CN116763757A - 一种包裹型复合物及其制剂的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及的是一种用于提高脾脏靶向效果和/或改善细胞摄取途径的包裹型复合物，以及包裹型纳米制剂的制备方法和应用。本发明将阴离子化合物与包载活性成分的纳米颗粒进行孵育，获得可显著提高该复合物的脾脏靶向效果和/或改善细胞摄取途径的包裹型复合物。

Description

一种包裹型复合物及其制剂的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于提高脾脏靶向效果和/或改善细胞摄取途径的包裹型复合物及其制剂的制备方法和应用。
背景技术
脾脏是机体最大的外周免疫器官，是接受抗原刺激产生免疫应答的场所。脾内定居着大量淋巴细胞和其他免疫细胞，抗原进入脾脏之后，可被抗原提呈细胞摄取并提呈给T细胞，诱导T细胞活化和增殖，产生致敏T淋巴细胞。淋巴结作为外周免疫器官，同样具有过滤和清除异物的作用，能处理外来异物性抗原产生免疫应答并被应用于肿瘤免疫治疗领域。然而，淋巴结清除癌细胞的能力较低，且其是针对来自淋巴液中的抗原产生免疫应答的场所。与淋巴结不同，脾脏是针对血液中的抗原产生免疫应答的场所，且90％左右的循环血液要经过脾，脾脏的这种生物学特性使得利用靶向递送技术将mRNA药物靶向递送至脾脏，表达相应的抗原蛋白，诱导快速的抗肿瘤免疫应答，发挥高效地抗肿瘤作用成为可能。
近年来，研究者开始尝试将抗原递送至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用。有研究者通过简单调整阳离子脂质体与mRNA比例将抗原mRNA递送至脾脏发挥疫苗抗肿瘤活性的研究报道，但后续无相关的报道，可能是阳离子脂质体的毒性及临床实验中疫苗的免疫抗肿瘤效果不佳。也有研究者将DNA递送至脾脏内B细胞发挥预防性的免疫抗肿瘤活性。此外，有研究者通过调整纳米递送载体的粒径，将蛋白/多肽抗原递送至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用，尽管有一定的抗肿瘤效果，这种策略递送抗原至脾脏的效率不高，且细胞毒性T淋巴细胞的应答强度并不清楚。
mRNA药物由于其时效性、有效性和简单的制造过程，被誉为医学的未来，在感染性疾病、肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病以及遗传病等的预防和治疗领域极具应用前景。mRNA药物研发成功的关键是确保mRNA在生理条件下的稳定并有效地传递到目标组织。目前Moderna和BioNTech公司开发的mRNA新冠疫苗均将mRNA递送至肝脏表达抗原蛋白，其虽然能激活机体的免疫反应，但仍存在免疫原性不足的问题，这一点在肿瘤mRNA疫苗的研发过程中尤为突出。mRNA疫苗要发挥更强的免疫效力，最佳的递送靶脏器是脾脏等免疫器官，然而可实现脾脏靶向的递送载体的开发难度较高。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于提高脾脏靶向效果的包裹型复合物，该包裹型复合物能够在生理条件下将核酸类药物，蛋白药物及小分子药物稳定并有效地靶向递送到脾脏组织。
本发明的目的之二在于提供一种用于改善细胞摄取途径的包裹型复合物，该包裹型复合物能够在生理条件下增强所包载活性成分通过小窝蛋白途径的摄取，提高被递送的活性成分进入细胞质的效率，尤其是在递送mRNA时，可将mRNA直接递送至细胞质，翻译表达相应的蛋白。与内吞摄取途径相比，避免了经溶酶体逃逸的过程，大幅降低了被溶酶体中相关酶降解的可能，可有效提供mRNA的表达效率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于提高脾脏靶向效果和/或改善细胞摄取途径的包裹型复合物，所述包裹型复合物由外部的带负电包裹层和内部的纳米颗粒组成；所述外部的包裹层为阴离子化合物或阴离子化合物的混合物；所述纳米颗粒为包载活性成分的阳离子纳米颗粒。
进一步，所述阴离子化合物为透明质酸钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、肝素钠、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、十二烷基磺酸钠及其衍生物中的一种或几种。
进一步，所述阳离子纳米颗粒包括：脂质体、核壳型纳米粒、HDL纳米粒、脂质纳米颗粒、固体脂质纳米粒、聚合物胶束脂质纳米粒、聚合物纳米粒、胶束、乳剂；所述活性成分为核酸、蛋白多肽类药物或小分子药物及其混合物中的一种或几种。
进一步，所述阳离子纳米颗粒含有DOTAP、DOTMA、DOSPA、DTAB、DDAB、DC-CHOL脂质材料中的一种或几种。
进一步，所述外部的带负电包裹层与所述活性成分的质量比为1:0.25～1:4。
进一步，所述核酸包括编码病毒的抗原蛋白、基因编辑工具蛋白、蛋白补充治疗相关蛋白、细胞因子的mRNA；所述病毒的抗原蛋白包括EBV、HPV、HBV、SARS-Cov-2、编码疟疾、合胞病毒、登革、寨卡、狂犬、流感病毒的抗原蛋白，所述基因编辑工具蛋白包括Cas9，所述细胞因子包括细胞因子IL12，所述蛋白补充治疗相关蛋白包括编码肿瘤的抗原蛋白Mucin1、KRAS。
进一步，所述mRNA包括但不限于鼻咽癌治疗用的LMP1-mRNA，LMP2-mRNA，EBNA1-mRNA(CN112237628A)，EBV-mRNA；宫颈癌及口咽癌治疗用的E6/E7-mRNA(EP3011060B1)，HPV-mRNA；SARS-Cov-2预防用的RBD-mRNA(CN113527522A)、S-mRNA。
进一步，所述复合物不含膜稳定剂胆固醇。
