CN111904934B - miRNA185抑制剂的脂质体及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及miRNA185抑制剂的脂质体及其制法。具体地说，本发明的脂质体包含miR185i、DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE‑PEG。该脂质体可被制成混悬液或者冷冻干燥粉末。本发明脂质体呈现如本发明所述优异的技术效果，例如具有良好的粒度和zeta电位的特征，具有相当高的脂质包封率和血清稳定性试验残余率，具有相当高的肝脏累积率以及优良的安全性。

Description

miRNA185抑制剂的脂质体及其制法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种核酸类药物，尤其涉及一种具有靶向性能的核酸类药物，该核酸类药物是miRNA185抑制剂(miR185i，miRNA185i，5’-UCAGGAACUGCCUUUCUCUCCA-3’)的脂质体形式。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是一种由脂质代谢紊乱引起的进行性疾病，在世界范围内具有较高的发病率和死亡率[Rodriguez,F.；Maron,D.J.；Knowles,J.W.；Virani,S.S.；Lin,S.；Heidenreich,P.A.Association of Statin Adherence WithMortality in Patients With Atherosclerotic Cardiovascular Disease.JAMACardiol.2019,4,206-213]。肝脏是胆固醇代谢的主要器官，microRNA185反义抑制剂(miR185i)可促进胆固醇清除。典型的血脂异常表现为低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低。MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的内源性非编码小RNA，在调节血脂异常和动脉粥样硬化的基因调控中起着重要作用。MiRNA作为动脉粥样硬化的治疗方法越来越被认为是一种有前途的治疗方法[Solly,E.L.；Dimasi,C.G.；Bursill,C.A.；Psaltis,P.J.；Tan,J.T.M.MicroRNAs as therapeutic targets andclinical biomarkers in atherosclerosis.J.Clin.Med.2019,8,E2199；Lu,Y.；Thavarajah,T.；Gu,W.；Cai,J.；Xu,Q.Impact of miRNA in atherosclerosis.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2018,38,e159-e170；Andreou,I.；Sun,X.；Stone,P.H.；Edelman,E.R.；Feinberg,M.W.MiRNAs in atherosclerotic plaque initiation,progression,andrupture.Trends Mol.Med.2015,21,307-318；Feinberg,M.W.；Moore,K.J.MicroRNAregulation of atherosclerosis.Circ.Res.2016,118,703-720]。
MicroRNA-185(miR185)是肝细胞清道夫受体I类(SR-BI)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和KH型剪接调节蛋白(KSRP)的关键转录后调节剂，在控制胆固醇稳态中起着重要作用[Jiang,H.；Zhang,J.；Du,Y.；Jia,X.；Yang,F.；Si,S.；Wang,L.；Hong,B.MicroRNA-185modulates low density lipoprotein receptor expression as a keyposttranscriptional regulator.Atherosclerosis 2015,243,523-532；Wang,L.；Jia,X.J.；Jiang,H.J.；Du,Y.；Yang,F.；Si,S.Y.；Hong,B.MicroRNAs 185,96,and 223repressselective high-density lipoprotein cholesterol uptake throughposttranscriptional inhibition.Mol.Cell.Biol.2013,33,1956-1964]。在高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠中，利用慢病毒载体将miR185反义序列导入miR185i，降低了血浆胆固醇水平，减少了动脉斑块面积，为抗动脉粥样硬化策略提供了一种有前景的药物。然而，裸露的小RNA在血浆中不稳定，容易被核酸酶降解。除了游离小RNA的不稳定性外，其亲水性、负电荷和高分子量阻止了核酸穿过细胞膜。为了克服这些障碍，迫切需要开发有效的策略将miR185i导入肝脏。
