓は、脾臓免疫細胞の解析に使用するため、凍結保管前にその一部を取り分け、残りを凍結して保管した。

凍結保管した組織とジルコニアビーズ（直径１．４ｍｍ）を入れたサンプルチューブに、１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを１ｍＬ／チューブで添加し、ビーズ式細胞破砕装置を用いて４℃、５０００ｒｐｍ、４０秒間で組織を破砕した。得られた破砕物を４℃、１３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離処理した後、上清を回収して測定用サンプルとした。

Ｎｌｕｃ発現量は、市販のルシフェラーゼアッセイシステム（「Nano-Glo（登録商標） Luciferase Assay System」、プロメガ社製）を用いて行った。まず、Nano-Glo Luciferase Assay SubstrateとNano-Glo Luciferase Assay Bufferを５０：１で混合し、Nano-Glo Luciferase Assay Reagentを得た。２５μＬの測定用サンプルと２５μＬのNano-Glo Luciferase Assay Reagentを混合し、３分間インキュベートした後、各サンプルの発光量をルミノメーター（「Luminescencer-PSN AB-2200」ATTO社製）で測定した。ルシフェラーゼ発光量に対する各臓器間のタンパク量は、ＢＣＡ（Bicinchoninic acid）アッセイで補正した。ＢＣＡアッセイは、検量線作成のためのタンパク質としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用い、市販のＢＣＡアッセイキット（「Pierce BCA protein assay」、Pierce社製）用いて行った。

＜脾臓免疫細胞における脂質ナノ粒子の細胞内取り込み及びＮｌｕｃ発現量の測定＞
脾臓の一部をハサミで細断した後、適量のハンクス平衡塩溶液（－）（ＨＢＳＳ（－））を添加して脾臓から細胞をほぐした。得られた懸濁液を、４０μｍセルストレイナーに通し、４℃、４００ｇ、５分間遠心分離処理した。上清を除去した後、沈殿に１ｍＬのＲＢＣライシスバッファーを添加することで再懸濁し、３分間室温でインキュベートした。その後、懸濁液をＨＢＳＳ（－）で１０倍希釈し、再び４℃、４００ｇ、５分間遠心分離処理して、上清除去した。得られた沈殿を適量のＨＢＳＳ（－）で再懸濁した後、細胞数を計数し、１．５ｍＬ容チューブに適量の細胞数となるように分取し、４℃、４００ｇ、５分間遠心分離処理した。上清を除去した後、ブロッキング処理として、沈殿に、精製抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＦＡＣＳ バッファーで１０μｇ／ｍＬに調製）を１００μＬ／１．０×１０^６ｃｅｌｌｓとなるように添加し、５分間おきにタッピングしつつ１０分間、４℃でインキュベートした。

ブロッキング後の細胞に、ＰＥ標識抗マウスＦ４／８０抗体とＡＰＣ標識抗マウスＣＤ１１ｃ抗体とＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５標識抗マウスＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体、及びＰＥ／Ｃｙ７標識抗マウスＣＤ１９抗体を用いて抗体染色し、５分間おきにタッピングしつつ３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベート終了後、ＦＡＣＳバッファーにより１０００μＬ／チューブに調製して、４℃、４００ｇ、５分間遠心分離処理した。続けて２回、１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄したものを、ＦＡＣＳ解析用サンプルとした。

ＦＡＣＳは、セルソーター（「SH800」、ソニー社製）を用いて行った。サンプルにＰＩ（Propidium Iodide）溶液を６μＬ／１×１０^６ｃｅｌｌｓとなるように添加し、約１５分後に、セルソーターを用いて、２０μＬの２×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒが入った１．５ｍＬ容チューブに、樹状細胞（ＤＣ細胞）、マクロファージ（Ｍφ）、及びＢ細胞を、それぞれ細胞数３０００個（約２０μＬ）となるように分取した。細胞表面抗原の発現パターンから、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ陽性かつＣＤ１１ｃ陽性の細胞を樹状細胞として分取し、Ｆ４／８０陽性細胞をマクロファージとして分取し、ＣＤ１９陽性細胞をＢ細胞として分取した。

なお、セルソーターの蛍光補正は、市販の蛍光補正用キット（「VersaComp Antibody Capture Bead Kit」、Beckman Coulter社製）を用いて行った。セルソーターの蛍光漏れ込み補正用のビーズの調製は、当該キットに添付のプロトコルに従って行った。

セルソーターで分画された樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージについて、それぞれ、細胞内への脂質ナノ粒子の取り込み量とＮｌｕｃ発現量を測定した。脂質ナノ粒子の取り込み量は、各細胞のＤｉＯの蛍光強度の平均値として測定した。各細胞のＮｌｕｃ発現量の測定は、市販のルシフェラーゼアッセイシステム（「Nano-Glo（登録商標） Luciferase Assay System」、プロメガ社製）を用いて前記の通りにして行った。

