CN109125306B - 靶向肝癌的自噬siRNA-Fingolimod共递送脂质纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药领域,尤其是靶向递送药物制剂领域,具体涉及靶向肝癌的自噬siRNA‑Fingolimod共递送纳米载药系统、及其制备方法与用途。本发明公开了靶向肝癌的自噬siRNA‑Fingolimod共递送纳米载药系统。本发明公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的纳米载药系统LCP‑II‑sibeclin1‑FTY720的制备方法。药理学实验表明,本发明的纳米载药系统同时载有beclin1的siRNA和FTY720、主动靶向肝癌并递送进入肝癌细胞内、在肝癌细胞内酸性环境下释放,具有协抗肝癌的作用,具有开发抗肝癌药物的价值。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域,尤其是靶向递送药物制剂领域,具体涉及靶向肝癌的自噬siRNA-Fingolimod共递送脂质纳米颗粒、及其制备方法与用途。
背景技术
我们的研究发现Fingolimod(FTY720,芬戈利德)能够有效的诱导肝癌细胞凋亡,而且如果能够同时抑制肝癌细胞的自噬,FTY720抗肝癌的效果会更好,因此同时应用FTY720和靶向自噬的SiRNA具有协同抗肝癌的作用。但是,在应用FTY720和靶向自噬的SiRNA的过程中遇到了问题,一是如果直接给予FTY720和靶向自噬的SiRNA,在体内的靶向性差会诱导正常细胞凋亡,引起严重的不良反应;另外,由于SiRNA的负电性以及FTY720的对溶剂的依赖性,一次给药能够同时递送FTY720和靶向自噬的SiRNA也难以实现。本实验运用一个新的载药系统,能够共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720。该载药系统为脂质纳米颗粒,表面接有叶酸即FA,FA作为配体可以结合肝癌细胞表面高表达的叶酸受体起到主动靶向的作用。该载药系统的磷酸钙核即CaP core遇酸可以反应,起到在肝癌细胞内的酸性环境下释放的目的。而且该载药系统同时载有靶向自噬蛋白beclin1的siRNA和诱导肝癌细胞凋亡的FTY720,起到协同诱导肝癌细胞凋亡的目的。
发明内容
本发明公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的纳米载药系统LCP-II-sibeclin1-FTY720。该载药系统为脂质纳米颗粒,表面接有叶酸即FA,FA作为配体可以结合肝癌细胞表面高表达的叶酸受体起到主动靶向的作用。而且该载药系统的磷酸钙核即CaP core遇酸可以反应,起到在肝癌细胞内的酸性环境下释放的目的。另外,该载药系统同时载有靶向自噬蛋白beclin1的siRNA和诱导肝癌细胞凋亡的FTY720,起到协同诱导肝癌细胞凋亡的目的。
本发明公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720,该脂质纳米颗粒按照如下方法制备:
1)300μL的500mM的CaCl2和100μL的2mg/mL的自噬蛋白beclin1的siRNA分散于15ml环己烷/表面活性剂Igepal CO-520混合液中,体积比为71/29,以此制备油包水微乳液;
2)接着,300μL的25mM的pH=9.0的Na2HPO4分散于另外一个15ml环己烷/表面活性剂IgepalCO-520混合液中,体积比为71/29,并加入200μL溶于三氯甲烷的20mg/mL的DOPA,以此来制备磷酸相;
3)然后,将两者混合搅拌20分钟,将30mL无水乙醇加入到混合物中,并以12,000g离心20分钟以除去环己烷/表面活性剂;
4)用乙醇洗涤2-3次后,加入1mL氯仿,得到磷酸钙核即CaP core,然后储存在玻璃小瓶中;
5)为了制备用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720,将1ml CaP core,100μL的DOTAP/胆固醇以1:1、总浓度10mM,和100μL的3mM的DSPE-PEG-2000或DSPE-PEG-FA混合,然后通过旋转蒸发除去氯仿;
6)将残留的脂质通过薄膜水化法分散于含有1mM的FTY720的800μL生理盐水溶液中;
