CN107595774B - 一种自乳化纳米复乳及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自乳化纳米复乳及其制备方法和应用，涉及医疗技术领域，其包括以下步骤：取适量的司盘80和聚氧乙烯氢化蓖麻油按照质量比10:8进行混合，然后取适量的混合物和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合表面活性剂；按重量份计，取12～15份的混合表面活性剂和75份的油相进行混合，升温至60℃保持，同时磁力搅拌使混合表面活性剂中的助乳化剂溶解完全，于60℃下加入水相，磁力搅拌下冷却至室温即得W/O型纳米初乳；取适量的聚氧乙烯氢化蓖麻油和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合乳化剂；取适量的W/O型纳米初乳和混合乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到自乳化纳米复乳。

Description

一种自乳化纳米复乳及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体来讲是一种自乳化纳米复乳及其制备方法和应用。

背景技术

尽管小RNA的前景巨大，然而以治疗为目的小RNA的应用目前仍面临较大挑战：首先“off-target”效应和免疫刺激阻碍了小RNA的应用，如何最小化脱靶效应和避免免疫刺激成为人们关心的问题。通过不断研究，人们发现siRNA pool、化学修饰、最优化siRNA设计能够显著降低脱靶效应和免疫刺激；使siRNA被特异性地输送到靶细胞，减少其与免疫细胞接触、内化和在内吞体中滞留的机会也能减少“off-target”效应和免疫刺激。最后也是最大的挑战即siRNA的体内递送问题。由于siRNA①具有相对较大的分子量和聚阴离子属性，不能自由通过细胞膜；②血液稳定性差，易被血液中存在的核酸酶降解；③血浆中带正电荷的蛋白会与之中和产生聚集；④肾脏的快速清除以及非靶组织的分布；⑤胞内溶酶体降解等使得siRNA特异、有效的递送仍是RNAi临床广泛应用的主要障碍。因此如何将siRNA有效地传递到靶细胞并与靶基因结合，是当前RNAi成功应用于临床面临的关键问题，所以提高小核酸药物体内稳定性、开展小核酸药物递送载体系统的研究，开发安全有效地将小核酸递送至靶组织、靶细胞且能成功逃过溶酶体降解的非细胞毒性和不依赖siRNA序列的递送载体和方法具有重大意义。

为了实现小RNA有效的体内递送，科学家们通过多种方法与途径来实现该目的，包括：通过化学修饰来提高小RNA的稳定与细胞膜通透性；利用各种优秀的载体及合适的给药途径将小RNA稳定地递送至靶组织与靶细胞。

递送载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体有着感染细胞的天性，有一套将自己的基因导入靶细胞的步骤，转染效率高。然而其大量生产困难、细胞毒性大具有潜在的致突变力、引起毒性免疫原性强且装载外源基因的大小有限，这使得病毒载体递送系统的临床应用受到限制。

与病毒载体相比，非病毒载体具有无免疫原性、易生产、可修饰连接靶向配体、无致瘤性等优点而备受研究者关注。一个优秀的小RNA递送系统有如下特点：1)生物相容，生物降解，反复给药无免疫应答；2)有效递送小RNA至靶细胞并保护其活性双链免受核酸攻击；3)全身给药后能提供靶组织的特异性分布并避免快速的肝肾清除；4)通过胞吞递送至靶细胞后，体系应能促进endosomal释放siRNA到胞浆(细胞质)与内源RISC相互作用；5)大量生产可重现且成本可接受；6)存储(如室温)稳定性及给药顺应性。

脂质体和乳剂都已经作为药物载体在临床上使用。作为核酸的递送载体，阳离子脂质体进人体内高血清的环境后，转染效率降低，且伴随着剂量依赖毒性。阳离子乳剂因具有血清稳定性高、容易制备及工业化生产成本低等优势而备受研究者关注。在体外，阳离子乳剂可以将DNA转入到含有90％的血清的细胞中，转染效率较高。阳离子乳剂主要由带正电荷的乳化剂、助乳化剂、油相、水相及其附加剂组成。与普通乳剂相比，因其带有正电荷，可以与表面带有负电荷的基因和细胞表面结合，达到有效包裹并传递基因到细胞内的作用。2004年Bivas-Benita等成功地利用带正电阳离子乳剂包裹基因给药，为非病毒载体的细胞转染指明了新的研究方向。同时最新的研究结果证明，阳离子乳剂物理和生物活性方面超过阳离子脂质体，且其细胞毒性也低于阳离子脂质体。因此，随着基因技术的发展，从临床可应用角度考虑，安全、经济、有效及可批量化生产的递送载体对小核酸药物的开发及核酸治疗应用具有举足轻重的作用，此时乳剂作为比较合适的递送载体受到越来越多关注。但是，关于乳剂做为核酸的递送载体，如何精确的实现组织靶向，处方设计、剂型及乳剂类型对核酸体内外稳定性、体内外转染效率、体内外药物的释放及胞内释放都需要深入研究，同时应兼顾临床应用的一些特点与限制，尽量将小核酸推向临床应用。