＜担がんマウスの作製＞
担がんマウスは、ＯＶＡ発現マウス悪性リンパ腫由来の培養細胞株Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞をマウスに皮下移植することにより作製した。
Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０培地中で、３７℃、５体積％ ＣＯ２環境下で培養した。生細胞数の計測は、トリパンブルー染色法により行った。
Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を２×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように冷Ｄ－ＰＢＳ（－）で懸濁した細胞懸濁液を、４℃で細胞を保存しつつ、２６Ｇ注射針を用いて、８×１０^５ ｃｅｌｌｓ／４０μＬ／ｍｏｕｓｅとなる量を、右脇腹を剃毛したｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、雌性、ｓｌｃから供給）に皮下移植した。細胞懸濁液の調製から皮下移植までは、２時間以内に終了させた。

＜腫瘍体積の測定＞
担がんマウスの腫瘍体積は、デジタルノギスを用いて、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞移植後６日目より３日おきに、以下の式に従って算出した。

［腫瘍体積(ｍｍ^３)］＝［長径(ｍｍ^３)］×［短径(ｍｍ^３)］×［短径(ｍｍ^３)］×０．５２

腫瘍体積４０００ｍｍ^３をエンドポイントとし、それを超えたマウスは、頸椎脱臼により安楽死させた。

［実施例１］
核酸を含有する脂質ナノ粒子において、脾臓樹状細胞における発現効率に対する、調製時の各因子の主効果の程度を明らかにすることを重視した決定的スクリーニング計画を実施した。検討する因子として、ｐＨ感受性カチオン性脂質の種類と含有量、リン脂質の含有量、ＰＥＧ脂質の含有量、及び核酸含有水溶液のＮａＣｌ濃度を選出し、各水準を設定した。

脂質ナノ粒子を構成する脂質成分として、ｐＨ感受性カチオン性脂質（ＣＬ）、リン脂質（ＰＬ）、コレステロール（ｃｈｏｌ）、及びＰＥＧ脂質を用いた。ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＣＬ４Ｈ６又はＣＬ７Ｈ６を用い、リン脂質としてＤＯＰＥを用いた。ＰＥＧ脂質として、血中において速やかに脱離するＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ、又は、脱離しにくく血中滞留化に寄与するＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧを使用した。ＣＬ４Ｈ６及びＣＬ７Ｈ６は、特許文献１に記載の方法で合成したものを用いた。各試験区の全脂質成分に対するｐＨ感受性カチオン性脂質の含有割合（モル％）、リン脂質の含有割合（モル％）、及びＰＥＧ脂質の含有割合（モル％）を表１に示す。なお、コレステロール含有割合（モル％）は、１００モル％から、ｐＨ感受性カチオン性脂質とリン脂質とＰＥＧ脂質の含有割合を差し引いた残部である。

データ分析ソフトウェア「ＪＭＰ（登録商標）」（SAS社製）に基づいて実験計画を作成し、全３２４通り（３^４×２^２）のうち１４種類の組成（Ａ－１～Ａ－１４）を抜粋した。次いで、表１に記載の脂質組成により、表１に記載のＮａＣｌ濃度に調製した核酸含有溶液を用いて、ＲＮＡを搭載させた脂質ナノ粒子を調製した。調製した各脂質ナノ粒子のζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びＲＮＡ封入率（％）を測定した。各試験区の脂質ナノ粒子サンプルは、duplicateで測定した（ｎ＝２）。測定結果を表２に示す。

表２に示すように、ζ平均粒子径として約８０～７５０ｎｍの範囲の脂質ナノ粒子が調製された。また、脂質ナノ粒子の均一性の指標であるＰｄＩにおいて、多くの脂質ナノ粒子は０．２以下を示し、全ての脂質ナノ粒子でＲＮＡ封入率は７０％以上であった。統計解析により、ζ平均粒子径に対する各因子の効果を検定したところ、ＤＯＰＥの割合、ＰＥＧ脂質の割合、及び脂質ナノ粒子調製時のＮａＣｌ濃度が、統計学的有意にζ平均粒子径に影響を及ぼすことが示された（表３、図２）。より詳細には、ＤＯＰＥの割合を小さくする、ＰＥＧ脂質の割合を小さくする、及び、脂質ナノ粒子調製時のＮａＣｌ濃度を高くすることによって、脂質ナノ粒子のζ平均粒子径が大きくなることがわかった。

また、ＰＥＧ脂質の割合及び脂質ナノ粒子調製時のＮａＣｌ濃度が、統計学的有意に個数平均粒子径に影響を及ぼすことが示された。より詳細には、ＰＥＧ脂質の割合を小さくする、及び、脂質ナノ粒子調製時のＮａＣｌ濃度を高くすることによって、脂質ナノ粒子の個数平均粒子径が大きくなることがわかった。さらに、ｐＨ感受性カチオン性脂質の割合、ＤＯＰＥの割合、及びｐＨ感受性カチオン性脂質の種類が、統計学的有意にＲＮＡ封入率に影響を及ぼすことが示された。より詳細には、ｐＨ感受性カチオン性脂質の割合を大きくする、ＤＯＰＥの割合を大きくする、及びｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ７Ｈ６を用いることにより、脂質ナノ粒子のＲＮＡ封入率が高くなることがわかった。