7)通过挤压器中200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回挤压5次,然后将得到LCP-II纳米颗粒即LCP-II NPs以10KDa的分子量截止值的HEPES缓冲盐水;HEPES缓冲盐水组成为145mMNaCl和20mM HEPES,pH7.4;透析以除去未包封的FTY720,即得到一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720。
本发明公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720,该脂质纳米颗粒可以向肝癌细胞内递送并释放siRNA和FTY720,可以用于制备向肝癌细胞内递送并释放siRNA和FTY720药物或者试剂。进一步的,本发明公开的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720表面具有叶酸即FA,叶酸可以与肝癌细胞表面高表达的叶酸受体特异性结合,起到主动靶向肝癌细胞的目的,可以用于制备向肝癌细胞主动靶向递送siRNA和FTY720药物或者试剂。
本发明公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720,该脂质纳米颗粒能够在体外高效转染beclin1的siRNA并高效沉默beclin1基因从而达到抑制自噬目的,可以用于制备体外转染beclin1的siRNA并高效沉默beclin1基因从而达到抑制自噬目的的药物或者试剂。更进一步的,该脂质纳米颗粒能够高效阻断FTY720诱导的肝癌或者肝癌细胞的自噬,可以用于制备高效阻断FTY720诱导的肝癌或者肝癌细胞自噬的药物或者试剂。
本发明公开了一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720,该脂质纳米颗粒能够主动靶向肝癌并协同治疗肝癌,可以用于制备主动靶向肝癌并协同治疗肝癌的药物或者试剂。
本发明具有如下的有益效果:
1、本发明公开了的一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720可以实现一个载体,同时载siRNA和FTY720两种药物。
2、本发明公开了的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720通过表面接有的叶酸即FA能够达到主动靶向肝癌的目的。
3、本发明公开了的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720的磷酸钙核即CaPcore遇酸可以反应,起到在肝癌细胞内的酸性环境下释放的目的。
4、本发明公开了的脂质纳米颗粒LCP-II-sibeclin1-FTY720同时载有靶向自噬蛋白beclin1的siRNA和诱导肝癌细胞凋亡的FTY720,通过FTY720诱导凋亡,而FTY720诱导凋亡过程中、细胞会启动自噬保护自己,我们利用自噬蛋白beclin1的siRNA来抑制自噬,从而将细胞启动的保护效应消除,从而起到协同诱导肝癌细胞凋亡的目的,能够用于肝癌的高效治疗。
附图说明
图1.制备用于共载siRNA和FTY720的纳米载药系统LCP-II NPs的示意图。
图2.siRNA和FTY720共载的LCP-II NPs表征。(A)LCP-II-siRNA和LCP-II-siRNA-FTY720的代表性TEM图像(LCP-II-siRNA为单独包裹siRNA,LCP-II-siRNA-FTY720为共载siRNA和FTY720)。比例尺:100nm。(B)(C)LCP-II-siRNA和LCP-II-siRNA-FTY720的颗粒大小和表面电荷分布,(LCP-II-siRNA为单独包裹siRNA,LCP-II-siRNA-FTY720为共载siRNA和FTY720)。(D)LCP-II包裹的FTY720在体外随时间的变化的释放速率。
图3.FAM-siRNA包封于LCP-II NPs中的细胞摄取和分布(A)单独FAM标记的siRNA,LCP-II NPs不带有FA包裹的FAM标记的siRNA和LCP-II NPs带有FA包裹的FAM标记的siRNA分别加入到SMMC-7721中培养,共聚焦显微镜拍摄细胞摄取LCP-II-siRNA的情况(B)用带有FA的LCP-II-sibeclin1和PBS对照处理后,SMMC-7721细胞中beclin1的表达水平。(C)用带有FA的LCP-II-sibeclin1和PBS对照处理后,SMMC-7721细胞中beclin1的mRNA水平。(*P<0.05)
