CN110548007B - 阳离子脂质体、基于其的核酸类药物递送系统及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE‑PEG2000的阳离子脂质体，基于其的核酸类药物递送系统，所述阳离子脂质体和核酸类药物递送系统的制备方法及其用于治疗由基因异常表达引起的疾病的用途。

Description

阳离子脂质体、基于其的核酸类药物递送系统及其制备方法 与用途
技术领域
本发明涉及包含N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵盐(DOTAP)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇和1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)的阳离子脂质体，基于其的核酸类药物递送系统，所述阳离子脂质体和核酸类药物递送系统的制备方法及其用于治疗由基因异常表达引起的疾病的用途。
背景技术
基因转染是将具有生物功能的核酸(包括RNA、DNA、反义核酸等)转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。单独的核酸分子在组织或细胞中易被核酶降解，且核酸分子自身带有负电荷，不利于渗透进入带负电荷的细胞膜。
早期的转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。因此，研究人员积极开发了多种基因载体，并且在其选择性、安全性和高效性上不断进行研究和改进。目前，研究和临床应用中常用的载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体是一种常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞进行感染的分子机制，可发生于完整活体或者细胞培养中。病毒载体因其高效性而倍受关注，但其负载量低、特异性不强、安全性差等缺点给临床应用带来很大障碍。非病毒载体主要包括阳离子聚合物和阳离子脂质体，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相像的特征，容易透过细胞膜。阳离子聚合物基因载体相对于病毒载体具有一定优势，然而其基因转染效率低，所用聚合物材料多为非生物可降解材料，尤其是反复给药后这些材料容易积聚于体内，可能会引发毒性反应。
脂质体指含有至少一个环绕内部核心的脂双层的人工制备的囊泡。阳离子脂质体通常由阳离子脂质和辅助脂质在适当的条件下复合而成，其中阳离子脂质通过静电作用与基因复合，而辅助脂质则起到防止脂质氧化或将配体连接至脂质体的表面的作用或者可以减少脂质颗粒的聚集。
与阳离子聚合物相比，阳离子脂质体具有低毒、生物相容性好及转染效率高等优点，是一种应用较为广泛的非病毒基因载体。但是阳离子脂质体在临床应用中仍然存在困难。
首先，具有高表面电荷的阳离子脂质体通常会有一定的细胞毒性，因此需要控制阳离子脂质材料在脂质体中的用量。此外，阳离子脂质体进行基因转染的前提是与待转染的核酸形成阳离子脂质体/核酸复合物，常规的阳离子脂质体与核酸进行复合时，阳离子脂质体需要过量才能实现完全包裹，因此需要消耗大量的阳离子脂质体，导致细胞毒性较大。
其次，阳离子脂质体基因复合物由于表面带有正电荷，易于与血浆中的血清蛋白产生非特异性吸附，形成大尺寸的聚集体，该聚集体易被网状内皮系统(RES)清除，导致其血液循环时间短，稳定性差，运转效率低。为此，需要对阳离子脂质体进行表面修饰，制备长循环阳离子脂质体。目前常用的长循环阳离子脂质体修饰试剂为基于聚乙二醇(PEG)的脂质分子，如DSPE-PEG分子。PEG通过氢键和溶剂中的水分子作用，在被修饰的阳离子脂质体表面形成一层水合层，掩盖阳离子脂质体表面正电荷，从而达到抑制蛋白质吸附并减少吞噬系统识别的作用。但是，PEG增加了脂质体表面的亲水性，从而降低了脂质体的转运和细胞摄取量。目前，摩尔含量为5％的PEG被广泛使用在各种脂质体制剂中，然而我们并不知道其是否能成功从内涵体逃逸，将siRNA转运至细胞质。
发明内容
本发明提供阳离子脂质体，其粒度分布均匀，体系重现性好，具有较强运载药物(优选核酸类药物)的作用(较高的核酸载量)和较高的转染效率，同时具有在体内长循环的能力，而且其细胞毒性低(具有较低的阳离子脂质(即DOTAP)含量)、在血浆中的稳定性好且易于制备。
本发明的一些方面提供阳离子脂质体，其包含以下组分：
≥20摩尔％且≤40摩尔％的DOTAP；
≥20摩尔％且≤40摩尔％的DOPE；
≥20摩尔％且≤50摩尔％的胆固醇；以及
≥1摩尔％且＜5摩尔％的DSPE-PEG2000。
本发明的另一些方面提供制备本发明的阳离子脂质体的方法。
本发明的另一些方面提供载药阳离子脂质体制剂，其包含本发明的阳离子脂质体以及药物。
本发明的另一些方面提供制备本发明的载药阳离子脂质体制剂的方法。
本发明的另一些方面提供药物组合物，其包含本发明的阳离子脂质体或本发明的载药阳离子脂质体制剂，以及药学上可接受的载体。