关于siRNA的递送，还要考虑不同的给药途径、递送载体及两者的结合。一般来说，给药方法可粗略分为局部(local delivery)(如肿瘤、心脏、肌肉、眼、真皮、中枢神经系统、呼吸系统、耳和肝等)和全身给药(systemic delivery)。相比其它给药方式，局部给药直接靶向于组织，这能减少非靶组织的分布，可能降低siRNA的用量，由于要更接近靶组织，所以可能会需要侵入性的注射方法，对于一些深部组织，比如心、肾、肝和肿瘤等，这会限制其临床应用；对于其它一些组织，如阴道、直肠、鼻腔、口腔和眼等，通过局部给药是一个比较合理的途径。迄今已有很多通过局部给药途径进行动物体内RNAi药物药效评价和国外RNA药物I-III期临床试验的报道。主要是通过将RNAi药物分子(siRNA﹑miRNA﹑shRNA等)通过注射﹑滴入﹑涂抹或喷雾等方式直接导进到一个特定的组织或器官中。

原位凝胶是一种新型的药物传递系统，它以溶液状态给药后，能在用药部位根据环境的变化而迅速发生相转变，由液态转化形成非化学交联半固体凝胶的制剂，原位凝胶的形成机制是当外界环境如温度、或离子强度等发生变化时，聚合物在生理条件下、发生分散状态或构象的可逆变化，完成由溶液状态向半固体凝胶状态的相转化过程。原位凝胶多由水溶性高分子材料制备而成，具有高度亲水性的三维网格结构。与其他传统的给药系统相比，原位凝胶有明显优势：将药物制备成原位凝胶，通过轴膜给药，可以避开胃肠道的消化和肝脏的首过消除，使得有效剂量小，生物利用度高；可以根据环境的变化来调整凝胶的理化性状和药物在体内的状态以达到及时有效治疗；与轴膜组织的亲和力强，滞留时间长，具有良好的缓释或控释作用；组织相容性好，使用方便，减少了给药频率，提高了患者的顺应性；可以通过多种途径给药，如经皮、眼部、鼻腔、直肠、注射给药，适用范围广泛；同时，原位凝胶也可用于局部作用药物、全身作用药物、大分子药物、细胞组织、亲水性药物、疏水性药物等。温度敏感型原位凝胶(thermosensitive in situ gel)是一种依从温度而发生相转变的凝胶。它在储藏条件下是自由流动的液体，注射进入人体后可填充于组织间隙，在体内可迅速发生相转变，在注射部位形成半固体状态凝胶，达到局部给药或延缓药物释放的目的。具有可注射、创伤小、给药方便、延缓药物释放、与组织接触紧密等优点，适用于体内局部或植入给药，是目前研究较为广泛的敏感型原位凝胶之一。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种自乳化纳米复乳及其制备方法和应用，解决了生物药剂学分类系统Ⅲ(BCSⅢ)(高溶解性低渗透性的药物，如蛋白、小核酸等活性分子)体内吸收差及稳定性差的问题。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，包括以下步骤：制备混合表面活性剂：取司盘80和聚氧乙烯氢化蓖麻油按照质量比10:8进行混合，然后取适量的混合物和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合表面活性剂；制备W/O型纳米初乳：取混合表面活性剂和油相按质量比12～15：75进行混合，升温至60℃保持，同时磁力搅拌使混合表面活性剂中的助乳化剂溶解完全，于60℃下加入水相，磁力搅拌下冷却至室温即得W/O型纳米初乳；制备混合乳化剂：取适量的聚氧乙烯氢化蓖麻油和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合乳化剂；制备自微乳化制剂：取适量的W/O型纳米初乳和混合乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到自乳化纳米复乳。在上述技术方案的基础上，制备混合乳化剂时，先将助乳化剂溶于无水乙醇中再与聚氧乙烯氢化蓖麻油混匀，之后将此混合物置50℃挥干无水乙醇即可。

在上述技术方案的基础上，所述助乳化剂为卵磷脂、丙二醇或者丙三醇。

在上述技术方案的基础上，所述油相为大豆油、花生油、芝麻油、角鲨烯或者中链脂肪酸甘油酯中的一种或联合应用。

在上述技术方案的基础上，所述水相为去离子水、注射用水、PBS溶液、溶解有药物的水性溶液或者溶解有药物的PBS溶液中的一种。

本发明还公开了一种自乳化纳米复乳，该纳米复乳采用上述的制备方法制得。

本发明还公开了一种自乳化纳米复乳的应用，将上述自乳化纳米复乳置于适量的水或者磷酸盐缓冲液(PH值为7.4)中轻微搅拌后，通过静脉注射途径给药。

本发明还公开了一种自乳化纳米复乳的应用，将上述自乳化纳米复乳置于适量的温敏凝胶中，通过皮肤、黏膜或者腔道途径局部给药。

在上述技术方案的基础上，所述温敏凝胶通过以下步骤制得：步骤S1.按重量份称取泊洛沙姆10～20份、卡波姆或羟丙基甲基纤维素4～8份，然后加入70～80份温度为4℃的蒸馏水，搅拌均匀后置于4℃条件下，直至其充分溶胀、分散均匀、溶解，得到凝胶溶液，放置待用；步骤S2.按重量份称取附加剂0～2份、防腐剂0～0.1份，加入到步骤S1制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀；在搅拌状态下，加蒸馏水或注射用水定容至100mL，然后用氢氧化钠调节pH值至6.80,即得到胶凝点为29～35℃的温敏凝胶。

在上述技术方案的基础上，步骤S2中，所述附加剂为1，2-丙二醇或丙三醇；所述防腐剂为苯甲酸或山梨酸。

有益效果：

本发明中小RNA被包裹于微乳的内水相，一方面使药物避免与体液或组织液直接接触，可保护其免受核酸酶的攻击；另一方面利用乳剂适当增加亲水性药物的亲脂性并保持纳米的尺寸而更易透过生物膜等，提高小RNA体内转染效率；此外该制剂可在临用前通过温和振摇自乳化形成纳米乳，这为小RNA体外稳定性提供了保障。