图4.用单独的FTY720和不同的纳米复合载体处理后的细胞活力。SMMC-7721细胞中加入不同浓度的FTY720,lipo3000转染sibelin1后再加入FTY720,LCP-II包裹的FTY720带有FA(LCP-II-FTY720),LCP-II共载siRNA和FTY720带有或不带有FA(LCP-II-sibeclin1-FTY720with or without FA,没有特殊说明LCP-II NPs都是带有FA配体的),24小时后,测定SMMC-7721的细胞活力。
图5.LCP-II NPs共载可以有效的抑制FTY720诱导的自噬。(A)SMMC-7721细胞用GFP-LC3转染,接着用7.5μM带有FA,LCP-II单独包裹FTY720(LCP-II-FTY720)和LCP-II共载sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720(LCP-II-sibeclin1-FTY720)处理24小时后,共聚焦显微镜拍摄GFP-LC3形成点状的代表性图像(没有特殊说明,LCP-II NPs都是带有FA的)。(B)两组处理后呈现典型GFP-LC3斑点的细胞百分比。(C)用7.5μM FTY720,LCP-II-FTY720和LCP-II-sibeclin1-FTY720处理24h后,通过Western印迹测定LC3B-II和beclin1的表达水平。(*P<0.05,**P<0.01)
图6.用7.5μM单独的FTY720,带有FA,LCP-II单独包裹FTY720(LCP-II-FTY720)和LCP-II共载sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720(LCP-II-sibeclin1-FTY720)和PBS对照处理SMMC-7721细胞24小时后,细胞凋亡率的检测(没有特殊说明,LCP-II NPs都是带有FA的)。(与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***<0.001)
图7.用7.5μM单独的FTY720,带有FA,LCP-II单独包裹FTY720(LCP-II-FTY720)和LCP-II共载sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720(LCP-II-sibeclin1-FTY720)和PBS对照处理SMMC-7721细胞24小时后,SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白的表达水平(没有特殊说明,LCP-II NPs都是带有FA的)。
图8.不同的纳米复合物体内抗肿瘤效应。(A)裸鼠皮下瘤模型建立后,分别给予PBS空白对照,LCP-II空白对照,LCP-II-sibeclin1-FTY720无FA,LCP-II-FTY720带有FA和LCP-II-sibeclin1-FTY720带有FA组(分别标记为a,b,c,d,e)治疗,治疗结束后各组的肿瘤。(B)裸鼠皮下瘤模型建立后,皮下瘤大小大约为50–100mm3时,各组皮下瘤的大小增长情况。(C)治疗结束后,各组皮下瘤的重量。(n=5,*P<0.05,**P<0.01,***<0.001)
具体实施方式
实施例1用于共载siRNA和FTY720的纳米载药系统LCP-II的制备与表征
一、制备、表征与药物释放实验
1.纳米载药系统LCP-II的制备和表征
本发明需要共载并递送的分子是SiRNA和Fingolimod(FTY720,芬戈利德),SiRNA分子的靶蛋白是beclin1,即用来敲减beclin1达到抑制自噬的目的。
首先,300μLCaCl2(500mM)和100μL siRNA(2mg/mL)分散于15ml环己烷/表面活性剂(Igepal CO-520)混合液中(71/29V/V),以此制备油包水微乳液。接着,300μL Na2HPO4(25mM pH=9.0)分散于另外一个15ml环己烷/表面活性剂(Igepal CO-520)混合液中(71/29V/V),并加入200μL溶于三氯甲烷的DOPA(20mg/mL),以此来制备磷酸相。然后,将两者混合搅拌20分钟,将30mL无水乙醇加入到混合物中,并以12,000g离心20分钟以除去环己烷/表面活性剂。用乙醇洗涤2-3次后,加入1mL氯仿,得到磷酸钙核(CaP core),然后储存在玻璃小瓶中。为了制备LCP-II-sibeclin1-FTY720,将1ml CaP core,100μL DOTAP/胆固醇(1:1,10mM)和100μLDSPE-PEG-2000或DSPE-PEG-FA(3mM)混合,然后通过旋转蒸发除去氯仿。将残留的脂质通过薄膜水化法分散于含有1mM FTY720的800μL生理盐水溶液或者空白生理盐水中。并通过挤压器中200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回挤压5次,然后将得到LCP-II纳米颗粒(LCP-II NPs)以10KDa的分子量截止值的HEPES缓冲盐水(HBS,145mM NaCl,20mM HEPESpH7.4)透析以除去未包封的FTY720。