各試験区で調製した脂質ナノ粒子を、１．０ｍｇ ＲＮＡ／ｋｇでｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、雌性、slc社より供給）に、尾静脈投与した。脂質ナノ粒子の投与から２４時間後に、当該マウスを安楽死させ、肝臓及び脾臓におけるＮｌｕｃ発現量を測定した。また、採取された脾臓中の樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージにおける脂質ナノ粒子の細胞内取り込みとＮｌｕｃ発現量を測定した。

Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子を投与したマウスの、肝臓及び脾臓における、タンパク質１ｇ当たりのＮｌｕｃ発現量の測定結果を図３に示す。また、Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓免疫細胞における、脂質ナノ粒子の取り込み量（各細胞のＤｉＯの蛍光強度の平均値）の測定結果を図４に、Ｎｌｕｃ発現量の測定結果を図５に、それぞれ示す。

樹状細胞におけるＮｌｕｃ遺伝子発現量は、Ａ－６、Ａ－１０、Ａ－１１、Ａ－１３及びＡ－１４の脂質ナノ粒子が多く、特に、Ａ－１１の脂質ナノ粒子が最も遺伝子発現に優れていた（図５）。一方で、細胞内への脂質ナノ粒子の取り込みは、いずれの試験区の脂質ナノ粒子であっても、樹状細胞よりもマクロファージの方が多かった（図４）。これらの結果から、細胞内に取り込まれた脂質ナノ粒子量に対する遺伝子発現の割合は、マクロファージと比較して樹状細胞が高いことが確認された。また、Ｂ細胞には、脂質ナノ粒子はほとんど取り込まれておらず（図４）、遺伝子発現も確認されなかった（図５）。

脾臓全体におけるＮｌｕｃ発現量は、Ａ－１１の脂質ナノ粒子が最も多く、Ａ－２及びＡ－７の脂質ナノ粒子も多かった（図３）。Ａ－２及びＡ－７の脂質ナノ粒子は、樹状細胞での遺伝子発現はごくわずかであったことから、これらの脂質ナノ粒子は、大部分がマクロファージ等の樹状細胞以外の脾臓細胞に取り込まれたと推察された。これらの結果から、脾臓全体の遺伝子発現が高ければ必ず樹状細胞の遺伝子発現も高くなるというわけではないことが示された。

統計解析の結果、ｐＨ感受性カチオン性脂質の割合、ＤＯＰＥの割合、ｐＨ感受性カチオン性脂質の種類、及びＰＥＧ脂質の種類が、統計学的有意に脾臓におけるＮｌｕｃ発現量に影響を及ぼすことが示された。また、個数平均粒子径が１００ｎｍ以上である脂質ナノ粒子は、個数平均粒子径が１００ｎｍ未満である脂質ナノ粒子と比較して、統計的学有意に樹状細胞における遺伝子発現が高かった。また、脾臓樹状細胞における遺伝子発現に関して（図４）、上位の５試験区の脂質ナノ粒子と下位５試験区の脂質ナノ粒子で出現するＰＥＧ量、ＮａＣｌ濃度、及びｐＨ感受性カチオン性脂質の種類の各水準の頻度から、ＰＥＧ量を少なくし、ＮａＣｌ濃度を高くし、ｐＨ感受性カチオン性脂質としてＣＬ４Ｈ６を使用することが、脾臓樹状細胞における遺伝子発現効率を高めるために適していることが示唆された。

［実施例２］
設定した領域に対して均等に因子の値を割り振ることによって組成の絞り込みを行うことができるタグチ計画（一部実施計画）を用いて、脂質ナノ粒子の脂質組成の再検討を行った。

実施例１の結果をふまえて、樹状細胞における遺伝子発現に粒子径が寄与することを考慮し、平均粒子径が１００ｎｍ以上となるように、脂質ナノ粒子調製時の核酸含有水溶液のＮａＣｌ濃度を３００ｍＭとした。また、脾臓における遺伝子発現増加に影響を与える主効果を考慮し、ｐＨ感受性カチオン性脂質として、ＣＬ４Ｈ６を使用した。その他に検討する因子として、ＣＬ４Ｈ６の含有量、リン脂質（ＤＯＰＥ）の含有量、ＰＥＧ脂質の種類、およびＰＥＧ脂質の含有量を選出し、各水準を設定した。

データ分析ソフトウェア「ＪＭＰ」に基づいて実験計画を作成し、全１６通り（２^４）のうち８種類の組成（Ｂ－１～Ｂ－８）を抜粋した（表４）。次いで、表４に記載の脂質組成により、ＮａＣｌ濃度３００ｍＭに調製した核酸含有溶液を用いて、ＲＮＡを搭載させた脂質ナノ粒子を調製した。調製した各脂質ナノ粒子のζ平均粒子径（ｎｍ）、個数平均粒子径（ｎｍ）、ＰｄＩ、及びＲＮＡ封入率（％）を測定した。各試験区の脂質ナノ粒子サンプルは、duplicateで測定した（ｎ＝２）。測定結果を表５に示す。