本发明的另一些方面提供本发明的阳离子脂质体用于制备载药阳离子脂质体制剂(优选载核酸阳离子脂质体制剂)的用途。
本发明的另一些方面提供本发明的阳离子脂质体或本发明的载药阳离子脂质体制剂在制备用于治疗由基因异常表达引起的疾病的药物中的用途。
本发明的另一些方面提供载药阳离子脂质体制剂(优选载核酸阳离子脂质体制剂)，其用于治疗由基因异常表达引起的疾病。
本发明的另一些方面提供治疗由基因异常表达引起的疾病的方法，其包括向需要其的个体给药有效量的本发明的载药阳离子脂质体制剂(优选载核酸阳离子脂质体制剂)。
附图说明
图1显示本发明的阳离子脂质体的核酸复合能力测试结果。
图2显示本发明的阳离子脂质体的细胞毒性测试结果。
图3显示本发明的载核酸阳离子脂质体制剂的放置稳定性测试结果。
图4显示本发明的载核酸阳离子脂质体制剂的血浆稳定性测试结果。
图5显示本发明的载核酸阳离子脂质体制剂的转染效率测试结果。
图6显示本发明的载核酸阳离子脂质体制剂体外药效学研究的测试结果。
图7显示用对比例1的阳离子脂质体制备的载核酸制剂的转染效率测试结果。
图8显示用对比例2的阳离子脂质体制备的载核酸制剂的转染效率测试结果。
图9显示用对比例3的阳离子脂质体制备的载核酸制剂体外药效学研究测试结果。
具体实施方式
定义
除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本文中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
如本文中所使用，术语“多分散系数”或者“PDI”是与溶液中颗粒的粒径分布相关的无量纲(dimensionless)数。PDI可通过对用称作动态光散射的技术测量的对比数据进行分析得到。该指数为由对比数据的简单双参数拟合(累积量分析，cumulants analysis)计算的数。
如本文中所使用，术语“ζ电位”是与液体中颗粒的表面电荷相关的量，其指示分散于液体中的固体或者分散于液体中的液体的势稳定性。如果悬浮液中所有的颗粒具有大的负或者正ζ电位，则它们会倾向于彼此排斥，并且没有絮凝的趋势。但是，如果颗粒具有低ζ电位值，则会存在较小的阻止颗粒聚集的力，并且颗粒可能具有更大的絮凝趋势。关于ζ电位的更多信息可参照Hunter，R.J.(1988)Zeta Potential in Colloid Science：Principles And Applications，Academic Press，UK。
如本文中所使用，术语“N/P比”是指阳离子脂质中的氮原子与核酸中磷酸的摩尔比。
术语“薄膜分散法”是指将磷脂等膜材溶于适量的有机溶剂(例如氯仿、甲醇或者氯仿与甲醇的混合物)中，然后通过减压旋转蒸发除去溶剂，使脂质在器壁形成薄膜后，加入缓冲溶液进行振摇，脂质薄膜脱落后自动组装，任选地通过挤出后形成脂质体的方法。
术语“超声分散法”是指将磷脂等膜材溶于适量的氯仿或其它有机溶剂中(任选地将脂溶性药物在有机溶剂中溶解)，然后通过减压旋转蒸发除去溶剂，使脂质在器壁形成薄膜后，加入缓冲溶液，通过超声波处理使脂质薄膜脱落并形成脂质体的方法。
术语“反相蒸发法”又称逆相蒸发法，是指将磷脂等膜材溶于适量的氯仿或其它有机溶剂中，任选地加入待包封药物的水溶液，进行短时超声使之形成稳定的油包水(W/O)型乳剂，然后减压蒸发除去有机溶剂，达到胶态后，滴加缓冲液，旋转使器壁上的凝胶脱落，得水性混悬液，然后任选地通过凝胶色谱法或超速离心法除去未包封的药物，得到脂质体(优选为大单室脂质体)。
术语“冷冻干燥法”是指将磷脂等膜材高度分散在水溶液中，冷冻干燥，然后再分散到水性介质(任选地含有药物)中，形成脂质体。
术语“冻融法”是指将磷脂等脂材用少量的水溶解，将胆固醇熔融后与之混合，然后滴入约65℃的水相溶液中保温制得脂质体。
术语“复乳法”是指将少量水相与较多量的磷脂油相进行乳化，形成W/O型的反相胶团，减压蒸发除去部分溶剂后加入较大量的水相进行第二次乳化，形成水包油包水(W/O/W)型复乳，减压蒸发除去有机溶剂，即得脂质体。
术语“注入法”是指将磷脂等脂材溶于适量有机溶剂中形成油相，然后把油相匀速注射到所述有机溶剂沸点以上的恒温水相中，搅拌使有机溶剂完全挥发，再匀化或超声处理得到脂质体。
除非另外指明，本文中所引用的核酸序列以5’至3’方向书写。术语“核酸”是指DNA或RNA或其修饰的形式，其包含在DNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”)或在RNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，尿嘧啶“U”)。双链RNA核酸分子还可以在3’端包含“T”碱基，即使“T”碱基在RNA中不是天然存在的。在一些情形中，这些碱基可以表示为“dT”，以区分在核糖核苷酸链中存在的脱氧核糖核苷酸。