该纳米复乳可经静脉给药，或者与温敏凝胶联合使用，可实现经局部如经皮肤或黏膜给药，即一方面可以充分利用纳米复乳递送系统的优点，保护药物体外贮藏稳定性、体内免受酶的攻击；一方面利用生物黏附剂的特点，延长与粘膜组织的接触时间，达到缓控释药物的目的，提高生物利用度；同时，该温敏凝胶室温下为液态，可均匀填充于不规则腔道，给药后在体温下几分钟内即可凝固，形成带有黏附性的凝胶不会流出体外，给药方便，顺应性好。

本发明中温敏凝胶制剂可根据其组方的调整可制备出不同的凝胶温度。另外，由于小RNA性质上的相似，自微乳组分中的药物可以是各种经筛选验证效果显著的siRNA。因此，可根据病人诊断结果选择相应靶基因的siRNA自微乳制剂，临用前在该siRNA自微乳制剂中加入溶剂形成自微乳剂，再与室温下呈液态的温敏凝胶混合均匀给药即可，实现了个性化治疗。

附图说明

图1为本发明实施例中去离子水中自乳化后的粒径的示意图。

图2为本发明实施例中PBS液中自乳化后的粒径的示意图。

图3为本发明实施例中培养基液中自乳化后的粒径的示意图。

图4为本发明实施例中W/O/W纳米复乳对细胞增殖的影响的示意图。

图5为本发明实施例中W/O/W型siRNA纳米复乳入胞效果的示意图。

图6本发明实施例中体外Hela细胞的转染效果图。

图7为本发明实施例中小RNA制剂经阴道给药后对靶基因表达的影响示意图。

图8为为本发明实施例中W/O/W型小RNA纳米复乳制剂经皮肤给药后对靶基因表达的影响及靶组织中siRNA的含量示意图。

具体实施方式

下面通过参考附图描述实施例是示例性的，旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。通过对本发明的具体实施方式作进一步的描述，使本发明的技术方案及其有益效果更加清楚、明确。

本发明实施例提供了一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，包括以下步骤：

制备混合表面活性剂：取适量的司盘80和聚氧乙烯氢化蓖麻油按照质量比10:8进行混合，然后取适量的混合物和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合表面活性剂；具体的，所述助乳化剂为卵磷脂、丙二醇或者丙三醇。

制备W/O型纳米初乳：按质量比计，取12份的混合表面活性剂和75份的油相进行混合，升温至60℃保持，同时磁力搅拌使混合表面活性剂中的助乳化剂溶解完全，于60℃下加入水相，磁力搅拌下冷却至室温即得W/O型纳米初乳；具体的，所述油相为大豆油、花生油、芝麻油、角鲨烯或者中链脂肪酸甘油酯中的一种或联合应用。所述水相为去离子水、注射用水、PBS溶液、溶解有药物的水性溶液或者溶解有药物的PBS溶液中的一种。优选的，混合表面活性剂可取15份与75份的油相进行混合。

制备混合乳化剂：取适量的聚氧乙烯氢化蓖麻油和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合乳化剂；具体的，制备混合乳化剂时，先将助乳化剂溶于少量无水乙醇中再与聚氧乙烯氢化蓖麻油混匀，之后将此混合物置50℃挥干无水乙醇即可。

制备自微乳化制剂：取适量的W/O型纳米初乳和混合乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到自乳化纳米复乳。

本发明实施例还公开了一种自乳化纳米复乳，该纳米复乳采用上述的制备方法制得。

本发明实施例还公开了一种自乳化纳米复乳的应用，将上述自乳化纳米复乳置于适量的水或者磷酸盐缓冲液中轻微搅拌后，通过静脉注射途径给药。

本发明实施例还公开了一种自乳化纳米复乳的应用，将上述自乳化纳米复乳置于适量的温敏凝胶中，通过皮肤、黏膜或者腔道途径局部给药。

所述温敏凝胶通过以下步骤制得：

步骤S1.按重量份称取泊洛沙姆10份、卡波姆或羟丙基甲基纤维素4份，然后加入70份温度为4℃的蒸馏水，搅拌均匀后置于4℃条件下，直至其充分溶胀、分散均匀、溶解，得到凝胶溶液，放置待用；

步骤S2.按重量份称取附加剂0份、防腐剂0份，加入到步骤S1制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀；在搅拌状态下，加蒸馏水或注射用水定容至100mL，然后用氢氧化钠调节pH值至6.80,即得到胶凝点为29℃的温敏凝胶。具体的，所述附加剂为1，2-丙二醇或丙三醇；所述防腐剂为苯甲酸或山梨酸。

或者按照下列步骤制备：

步骤S1.按重量份称取泊洛沙姆20份、卡波姆或羟丙基甲基纤维素8份，然后加入80份温度为4℃的蒸馏水，搅拌均匀后置于4℃条件下，直至其充分溶胀、分散均匀、溶解，得到凝胶溶液，放置待用；

步骤S2.按重量份称取附加剂2份、防腐剂0.1份，加入到步骤S1制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀；在搅拌状态下，加蒸馏水或注射用水定容至100mL，然后用氢氧化钠调节pH值至6.80,即得到胶凝点为35℃的温敏凝胶。具体的，所述附加剂为1，2-丙二醇或丙三醇；所述防腐剂为苯甲酸或山梨酸。