单独包封阴性对照的siRNA标记为LCP-II,单独包封siRNA的标记为LCP-II-siRNA,单独包封FTY720的标记为LCP-II-FTY720,共载siRNA和FTY720的标记为LCP-II-siRNA-FTY720(没有特殊说明LCP-II NPs都是带有FA)。
为了测量FTY720在LCP-II NPs中的包封效率(EE),在前面的制备步骤:“将残留的脂质通过薄膜水化法分散于含有1mM FTY720的800μL生理盐水溶液中。并通过挤压器中200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回挤压5次,然后将得到LCP-II纳米颗粒(LCP-II NPs)”之后,将含有LCP-II纳米颗粒的生理盐水溶液以12000g离心20分钟,收集上清液进行吸光度检测。FTY720在盐水溶液中有最大的特征吸收波长220nm,在最大吸收波长处获得不同样品的吸光度。根据兰伯特-比尔定律,测量FTY720的浓度。
EE=(1-离心后上清FTY720浓度/总FTY720浓度)×100%
通过TEM检测方法来检测LCP-II NPs。将1μL LCP-II NPs重悬于1ml PBS中,并加到铜网格栅上(北京中兴科技有限公司)。TEM图像通过JEM-2100透射电子显微镜(Jeol,Japan)拍摄。对于颗粒大小和电荷测量,将1μLLCP-II NP重悬于1ml PBS中,并用ZetasizerNano ZS90仪器(Malvern,UK)测量。
2.LCPII-FTY720NPs的体外释放实验
为了测量药物从LCP-II释放的速率,将包封了FTY720的LCP-II加入到37℃的生理盐水中。在不同时间点(0,6,12,24,36和48小时),通过12000g离心20分钟,下层颗粒为包封了FTY720的LCP-II(未释放的FTY720还在LCP-II中),收集上清液用于吸光度检测。如上所述测量FTY720的浓度方法用分光光度计在220nm处测OD值并计算上清中FTY720的浓度和数量。用上清中FTY720的数量比上初始总的包封在LCP-II中的FTY720的量即药物释放的百分比。
二、结果与结论
我们制备了一种pH敏感的CaP core,核内包裹着siRNA,然后加入两亲性磷脂DOPA作为内层脂质体。将CaP core与DOTAP/胆固醇(1:1)和带有或不带有FA的DSPE-PEG-2000混合以合成LCP-II纳米颗粒(NPs)。然后,通过旋转蒸发除去氯仿后,将残留的脂质通过薄膜分散法分散于含有或不含有FTY720的生理盐水中,以形成共载纳米载体LCP-II-SiRNA-FTY720(图1)。最后,将其通过200和100nm聚碳酸酯膜挤出5个循环。通过透射电子显微镜(图2A)和颗粒大小、电荷分析测定LCP-II复合物的尺寸,形态和表面电荷。结果显示,在通过200和100nm聚碳酸酯膜挤出5次后,LCP-II的平均粒度为57±6.4nm(图2B),而用FTY720装载,尺寸为76±3.9nm(图2B)。LCP-II-siRNA的表面电荷约为5mV,LCP-II-siRNA-FTY720的表面电荷为12mV(图2C),表明FTY720负载对复合物的表面电荷有一定的影响。装载FTY720的LCP-II的封装效率(EE%)为43.1±3.0%。为了确定来自LCP-II包封的FTY720体外释放动力学,将该制剂加入到37℃的PBS中。12小时后从LCP-II NPs向培养基释放的FTY720小于30%,而在24小时,LCP-II中含有的FTY720仍然保持在45%以上的FTY720(图2D)。结果表明,LCP-II-FTY720是比较稳定。
实施例2共递送纳米载药系统在体外的抗肿瘤的实验
一、材料
1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP),二油酰磷脂酸(DOPA)和过1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇2000)]铵盐(DSPE-PEG)均购于美国的Avanti Polar lipids。DSPE-PEG-FA购于西安瑞禧生物科技有限公司。胆固醇购于Sigma公司。荧光标记(FAM)的beclin1的siRNA(靶序列5'-CAGTTTGGCACAATCAATA-3')和对照siRNA(靶序列5'-AAT TCT CCGAACGTGTCACGT-3')购于上海吉玛基因公司。