当核酸分子选择性减少或抑制基因的表达时，该基因被所述核酸分子“靶向”。或者，核酸分子在严格条件下与基因转录物(即，其mRNA)杂交时，所述核酸分子靶向该基因。能够“在严格条件下”杂交意指在趋向于不利于杂交的标准条件下，例如，高温和/或低盐含量，与靶mRNA区域退火。适当的流程(包括0.1×SSC，68℃，2小时)记述在Maniatis，T.等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory，1982，第387-389页中。
如本文中所使用，术语“CKIP-1”是指CKIP-1基因或蛋白质(也被称为PLEKH01)。CKIP-1的序列的例子包括但不限于：人类：(Genbank号NM_016274.4)；小鼠：(Genbank号NM_023320.2)；大鼠：(Genbank号NM_001025119.1)和食蟹猴：(Genbank号XM_001098879和XM_001098774)。
本发明的载核酸阳离子脂质体制剂能够在细胞内显著地抑制CKIP-1的表达。在一些实施方案中，CKIP-1的表达被抑制至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，甚至100％。优选地，本发明的载核酸阳离子脂质体制剂能够抑制CKIP-1的表达至少50％。更优选地，本发明的载核酸阳离子脂质体制剂能够抑制CKIP-1的表达至少70％。
在一些实施方案中，本发明提供阳离子脂质体，其包含以下组分：
≥20摩尔％且≤40摩尔％，优选≥25摩尔％且≤40摩尔％的DOTAP；
≥20摩尔％且≤40摩尔％，优选≥20摩尔％且≤35摩尔％的DOPE；
≥20摩尔％且≤50摩尔％，优选≥30摩尔％且≤45摩尔％的胆固醇；以及
≥1摩尔％且＜5摩尔％，优选≥1摩尔％且≤4摩尔％的DSPE-PEG2000。
在一些实施方案中，本发明提供阳离子脂质体，其由DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG2000组成。
在一些实施方案中，本发明提供阳离子脂质体，其还包含其它脂质组分，例如1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)和/或蛋黄卵磷脂。
在一些实施方案中，本发明提供阳离子脂质体，其中所述DOTAP为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵硫酸甲酯盐或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵。
在一些实施方案中，本发明提供阳离子脂质体，其中所述DSPE-PEG2000为PEG末端具有官能团修饰(所述官能团包括甲基、羧基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、巯基、氨基、叶酸基团和生物素基团)的DSPE-PEG2000，例如1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-羧基聚乙二醇(DSPE-cPEG2000)或1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-马来酰亚胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-MAL)，或者其任意混合物。
在一些实施方案中，本发明提供阳离子脂质体，其平均粒径为50-200nm，优选为80-180nm，更优选为100-150nm。
在一些实施方案中，本发明提供制备阳离子脂质体的方法，其为薄膜分散法、超声分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法或注入法，优选为薄膜分散法、超声分散法或注入法。
在一些实施方案中，所述薄膜分散法包括以下步骤：
(1)将DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG2000溶于有机溶剂(例如氯仿、甲醇或者氯仿与甲醇的混合物)中，旋转蒸发使其形成脂质薄膜；然后去除所述脂质薄膜中残留的有机溶剂(优选通过采用氮气吹扫法或真空干燥法进行)；
(2)用缓冲液(优选PBS缓冲液)水化所述脂质薄膜，得到阳离子脂质体原液；以及
(3)采用脂质体挤出器，将所得阳离子脂质体原液通过薄膜(优选聚碳酸酯膜)进行挤出，得到阳离子脂质体。
在一些实施方案中，步骤(1)中的旋转蒸发的温度为30-70℃，旋转蒸发时间为0.25-2h，并且转速为60-150rpm；优选地，步骤(1)中的旋转蒸发的温度为40-60℃，旋转蒸发时间为0.5-1h，转速为80-120rpm。
在一些实施方案中，步骤(2)中的水化优选通过磁力搅拌进行；优选地，所述磁力搅拌的转速为2000-6000rpm，搅拌时间为0-3h；更优选地，所述磁力搅拌的转速为4000-5000rpm，搅拌时间为0-1h。
在一些实施方案中，在步骤(3)中将阳离子脂质体原液依次通过孔径为800nm至100nm(例如800nm、400nm、200nm或100nm)的多张(例如两张或三张)聚碳酸脂膜，每张膜进行1-20个，优选3-10个循环。