体内分布实验结果显示，与含胆固醇的包裹型复合物相比，不含胆固醇的包裹型复合物在脾脏的表达显著增强，且未进行包裹的复合物脾脏无表达，表明不含胆固醇的包裹型复合物更易靶向到脾脏。细胞摄取途径抑制考察结果显示，不含胆固醇的SA包裹型复合物可以通过小窝蛋白介导的途径进入细胞，而含胆固醇的SA包裹型复合物通过该途径摄取不明显。
本发明的目的之二在于提供一种包裹型纳米制剂，较传统正电荷的纳米制剂而言，该纳米制剂采用阴离子聚合物包裹策略，可实现脾脏靶向并改善细胞摄取途径，其所递送的mRNA具有更高的转染能力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
包裹型纳米制剂，所述包裹型纳米制剂由包裹型复合物和药学上可接受的辅料组成；所述包裹型复合物由外部的带负电包裹层和内部的纳米颗粒组成；所述外部的带负电包裹层为阴离子化合物或阴离子化合物的混合物；所述纳米颗粒为包载活性成分的阳离子纳米颗粒。
进一步的，所述的包裹型复合物或包裹型纳米制剂在制备mRNA药物中的应用。
更进一步的，所述mRNA药物用于治疗的疾病包括鼻咽癌、宫颈癌、头颈鳞癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、病毒感染以及动脉粥样硬化。
本发明的目的之三在于提供包裹型复合物或包裹型纳米制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述的包裹型复合物或包裹型纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将阳离子脂质材料溶于无水乙醇中，采用薄膜水化法制备带正电荷的纳米颗粒；
2)、将步骤1)制备的带正电荷的纳米粒子与活性成分进行混合孵育，得到包载活性成分的纳米颗粒；
3)、将所述包裹层的阴离子化合物或阴离子化合物的混合物与步骤2)所述的带正电荷的纳米颗粒进行混合孵育，获得包裹型复合物；
4)、向3)制备的包裹型复合物中添加药学上可接受的辅料，即得包裹型纳米制剂。
本发明的目的之四在于提供包裹型复合物或包裹型纳米制剂的用途。
进一步的，所述的包裹型复合物或包裹型纳米制剂在改变mRNA药物内吞途径和/或增强溶酶体逃逸能力中的应用。
进一步的，所述的包裹型复合物或包裹型纳米制剂在提高mRNA药物脾脏靶向效果中的应用。
本发明的有益之处在于：
1)在以往的研究中，极少使用包裹策略进行纳米颗粒的递送，本发明实现了使用包裹策略进行纳米颗粒的递送，且第一次实验证明了纳米颗粒中脂质膜稳定剂胆固醇的存在不利于纳米颗粒的阴离子包裹，不含胆固醇的纳米颗粒的包裹型复合物稳定性大幅提高。
2)本发明通过将阴离子包裹在带正电荷的负载mRNA的纳米颗粒上，获得了一种处方简化、稳定性高、易于制备的新型阴离子mRNA纳米药物。
3)本发明基于包裹策略的负电荷mRNA纳米药物，尤其是不含脂质膜稳定剂胆固醇的包裹型复合物，具有传统正电荷mRNA纳米药物所不具有的优势，包括具有脾靶向效果，可实现小窝蛋白摄取途径，具有更高的转染能力、更强的抗血清能力、更强的溶酶体逃逸能力以及更好的生物安全性。
4)本发明采取的阴离子包裹策略成功克服了基因载体在基因药物递送上存在的缺陷。
附图说明
图1为实施例1中处方5～处方8的粒径、ζ电位，即不同质量比的SA@DOTAP/CHOL-mRNA的粒径、ζ电位；
图2为实施例1中处方1～处方4的粒径、ζ电位，即不同质量比的SA@DOTAP-mRNA的粒径、ζ电位；
图3为在无血清和10％血清条件下，实施例1中处方5～处方8的转染，即SA@DOTAP/CHOL-GFP在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图4中，图4-A和图4-B分别为在无血清和10％血清条件下，实施例1中处方5～处方8的转染结果，即SA@DOTAP/CHOL-GFP在DC 2.4细胞中的定量分析，(mean±SD，n＝3)；
图5为在无血清和10％血清条件下，实施例1中处方1～处方4的转染结果，即SA@DOTAP-mRNA在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图6中，图6-A和图6-B分别为在无血清和10％血清条件下，实施例1中处方1～处方4的转染结果，即SA@DOTAP-mRNA在DC2.4细胞中的定量分析(G、H)，(mean±SD，n＝3)；
图7为无血清和10％血清条件下，实施例1中处方1，处方5及处方4在DC 2.4细胞中的表达图像；
图8中，图8-A和图8-B分别为无血清和10％血清条件下，实施例1中处方1，处方5及处方4在DC 2.4的定量分析；
图9为实施例1中处方4和处方8，即SA@DOTAP/CHOL-GFP和SA@DOTAP-GFP的粒径分布；
图10为实施例1中处方4和处方8，即SA@DOTAP/CHOL-GFP和SA@DOTAP-GFP的形态结构表征；
图11为实施例1中处方1，处方4，处方5，即DOTAP/CHOL-GFP、DOTAP-GFP和SA@DOTAP-GFP的粒径、电势和PDI随时间的变化；
图12为凝胶阻滞法考察施例1中处方1，处方4，处方5的mRNA负载稳定性；
图13为实施例2中处方1～处方4，即不同质量比的HA@DOTAP-mRNA的粒径、ζ电位；
图14为实施例2中处方1～处方4，即不同质量比的HA@DOTAP-mRNA于10％血清条件下，在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图15中，在10％血清条件下，实施例2中处方1～处方4在DC2.4细胞中的定量分析，(mean±SD，n＝3)；
图16实施例3中，处方1～处方8，即为不同阴离子包裹制备的包覆型复合物在DC2.4细胞中的GFP表达图像；