二、细胞与细胞培养
人源肝癌细胞系SMMC-7721购于上海中科院细胞库,细胞培养于完全培养基中,DMEM培养基加入10%胎牛血清和100u/ml盘尼西林(购于加拿大维森特公司),并于37℃和5%CO2条件下的细胞培养箱中培养
三、统计方法
所有结果都表示为平均值±标准偏差(SD)。数据用Students’t检验进行分析。当P<0.05时,数据被认为是显著差异的。
四、实验
1、细胞体外摄取LCP-II-sibeclin1-FTY720
将SMMC-7721细胞(每孔1×10 5)种植于盖玻片上,并于12孔板中培养。24小时后,细胞用包封于LCP-II NPs中的FAM标记的sibeclin1(beclin1的SiRNA)(100nM)处理,培养6小时后,用PBS洗涤两次。然后,将细胞用4%多聚甲醛在室温下固定20分钟,再次用PBS洗涤两次,最后用DAPI染核后,通过共焦显微镜获得图像。
2、细胞毒性分析
为了在体外检测细胞活力,将SMMC-7721细胞以1×104个细胞/孔的浓度种植于96孔板上培养,并用PBS,FTY720,FTY720和lipo2000-sibeclin1(lipo3000处理的beclin1的SiRNA),LCP-II-FTY720,LCP-II-sibeclin1-FTY720不带有FA和LCP-II-sibeclin1-FTY720带有FA的复合物分别处理24小时。向96孔板中加入MTT溶液(5mg/ml,20μL/孔)。孵育4小时后,加入150μL DMSO溶解不溶性晶体。通过分光光度计在490nm处测量吸光度值。所有实验都进行了3次重复。
3、流式细胞术分析
将SMMC-7721细胞(1×106)接种于6孔板中培养24小时,用PBS,FTY720,LCPII-FTY720,LCPII-sibeclin1-FTY720带有FA的载体分别处理细胞24小时。收集细胞,包括凋亡,死亡和贴壁细胞,并用PBS洗涤,然后重新悬浮。用Annexin V-FITC/PI孵育后,用流式细胞仪检测细胞凋亡。
4、蛋白质印迹分析
用FTY720,LCP-II-FTY720,LCP-II-sibeclin1-FTY720带有FA的载体处理24小时后,通过含有1%蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific,USA)的RIPA肽裂解缓冲液(碧云天)将SMMC-7721细胞裂解。通过10-12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离相同量的蛋白质。使用从Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA)购买的抗体(beclin1,LC3B,parp,cleved parp,caspase 3,caspase 9,cleved caspase 3,caspase9)特异性标记目标蛋白。然后用荧光二抗孵育,使用化学发光液(Millipore,USA)检测蛋白质条带。
五、结果与结论
1、体外细胞摄取LCP-II和其在体外转染siRNA的基因沉默效率
叶酸受体(FR)在包括HCC在内的各种癌症中高表达,并且在正常组织中是低水平表达。叶酸(FA)是人类细胞必需的维生素,与叶酸受体特异性结合。此外,FA与其他分子结合形成复合物后,仍然可以保持与FR的亲和力,并可以通过胞吞作用方式被细胞吸收。为了实现通过配体与受体介导的靶向肿瘤细胞siRNA和药物的递送,将叶酸(FA)偶联到DSPE-PEG的末端使得其可以与FR靶向特异性结合。细胞与带有或不带有FA的LCP-NPs共培养后,使用共聚焦荧光显微镜检测SMMC-7721细胞对LCP-II NPs摄取。FAM标记的Si-beclin1被包封在LCP-II中,然后加入到SMMC-7721细胞中。4小时后,收集SMMC-7721细胞的图像。结果表明,SMMC-7721细胞与包封有FAM-Sibeclin1的LCP-II NPs一起孵育后,细胞质中显示绿色荧光,这表明FAM标记的Sibeclin1(beclin1的SiRNA)均匀分布在SMMC-7721细胞的整个细胞质中。然而,当使用不带有FA的LCP-II NPs和单独FAM-sibeclin1而不是具有FA的LCP-II-siRNA时,其不容易内化到细胞中(图3A)。另外,用蛋白印迹法测定蛋白表达水平,加入带有FA的LCP-II-sibeclin1后,beclin1的表达显着抑制(图3B)。并且,beclin1的mRNA水平也受到抑制(图3C),以上证实LCP-II可以被细胞吸收,并抑制beclin1的表达。