在一些实施方案中，本发明提供载药阳离子脂质体制剂，其包含本发明的阳离子脂质体以及药物，所述药物优选为核酸类药物(此时所述制剂也称作“载核酸阳离子脂质体制剂”)。
在一些实施方案中，本发明提供载药阳离子脂质体制剂，其中所述核酸类药物为RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、antagomir、miRNA、核酶及siRNA中的一种或两种以上的混合物，优选为CKIP-1 siRNA，所述CKIP-1 siRNA优选包含SEQ ID NO：1所示的有义链和SEQ ID NO：2所示的反义链。
在一些实施方案中，本发明提供载药阳离子脂质体制剂，其中阳离子脂质和所述核酸类药物的N/P比为(2-12)∶1，优选(2-10)∶1，最优选(2-6)∶1。
在一些实施方案中，本发明提供制备本发明的载药阳离子脂质体制剂的方法，其包括以下步骤：
(1)根据上文所述的方法制备阳离子脂质体；以及
(2)将所述阳离子脂质体与药物(优选包含核酸类药物的溶液，更优选为用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水配制的核酸溶液)混合(优选进行1-20min)，得到载药阳离子脂质体制剂。
药物组合物和治疗方法
在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的阳离子脂质体或本发明的载药阳离子脂质体制剂，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明提供本发明的阳离子脂质体用于制备载药阳离子脂质体制剂的用途，优选地，所述载药阳离子脂质体制剂如本申请中所定义。
在一些实施方案中，本发明提供本发明的阳离子脂质体或本发明的载药阳离子脂质体制剂在制备用于治疗由基因异常表达引起的疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供载药阳离子脂质体制剂(优选载核酸阳离子脂质体制剂)，其用于治疗由基因异常表达引起的疾病。
在一些实施方案中，本发明提供治疗由基因异常表达引起的疾病的方法，其包括向需要其的个体给药有效量的本发明的载药阳离子脂质体制剂(优选载核酸阳离子脂质体制剂)。
在一些实施方案中，所述由基因异常表达引起的疾病是关节炎，特别是类风湿关节炎。
本发明中“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症，所述疾病优选是关节炎，特别是类风湿关节炎。
在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药学上可接受的载体的实例如在Remington’s PharmaceuticalSciences(1990)中所述。
本发明的药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。
对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。
所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。
如本文中所使用的术语“有效量”指被给药后会在一定程度上缓解所治疗病症的一或多种症状的化合物的量。
可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可给药单次推注，可随时间给药数个分剂量，或可如治疗情况的急需所表明而按比例减少或增加剂量。要注意，剂量值可随要减轻的病况的类型及严重性而变化，且可包括单次或多次剂量。要进一步理解，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据个体需要及给药组合物或监督组合物的给药的人员的专业判断来随时间调整。
所给药的本发明的化合物的量会取决于所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率、化合物的处置及处方医师的判断。一般而言，有效剂量在每日每kg体重约0.0001至约50mg，例如约0.01至约10mg/kg/日(单次或分次给药)。对70kg的人而言，这会合计为约0.007mg/日至约3500mg/日，例如约0.7mg/日至约700mg/日。在一些情况下，不高于前述范围的下限的剂量水平可以是足够的，而在其它情况下，仍可在不引起任何有害副作用的情况下采用较大剂量，条件是首先将所述较大剂量分成数个较小剂量以在一整天中给药。
本发明的化合物在药物组合物中的含量或用量可以是约0.01mg至约1000mg，适合地是0.1-500mg，优选0.5-300mg，更优选1-150mg，特别优选1-50mg，例如1.5mg、2mg、4mg、10mg、25mg等。
除非另外说明，否则如本文中所使用，术语“治疗(treating)”意指逆转、减轻、抑制这样的术语所应用的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状的进展，或预防这样的病症或病况或者这样的病症或病况的一或多种症状。