图17为实施例4中处方1～处方7，即不同质量比的胶束纳米颗粒SA@DOTAP/DOPE-mRNA的粒径、ζ电位；
图18为实施例4中处方1～处方7，即不同质量比的胶束纳米颗粒(SA@DOTAP/DOPE-mRNA)于10％血清条件下，在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图19为实施例5中，在不同PLGA/脂质质量比条件下，壳-核型纳米颗粒CS的粒径、PDI(A)和Zeta电位(B)；
图20为实施例5中处方1～处方4，即mRNA与SA不同质量比条件下，SA@CS-mRNA的粒径，电位；
图21为实施例5中处方1～处方4，即不同质量比的SA@CS-mRNA于10％血清条件下，在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图22为实施例1中处方26～27，即SA包裹前的脂质体纳米颗粒DOTMA-mRNA与SA包裹后的SA@DOTMA-mRNA在10％血清条件下，在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图23为实施例1中处方28～29，即SA包裹前的脂质体纳米颗粒DOSPA-mRNA与SA包裹后的SA@DOSPA-mRNA在10％血清条件下，在DC 2.4细胞中的GFP表达图像；
图24为实施例1中处方30～31，即SA包裹前的脂质体纳米颗粒DC-CHOL-mRNA与SA包裹后的SA@DC-CHOL-mRNA在10％血清条件下，在DC 2.4细胞中的GFP表达图像
图25为采用DOTAP/CHOL-CY5、DOTAP-CY5和SA@DOTAP-CY5处理DC 2.4细胞5h的激光扫描显微镜(LSCM)图像；
图26为流式分析，用PBS、DOTAP/CHOL-CY5、DOTAP-CY5和SA@DOTAP-CY5处理DC 2.4细胞2h后的平均荧光强度分析；
图27为不同细胞摄取抑制剂处理后的DOTAP/CHOL-CY5、DOTAP-CY5、SA@DOTAP/CHOL-CY5和SA@DOTAP-CY5的细胞摄取实验；
图28为CLSM图像显示DC 2.4细胞中DOTAP/CHOL-CY5、DOTAP-CY5和SA@DOTAP-CY5的溶酶体逃逸；
图29为DOTAP/CHOL-GFP、DOTAP-GFP、SA@DOTAP-GFP在50％血清中，粒径随时间的变化；
图30为DOTAP/CHOL-GFP、DOTAP-GFP、SA@DOTAP-GFP在10％、30％胎牛血清中的转染效率；
图31为流式细胞术分析BMDC细胞培养7天后的纯度；
图32中，图32-A为DOTAP/CHOL-OVA、DOTAP-OVA和SA@DOTAP-OVA在BMDC细胞中的抗原呈递，图32-B为DOTAP/CHOL-OVA、DOTAP-OVA和SA@DOTAP-OVA刺激BMDC细胞成熟；
图33为静脉注射DOTAP/CHOL-LUC、DOTAP-LUC和SA@DOTAP-LUC后荧光素酶在小鼠体内的表达；
图34为荧光素酶表达的定量分析肺(图34-A)和脾(图34-B)DOTAP/CHOL-LUC、DOTAP-LUC和SA@DOTAP-LUC(±SD，n＝3)；
图35为静脉注射SA@DOTAP/CHOL-LUC和SA@DOTAP-LUC后荧光素酶在小鼠体内的表达；
图36为荧光素酶表达的定量分析肺(图36-左)和脾(图36-右)SA@DOTAP/CHOL-LUC和SA@DOTAP-LUC(±SD，n＝3)；
图37为流式细胞仪分析OVA-specific CTL增殖后的脾三次通过vein-injectedDOTAP/CHOL-OVA DOTAP-OVA和SA@DOTAP-OVA(±SD，n＝3)；
图38为治疗结束后，DOTAP/CHOL-OVA、DOTAP-OVA和SA@DOTAP-OVA组小鼠的淋巴结重量；
图39为免疫治疗方案示意图；
图40为各组小鼠肿瘤生长情况；
图41为各组小鼠肿瘤体积的增长(均值±SD，n＝6)；
图42-A为各组小鼠治疗后肿瘤重量(均值±SD，n＝6)，图42-B为DOTAP/CHOL-OVA、DOTAP-OVA和SA@DOTAP-OVA的肿瘤抑制率；
图43为FACS分析OVA特异性CTL在肿瘤中增殖(均值±SD，n＝3)；
图44为脂质体/mRNA复合物对DC 2.4细胞的毒性试验；
图45为不同处理小鼠肝功能测定；
图46为不同处理小鼠肾功能测定；
图47为初次免疫后第10天心、肝、脾、肺、肾病理组织的H&E染色。
注：图1～图47中，*p<0.05，***p<0.01。
具体实施方式
实施例1制备脂质体/复合物
表1处方组成
采用薄膜水化法分别制备未负载主药的含CHOL和不含CHOL的阳离子脂质体(具体处方见表1)。具体步骤如下：
1)在圆底烧瓶中加入阳离子载体和辅助载体脂质的乙醇溶液，在真空条件下干燥制备脂质膜。
2)加入RNase-free水，在60℃下水化和收集脂质膜溶液。
3)将脂质膜溶液置于冰浴中，100W超声3分钟，得到未载药的脂质体。
4)采用未载药的脂质体与主药共孵育的方法制备不同N/P或质量比的药物纳米递送系统，其具体制备方法为：按上述处方表中的配比，取未载药的脂质体标记为A；将主药加入到RNase-free水中，混匀得B；将B与A混匀后室温孵育10min，即得不同的脂质体复合物。
5)包裹型复合物的制备方法：按处方表中的配比，向脂质体复合物中加入海藻酸钠溶液，混匀后孵育5min即可。
实施例1制备的包裹型复合物的粒径电位及PDI检测
取制备的样品，采用纯化水稀释10倍后，用马尔文激光粒度仪进行粒度、电位及PDI检测，结果如表2所示。
表2