表５に示すように、全ての試験区の脂質ナノ粒子は、ζ平均粒子径が約１１０～４２０ｎｍの範囲であった。また、全ての脂質ナノ粒子のＰｄＩ及びＲＮＡ封入率は、それぞれ、０．１５以下及び８０％以上であった。統計解析の結果から、ＰＥＧ脂質の割合が、統計的有意に個数平均粒子径に影響を及ぼすこと、ＤＯＰＥの割合が、統計学的有意にＲＮＡ封入率に影響を及ぼすこと、が示された。脂質ナノ粒子の物性に関する統計解析結果は、実施例１の結果とおおむね同様であった。

続いて、試験区Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子について、実施例１と同様にして、ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに尾静脈投与し、肝臓及び脾臓におけるＮｌｕｃ発現量と、脾臓中の樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージにおける脂質ナノ粒子の細胞内取り込みとＮｌｕｃ発現量を、それぞれ測定した。Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子を投与したマウスの脾臓免疫細胞における、脂質ナノ粒子の取り込み量（各細胞のＤｉＯの蛍光強度の平均値）の測定結果を図６に、Ｎｌｕｃ発現量の測定結果を図７に、それぞれ示す。

樹状細胞におけるＮｌｕｃ遺伝子発現量は、Ｂ－１、Ｂ－３、Ｂ－５、及びＢ－７の脂質ナノ粒子が多く、特に、Ｂ－５の脂質ナノ粒子が最も遺伝子発現に優れていた（図７）。一方で、細胞内への脂質ナノ粒子の取り込みは、いずれの試験区の脂質ナノ粒子であっても、樹状細胞よりもマクロファージの方が多かった（図６）。これらの結果から、細胞内に取り込まれた脂質ナノ粒子量に対する遺伝子発現の割合は、マクロファージと比較して樹状細胞が高いことが確認された。

統計解析の結果、樹状細胞の遺伝子発現量と脂質ナノ粒子の粒子径に高い相関が確認されたが、この両者の相関性は、実施例１の実験結果よりも高かった。これは、実施例１と比較して本実施例では、脂質ナノ粒子の組成を狭い範囲で検討したため、相対的に樹状細胞における遺伝子発現に粒子径が与える貢献度が上昇したためと推察された。

実施例１の試験区Ａ－１～Ａ－１４の脂質ナノ粒子と、試験区Ｂ－１～Ｂ－８の脂質ナノ粒子の脾臓樹状細胞におけるＮｌｕｃ遺伝子発現量の結果をまとめて図８に示す。これらの脂質ナノ粒子のうち、最もＮｌｕｃ遺伝子発現量が多かったのはＡ－１１の脂質ナノ粒子であった。また、脂質ナノ粒子の粒子径、樹状細胞における細胞内取り込み、及び樹状細胞における遺伝子発現は、それぞれ高い相関を示した。このため、脂質ナノ粒子の粒子径の増大に伴う樹状細胞における遺伝子発現の上昇は、細胞内取り込みの増加に起因すると考えられた。さらに、実施例１と同様に、脾臓における遺伝子発現と樹状細胞における遺伝子発現は、一定の相関を示したが、脾臓において高い遺伝子発現を示す脂質ナノ粒子が必ずしも樹状細胞において高い遺伝子発現を示すとは限らないことも示された。

また、これらの脂質ナノ粒子について、樹状細胞への脂質ナノ粒子の取り込み量（ＤｉＯの蛍光強度の平均値）と、樹状細胞の成熟化マーカーの１つであるＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量との関係を図９（Ａ）に、樹状細胞におけるＮｌｕｃ遺伝子発現量とＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量との関係を図９（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、脂質ナノ粒子の樹状細胞内への取り込みは、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量と、高い相関を示した（図９（Ａ））。これらの結果から、Ａ－１１の脂質ナノ粒子は、脾臓樹状細胞へ効率的に取り込まれることにより樹状細胞の成熟化を誘導し、同時に高い遺伝子発現を実現することが明らかとなった。本発明に係るの脂質ナノ粒子は、樹状細胞における効率的な遺伝子発現に留まらず、樹状細胞の成熟化も誘起するため、ｍＲＮＡワクチンとして高い性能を示すことが期待される。

［実施例３］
実施例１及び２において、脾臓樹状細胞において最も高い遺伝子発現を示したＡ－１１の脂質ナノ粒子の再現性と、ＰＥＧ脂質の含有量の影響を調べた。
具体的には、表６に記載の脂質組成で、実施例１のＡ－１１と同様にして、ＲＮＡを搭載した脂質ナノ粒子を調製した。