如本文所使用的“个体”包括人或非人动物。示例性人个体包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人个体(称为患者)或正常个体。本发明中“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
实施例
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。
在以下实施例中所使用的CKIP-1 siRNA包含如表1中所示的有义链和反义链。
表1.CKIP-1 siRNA核酸序列
Figure BSA0000164837440000111
实施例1：阳离子脂质体的制备
(1)称取摩尔比例为30∶29∶40∶1的DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-mPEG2000于旋蒸瓶中，用氯仿使其完全溶解，于50℃下，以90rpm的转速旋转蒸发1h去除氯仿，使之形成均匀脂质薄膜，然后氮气吹扫3min以去除残留氯仿。
(2)量取一定体积的浓度为10mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)至旋蒸瓶中进行水化，摇动瓶体使脂质薄膜水化脱落，得脂质体原液。
(3)将上述所得脂质体原液依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸脂膜5个循环、10个循环和10个循环以进行挤出，即得阳离子脂质体。
实施例2：阳离子脂质体的制备
(1)称取摩尔比例为40∶24∶34∶2的DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-mPEG2000于旋蒸瓶中，用氯仿使其完全溶解，于50℃下，以90rpm的转速旋转蒸发1h去除氯仿，使之形成均匀脂质薄膜，然后氮气吹扫3min以去除残留氯仿。
(2)量取一定体积的浓度为10mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)至旋蒸瓶中进行水化，摇动瓶体使脂质薄膜水化脱落，然后在室温下以4000rpm转速磁力搅拌1h，得脂质体原液。
(3)将上述所得脂质体原液依次通过800nm、200nm和100nm的聚碳酸脂膜3个循环、5个循环和10个循环以进行挤出，即得阳离子脂质体。
实施例3：阳离子脂质体的制备
(1)称取摩尔比例为25∶35∶37∶3的DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-mPEG2000于旋蒸瓶中，用氯仿使其完全溶解，于60℃下，以100rpm的转速旋转蒸发1h去除氯仿，使之形成均匀脂质薄膜，然后氮气吹扫3min以去除残留氯仿。
(2)量取一定体积的浓度为10mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)至旋蒸瓶中进行水化，摇动瓶体使脂质薄膜水化脱落，然后在室温条件下以5000rpm转速磁力搅拌0.5h，得脂质体原液。
(3)将上述所得脂质体原液依次通过200nm和100nm的聚碳酸脂膜10个循环和10个循环以进行挤出，即得阳离子脂质体。
实施例4：载核酸阳离子脂质体制剂的制备
取空白阳离子脂质体溶液100μl，用100μl DEPC处理水按N/P比为1、2、4、6、8或10配制CKIP-1 siRNA溶液，室温放置10min，将siRNA溶液与空白阳离子脂质体溶液混合，室温放置20min，即得载核酸阳离子脂质体制剂。
实施例5：阳离子脂质体平均粒径、PDI及电位研究
利用动态散射法，采用马尔文激光粒度及电位分析仪测定。
1)平均粒径和PDI的测定
取所制备阳离子脂质体20μl，用去离子水稀释至1ml，加入样品池，每个样品重复测定3次。测量条件为：173°散射角，25℃。
2)ζ电位的测定
将用去离子水50倍稀释的阳离子脂质体1mL加入测定容器中，避免容器内产生气泡，每个样品重复测定3次。
表2.平均粒径、PDI和ζ电位测定结果。
样品 平均粒径(nm) PDI ζ电位(mV)
实施例1 135.9 0.045 46.2
实施例6：阳离子脂质体核酸复合能力的研究
具有强的核酸复合能力是载核酸阳离子脂质体制剂成功的关键因素，以N/P比为指标，采用琼脂糖凝胶电泳法，考察本发明的阳离子脂质体的核酸复合能力。称取0.9g的琼脂糖溶于60ml的1×TAE溶液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，趁热向琼脂糖凝胶中加入3μl核酸染料(SYBRTMSafe)，并将凝胶加入凝胶槽，插入梳子，自然晾干后拔出梳子。将如实施例4中所述以不同N/P比通过实施例1的阳离子脂质体和siRNA制备的载核酸阳离子脂质体制剂(8μl)与2μl的10×加样缓冲液的混合液加入到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为150V进行电泳实验，常温下电泳20min。以相同浓度的纯siRNA溶液和载核酸阳离子脂质体制剂完全破乳的溶液作为对照。结果如图1所示，其表明本发明的载核酸阳离子脂质体制剂在N/P为2-10时均能够完全复合siRNA，具有很强的siRNA复合能力。