在本实施例中，将500μL的海藻酸钠溶液(SA)加入到1ml脂质体复合物(DOTAP-mRNA或DOTAP/CHOL-mRNA)中，混匀后孵育5min制得包裹型复合物。在处方5～处方8中，随着SA的加入，制剂的粒径显著增大，电位变化不明显，且PDI明显变大，表明不能形成稳定均一的制剂，推测CHOL的添加不利于SA对脂质体形成包裹。处方1～处方4中的检测结果表明，采用不同mRNA与SA质量比可以制备稳定性的包裹型复合物，且随着SA用量的增加其电荷逐渐变为负电荷，当mRNA与SA的质量比达到1:0.5时，制得带负电荷的包裹型复合物，且在一定范围内，包裹型复合物的PDI随着SA的加入逐渐降低；处方9～处方25中，发现SA可以对负载不同mRNA、DNA、siRNA、microRNA、lncRNA、saRNA、ASO、质粒、蛋白质、多肽及小分子化药的复合物进行包裹；处方26～处方31中，发现SA可以对多种阳离子材料制备的脂质体复合物进行包裹。
实施例2制备透明质酸HA包裹的DOTAP-mRNA
表3处方组成
/>
按表3中的处方，采用实施例1中脂质体复合物的制备方法制备得到相应的脂质体复合物。
包裹型复合物的制备方法：按处方表中的配比，向脂质体复合物中加入透明质酸钠溶液，混匀后孵育5min即可。
实施例2制备的包裹型复合物的粒径电位及PDI检测
取制备的样品，采用纯化水稀释10倍后，用马尔文激光粒度仪进行粒度、电位及PDI检测，结果如表4所示。
表4
/>
在本实施例中，使用天然阴离子化合物透明质酸钠(HA)包裹脂质体复合物，处方2～处方4说明，HA加入后，复合物的粒径明显变大，HA加入量越多，粒径越大，其电位呈逐渐下降趋势，稳定在15～30mV之间；处方4～处方9说明，HA能对负载不同mRNA的脂质体复合物形成良好的包裹；处方10～处方19分别说明，HA能对负载不同mRNA、DNA、siRNA、microRNA、lncRNA、saRNA、ASO、，质粒、蛋白质、多肽及小分子化药的脂质体复合形成包裹，最终能形成粒径＜300nm，电荷为15～40mV之间的纳米复合物。
实施例3多种阴离子包裹层的功能验证
表5处方组成
包裹型复合物的制备方法：按处方表中的配比，采用实施例1中脂质体复合物的制备方法制备脂质体复合物，然后向脂质体复合物中加入相应的阴离子溶液，混匀后孵育5min即可。
实施例3制备的包裹型复合物的转染检测，见图16，实验结果表明，羧甲基纤维素钠(CMC)、肝素钠(NA)、硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素(HS)、十二烷基磺酸钠(SDS)等多种阴离子化合物都能成功的包覆基因纳米疫苗，并在一定成程度上提高基因纳米疫苗的转染能力。
实施例4制备胶束/复合物
表6处方组成
/>
1)利用溶剂挥发制备胶束纳米颗粒，在圆底烧瓶中加入DOTAP及辅助载体溶液，在真空条件下干燥成膜。
2)加入RNase-free水，在60℃下搅拌收集胶束溶液。
3)在冰浴中，100W超声3分钟，得到未载药的胶束。
4)采用胶束溶液与主药共孵育的方法制备不同N/P，不同质量比纳米药物递送系统，其方法为：取适量的未载药的胶束标记为A；将主药加入到RNase-free水中，溶解得B；按处方配比将B与A混匀后室温孵育10min，即得不同的胶束复合物。
5)包裹型复合物的制备方法：按处方表中的配比，向胶束复合物中加入海藻酸钠溶液，混匀后孵育5min即可。
实施例4制备的包裹型复合物的粒径电位及PDI检测
取制备的样品，采用纯化水稀释10倍后，用马尔文激光粒度仪进行粒度、电位及PDI检测，结果如表7所示。
表7
处方 粒径(nm) 电位(mV) PDI
处方1 63 32 0.34
处方2 147 32 0.20
处方3 148 33 0.22
处方4 181 28 0.19
处方5 170 -23 0.21
处方6 168 -26 0.21
处方7 155 -29 0.20
处方8 156 -22 0.23
处方9 169 23 0.21
处方10 162 -28 0.21
处方11 166 -24 0.24
处方12 154 -22 0.25
处方13 149 -26 0.23
处方14 170 -30 0.24
处方15 160 -24 0.21
处方16 164 -23 0.21
在本实施例中，发现使用天然阴离子化合物海藻酸钠(SA)能较好地包裹胶束复合物，处方2～处方4说明，当mRNA与SA的质量比大于1:1时，SA加入量越多，粒径越大，电位则稳定在20mV～40mV之间；处方5～处方7则说明，当SA加入到一定量后，即当mRNA与SA的质量比小于1:1时，可以逆转胶束复合物的电性，电荷量在-20mV～-30mV之间。处方8～处方13表明SA能对负载不同种类的胶束复合物纳米制剂形成良好的包裹，处方14～处方17分别说明，SA能对负载DNA，蛋白质，siRNA及质粒的脂质体复合形成包裹，能形成制剂均一且稳定，电荷为-20mV～-30mV之间的纳米复合物，以上结果表明SA能对胶束复合物形成良好的包裹。
实施例5制备壳-核-纳米颗粒
表8处方组成
1)采用乳化-溶剂挥发法制备PLGA纳米粒。首先，称取适量PLGA，并置于EP管中，加入适量乙酸乙酯，水浴超声溶解，制备油相。同时，称取适量PVA于EP管中，加入RNase-free水溶解，配制成PVA浓度为1％(w/v)的水相溶液。用注射器将油相快速注入水相中，迅速置于冰浴条件下，超声乳化后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，于37℃水浴条件下进行旋转蒸发，得到PLGA纳米粒。
2)将制得的纳米颗粒用于水化DOTAP脂质膜后，置于探头下超声3min，即得未载药的CS纳米颗粒。