本文采用低能两步乳化的方法制备W/O/W型纳米复乳，第一步结合相转变温度法与机械法制备W/O纳米初乳，第二步采用低能的自乳化方法获得W/O/W型微乳。然后对其性质——外观、粘度、离心稳定性、粒径分布、zeta电位、自乳化行为、产率及包封率等指标进行了研究评价。

实验方法

1.W/O/W纳米乳制备的工艺研究

其具体制备工艺流程如下：(1)制备内水相，取PBS溶液适量，加入亲油性表面活性剂，于冰浴下保温搅拌至均匀；(2)1000rpm下于(1)中缓慢滴加与PBS溶液等量的油相，冰浴下持续搅拌乳化8min，然后升温至60℃，于60℃持续搅拌乳化5min，然后加入剩余的油相，继续搅拌至形成均匀的初乳；(3)将粗乳进行高速分散(8000rpm，3min)，得到W/O型初乳。(4)将以上得到的W/O型初乳与亲水型表面活性剂SAⅡ按处方量配制，在磁力搅拌下混合均匀，得到自微乳化制剂。

2.W/O/W微乳的处方筛选

2.1W/O型纳米初乳处方研究

关于W/O型初乳的处方研究，本研究重点考察了以下单因素对理亲油型乳化剂Span 80、SP85的用量(w/w)和亲水型乳化剂Tween80、聚氧乙烯蓖麻油(Polyglycerolester of polyricinoleic acid，EL30)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)的组合与用量(w/w)；油相的种类与用量对初乳粒径及内水相所占百分比的影响。分别制备了Span 80、Span85与三种亲水型乳化剂Tween 80、EL30、RH40不同配比的组合，得到了一系列HLB的乳化剂；以天然卵磷脂、丙二醇或甘油为助乳化剂，将这些组合乳化剂分别与MCT、大豆油、角鲨烯、油酸配合使用，固定其中水相用量为12％，总表面活性性用量为13％～14％，按上述工艺制备W/O初乳。

2.2W/O/W型纳米复乳处方研究

将在2.1项下制备得到的W/O型纳米初乳当做W/O/W型纳米复乳中的油相，W/O/W型纳米复乳的处方主要由油相(W/O型纳米初乳)及表面活性剂、助表面活性剂三个部分组成。其中表面活性剂为RH40或EL3单独使用或与Span80的组合使用，助表面活性剂为丙二醇、甘油或天然卵磷脂，初步确定RH40或EL3与Span80的比例后，按科学实验设计之正交实验设计方法确定表面活性剂和助表面活性剂的种类，然后对该处方按三相图的方法进行优化用量。

本专利文件中选用自纳米复乳化形成的W/O/W的自乳化性能(Y1，min)、复乳产率(Y2，％)、离心稳定性(Y3，不沉降、轻微沉降、沉降)为指标，采取综合评分方法评价结果。实验过程中固定油相与总表面活性剂的比例为8：2，总表面活性剂中表面活性剂与助表面活性剂的比例为7：3，设计了2因素4水平的正交实验，按L16(45)正交表设计实验，如Tab.1所示。

上述纳米复乳自乳化性能采用肉眼观察法进行评价，具体实验操作如下：

称取一定量(1g)的自纳米复乳样品，加入5ml PBS溶液，保持温度在37℃，采用温和磁力搅拌，时时观察，采用肉眼观察所形成乳剂的外观，根据评分等级打分，判断其自复乳化的性能。具体的评分等级分为4个等级，如下所示：

(A)立即形成澄清或呈轻微蓝色乳光的微乳，记5分；

(B)快速形成较浓厚的乳白色的乳剂，微泛兰乳光，记4分；

(C)快速形成浓厚的乳白色的乳剂，无兰乳光，记3分；

(D)乳化程度差，表面有大油滴，记1分。

复乳产率采用电导率测定的方法来计算，其计算公式为：产率(％)＝100×[Sl-(A×(S2-S3))/B]÷S1，其中S1、S2、S3分别为1g·L-1NaCL溶液、以1g·L-1NaCL溶液为内水相制得的复乳以及空白复乳的电导率；A为所配复乳总量(mL)；B为内水相体积(mL)；

离心稳定性测定方法为：将所得终乳首先以3000r·min-1离心5min后，观察是否仍维持澄清、透明或分层，记4分；若仍维持澄清、透明则继续在5000r·min-1离心5min观察是否仍维持澄清、透明或分层，记5分。

综合评分为自乳化性能、离心分离时间分别占30％，复乳产率占40％，三项指标的综合分值。

Tab.1 W/O/W自纳米复乳处方的因素和水平表

2.3W/O/W纳米复乳的质量评价及形貌表征

纳米复乳自乳化性能评价采用肉眼观察法进行，具体实验操作如下：称取一定量(1g)的自纳米复乳样品，加入5ml PBS溶液，保持温度在37℃，采用温和磁力搅拌，时时观察，采用肉眼观察所形成乳剂的外观。