实施例7：阳离子脂质体细胞毒性的研究
于96孔板中将HS27细胞按一定数目铺板，12h后将不同浓度的空白阳离子脂质体及阳性对照Lipofectamin 2000加入细胞培养液中，继续培养24h后，加入一定量的CCK-8，孵育2-4h后于450nm波长处用酶标仪测定各孔板中的吸光度，以未处理细胞为对照，计算细胞存活率。结果如图2所示，其表明与商品化转染试剂lipofectamin 2000相比，本发明的阳离子脂质体细胞毒性明显较小。
实施例8：载核酸阳离子脂质体制剂放置稳定性的研究
取实施例1的空白阳离子脂质体溶液100μl，按N/P＝6分别于0天、14天和28天根据实施例4制备载核酸阳离子脂质体制剂，4℃保存。于第28天测定三批载核酸阳离子脂质体制剂的平均粒径、PDI、电位，并以琼脂糖凝胶电泳法考察核酸的稳定性和包封率。
载核酸阳离子脂质体制剂的平均粒径、PDI、电位结果如下表3所示。
表3.载核酸阳离子脂质体制剂的平均粒径、PDI、电位结果
Figure BSA0000164837440000131
琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，其表明：与标准核酸溶液相比，本发明的载核酸阳离子脂质体制剂放置28天后仍无游离核酸，破乳后电泳条带亮度与标准核酸溶液条带的亮度相当，表明本发明的阳离子脂质体可以很好的保护核酸类药物，提高其稳定性。
实施例9：载核酸阳离子脂质体制剂血浆稳定性的研究
取实施例1的空白阳离子脂质体溶液100μl，按N/P＝6根据实施例4制备载核酸阳离子脂质体制剂，将此制剂与50％大鼠血浆于37℃下进行孵育，分别于0h和2h取样品50μl，将其与50μl 10％TritonX-100混合，破乳5分钟后进行琼脂糖凝胶电泳分析(电泳条件：150V，20min)。结果如图4所示，其显示：标准核酸溶液在用大鼠血浆孵育2h后电泳条带亮度降低，表明在血浆中核酸被一定程度降解；而本发明的载核酸阳离子脂质体制剂在用大鼠血浆孵育2h后电泳条带亮度无明显降低，表明本发明的阳离子脂质体可以保护核酸类药物，提高其血浆稳定性。
实施例10：载核酸阳离子脂质体制剂转染效率的研究
将hFOB1.19细胞以10万/孔在24孔板中培养过夜，转染前0.5h更换为Opti-MEM培养基，将荧光素标记的CKIP-1 siRNA溶液或载荧光素标记的CKIP-1 siRNA的阳离子脂质体制剂加入培养基中，在37℃下转染5h。丢弃培养基，并用PBS溶液漂洗细胞3次，收集细胞进行流式细胞术分析。结果如图5所示，其表明与裸siRNA及用商品化转染试剂lipofectamin2000制备的制剂相比，本发明的载核酸阳离子脂质体制剂具有较高的转染效率效果。
实施例11：载CKIP-1 siRNA阳离子脂质体制剂体外药效学研究
将细胞以10万/孔在24孔板中培养过夜，转染前0.5h更换为Opti-MEM培养基，将载CKIP-1 siRNA的阳离子脂质体制剂加入培养基中，在37℃下转染5h。丢弃培养基，并用PBS溶液漂洗细胞3次，更换含10％胎牛血清的培养基继续培养48h。丢弃上清液，并用PBS溶液漂洗细胞3次，用TRIzol试剂提取总RNA，并用cDNA逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。之后采用荧光定量PCR法检测siRNA对成骨样细胞的CKIP-1mRNA表达量的抑制效果(以正常细胞为空白对照)。PCR反应试剂购自Applied Biosystems公司。反应条件为：95℃，10mins(1个循环)；95℃，15secs，60℃，60secs(40个循环)。荧光定量PCR法中，以GAPDH基因作为内参基因，各基因的引物序列如表4所示。
表4.引物序列
Figure BSA0000164837440000141
Figure BSA0000164837440000151
结果如图6所示，其表明载CKIP-1 siRNA阳离子脂质体制剂能显著抑制人成骨细胞株hFOB1.19内CKIP-1 mRNA的表达。
对比例1
阳离子脂质体的制备
(1)称取摩尔比例为30∶28∶40∶2的DOTAP、DOPC、胆固醇和DSPE-mPEG2000于旋蒸瓶中，用氯仿使其完全溶解，于50℃下，以90rpm的转速旋转蒸发1h去除氯仿，使之形成均匀脂质薄膜，然后进行氮气吹扫3min以去除残留氯仿。
(2)量取一定体积的浓度为10mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)至旋蒸瓶中进行水化，摇动瓶体使脂质薄膜水化脱落，得脂质体原液。
(3)将上述所得脂质体原液依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸脂膜5个循环、10个循环和10个循环以进行挤出，即得对比例1的阳离子脂质体。
表5.对比例1的阳离子脂质体的平均粒径、PDI和ζ电位结果。