3)采用CS纳米颗粒与主药共孵育的方法制备不同N/P，不同质量比纳米递送系统，其方法为：取适量的未载药的CS纳米颗粒标记为A；将不同质量的主药加入到RNase-free水中，溶解得B；B与A混匀后室温孵育10min，即得不同的CS纳米颗粒复合物。
包裹型复合物的制备方法：按处方表中的配比，向CS纳米颗粒复合物中加入海藻酸钠溶液，混匀后孵育5min即可。
实施例5制备的包裹型复合物的粒径电位及PDI检测
取制备的样品，采用纯化水稀释10倍后，用马尔文激光粒度仪进行粒度、电位及PDI检测，结果如下：
表9
处方 粒径(nm) 电位(mV) PDI
处方1 120 38 0.39
处方2 125 32 0.28
处方3 128 27 0.27
处方4 324 22 0.39
处方5 130 26 0.27
处方6 133 26 0.25
处方7 125 29 0.23
处方8 126 22 0.25
处方9 139 23 0.28
处方10 132 28 0.25
处方11 126 24 0.29
处方12 124 22 0.26
处方13 129 26 0.29
在本实施例中，发现使用天然阴离子化合物海藻酸钠(SA)能较好的包裹核-壳纳米复合物，处方2～处方3说明，在一定范围内，SA加入量越多，电位越小，处方4说明，当SA与主药的质量比达到1:1.5时，复合物的粒径显著变大；在一定范围内，随着SA加入量的增加，复合物的电位降低，复合物的电位稳定在20mV～40mV之间；处方5～处方9说明SA能对负载不同种类mRNA的壳-核型纳米制剂形成良好的包裹，处方10～处方13分别说明，SA能对负载DNA，蛋白质，siRNA及质粒的脂质体复合形成包裹，能形成制剂粒径均一稳定，电荷为20mV～30mV之间的纳米复合物，以上结果表明海藻酸钠能对壳-核型复合物形成良好的包裹。
实施例6转染试验、稳定性和凝胶电泳实验
1)转染试验
(1)采用转染试剂lipo-2k与主药共孵育的方法制备阳性对照，lipo-2k的制备方法为：3μL未载药的lipo-2k到装有50μL opti-MEM培养基的EP管中记为A；将1μg GFP-mRNA加入到装有50μL opti-MEM培养基的EP管中记为B；B与A混匀后室温孵育10min，即得阳性对照lipo-2k。
(2)对实施例1中处方1～处方8的样品进行转染试验。将DC2.4细胞接种于含0.5mLDMEM(含10％胎牛血清)的24孔培养板(1个×104细胞/孔)过夜。然后用含不同浓度的胎牛血清的培养基替换旧培养基后，每孔加入含1μg GFP-mRNA的脂质体/mRNA复合物孵育24h。最后采用倒置荧光显微镜(Nikon，日本)和流式细胞术(FACS,BD AccuriC6，美国)评价转染效果。
结果如图3～图6所示，SA不仅显著增强了DOTAP-GFP的转染，而且其转染效率显著高于采用通用处方制备的脂质体DOTAP/CHOL-GFP；但另一方面，采用SA包裹常用处方制备的脂质体DOTAP/CHOL-GFP制备的SA@DOTAP/CHOL-GFP的转染效率显著降低，推测CHOL的存在可能不利于SA对脂质体复合物的包裹。
2)SA@DOTAP-mRNA贮存稳定性考察
具体考察实施例1中处方1，处方4及处方5的脂质体复合物在4℃保存，通过粒径、PDI和Zeta电位测试脂质体/mRNA复合物的稳定性。结果：如图11～图12所示，在稳定性考察过程中SA@DOTAP-GFP比DOTAP-GFP和DOTAP/CHOL-GFP具有更均匀的性质，其PDI更小，且相较于未包裹的脂质体复合物DOTAP-GFP来说，SA@DOTAP-mRNA在储存期间没有出现PDI显著增大的现象，并且其粒径、Zeta电位也在保存过程中无明显变化，推测SA具有稳定阳离子脂质体的作用。
3)凝胶电泳实验
如图11所示，具体考察实施例1中处方1及处方4及处方5的稳定性未发现mRNA从DOTAP-GFP，SA@DOTAP-GFP和DOTAP/CHOL-GFP制剂中泄漏的情况，该结果表明SA的包裹没有影响到阳离子脂质体对mRNA的负载，进一步表明SA@DOTAP-mRNA具有广阔的工业生产和临床应用前景。
实施例7不同纳米脂质的制剂学考察及转染实验
如图3～图6所示，具体考察实施例1中处方1～处方8，研究发现阴离子化合物SA有利于提高DOTAP脂质体的基因递送能力，因此，通过替换不同的阳离子脂质制备不同的脂质体复合，并通过SA对这些脂质体复合物进行包裹。制得多种包裹型复合物，具体考察实施例1中处方26～处方31，结果如图22、23、24，表明SA的包裹能促进多种阳离子脂质体的基因转染能力。
考察实施例2中处方1～处方4与实施例3中处方1～8，探究不同类型的阴离子化合物在提高阳离子脂质体转染能力方面的应用，结果如图14～16结果表明HA，SDS等阴离子化合物能提高阳离子脂质体的基因转染能力。
考察实施例4中处方1～处方6，实施例5中处方1～处方4，探究SA对不同类型的基因递送载体的包裹作用，实验结果如图18与图22所示，表明SA可以对多种类型的纳米制剂实现包载，如胶束，聚合物，壳-核纳米颗粒等多种纳米制剂，并能在一定程度上提高被包裹层的转染效率。
实施例8转染的机制
表10处方组成
1.采用薄膜水化法分别制备未负载主药的阳离子脂质体(DOTAP脂质体和DOTAP/CHOL脂质体)。具体步骤如下：
1)在圆底瓶中加入DOTAP和胆固醇溶液，在真空条件下干燥制备脂质膜；
2)加入RNase超纯水，在60℃下收集脂质膜；
3)在冰浴中，100W超声3分钟，得到空的DOTAP脂质体和空的DOTAP/CHOL脂质体；
4)采用脂质体与标记了CY5荧光染料的mRNA分子共孵育的方法制备N/P为3：1的纳米递送系统。取适量的空载脂质体加入到一定量的水中标记为A；将不同质量的主药加入到RNase-free水(含10μL 1.5mM的RNase-free的NaCl溶液)中，混匀得B；B与A混匀后室温孵育10min，即得不同的脂质体复合。