外观性状：肉眼观察，应透明或略带乳光的溶液。

粒径及电位：采用马尔文nano粒度与zeta电位测定仪进行测定。

稳定性采用离心法测定，将所制终乳以5000r·min-1离心10min后，观察是否仍维持澄清、透明。

2.4W/O/W型纳米复乳稳定性研究

在注意无菌及酒精消毒的环境下，依法制备W/O型纳米初乳、W/O/W型纳米复乳及配制W/O/W型纳米复乳处方，W/O/W型纳米复乳处方分装成若干份，将上述样品置于室温下，分别于10天、20天、1个月直接观察W/O型纳米初乳和W/O/W型纳米复乳、取W/O/W型纳米复乳处方进行自乳化情况考察。

2.5W/O/W纳米复乳对细胞增殖的影响

采用WST-8法检测空白W/O/W纳米复乳体外对Hela细胞增殖的影响，以评价W/O/W纳米复乳的毒性。

2.6W/O/W型纳米复乳入胞效率研究

用W/O/W型纳米复乳包载FAM荧光标记的小RNA，考察W/O/W型纳米复乳转染小RNA入胞的效率。

(1)配制实验样品液：

1)配制小RNA W/O/W型纳米复乳：其配制方法基本同空白W/O/W型纳米复乳，只是将其中的内水相改为FAM荧光标记的小RNA PBS溶液；

2)取上述小RNAW/O/W型纳米复乳1μl，加入100μl无血清培养液乳化，即得(96孔板1孔的用量)；

(2)配制阳性对照样品液：

1)将荧光标记的小RNA粉末溶解于无RNA酶的无菌水中，配成终浓度为5-50μmol/L的小核酸溶液。

2)lipofectamine 2000(Invitrogen)与小核酸混合液的制备：分别将50μl FAM荧光标记的小核酸溶液(0.27ug/ul)和50μl的lipofectamine 2000(Invitrogen)分别稀释于100μl无血清培养液(Opti-MEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述FAM荧光标记的小核酸溶液与lipofectamine 2000溶液混合，于室温静置20分钟。

(3)用胰酶消化处于对数生长期的Hela细胞，添加10％FBS的DMEM培养基培养，用血细胞计数板计数细胞，然后96孔板孔每孔加入2000个细胞培养，分别加入步骤(1)和(2)中的样品液进行转染，6小时后更换添加10％FBS的DMEM培养基培养24小时后在荧光显微镜下观察荧光情况。

3温敏凝胶制备

3.1温敏凝胶制备方法

①按处方称取泊洛沙姆、羟丙基甲基纤维素等基质，加入蒸馏水使成合适浓度，搅拌5min，置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解，得亲水凝胶的澄明溶液；

②将其它小分子物质溶解，加入步骤①制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀，最后用蒸馏水定容至终体积，搅拌混匀，用氢氧化钠调节pH值至6.80，120℃灭菌30min，冷却至4℃，将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml)，即得温度敏感型凝胶。

3.2温敏凝胶处方筛选

控制基质的总浓度为20％，按下表处方依法配制凝胶液，对各处方下的凝胶进行外观性状、胶凝温度、胶凝时间及黏附性能考察。

Tab.2 以泊洛沙姆为基质的温敏凝胶处方

4.体外细胞实验考察小RNA制剂对靶基因A表达的影响

以W/O/W型纳米复乳为载体包载siRNA，以靶基因的表达量为指标，考察W/O/W型纳米复乳是否能有效将siRNA转染进细胞，同时做NC及lipo2000为转染试剂的阳性对照。

4.1配制转染试剂与小核酸的混合溶液。

具体步骤如下：

1)将荧光标记的小核酸粉末溶解于无RNA酶的无菌水中，配成终浓度为5-50μmol/L的小核酸溶液。

2)lipofectamine 2000(Invitrogen)与小核酸混合液的制备：分别将50μlFAM荧光标记的小核酸溶液(0.27ug/ul)和50μl的lipofectamine 2000(Invitrogen)分别稀释于100μl无血清培养液(Opti-MEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述FAM荧光标记的小核酸溶液与lipofectamine 2000溶液混合，于室温静置20分钟。

3)按照前文中W/O/W型siRNA纳米复乳的制备处方和方法制备siRNA纳米复乳，其载药量约为10～20μg/100μL，用3倍体积的培养基乳化，此时得到含siRNA为2.5～5μg/100μL的含药培养基。

4.2用胰酶消化处于对数生长期的Hela细胞，添加10％FBS的DMEM培养基培养，用血细胞计数板计数细胞，然后6孔板的每个孔上加入10万个细胞培养，添加将步骤3)中的培养基进行培养；lipo2000的转染按常规方法操作，即无血清转染6小时后换液；NC的操作同样品，只是不加任何转染试剂或药物载体进行“转染”，转染至24小时收样，依法收集细胞中的总RNA，Q-RT-PCR检测靶基因的表达量。

5.小RNA制剂经阴道给药后对靶基因表达的影响及靶组织中siRNA的含量研究

以靶组织中靶基因A表达量及药物siRNA的含量为指标，考察siRNA制剂经阴道给药的药效。

5.1凝胶的制备

1)称取160.0g泊洛沙姆407，加入蒸馏水500ml(4℃左右)，搅拌5min，置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解，得亲水凝胶的澄明溶液。

2)取甲基纤维素(MC)5.0g/L与十二烷基硫酸钠10g/L加入蒸馏水200ml，加热至50℃溶解。

3)取103.75g 1,2-丙二醇、30g甘油加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀，在搅拌状态下，将步骤2)的溶液缓缓加入，搅拌混合均匀，用蒸馏水定容至1L，搅拌混匀，用氢氧化钠调节pH值至6.80，120℃灭菌30min，冷却至4℃，将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml)，即得温敏凝胶。