2、LCP-II NPs共载体系的体外细胞毒性实验
用含有不同浓度FTY720的LCP-II NPs处理细胞,于24小时后,通过MTT测定法测定细胞生长抑制率。结果表明,当使用单独的FTY720和其他各种复合物纳米载体处理SMMC-7721细胞时,共载siRNA和药物靶向给药的NPs显示出最低的细胞活力。7.5μM单独的FTY720细胞生长抑制率大约为33%。当阻断细胞自噬介导的beclin1的表达时,FTY720诱导的自噬作用被显著抑制,进而促进细胞毒性,导致细胞凋亡。利用lipo3000转染siRNA减少保护性自噬后细胞生长抑制增加至约57%。同时,在不带有sibeclin1(beclin1的SiRNA),但是FTY720包封于带有FA的LCP-II NPs组中,细胞生长抑制率约为50%。更重要的是当用带有FA的LCP-II-Sibeclin1-FTY720共载载体处理时,细胞抑制率为65%,结果显示LCP-II NPs有效地将siRNA和药物共递送给靶细胞。然而,没有FA配体,共载载体的细胞毒性将显著的降低。总的来说,结果表明,FTY720和sibeclin1(beclin1的SiRNA)通过LCP-II NPs的共载体具有最大的抑制作用和最高的细胞毒性水平(图4)。
3、LCP-II NPs共载体系处理GFP-LC3转染的SMMC-7721细胞
为了进一步研究LCP-II NPs共载靶向递送体系能否有效阻断FTY720诱导的细胞自噬,将GFP-LC3转染入SMMC-7721细胞,这是细胞自噬的一个众所周知的指标。如果存在自噬,则分布于细胞质中的LC3将改变为点状结构。结果表明,用LCP-II-FTY720处理后,可诱导SMMC-7721细胞出现明亮的绿色荧光点,证明FTY720可诱导细胞自噬(图5A)。用LCPII-FTY720处理24h后,形成点状LC3的SMMC-7721细胞比例为65%。与LCP-II-FTY720相比,用可以阻断FTY720诱导的自噬LCP-II-sibeclin1-FTY720共载体处理显著地降低了SMMC-7721细胞中内源性LC3的绿色荧光聚集。此外,具有典型点状LC3的SMMC-7721细胞的比例降低至32%(图5B)。此外,当有自噬时,LC3-I将转化为LC3-II,这是自噬的指标。它可以通过蛋白质印迹确定。结果表明,用FTY720和LCP-II FTY720处理后,大量的LC3-I转化为LC3-II。当用LCP-II-sibeclin1-FTY720处理时,LC3-II和beclin1的水平将明显降低(图5C)。总之,通过LCP-II NPs将sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720共同传递可以有效地阻断FTY720诱导的细胞自噬。
4、细胞凋亡测定
为了检测LCPII NPs共载体系对SMMC-7721细胞凋亡的协同作用,我们用不同形式的LCP-II NPs处理后,检测SMMC-7721细胞的凋亡比例。使用Annexin V-FITC/PI凋亡染色,流式细胞仪分析凋亡细胞百分比。用单独FTY720处理后SMMC-7721细胞的凋亡率为20%。用FTY720包封于LCP-II NPs处理的细胞凋亡细胞比例增加到32%。通过sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720共递送的载体处理的SMMC-7721细胞中beclin1蛋白被显著抑制,从而抑制FTY720诱导的自噬,结果显示细胞凋亡率明显高于游离FTY720和LCP-II-FTY720(图6)。结果表明,通过LCP-II共递送sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720可以抑制与细胞凋亡相关的自噬,并且细胞死亡率显著增加。
此外,为了进一步检测不同处理后SMMC-7721细胞中caspase-3,caspase-9和PARP等凋亡蛋白的水平,我们提取不同处理组SMMC-7721细胞蛋白进行蛋白免疫印迹分析。与流式细胞术分析结果一致,用FTY720和LCPII-FTY720治疗可诱导细胞凋亡。另外,与LCPII-FTY720或单独的FTY720相比,向SMMC-7721细胞中加入LCPII-siBeclin1-FTY720共载体显著的增加cleved caspase-3,caspase-9和PARP的表达水平,表明共载体系可以有效的促进细胞凋亡(图7)。总之,这些结果表明,通过LCP-II NPs共同靶向递送sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720具有更大的HCC治疗潜力。