2.包裹型复合物(SA@DOTAP-CY5、SA@DOTAP/CHOL-CY5)的制备方法：向1ml脂质体复合物中加入500μL浓度为200μg/ml的海藻酸钠溶液，混匀后孵育5min即可。
3.细胞摄取
具体考察实施例8处方1～处方3，将DC2.4细胞接种于24孔培养板(1×105个细胞/孔)，在含10％胎牛血清的0.5mL DMEM中孵育过夜。用含10％胎牛血清的新鲜DMEM代替培养基，每孔加入含1μg CY5-mRNA的脂质体/mRNA复合物。6h采用共聚焦显微镜和流式细胞术研究DC 2.4细胞对DOTAP-CY5、DOTAP/CHOL-CY5和SA@DOTAP-CY5的摄取情况；并收集细胞，用PBS冲洗2次，采用流式细胞术研究DC 2.4细胞对DOTAP-CY5、DOTAP/CHOL-CY5和SA@DOTAP-CY5的摄取情况，以此探查SA@DOTAP-GFP更高的转染效率是否与细胞摄取有关。结果：如图25～图26所示，SA和CHOL均上调DOTAP-CY5的内吞作用，但DOTAP/CHOL-CY5与SA@DOTAP-CY5的内吞作用无显著差异。因此，采用细胞摄取抑制剂预处理细胞探究细胞对纳米制剂的摄取机制是否发生改变。
将DC2.4细胞接种于24孔培养板(1×10^5个细胞/孔)，在含10％胎牛血清的0.5mLDMEM中孵育过夜。然后用含有不同吸收抑制剂的500μL DMEM代替培养基。(摄取抑制剂用量:氯丙嗪，5μg/孔；细胞松弛素D,0.255μg/孔；制霉菌素、5μg/)。孵育0.5h后，每孔加入含1μg CY5-mRNA的脂质体/mRNA复合物孵育2h。最后收集细胞，用流式细胞仪检测荧光强度。
结果：如图27所示，网格蛋白和巨胞饮抑制剂氯丙嗪和细胞松弛素D预处理后，DOTAP/CHOL-CY5、DOTAP-CY5、SA@DOTAP/CHOL-CY5和SA@DOTAP-CY5的细胞摄取量均减少，但仅SA@DOTAP-CY5的细胞摄取量被抑制剂制霉菌素显著抑制。说明不含胆固醇的SA包裹型复合物SA@DOTAP-mRNA可以通过小窝蛋白介导的途径进入细胞，而含胆固醇的SA包裹型复合物SA@DOTAP/CHOL-mRNA通过该途径摄取不明显。
小泡蛋白依赖的内吞作用可使得制剂不进入溶酶体。基于小泡蛋白依赖性内吞作用的疫苗最终被运送到内质网，内质网中的核糖体和主要组织相容性复合体(MHC)分子为mRNA翻译和抗原提呈提供了方便的途径。为SA@DOTAP-mRNA的高效翻译和抗原提呈提供了依据，详见图27。
4.溶酶体逃逸
具体考察实施例8中处方1～处方3的溶酶体逃逸能力，具体步骤如下，将DC2.4细胞接种于含有2mL DMEM培养基(含10％胎牛血清)的共聚焦培养皿(×10^5细胞/孔)中培养24h。以CY5-mRNA为示踪剂，LysoTracker为溶酶体标记物。每个板加载CY5-mRNA的脂质体/mRNA复合物(CY5-mRNA终浓度为0.5μg/板)，37℃黑暗孵育2h。到达孵育时间点后，弃去培养基，用预冷的PBS冲洗细胞2次，去除吸附在细胞表面的纳米修复物(在摄取终止前1h，加入溶酶体标记物(终浓度为75μM Lyso-Tracker)以标记溶酶体)。预冷细胞，用PBS漂洗两次，利用激光共聚焦显微镜研究DOTAP/CHOL-CY5，DOTAP-CY5和SA@DOTAP-CY5的溶酶体逃逸能力。
结果：如图28所示，DOTA-CY5和DOTAP/CHOL-CY5均不同程度地与溶酶体共定位，而SA@DOTAP-CY5与溶酶体共定位率较低。数据显示，SA具有一定的阴离子聚合物特性，可以提高纳米药物从溶酶体的逃逸能力。
其一，SA侧链可能被H+中和，随着pH降低而分离；其二，不带电的疏水侧链插入内体膜的疏水部分，降低内体稳定性，促进内体逃逸；其三，阳离子脂质通过与溶酶体膜上的阴离子磷脂融合而破坏溶酶体膜，从而介导溶酶体中脂质体的逃逸。
在本发明中，我们的处方只包含mRNA、阳离子脂类DOTAP和包衣材料SA。SA结合氢离子并脱落后，DOTAP-mRNA暴露，没有CHOL对DOTAP-mRNA脂膜的稳定作用，DOTAP分子更容易与溶酶体膜融合，从而提高了溶酶体逃逸效应。
5.抗血清转染实验
①在高浓度胎牛血清条件下对DC 2.4细胞进行转染实验，具体考察实施例1中处方1，处方5及处方7，以此验证SA@DOTAP-GFP是否通过降低血清蛋白吸附而增加转染量。
结果：如图30所示，SA/DOTAP-GFP在30％胎牛血清条件下具有较高的转染效率，而DOTAP-GFP和DOTAP/CHOL-GFP的转染效率明显降低。
②具体考察实施例1中处方1，处方4及处方5的抗血清能力，将含50％胎牛血清的水溶液分别与实施例1中处方1，处方5及处方7制剂共孵育，测定这三种脂质体/mRNA复合物的粒径变化。
结果：如图29所示，与DOTAP-GFP和DOTAP/CHOL-GFP相比，SA@DOTAP-GFP的粒径随孵育时间变化不大，说明SA显著降低了DOTAP对FBS的吸附。
实施例9免疫活性考察
表11处方组成
1)在本实施例中，以OVA-mRNA作为主药，按照表中处方，参照实施例1的制剂制备方法，制备SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA,DOTAP-LUC，DOTAP/CHOL-LUC，SA@DOTAP-LUC和SA@DOTAP/CHOL-LUC。