調製した脂質ナノ粒子について、実施例１と同様にして、ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに尾静脈投与し、脾臓樹状細胞における脂質ナノ粒子の細胞内取り込み量とＮｌｕｃ発現量を、それぞれ測定した（ｎ＝２～３）。脂質ナノ粒子の取り込み量（各細胞のＤｉＯの蛍光強度の平均値）の測定結果を図１０（Ａ）に、Ｎｌｕｃ発現量の測定結果を図１０（Ｂ）に、それぞれ示す。図１０に示すように、脾臓樹状細胞における脂質ナノ粒子の細胞内取り込み量とＮｌｕｃ発現量はいずれも、ＰＥＧ脂質含有量依存的に低下していた。

調製した脂質ナノ粒子を４℃で３週間保存し、物性を経時的に測定した。結果を図１１に示す。図１１（Ａ）は、各脂質ナノ粒子のζ平均粒子径（ｎｍ）の測定結果を示し、図１１（Ｂ）は、各脂質ナノ粒子のＲＮＡ封入率（％）の測定結果を示す。この結果、ＰＥＧ脂質量にかかわらず、ＲＮＡ封入率はいずれも同程度であったが、ζ平均粒子径はＰＥＧ脂質量依存的に小さくなった。いずれの脂質ナノ粒子も、４℃で３週間程度の保存では特に物性変化は観察されず、保存安定性が高いことも確認された。

［実施例４］
実施例１及び３における試験区Ａ－１１の脂質ナノ粒子は、脾臓樹状細胞における効率的な遺伝子発現と成熟化を誘導可能なｍＲＮＡワクチンとして応用可能であると期待される。そこで、腫瘍関連抗原をコードするｍＲＮＡを搭載したＡ－１１の脂質ナノ粒子を使用して、抗腫瘍活性評価を行った。

具体的には、まず、オバルブミン（ＯＶＡ）遺伝子を含むｐＤＮＡを鋳型として、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡと同様にしてin vitro転写により、５’末端のキャップ構造と３’末端のポリＡが付加されたＯＶＡをコードするｍＲＮＡ（ＯＶＡ－ｍＲＮＡ）を調製した。次いで、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡに代えてＯＶＡ－ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１の試験区Ａ－１１と同様にして、ＯＶＡ－ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ）を調製した。

ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰの予防的抗腫瘍活性は以下の通りにして評価した。
まず、マウスに１週間おきに２度、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを、マウスの体重１ｋｇ当たりＯＶＡ－ｍＲＮＡ量換算で０．２５ｍｇ（０．２５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ）、０．５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ、又は０．７５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇずつ静脈内投与した（各投与群：ｎ＝３～５）。コントロールマウスには、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰに代えて等量のＰＢＳを投与した。さらにその１週間後に、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を右脇腹に皮下移植し、３日おきに腫瘍体積を経時的に測定した。腫瘍体積の測定結果を図１２に示す。この結果、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ投与群においては、０．２５ ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ以上のいずれの投与量においても、腫瘍の生着が完全に予防された。

ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰの治療的抗腫瘍活性は以下の通りにして評価した。
まず、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞をマウスの右脇腹に皮下移植し、３日おきに腫瘍体積を経時的に測定した。移植後７、１０、及び１４日目に、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを０．１２５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ、０．２５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ、又は０．５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇずつ静脈内投与した（各投与群：ｎ＝３～５）。コントロールマウスには、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰに代えて等量のＰＢＳを投与した。腫瘍体積の測定結果を図１３に示す。図中、「＊＊」は、ｎｒＡＮＯＶＡとそれに続くＳＮＫテストによりｐ＜０．０１であったことを示す。この結果、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ投与群においては、０．１２５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ以上のいずれの投与量においても、腫瘍体積の減少が認められた。ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ投与群全１２匹のうち、０．２５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ投与群全４匹のうちの１匹と、０．５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ投与群全３匹のうちの１匹では、腫瘍が完全に消失していた。

腫瘍が完全消失して寛解した２匹のマウスに対して、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞の皮下移植から６８日目に、再度Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下移植し、移植後７及び１０日目に、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを最初と同じ投与量を投与した。コントロールのＰＢＳ投与群と、１回目の皮下移植から寛解した２匹のマウスについて、腫瘍体積の測定結果を図１４に示す。この結果、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞再移植後も、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰにより腫瘍の生着は完全に抑制された。これは、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを投与されたマウスでは、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰによって脾臓樹状細胞内で発現されたＯＶＡによる抗原刺激を経験したメモリーＴ細胞が残存しており、これにより抗腫瘍活性が持続していたためと考えられた。

また、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰの投与量依存的な抗腫瘍活性は認められなかったことから、抗腫瘍活性を評価する上で１回当たりの投与量０．１２５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇは飽和している可能性が高いと考えられた。そこで、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰの治療的抗腫瘍活性評価における適切な投与量の検討を行った。具体的には、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞の皮下移植後から８日目及び１１日目に、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰを、１回当たりの投与量を、０．０５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ、０．００５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ、又は０．００１５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇとして尾静脈投与した。各投与群の腫瘍体積の測定結果を図１５に示す。この結果、０．０１５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ以上の投与量の場合に、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰは治療的抗腫瘍活性を示した。