5.2siRNA凝胶制剂及阳性对照样品的制备

1)依照前文的处方与方法配制W/O/W型siRNA纳米复乳；

2)W/O/W型siRNA纳米复乳用等体积DEPC-水乳化后再与3～4倍量的温敏凝胶混合；

3)Jet-PEI与小核酸的温敏凝胶制剂的配制：将26μl的siRNA溶液和13μl的Jet-PEI分别稀释于与其同体积的质量百分浓度10％的葡萄糖溶液中，然后将该小核酸溶液与jet-PEI溶液混合配制成78μl的小核酸jet-PEI混合液，复合物于室温静置15分钟。将小核酸jet-PEI混合液按配制比例为1：5(体积比)加入上述温敏凝胶，得到小核酸温敏凝胶。该小核酸温敏凝胶中siRNA为127.22μg/ml。

4)按照上述方法制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂作为阴性对照NC。

5.3给药方案

取NIH小鼠18只，体重20～28g，雌性，随机分成3组，每组6只，实验前10％乌拉坦麻醉，用无菌无RNase酶的PBS冲洗阴道3～5次(60ul/次)，吸干阴道内残留PBS液，将60～65μl上述三组小核酸温敏凝胶样品分别注入上述三组小鼠的阴道内宫颈处，给药后，倒立小鼠3～5min，并轻轻左右晃动，以使药物充分填满腔道并凝固。

给药24小时后处死小鼠，普通生理盐水或PBS冲洗阴道3次(60ul/次)并吸干PBS液，再用无菌无RNase酶的PBS冲洗阴道1～2次(60ul/次)并吸干PBS液；然后解剖小鼠，摘取阴道，小心将阴道翻转过来，扎紧阴道口，将宫颈部份浸泡于1mL Trizol液(Invitrogen)中并吹打提取5分钟后回收Trizol液；依法提取提取上述样品中的总RNA，通过Q-RT-PCR检测组织中靶基因的表达量及siRNA的含量。

6、小RNA制剂经皮给药后对靶基因表达的影响及靶组织中siRNA的含量研究

6.1样品的制备

空白凝胶的制备和siRNA凝胶制剂及阳性对照样品的制备同前文，此处不再累述。

6.2实验方案

取NIH小鼠18只，体重20～28g，雌性，随机分成3组，每组6只，实验前4-12小时，其腹部经市售脱毛膏做脱毛处理。

实验前20％乌拉坦麻醉(0.1ml/20g)，用RNase free PBS将小鼠皮肤擦净，按小鼠体重给药(100μL/20g)，将药物均匀涂抹于皮肤；给药后将无菌纱布覆盖给药部位，并将动物仰躺固定一定时间(8小时)，使药物有一定的吸收时间。给药后24小时后用自来水清洗给药部位5遍，再用少量脱毛膏脱毛处理一遍并清洗两遍；同时于背部脱毛；上述处理3小时后处死动物，RNase free PBS擦净给药部位皮肤，Trizol(Invitrogen)抽提给药皮肤中的总RNA，通过Q-RT-PCR检测组织中靶基因的表达量及siRNA的含量。

结果与讨论

1.W/O/W纳米乳的制备工艺

(1)考察了搅拌速度对终初乳的影响：分别在600、800、1000、1200、1400rpm下于(1)中缓慢滴加与PBS溶液等量的油相，冰浴下持续搅拌乳化8min，然后升温至60℃，于60℃持续搅拌乳化5min，然后加入剩余的油相，继续搅拌至形成均匀的初乳；然后将粗乳进行高速分散(8000rpm，3min)，得到W/O型初乳，比较初乳的外观性状及离心稳定性，结果见表，表明随着搅拌速度的增加，所得初乳的粒径有先减小后增大的趋势，故最终将搅拌速度定为800～1000rpm。

(2)考察了乳化温度对终初乳的影响：在1000rpm搅拌下于(1)中缓慢滴加与PBS溶液等量的油相，冰浴下持续搅拌乳化8min，然后升温至50、60或70℃，于此持续搅拌乳化5min，然后加入剩余的油相，继续搅拌至形成均匀的初乳；然后将初乳进一步进行高速分散(8000rpm，3min)，得到W/O型初乳，比较初乳的外观性状及离心稳定性，结果见表，表明最佳乳化温度为60℃。

最终其具体制备工艺流程如下所示：

其具体制备工艺流程如下：

(1)制备内水相，取PBS溶液适量，加入亲油性表面活性剂，于冰浴下保温搅拌至均匀；

(2)1000rpm下于(1)中缓慢滴加与PBS溶液等量的油相，冰浴下持续搅拌乳化8min，然后升温至60℃，于60℃持续搅拌乳化5min，然后加入剩余的油相，继续搅拌至形成均匀的初乳；

(3)将粗乳进行高速分散(8000rpm，3min)，得到W/O型初乳。

(4)将以上得到的W/O型初乳与亲水型表面活性剂SAⅡ按处方量配制，在磁力搅拌下混合均匀，得到自微乳化制剂。

含药W/O/W微乳的制备即将空白微乳中内水相改为DEPC-水配制的siRNA水溶液。

2.W/O/W纳米乳的处方组成

(1)助乳化剂种类的影响：

配制Span80与TW80从10:1～10:8比例的系列混合表面活性剂，分别以甘油、丙二醇、卵磷脂为助表面活性剂与MCT如下处方制备W/O型初乳，以能形成透明、半透明或带兰乳光的乳状液且对5000rpm 5分钟离心稳定为指标，筛选助乳化剂，结果表明三种助表面活性剂中，只有卵磷脂才能辅助形成W/O型纳米初乳，其它两者只能形成O/W型纳米乳力，故后续研究应用中选择的助乳化剂为卵磷脂。