样品 平均粒径(nm) PDI ζ电位(mV)
对比例1 137.7 0.076 44.0
转染效率的研究
将hFOB1.19细胞以10万/孔在24孔板中培养过夜，转染前0.5h更换为Opti-MEM培养基，将荧光素标记的CKIP-1 siRNA加入不同剂量的对比例1的阳离子脂质体中形成载核酸阳离子脂质体制剂，然后加入细胞培养基中，在37℃下转染5h。丢弃培养基，并用PBS溶液漂洗细胞3次，进行荧光显微镜观察。以实施例1的阳离子脂质体为对照组，结果如图7所示。由图7可见，用对比例1的阳离子脂质体制备的制剂的转染效率远低于用实施例1的阳离子脂质体制备的制剂。
对比例2
阳离子脂质体的制备
(1)称取摩尔比例为30∶28∶40∶2的DOTAP、蛋黄卵磷脂、胆固醇和DSPE-mPEG2000于旋蒸瓶中，用氯仿使其完全溶解，于50℃下，以90rpm的转速旋转蒸发1h去除氯仿，使之形成均匀脂质薄膜，然后进行氮气吹扫3min以去除残留氯仿。
(2)量取一定体积的浓度为10mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)至旋蒸瓶中进行水化，摇动瓶体使脂质薄膜水化脱落，得脂质体原液。
(3)将上述所得脂质体原液依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸脂膜5个循环、10个循环和10个循环以进行挤出，即得对比例2的阳离子脂质体。
表6.对比例2的阳离子脂质体的平均粒径、PDI和ζ电位结果。
样品 平均粒径(nm) PDI ζ电位(mV)
对比例2 146.2 0.029 47.2
转染效率的研究
将hFOB1.19细胞以10万/孔在24孔板中培养过夜，转染前0.5h更换为Opti-MEM培养基，将荧光素标记的CKIP-1 siRNA加入不同剂量的对比例2的阳离子脂质体中形成载核酸阳离子脂质体制剂，然后加入细胞培养基中，在37℃下转染5h。丢弃培养基，并用PBS溶液漂洗细胞3次，进行荧光显微镜观察。以裸CKIP-1 siRNA、实施例1、商品化转染试剂lipofectamin2000为对照组，结果如图8所示。由图8可见，经用对比例2的阳离子脂质体制备的制剂处理的细胞的荧光亮度远低于经用本申请的实施例1的阳离子脂质体制备的制剂处理的细胞的亮度，这表明其转染效率远低于用实施例1的阳离子脂质体制备的制剂。
对比例3
阳离子脂质体的制备
(1)称取摩尔比例为30∶25∶40∶5的DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-mPEG2000于旋蒸瓶中，用氯仿使其完全溶解，于50℃下，以90rpm的转速旋转蒸发1h去除氯仿，使之形成均匀脂质薄膜，然后进行氮气吹扫3min以去除残留氯仿。
(2)量取一定体积的浓度为10mM的PBS缓冲液(pH＝7.4)至旋蒸瓶中进行水化，摇动瓶体使脂质薄膜水化脱落，得脂质体原液。
(3)将上述所得脂质体原液依次通过400nm、200nm和100nm的聚碳酸脂膜5个循环、10个循环和10个循环以进行挤出，即得对比例3的阳离子脂质体。
表7.对比例3阳离子脂质体的平均粒径、PDI和ζ电位结果。
样品 平均粒径(nm) PDI ζ电位(mV)
对比例3 140.7 0.047 46.7
体外药效的研究
以与实施例11中所述相同的方法测试用对比例3的阳离子脂质体制备的载CKIP-1siRNA的体外药效学(以正常细胞为空白对照)。结果如图9所示，其表明用对比例3的阳离子脂质体制备的载CKIP-1 siRNA制剂抑制人成骨细胞株hFOB1.19内CKIP-1 mRNA的表达的能力明显低于用实施例1和实施例3制备的制剂，提示用具有高含量DSPE-mPEG2000(摩尔比≥5％)的阳离子脂质体制备的制剂的体外活性较差。
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。
Figure ISA0000164837460000011
Figure ISA0000164837460000021

Claims (39)

1.载药阳离子脂质体制剂，其包含阳离子脂质体以及核酸类药物，
其中所述阳离子脂质体包含以下组分：
≥25摩尔％且≤40摩尔％的DOTAP；
≥20摩尔％且≤35摩尔％的DOPE；
≥30摩尔％且≤45摩尔％的胆固醇；以及
≥1摩尔％且≤4摩尔％的DSPE-PEG2000；并且
所述核酸类药物为CKIP-1 siRNA。
2.权利要求1的载药阳离子脂质体制剂，其中所述阳离子脂质体由DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG2000组成。
3.权利要求1的载药阳离子脂质体制剂，其中所述阳离子脂质体还包含其它脂质组分。
4.权利要求3的载药阳离子脂质体制剂，其中所述其它脂质组分为DOPC和/或蛋黄卵磷脂。
5.权利要求1-4中任一项的载药阳离子脂质体制剂，其中所述DOTAP为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵硫酸甲酯盐或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵。