［実施例５］
実施例１の試験区Ａ－１１の脂質ナノ粒子の有用性を検討するため、既に報告されている２つのｍＲＮＡ送達システムとの遺伝子発現の比較を実施した。比較対象とした２つのｍＲＮＡ送達システムのうち、１つは、メラノーマ等に対するｍＲＮＡがんワクチンとして現在第Ｉ相臨床試験が実施されているＲＮＡ－ＬＰＸ（非特許文献２、３、BioNTech社製）とした。もう一つは、同じく臨床実績のあるＲＮＡ送達用脂質ナノ粒子であるＯｎｐａｔｔｒｏ（Alnylam社製）の同等製剤であるＭＣ３－ＬＮＰとした。ＭＣ３－ＬＮＰは、ｍＲＮＡ送達システムとしても一定の効率を示すことから、比較製剤としての使用例が複数報告されている（非特許文献７）。

ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡを搭載したＲＮＡ－ＬＰＸ（ｍＮＬｕｃ－ＲＮＡ－ＬＰＸ）は、以下の通りにして調製した。
まず、総脂質濃度１０ｍＭとなるようにエタノールに溶解させたＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（１：１ モル比、総量４００μＬ）をガラス試験管に加え、エバポレータにより溶媒を除去した。次いで、当該試験管に８００μＬのＤ－ＰＢＳ（－）を加え、約２分間水和させた。その後、ボルテックスミキサーで撹拌させた後、約５分間静置した。当該試験管を、バス型ソニケーターを用いて超音波処理（約３０秒間）し、調製されたリポソーム溶液をＤ－ＰＢＳ（－）により５．９２倍希釈した（総脂質濃度０．８４５ｍＭ）。０．２ｍｇ ｍＲＮＡ／ｍＬとなるようにＤ－ＰＢＳ（－）で希釈した溶液１００μＬに、リポソーム溶液１００μＬをボルテックスミキサーで撹拌しつつ加えた（Ｎ／Ｐ＝１．３／２）。

ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡを搭載したＭＣ３－ＬＮＰ（ｍＮＬｕｃ－ＭＣ３－ＬＮＰ）は、ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ（５０／１０／４０／１．５ｍｏｌ％）の脂質組成とし、かつ核酸含有水溶液にＮａＣｌを添加しなかった以外は、試験区Ａ－１１と同様にして調製した。

調製された各脂質ナノ粒子を、投与量を０．５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇとした以外は実施例１と同様にしてマウスに尾静脈投与し、投与から２４時間後に安楽死させて、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び鼠径部リンパ節を回収し、Ｎｌｕｃ発現量を測定した。測定結果を図１６に示す。この結果、ｍＮＬｕｃ－ＭＣ３－ＬＮＰは、肝臓、脾臓、鼠径部リンパ節、腎臓、肺の順で高い遺伝子発現を示し、脾臓と比較して肝臓において約１６倍の遺伝子発現を示した。ｍＮＬｕｃ－ＭＣ３－ＬＮＰは肝実質細胞へ効率的に核酸送達可能な製剤であることから、妥当な結果であった。ｍＮＬｕｃ－ＲＮＡ－ＬＰＸは、脾臓、鼠径部リンパ節、肺、肝臓、腎臓の順で高い遺伝子発現を示し、鼠径部リンパ節と比較して脾臓において約２７０倍の遺伝子発現を示した。ＲＮＡ－ＬＰＸは遺伝子発現の脾臓選択性が非常に高い製剤であることから、妥当な結果であった。これに対して、Ａ－１１の脂質ナノ粒子は、ｍＮＬｕｃ－ＭＣ３－ＬＮＰ及びｍＮＬｕｃ－ＲＮＡ－ＬＰＸと比較して、脾臓において約１３倍及び約５倍の遺伝子発現を示し、鼠径部リンパ節において約５倍及び約１００倍の遺伝子発現を示した。これらの結果から、Ａ－１１の脂質ナノ粒子が、臨床実績のある両製剤よりも、リンパ組織において効率的な遺伝子発現キャリアであることが示された。

次いで、各脂質ナノ粒子の脾臓樹状細胞への遺伝子発現効率を比較した。
まず、蛍光タンパク質ＥＧＦＰ遺伝子を含むｐＤＮＡを鋳型として、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡと同様にしてin vitro転写により、５’末端のキャップ構造と３’末端のポリＡが付加されたＯＶＡをコードするｍＲＮＡ（ＥＧＦＰ－ｍＲＮＡ）を調製した。ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡに代えてＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを搭載する以外は試験区Ａ－１１と同様にして、ＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを搭載した脂質ナノ粒子（ｍＥＧＦＰ－Ａ１１－ＬＮＰ）を調製した。
また、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡに代えてＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを搭載する以外は、ｍＮＬｕｃ－ＲＮＡ－ＬＰＸの調製と同様にして、ＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを搭載したＲＮＡ－ＬＰＸ（ｍＥＧＦＰ－ＲＮＡ－ＬＰＸ）を調製し、ｍＮＬｕｃ－ＭＣ３－ＬＮＰの調製と同様にして、ＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを搭載したＭＣ３－ＬＮＰ（ｍＥＧＦＰ－ＭＣ３－ＬＮＰ）を調製した。