(2)表面活性剂种类的影响：

以MCT为油相、卵磷脂为助乳化剂，配制Span80与TW80、E30、RH40以及Span85与TW80、E30、RH40从10:1～10:8比例的系列混合表面活性剂为乳化剂，按如下处方制备W/O型初乳，结果表明上述复配表面活性剂中形成W/O型纳米初乳能力为span80与RH40或EL30，其中span85复配的混合表面活性剂乳化效果均比较弱；为了说明不是由于油相与表面活性剂配合不当的原因，我们继续选择大豆油、角鲨烯、油酸相应的配合使用，结果仍不理想，故后续研究应用中选择的乳化剂span80与RH40组合。

(3)油相种类的影响：

配制Span80与TW80从10:1～10:8比例的系列混合表面活性剂，分别与MCT、大豆油、角鲨烯、油酸按如下处方制备W/O型初乳，结果表明四种油中形成W/O型纳米初乳能力强弱顺序为MCT﹥大豆油﹥角鲨烯﹥油酸，故后续研究应用中选择的油相为MCT。

3.W/O/W自纳米复乳的处方研究

Tab.3 W/O/W自纳米复乳处方安排和结果表

由于该正交表较简单，采用直接观察比较的方法分析：对于因素B助乳化剂，若不加助乳化剂，除乳化剂RH40外，其它乳化剂组合自乳化的能力均有所下降；此外助乳化剂还影响复乳的产率；对于所考察的三种助乳化剂，甘油的自乳化能力最强，天然卵磷脂次之；但对复乳产率来说，天然卵磷脂最高；对于离心稳定性，甘油与天然卵磷脂相当；而丙二醇相对来说各方面的效果都较弱；综合考虑，助乳化剂选择天然卵磷脂。对于因素A乳化剂，RH40的自乳化能力、复乳产率及离心稳定性等都强于其它几种组合，其次为RH40与sp80的组合。综上分析，最佳的乳化剂为RH40或RH40与sp80的组合，最佳助乳化剂为天然卵磷脂。

本项目中W/O/W型纳米复乳的最佳处方与制备方法为：

1)按(span80:RH40＝10:8):卵磷脂＝8:2比例配制混合表面活性剂SAⅠ；

2)将占处方总量12～15％的SAⅠ和75％的油相MCT混合，升温至60℃保持，同时磁力搅拌使卵磷脂溶解完全，于60℃下加入水相，磁力搅拌下冷却至室温即得W/O型纳米初乳；

3)配制RH40与卵磷脂比例为8:2的混合乳化剂SAⅡ，为了使卵磷脂与RH40互相溶散，先将卵磷脂溶于少量无水乙醇中再与RH40混匀，之后将此混合物置50℃挥干乙醇；

4)取步骤2)中的W/O型纳米初乳，与步骤3)中的SAⅡ按8:2的比例混合，即得自纳米复乳处方。该处方在水中可自乳化成W/O/W型纳米复乳。

4.W/O/W微乳的质量评价

4.1自纳米复乳自乳化行为评价

参见图1、图2和图3所示，取7.3项下制得的自纳米复乳1g，加入乳化介质，轻微搅拌下形成W/O/W纳米复乳，考察W/O/W自纳米复乳化在不同介质中的自乳化行为及其形成的W/O/W复乳的粒径与zeta电位。结果如Table.4所示，本文所制的自纳米复乳在去离子水、PBS及培养基液中均能较好的形成纳米复乳，但在PBS及培养基液中形成的微乳粒径较在去离子水中形成的有所增大。

Table4 纳米复乳自乳化行为考察

4.2W/O/W型纳米复乳稳定性研究

W/O型纳米初乳、W/O/W型纳米复乳及配制W/O/W型纳米复乳处方室温下稳定性考察，分别于0天、10天、20天、1个月直接观察W/O型纳米初乳和W/O/W型纳米复乳及取W/O/W型纳米复乳处方进行自乳化情况考察，表明W/O型纳米初乳、W/O/W型纳米复乳及配制W/O/W型纳米复乳处方室温下1个月保持稳定。

4.3W/O/W纳米复乳对细胞增殖的影响

采用WST-8法检测空白W/O/W纳米复乳体外对Hela细胞增殖的影响，评价W/O/W纳米复乳的毒性，结果如图4所示，该空白载药系统在处方量时24、48、72小时内对细胞无毒，但随着其用量增高，其毒性与时间呈依赖关系。

4.4W/O/W型纳米复乳入胞效率研究

用W/O/W型纳米复乳包载FAM荧光标记的小RNA，考察W/O/W型纳米复乳转染小RNA入胞的效率，结果见图5，表明W/O/W型纳米复乳可将小RNA转入细胞。

5.温敏凝胶

5.1温敏凝胶制备方法

温敏凝胶通过以下步骤制得：

步骤S1.按重量份称取泊洛沙姆10～20份、卡波姆或羟丙基甲基纤维素4～8份，然后加入70～80份温度为4℃的蒸馏水，搅拌均匀后置于4℃条件下，直至其充分溶胀、分散均匀、溶解，得到凝胶溶液，放置待用；