2)具体考察实施例9中SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA样品在BMDCs细胞上的抗原提呈能力和促进BMDCs细胞的成熟活化能力，以验证较高转染的SA@DOTAP-mRNA是否也能提高抗原提呈效果。具体地BMDCs(5×10^5)接种含有0.5mL RPMI-1640培养基(包含10％的FBS)中0.5h,然后将含1μg OVA-mRNA复合物添加到每个孔，孵育24h后。收集BMDCs细胞，并用PE-anti-mouse CD11c,FITC-anti-mouse CD86,APC-anti-mouseSIINFEKL/H-2Kb 25-D1.16流式抗体染色。用流式细胞术检测各个制剂在BMDCs细胞上的抗原提呈。
结果：如图30～图32所示，SA@DOTAP-OVA比对照组DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA具有更强的抗原提呈效应。
3)采用实施例9中DOTAP-LUC，DOTAP/CHOL-LUC，SA@DOTAP-LUC和SA@DOTAP/CHOL-LUC样品研究各复合物在小鼠各个器官中的表达情况。
在6～7周龄雄性C57BL/6/C小鼠体内检测DOTAP-LUC、DOTAP/CHOL-LUC和SA@DOTAP-LUC的体内表达，每组3只。以LUC-mRNA为工具mRNA，给药剂量为30μg/小鼠。注射后6h处死小鼠，体外成像观察小鼠心、肝、脾、肺、肾四组脂质体/mRNA复合物在体内的表达情况。
结果：如图33～图34所示，SA@DOTAP-LUC在小鼠肺中和脾脏中的表达均明显高于对照组DOTAP-LUC和DOTAP/CHOL-LUC。结合SA@DOTAP-mRNA的检测结果(图2)，说明改变脂质体的电荷量是改变阳离子脂质体分布的可行方法。
为进一步考察影响靶向脏器的主要因素，在6～7周龄雄性C57BL/6/C小鼠体内检测SA@DOTAP-LUC和SA@DOTAP/CHOL-LUC的体内表达，每组3只。以LUC-mRNA为工具mRNA，给药剂量为30μg/小鼠。注射后6h处死小鼠，体外成像观察小鼠心、肝、脾、肺、肾四组脂质体/mRNA复合物在体内的表达情况。
结果：如图35～图36所示，SA@DOTAP-LUC在小鼠肺中和脾脏中的表达均明显高于对照组SA@DOTAP/CHOL-LUC。结合SA@DOTAP-mRNA的检测结果(图36)，说明不含胆固醇的包裹型复合物更容易分布到脾，具有脾靶向的效果。
4)采用实施例9中SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA的样品研究SA@DOTAP-OVA的高转染效率和强抗原提呈能力是否能更好地促进T细胞增殖分化为特异性CTL。
将实施例9中SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA的样品免疫正常小鼠，分别于day7，day10，day15进行小鼠免疫治疗(mRNA用量为10μg/只)于day25处死小鼠并制备各组小鼠脾脏的细胞悬液。然后将1μL FITC-anti-mouse CD3,1μL APC-anti-mouseCD8A and 1μL H-2kB OVA tetramer SIINFKL/H-2Kb加入到流管中，在4℃黑暗孵育40min。最后采用流式细胞术检测OVA特异性T细胞。
结果：如图35所示，对照组DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA在促进OVA特异性CLTs增殖方面无显著性差异，SA@DOTAP-OVA显著促进OVA特异性CLTs增殖。除此之外，治疗组小鼠的淋巴结重量显著增加，较高水平的抗原提呈能力促进OVA特异性CTL的增殖，为有效的抗肿瘤免疫应答提供了可能，详见图37。
实施例10药效学实验
体内抗肿瘤作用
由于TCR的激活和IFN信号可能依赖于mRNA给药的途径，而部分研究表明，通过静脉注射mRNA疫苗可以避免mRNA存在的固有免疫的不良影响，并促进CD8+T细胞反应。因此，本实施例采用静脉给药的方式考察体内药效。
采用实施例9中SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA及SA@DOTAP-LUC的样品考察对荷瘤小鼠的治疗效果，通过小鼠尾静脉注射以DOTAP-OVA及DOTAP/CHOL-OVA作为阳性对照，SA@DOTAP-LUC作为阴性对照，SA@DOTAP-OVA作为目标治疗组，治疗EG7荷瘤小鼠。如图24所示，接瘤成功后，分别于day7，day10，day15进行小鼠免疫治疗(mRNA用量为10μg/只)，自第一次给药开始，每隔两天监测一次小鼠肿瘤体积的变化，具体考察的。各组小鼠肿瘤生长情况如图38所示。
与生理盐水组相比，各组均通过增加抗原呈递作用抑制肿瘤生长，而SA@DOTAP-LUC对肿瘤生长有轻微抑制作用，这可能是由于DOTAP本身具有一定的免疫佐剂作用所致。DOTAP/CHOL-OVA与DOTAP-OVA治疗效果无显著性差异，SA@DOTAP-OVA抗肿瘤作用显著高于DOTAP-OVA。
如图39、图40-A所示，虽然肿瘤体积和小鼠肿瘤重量无明显差异，但是SA@DOTAP-OVA组末次给药后肿瘤生长趋势有明显的消退现象。
如图40-B所示，SA@DOTAP-OVA的肿瘤抑制率为56％，DOTAP/CHOL-OVA的肿瘤抑制率为37％，SA@DOTAP-OVA的肿瘤抑制率明显高于DOTAP/CHOL-OVA。
如图40、图41所示，SA@DOTAP-OVA组肿瘤浸润性OVA特异性CTL明显高于对照组DOTAP/CHOL-OVA组，即SA@DOTAP-OVA的抗肿瘤作用强于DOTAP/CHOL-OVA。
实施例11包裹型mRNA疫苗的安全性和毒性评价
1)通过CCK8检测实施例9中SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA制剂的细胞毒作用，从而测试SA是否能降低阳离子脂质体的毒性。