調製された各脂質ナノ粒子を、投与量を０．５ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇとした以外は実施例１と同様にしてマウスに尾静脈投与し、投与から２４時間後に安楽死させて、脾臓を回収し、ＦＡＣＳで脾臓樹状細胞を分取した。脾臓樹状細胞全体に対する、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を図１７（Ａ）に、脾臓樹状細胞のＥＧＦＰ平均蛍光強度の測定結果を図１７（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、ｍＥＧＦＰ－Ａ１１－ＬＮＰ投与群のＥＧＦＰ陽性細胞の割合は約９％であり、ｍＥＧＦＰ－ＭＣ３－ＬＮＰ投与群及びｍＥＧＦＰ－ＲＮＡ－ＬＰＸ投与群と比較して、約５倍及び約１０倍であった。

また同時に、実施例１と同様にして、脾臓樹状細胞の成熟化マーカーであるＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現量を測定した。測定結果を図１７（Ｃ）に示す。この結果、ｍＥＧＦＰ－Ａ１１－ＬＮＰ投与群が有意に高いＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ発現量を示した。以上の結果より、ｍＥＧＦＰ－Ａ１１－ＬＮＰは、臨床実績のある両製剤と比較して、樹状細胞において高い遺伝子発現示すと同時に、樹状細胞の成熟化を効率的に誘導可能であることが示された。

［実施例６］
実施例４で調製したｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰと、ＲＮＡ－ＬＰＸ及びＭＣ３－ＬＮＰの抗腫瘍活性を比較した。

ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡに代えて、実施例４で使用したＯＶＡ－ｍＲＮＡを搭載する以外は、ｍＮＬｕｃ－ＲＮＡ－ＬＰＸの調製と同様にして、ＯＶＡ－ｍＲＮＡを搭載したＲＮＡ－ＬＰＸ（ｍＯＶＡ－ＲＮＡ－ＬＰＸ）を調製した。
同様に、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡに代えてＯＶＡ－ｍＲＮＡを搭載する以外はｍＮＬｕｃ－ＭＣ３－ＬＮＰの調製と同様にして、ＯＶＡ－ｍＲＮＡを搭載したＭＣ３－ＬＮＰ（ｍＯＶＡ－ＭＣ３－ＬＮＰ）を調製した。

また、ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡに代えてＯＶＡ－ｍＲＮＡを搭載する以外は実施例２の試験区Ｂ－８と同様にして、ＯＶＡ－ｍＲＮＡを搭載した脂質ナノ粒子（ｍＯＶＡ－Ｂ８－ＬＮＰ）も調製した。実施例２において、試験区Ｂ－８の脂質ナノ粒子のＮｌｕｃ発現量は、試験区Ａ－１１の脂質ナノ粒子と比較して、脾臓全体では同等であるが、脾臓樹状細胞においては低かった。

Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下移植した担がんマウスを用いて、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ、ｍＥＧＦＰ－Ａ１１－ＬＮＰ、ｍＯＶＡ－Ｂ８－ＬＮＰ、ｍＯＶＡ－ＲＮＡ－ＬＰＸ、及びｍＯＶＡ－ＭＣ３－ＬＮＰの治療的抗腫瘍活性を評価した。
具体的には、Ｅ.Ｇ７－ＯＶＡ細胞をマウスの右脇腹に皮下移植し、３日おきに腫瘍体積を経時的に測定した。移植後７及び１０日目に、脂質ナノ粒子を０．０３ｍｇ ｍＲＮＡ／ｋｇ静脈内投与した（各投与群：ｎ＝５）。コントロールマウスには、脂質ナノ粒子に代えて等量のＰＢＳを投与した。腫瘍体積の測定結果を図１８に示す。この結果、ｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰ投与群のみ、治療期間中の腫瘍体積の減少が認められた。ｍＯＶＡ－ＲＮＡ－ＬＰＸ投与群及びｍＯＶＡ－ＭＣ３－ＬＮＰ投与群では腫瘍体積の減少は認められなかったため、両製剤と比較してｍＯＶＡ－Ａ１１－ＬＮＰは優れた治療的抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。さらに、ｍＯＶＡ－Ｂ８－ＬＮＰ投与群においても腫瘍体積の減少は認められなかったことから、抗腫瘍活性を示す上で脾臓全体の遺伝子発現ではなく、免疫細胞レベルでの遺伝子発現が重要な指標となる可能性が示された。