6.权利要求1-4中任一项的载药阳离子脂质体制剂，其中所述DSPE-PEG2000为PEG末端具有官能团修饰的DSPE-PEG2000。
7.权利要求6的载药阳离子脂质体制剂，其中所述官能团选自甲基、羧基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、巯基、氨基、叶酸基团和生物素基团。
8.权利要求6的载药阳离子脂质体制剂，其中所述DSPE-PEG2000为DSPE-mPEG2000、DSPE-cPEG2000或DSPE-PEG2000-MAL，或者其任意混合物。
9.权利要求1-4中任一项的载药阳离子脂质体制剂，其中所述阳离子脂质体的平均粒径为50-200nm。
10.权利要求9的载药阳离子脂质体制剂，其中所述阳离子脂质体的平均粒径为80-180nm。
11.权利要求10的载药阳离子脂质体制剂，其中所述阳离子脂质体的平均粒径为100-150nm。
12.权利要求1-4中任一项的载药阳离子脂质体制剂，其中所述CKIP-1 siRNA包含SEQID NO：1所示的有义链和SEQ ID NO：2所示的反义链。
13.权利要求1-4中任一项的载药阳离子脂质体制剂，其中阳离子脂质和所述核酸类药物的N/P比为(2-12)∶1。
14.权利要求13的载药阳离子脂质体制剂，其中阳离子脂质和所述核酸类药物的N/P比为(2-10)∶1。
15.权利要求14的载药阳离子脂质体制剂，其中阳离子脂质和所述核酸类药物的N/P比为(2-6)∶1。
16.制备阳离子脂质体的方法，其中所述阳离子脂质体如权利要求1-11中任一项所定义，并且方法为薄膜分散法、超声分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法或注入法。
17.权利要求16的方法，其为薄膜分散法、超声分散法或注入法。
18.权利要求16或17的方法，其中所述薄膜分散法包括以下步骤：
(1)将DOTAP、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG2000溶于有机溶剂中，旋转蒸发使其形成脂质薄膜；然后去除所述脂质薄膜中残留的有机溶剂；
(2)用缓冲液水化所述脂质薄膜，得到阳离子脂质体原液；以及
(3)采用脂质体挤出器，将所得阳离子脂质体原液通过薄膜进行挤出，得到阳离子脂质体。
19.权利要求18的方法，其中所述有机溶剂为氯仿、甲醇或者氯仿与甲醇的混合物。
20.权利要求18的方法，其中所述去除所述脂质薄膜中残留的有机溶剂通过采用氮气吹扫法或真空干燥法进行。
21.权利要求18的方法，其中所述缓冲液为PBS缓冲液。
22.权利要求18的方法，其中将所得阳离子脂质体原液通过聚碳酸酯膜进行挤出。
23.权利要求18的方法，其中步骤(1)中的旋转蒸发的温度为30-70℃，旋转蒸发时间为0.25-2h，并且转速为60-150rpm。
24.权利要求23的方法，其中步骤(1)中的旋转蒸发的温度为40-60℃，旋转蒸发时间为0.5-1h，转速为80-120rpm。
25.权利要求18的方法，其中步骤(2)中的水化通过磁力搅拌进行。
26.权利要求25的方法，其中所述磁力搅拌的转速为2000-6000rpm，搅拌时间为0-3h。
27.权利要求26的方法，其中所述磁力搅拌的转速为4000-5000rpm，搅拌时间为0-1h。
28.权利要求18的方法，其中在步骤(3)中将阳离子脂质体原液依次通过孔径为800nm至100nm的多张聚碳酸脂膜，每张膜进行1-20个循环。
29.权利要求28的方法，其中在步骤(3)中将阳离子脂质体原液依次通过孔径为800nm、400nm、200nm或100nm的多张聚碳酸脂膜。
30.权利要求28的方法，其中所述多张聚碳酸脂膜为两张或三张聚碳酸脂膜。
31.权利要求28的方法，其中每张膜进行3-10个循环。
32.制备权利要求1-15中任一项的载药阳离子脂质体制剂的方法，其包括以下步骤：
(1)根据权利要求16-31中任一项所述的方法制备阳离子脂质体；以及
(2)将所述阳离子脂质体与药物混合，得到载药阳离子脂质体制剂。
33.权利要求32的方法，其中将所述阳离子脂质体与包含核酸类药物的溶液混合。
34.权利要求33的方法，其中将所述阳离子脂质体与用DEPC处理水配制的核酸类药物的溶液混合。
35.权利要求32-34中任一项的方法，其中所述混合进行1-20min。
36.药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的载药阳离子脂质体制剂，以及药学上可接受的载体。
37.权利要求1-15中任一项的载药阳离子脂质体制剂在制备用于治疗由基因异常表达引起的疾病的药物中的用途。
38.权利要求37的用途，其中所述疾病是关节炎。
39.权利要求38的用途，其中所述疾病是类风湿关节炎。
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