实施例3共递送纳米载药系统体内抗肿瘤的实验
一、实验Mice and in vivo tumor studies
1、裸鼠体内肿瘤研究
所有动物研究均按照南京鼓楼医院动物伦理委员会的指导和规定,获得批准。4-6周龄的雄性裸鼠(BALB/c裸鼠)购自于上海科学院实验动物中心。将SMMC-7721细胞重新悬浮于PBS中,异氟烷浸润麻醉裸鼠后,将细胞注入小鼠右侧腋窝(25只小鼠,每组5只)(每只小鼠200μL PBS中含有1×107个细胞)。两周后肿瘤体积约为100mm3,小鼠随机分为5组(PBS对照组,LCP-II阴性对照组,LCP-II-FTY720组,LCP-II-FTY720-sibeclin1不带有FA组,LCPII-FTY720-sibeclin1带有FA组)并且每天注射不同的复合物(总FTY720,5mg/kg),处理3周。每4天检查肿瘤直径,并在皮下种植SMMC-7721细胞后的第35天处死所有小鼠。
二、结果与结论
1、通过LCP-II-sibeclin1-FTY720共同递送的体内抗肿瘤效率
为了确定通过LCP-II共同靶向递送sibeclin1(beclin1的SiRNA)和FTY720是否可以在体内显著增强SMMC-7721细胞对FTY720的敏感性,我们在裸鼠中建立了皮下异种移植模型,尾静脉注射不同的纳米载体复合物,以评估抗肿瘤效果。结果表明,与PBS治疗相比,使用带有FA的LCP-II-FTY720治疗组导致肿瘤体积和肿瘤体重明显降低。另外,用带有FA的LCPII-sibeclin1-FTY720共同递送处理后,抗肿瘤效果最好,并且小鼠的肿瘤明显小于单独LCP-II-FTY720治疗组,以上结果表明FTY720诱导的自噬可以保护细胞凋亡,抑制自噬可以促进FTY720的抗肿瘤效应。用带有FA的LCP-II-sibeclin1-FTY720共同递送药物和siRNA处理的裸鼠的肿瘤体积和重量比用单独LCP-II-FTY720处理的裸鼠的肿瘤体积和重量小很多。然而,当我们在小鼠中使用不含FA的LCPII-sibeclin1-FTY720时,其抗肿瘤效应将显著降低,甚至低于带有FA的LCP-II-FTY720,这表明配体介导的靶向递送载体在共同递送体系中具有重要的作用,配体介导的递送在体内可以有效的靶向SMMC-7721细胞异种移植的肿瘤(图8A)。肿瘤重量和体积的变化如图8所示。图8B,C证实,通过LCP-II共同递送siRNA和药物比单独的载有FTY720的LCPII在抑制实体瘤生长中具有更大的作用,并且配体介导的靶向递送具有重要的作用。总而言之,这些结果表明通过纳米载体进行靶向特异性性共同递送是治疗肿瘤生长有效的新策略。
Claims (8)
1.一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒,其特征在于:脂质纳米颗粒表面接有叶酸即FA,FA作为配体结合肝癌细胞表面高表达的叶酸受体起到主动靶向的作用;该脂质纳米颗粒的磷酸钙核即CaP core遇酸反应,起到在肝癌细胞内的酸性环境下释放的目的;而且该脂质纳米颗粒同时载有靶向自噬蛋白beclin1的siRNA和诱导肝癌细胞凋亡的FTY720,起到协同诱导肝癌细胞凋亡的目的;
所述的脂质纳米颗粒按照如下方法制备:
1)300μL的500mM的CaCl2和100μL的2mg/mL的自噬蛋白beclin1的siRNA分散于15ml环己烷/表面活性剂Igepal CO-520混合液中,体积比为71/29,以此制备油包水微乳液;
2)接着,300μL的25mM的pH=9.0的Na2HPO4分散于另外一个15ml环己烷/表面活性剂Igepal CO-520混合液中,体积比为71/29,并加入200μL溶于三氯甲烷的20mg/mL的DOPA,以此来制备磷酸相;
3)然后,将两者混合搅拌20分钟,将30mL无水乙醇加入到混合物中,并以12,000g离心20分钟以除去环己烷/表面活性剂;
4)用乙醇洗涤2-3次后,加入1mL氯仿,得到磷酸钙核即CaP core,然后储存在玻璃小瓶中;
5)为了制备用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒,将1ml CaP core,100μL的DOTAP/胆固醇以1:1、总浓度10mM和100μL的3mM的DSPE-PEG-FA混合,然后通过旋转蒸发除去氯仿;
6)将残留的脂质通过薄膜水化法分散于含有1mM的FTY720的800μL生理盐水溶液中;