１０…第１導入路、２０…第２導入路、３０ 希釈流路、３１…合流点、４０…構造子、５０…屈曲した流路部位。

Claims (16)

1. ｐＨ感受性カチオン性脂質とポリアルキレングリコール修飾脂質とを含有しており、
   脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、前記ｐＨ感受性カチオン性脂質の含有量の割合が４０～７０モル％であり、
   脂質ナノ粒子を構成する全脂質量に対する、前記ポリアルキレングリコール修飾脂質の含有量の割合が０．５～１．７５モル％であり、
   個数平均粒子径が１５０ｎｍ以上である、脂質ナノ粒子。
2. 個数平均粒子径が、６００ｎｍ以下である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
3. 前記ｐＨ感受性カチオン性脂質が、下記一般式（Ｉ－１）
   

   

   ［式（Ｉ－１）中、Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_{１０－１４}アルキル基、１若しくは２個の不飽和結合を有する直鎖状のＣ_{１０－２０}アルケニル基、又は－ＣＨ（Ｒ^１５）（Ｒ^１６）（Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_５－１０アルキル基である）であり；ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立して、６～１０の整数を示し；ｐ１及びｑ１は、ｐ１＋ｑ１＝３～８を満たす０以上の整数を示し；ｒ１は０又は１を示し；Ｒ^１３及びＲ^１４はそれぞれ独立して、直鎖状のＣ_１－３アルキル基又はアリールＣ_１－３アルキル基である、若しくは、Ｒ^１３及びＲ^１４が互いに連結して、ピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、又は窒素原子がＣ_１－３アルキル基で置換されていてもよいピペラジン環を形成する］
   で表される、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。
4. さらに、ステロール及びリン脂質からなる群より選択される１種以上を含有している、請求項１～３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
5. 核酸を含有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
6. 前記核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の脂質ナノ粒子。
7. 前記核酸が、ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡである、請求項５に記載の脂質ナノ粒子。
8. 前記核酸が、脾臓樹状細胞内で発現させる遺伝子である、請求項５～７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を有効成分とする、医薬用組成物。
10. がんワクチン療法に用いられる、請求項９に記載の医薬用組成物。
11. 免疫賦活化のために用いられる、請求項９に記載の医薬用組成物。
12. 請求項５～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子であって、脾臓樹状細胞内で発現させる目的の外来遺伝子を封入した脂質ナノ粒子を、被験動物（但し、ヒトを除く）へ投与し、前記被験動物の脾臓樹状細胞内で前記外来遺伝子を発現させる、外来遺伝子の発現方法。
13. 請求項５～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を、流路構造体を用いて製造する方法であって、
    前記脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分をエタノールに溶解させた脂質溶液と、前記核酸を含有する水溶液とから、前記流路構造体中で脂質ナノ粒子を形成させる形成工程と、
    前記形成工程で得られた脂質ナノ粒子を含む溶液を、ｐＨ６．８～７．６の緩衝液中で透析する透析工程と、
    を有し、
    前記流路構造体が、互いに独立した、第１の流動体を導入する第１導入路と、第２の流動体を導入する第２導入路とが、それぞれ一定長を有して合流して１つの希釈流路を形成しており、
    前記希釈流路は、少なくともその一部において二次元的に屈曲した流路部位を有し、
    当該屈曲した流路部位は、これより上流の希釈流路の軸線方向ないしその延長方向をＸ方向と、このＸ方向と垂直に交差する希釈流路の幅方向をＹ方向とし、これより上流の希釈流路の流路幅をｙ_０とした場合に、Ｙ方向において対向する希釈流路の両側壁面より交互に、流路中心側に向かって、略Ｙ方向（略＋Ｙ方向、略－Ｙ方向）に、１／２ｙ_０以上１ｙ_０未満の一定高さｈ_１、ｈ_２...を有し、かつＸ方向に一定幅ｘ_１、ｘ_２...を有して突出し、希釈流路の流路幅を規制する構造子が、一定間隔ｄ_１、ｄ_２...をもって少なくとも２つ以上設けられていることで形成されており、
    前記第１導入路より前記脂質溶液を、前記第２導入路より前記核酸を含有する水溶液を、それぞれ導入し、
    前記核酸を含有する水溶液が、塩化ナトリウム濃度が２８０ｍＭ以上であり、かつ酸性である、脂質ナノ粒子の製造方法。
14. 前記核酸を含有する水溶液の塩化ナトリウム濃度が、５００ｍＭ以下である、請求項１３に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
15. 請求項１３又は１４に記載の脂質ナノ粒子の製造方法に使用するキットであって、
    脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分を含有する脂質組成物の乾燥物、及び
    塩化ナトリウムを含有し、水に溶解して塩化ナトリウム濃度が２８０ｍＭ以上の水溶液を調製するための乾燥物
    を備える、脂質ナノ粒子製造用キット。
16. さらに、エタノール、リン酸生理食塩水、及び核酸からなる群より選択される１種以上を含有する、請求項１５に記載の脂質ナノ粒子製造用キット。

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