步骤S2.按重量份称取附加剂0～2份、防腐剂0～0.1份，加入到步骤S1制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀；在搅拌状态下，加蒸馏水或注射用水定容至100mL，然后用氢氧化钠调节pH值至6.80,即得到胶凝点为29～35℃的温敏凝胶。具体的，附加剂为1，2-丙二醇或丙三醇；所述防腐剂为苯甲酸或山梨酸。

5.2温敏凝胶处方

温敏凝胶处方考察结果见Tab.5，表明：胶凝温度随F127浓度增大而下降，F68浓度增大而上升。F127浓度小于10％时，胶凝温度远远高于人体温度，加入F68可提高胶凝温度，但当单独使用F68时，在60℃温度范围内难以形成凝胶。其它几种基质的加入对凝胶胶凝温度和时间均些影响。F68使胶凝时间和温度均增加；卡波姆使胶凝时间缩短、黏附性增强。

Tab.5 以泊洛沙姆为主要材料温敏凝胶处方研究结果

选择其中胶凝温度约为33℃的温敏凝胶，用于后续的体内外实验中。

5.3温敏凝胶对转染试剂lipo2000及W/O/W纳米乳转染效率的影响

分别用转染试剂或凝胶制剂将FAM荧光标记的siRNA导入hela细胞，比较凝胶制剂与转染试剂的转染效果。结果如图5所示，表明：加了凝胶转染的细胞比不加凝胶的细胞荧光强度要高很多,小核酸温敏凝胶制剂的转染效率大于90％，而不加温敏凝胶的只加转染试剂转染效率为50～60％。结果表明小核酸温敏凝胶制剂增强了两种转染试剂及W/O/W型纳米复乳的转染效率。

6.体外细胞实验考察小RNA制剂对靶基因表达的影响

以W/O/W型纳米复乳为载体包装siRNA，以靶基因的表达量为指标，考察W/O/W型纳米复乳是否能有效将siRNA转染进细胞(EXPERIMENT GROUP)，同时做NC及lipo2000为转染试剂的阳性对照(PC)。结果见图6，结果表明W/O/W型纳米复乳可以将siRNA导入细胞并起到抑制靶基因的效果。

7.小RNA制剂经阴道给药后对靶基因表达的影响及靶组织中siRNA的含量研究

以靶组织中靶基因表达量及药物siRNA的含量为指标，考察siRNA制剂经阴道给药的药效，结果如图7，表明siRNA可在转染试剂(PEI)或W/O/W纳米复乳(ME)的介导下进入组织细胞并对其靶基因产生沉默效应。

8.小RNA制剂经皮给药后对靶基因表达的影响及靶组织中siRNA的含量研究

以给药部位皮肤中靶基因表达量及药物siRNA的含量为指标，考察siRNA制剂经皮给药后药效，结果如图8，表明siRNA可在转染试剂(PEI)或W/O/W纳米复乳(ME)的介导下进入组织细胞并对组织中的靶基因产生沉默效应。

本专利的创新之处在于首次将自微乳化给药系统应用于小RNA的递送中，可以根据小RNA的性质调节微乳类型，以达到提高小RNA的载药量及入胞效率；同时将之与生物黏附型温敏凝胶相结合，应用于阴道粘膜给药。一方面可以充分利用自乳化给药系统的优点，保护药物体外贮藏稳定性、体内免受酶的攻击；一方面利用生物黏附剂的特点，延长与粘膜组织的接触时间，达到缓控释药物的目的，提高生物利用度；同时，该温敏凝胶室温下为液态，可均匀填充于不规则腔道，给药后在体温下几分钟内即可凝固，形成带有黏附性的凝胶不会流出体外，给药方便，顺应性好。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (6)

1.一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，用于递送siRNA，其特征在于，包括以下步骤：

制备混合表面活性剂：取司盘80和聚氧乙烯氢化蓖麻油按照质量比10:8进行混合，然后取混合物和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合表面活性剂；

制备W/O型纳米初乳：按混合表面活性剂和油相的质量比取12～15：75进行混合，升温至60℃保持，同时磁力搅拌使混合表面活性剂中的助乳化剂溶解完全，于60℃下加入水相，磁力搅拌下冷却至室温即得W/O型纳米初乳；

制备混合乳化剂：取聚氧乙烯氢化蓖麻油和助乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到混合乳化剂；

制备自微乳化制剂：取W/O型纳米初乳和混合乳化剂按照质量比8:2进行混合，得到自乳化纳米复乳。

2.如权利要求1所述的一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，其特征在于：制备混合乳化剂时，先将助乳化剂溶于无水乙醇中再与聚氧乙烯氢化蓖麻油混匀，之后将此混合物置50℃挥干无水乙醇即可。

3.如权利要求1所述的一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，其特征在于：所述助乳化剂为卵磷脂、丙二醇或者丙三醇。

4.如权利要求1所述的一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，其特征在于：所述油相为大豆油、花生油、芝麻油、角鲨烯或者中链脂肪酸甘油酯中的一种或联合应用。

5.如权利要求1所述的一种用于自乳化纳米复乳的制备方法，其特征在于：所述水相为去离子水、注射用水、PBS溶液、溶解有药物的水性溶液或者溶解有药物的PBS溶液中的一种。

6.一种自乳化纳米复乳，其特征在于：该纳米复乳采用权利要求1-5中任一权利要求所述的制备方法制得。

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