将DC2.4细胞接种到96孔板上(细胞密度为1×104细胞/孔)，24h后，在每孔中加入不同数量的纳米疫苗。孵育24h后，每孔加10 1μL CCK8,37℃孵育4h，采用酶标仪检测细胞活力。
结果：如图42所示，实施例9中处方3制剂(SA@DOTAP-OVA)的毒性低于对照组DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA，并且治疗期间体重无异常变化。
2)通过H&E染色和生化分析进一步研究实施例9中SA@DOTAP-OVA，DOTAP-OVA，DOTAP/CHOL-OVA及SA@DOTAP-LUC的样品对小鼠生理的安全性的影响。
实施例10中小鼠在治疗结束后，每组随机选取1只小鼠，取其重要器官，制作各器官病理组织切片并染色。在病理切片扫描仪上观察染色组织并拍照，观察小鼠肝、肾、脾、肺等重要组织器官的病理变化。
结果：如图43～图45所示，通过H&E染色，DOTAP/CHOL-OVA在小鼠中未发现明显的肺毒性。但生化指标显示，DOTAP-OVA和DOTAP/CHOL-OVA对小鼠肝脏、肾脏等主要脏器造成损伤，而SA@DOTAP-OVA对小鼠的脏器损伤不明显。这表明添加SA可减轻DOTAP-OVA对小鼠重要器官功能的损伤，即可以通过添加SA减轻DOTAP-OVA诱导的小鼠组织毒性和炎症反应，即通过修饰SA可建立一种更安全的用于基因治疗的脂质体/mRNA复合物。
综上所述，本发明通过将阴离子材料聚合物包裹在含活性成分的带正电荷的纳米复合物上，获得了一种处方简化、稳定性高、易于制备的包裹型纳米制剂，对改善其体内和体外稳定性和递送效率具有显著的效果，提供了一种通过阴离子化合物改善现有纳米药物的方法。

Claims (13)

1.一种用于提高脾脏靶向效果和/或改善细胞摄取途径的包裹型复合物，其特征在于，所述包裹型复合物由外部的带负电包裹层和内部的纳米颗粒组成；所述外部的包裹层为阴离子化合物或阴离子化合物的混合物；所述纳米颗粒为包载活性成分的阳离子纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的包裹型复合物，其特征在于，所述阴离子化合物为透明质酸钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、肝素钠、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、十二烷基磺酸钠及其衍生物中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的包裹型复合物，其特征在于，所述阳离子纳米颗粒包括：脂质体、核壳型纳米粒、HDL纳米粒、脂质纳米颗粒、固体脂质纳米粒、聚合物胶束脂质纳米粒、聚合物纳米粒、胶束、乳剂；所述活性成分为核酸、蛋白多肽类药物或小分子药物及其混合物中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的包裹型复合物，其特征在于，所述阳离子纳米颗粒含有DOTAP、DOTMA、DOSPA、DTAB、DDAB、DC-CHOL脂质材料中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的包裹型复合物，其特征在于，所述外部的带负电包裹层与所述活性成分的质量比为1:0.25～1:4。
6.根据权利要求3所述的包裹型复合物，其特征在于，所述核酸包括编码病毒的抗原蛋白、基因编辑工具蛋白、蛋白补充治疗相关蛋白、细胞因子的mRNA；所述病毒的抗原蛋白包括EBV、HPV、HBV、SARS-Cov-2、编码疟疾、合胞病毒、登革、寨卡、狂犬、流感病毒的抗原蛋白，所述基因编辑工具蛋白包括Cas9，所述细胞因子包括细胞因子IL12，所述蛋白补充治疗相关蛋白包括编码肿瘤的抗原蛋白Mucin1、KRAS。
7.根据权利要求1-6任一所述的包裹型复合物，其特征在于，所述复合物不含膜稳定剂胆固醇。
8.用于提高脾脏靶向效果和/或改善细胞摄取途径的包裹型纳米制剂，其特征在于，所述包裹型纳米制剂由包裹型复合物和药学上可接受的辅料组成；所述包裹型复合物由外部的带负电包裹层和内部的纳米颗粒组成；所述外部的带负电包裹层为阴离子化合物或阴离子化合物的混合物；所述纳米颗粒为包载活性成分的阳离子纳米颗粒。
9.权利要求1所述的包裹型复合物或权利要求8所述的包裹型纳米制剂在制备mRNA药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述mRNA药物用于治疗的疾病包括鼻咽癌、宫颈癌、头颈鳞癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、病毒感染以及动脉粥样硬化。
11.权利要求1所述的包裹型复合物或权利要求8所述的包裹型纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将阳离子脂质材料溶于无水乙醇中，采用薄膜水化法制备带正电荷的纳米颗粒；
2)、将步骤1)制备的带正电荷的纳米粒子与活性成分进行混合孵育，得到包载活性成分的纳米颗粒；
3)、将所述包裹层的阴离子化合物或阴离子化合物的混合物与步骤2)所述的带正电荷的纳米颗粒进行混合孵育，获得包裹型复合物；
4)、向3)制备的包裹型复合物中添加药学上可接受的辅料，即得包裹型纳米制剂。
12.权利要求1所述的包裹型复合物或权利要求8所述的包裹型纳米制剂在改变mRNA药物内吞途径和/或增强溶酶体逃逸能力中的应用。
13.权利要求1所述的包裹型复合物或权利要求9所述的包裹型纳米制剂在提高mRNA药物脾脏靶向效果中的应用。
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