7)通过挤压器中200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回挤压5次,然后将得到LCP-II纳米颗粒即LCP-II NPs以10KDa的分子量截止值的HEPES缓冲盐水透析以除去未包封的FTY720,即得到一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒;HEPES缓冲盐水组成为145mM NaCl和20mM HEPES,pH7.4。
2.一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒的制备方法,其特征为步骤如下:
1)300μL的500mM的CaCl2和100μL的2mg/mL的自噬蛋白beclin1的siRNA分散于15ml环己烷/表面活性剂Igepal CO-520混合液中,体积比为71/29,以此制备油包水微乳液;
2)接着,300μL的25mM的pH=9.0的Na2HPO4分散于另外一个15ml环己烷/表面活性剂Igepal CO-520混合液中,体积比为71/29,并加入200μL溶于三氯甲烷的20mg/mL的DOPA,以此来制备磷酸相;
3)然后,将两者混合搅拌20分钟,将30mL无水乙醇加入到混合物中,并以12,000g离心20分钟以除去环己烷/表面活性剂;
4)用乙醇洗涤2-3次后,加入1mL氯仿,得到磷酸钙核即CaP core,然后储存在玻璃小瓶中;
5)为了制备用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒,将1ml CaP core,100μL的DOTAP/胆固醇以1:1、总浓度10mM和100μL的3mM的DSPE-PEG-FA混合,然后通过旋转蒸发除去氯仿;
6)将残留的脂质通过薄膜水化法分散于含有1mM的FTY720的800μL生理盐水溶液中;
7)通过挤压器中200nm、100nm的聚碳酸酯膜来回挤压5次,然后将得到LCP-II纳米颗粒即LCP-II NPs以10KDa的分子量截止值的HEPES缓冲盐水透析以除去未包封的FTY720,即得到一种用于主动靶向肝癌的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒;HEPES缓冲盐水组成为145mM NaCl和20mM HEPES,pH7.4。
3.权利要求1所述的一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒在制备向肝癌细胞内递送并释放siRNA和FTY720药物或者试剂中的应用。
4.权利要求1所述的一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒在制备利用叶酸即FA向肝癌细胞主动靶向递送siRNA和FTY720药物或者试剂中的应用。
5.权利要求1所述的一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒在制备体外转染beclin1的siRNA并高效沉默beclin1基因从而达到抑制自噬目的的药物或者试剂中的应用。
6.权利要求1所述的一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒在制备高效阻断FTY720诱导的肝癌或者肝癌细胞自噬的药物或者试剂中的应用。
7.权利要求1所述的一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒在制备主动靶向肝癌并协同治疗肝癌的药物或者试剂中的应用。
8.权利要求1所述的一种用于主动靶向肝癌细胞的共载自噬蛋白beclin1的siRNA和FTY720的脂质纳米颗粒在制备治疗肝癌的药物或者试剂中的应用。
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FTY720 induces necrotic cell death and autophagy in ovarian cancer cells: A protective role of autophagy;Ning Zhang et al;《Autophagy》;20101116;1157-1167 |
叶酸修饰多西紫杉醇纳米脂质体对肝癌Bel-7402细胞的体内外靶向性研究;计竹娃等;《中国药房》;20160410;1325-1328 |
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