近年来，纳米载体已成为一种安全、高效地传递miRNA的理想策略，以提高细胞摄取和药理作用。在以往的研究中，miR185i的体内传递是通过慢病毒系统实现的，具有很高的转染效率，但由于病毒DNA随机整合引起的强免疫原性和插入突变作用，病毒载体的安全性得不到保证[Thomas,C.E.；Ehrhardt,A.；Kay,M.A.Progress and problems with theuse of viral vectors for gene therapy.Nat.Rev.Genet.2003,4.346-358]。非病毒给药系统具有免疫原性低、安全性好、成本低廉等优点，具有更广泛的应用前景[Lin,G.；Li,L.；Panwar,N.；Wang,J.；Tjin,S.C.；Wang,X.；Yong,K.-T.Non-viral gene therapy usingmultifunctional nanoparticles:Status,challenges,and opportunities.Coord.Chem.Rev.2018,374,133-152]。其中，脂质体能与带负电荷的核酸静电结合，成为研究最广泛的寡核苷酸非病毒载体[Fernandez-
Figure BDA0002691625080000021
I.；Badiola,I.；Sanchez,A.Nanocarriers formicroRNA delivery in cancer medicine.Biotechnol.Adv.2017,35,350-360；Yin,H.；Kanasty,R.L.Eltoukhy,A.A.；Vegas,A.J.；Dorkin,J.R.；Anderson,D.G.Non-viralvectors for gene-based therapy.Nat.Rev.Genet.2014,15,541-555]。帕蒂西兰(Patisiran)是一种siRNA脂质体，其含有可电离脂质，用于治疗成人遗传性TTR介导的淀粉样变性(hATTR)多发性神经病，于2018年获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准。作为第一个被批准的全身给药的阳离子纳米颗粒，帕蒂西兰凸显了阳离子脂质体在核酸治疗领域的潜在应用前景[Buck,J.；Grossen,P.；Cullis,P.R.；Huwyler,J.；Witzigmann,D.Lipid-based DNA therapeutics:hallmarks of non-viral gene delivery.ACS Nano 2019,13,3754-3782；Yao,Y.；Wang,T.；Liu,Y.；Zhang,N.Co-delivery of sorafenib and VEGF-siRNA via pH-sensitive liposomes for the synergistic treatment ofhepatocellular carcinoma.Artif.Cells Nanomed.Biotechnol.2019,47,1374-1383；Yu,Q.；Qiu,Y.；Wang,X.；Tang,J.；Liu,Y.；Mei,L.；Li,M.；Yang,M.；Tang,L.；Gao,H.；Zhang,Z.；Xu,W.；He,Q.Efficient siRNA transfer to knockdown a placenta specificlncRNA using RGD-modified nano-liposome:A new preeclampsia-like mousemodel.Int.J.Pharm.2018,546,115-124；Lee,J.；Ahn,H.J.PEGylated DC-Chol/DOPEcationic liposomes containing KSP siRNA as a systemic siRNA delivery carrierfor ovarian cancer therapy.Biochem.Biophys.Res.Commun.2018,503,1716-1722]。
本领域对miRNA185抑制剂的给药形式方面尚无人作过尝试，例如在将其制备成脂质体时会遇到何种问题是尚不清楚的。因此，本领域技术人员期待提供一种miRNA185抑制剂的脂质体制剂形式，从而为临床提供一种有价值的给药方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miRNA185抑制剂的脂质体制剂形式，期待这种脂质体具有一个或者多个方面的优良药学性能，例如具有良好的效率、安全性和肝靶向性，是一种令人满意的小RNA转运系统。本发明出人意料地发现，本发明所制得的miRNA185抑制剂的脂质体制剂形式呈现优良的药学性能，例如具有优良的微粒粒度性能、电位性能、在肝脏内实现了显著的肝靶向性、在肝脏内维持相当长的时间、组织无异常病理改变等一种或多种优良药学性能。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种脂质药物组合物，其包含miR185i、DOTAP、DOPE、胆固醇、DSPE-PEG、葡萄糖。
根据本发明的脂质药物组合物，其中所述miR185i是具有如下序列所示的miR185抑制剂：5’-UCAGGAACUGCCUUUCUCUCCA-3’。
根据本发明的脂质药物组合物，其中所述DSPE-PEG所结合的PEG其分子量范围内1000～3000。
根据本发明的脂质药物组合物，其包含：0.2～1重量份的miR185i、1～6重量份的DOTAP、1～7重量份的DOPE、0.5～4重量份的胆固醇、0.5～3重量份的DSPE-PEG、0重量份或者50～100重量份的葡萄糖。
根据本发明的脂质药物组合物，其包含：0.2～0.9重量份的miR185i、1.4～5.8重量份的DOTAP、1.5～6.5重量份的DOPE、0.7～3.2重量份的胆固醇、0.5～2.5重量份的DSPE-PEG、0重量份或者60～80重量份的葡萄糖。
根据本发明的脂质药物组合物，其包含：0.2～0.85重量份的miR185i、1.4～5.8重量份的DOTAP、1.5～6重量份的DOPE、0.8～3.2重量份的胆固醇、0.5～2.2重量份的DSPE-PEG、0重量份或者70～80重量份的葡萄糖。
根据本发明的脂质药物组合物，其是冷冻干燥粉末。在一个实施方案中，该冷冻干燥粉末中的水分含量小于5％，优选小于3％，更优选小于2％。
根据本发明的脂质药物组合物，其中还包含水。
根据本发明的脂质药物组合物，其中还包含水，水的量是使得其中固形物浓度在3～20％范围内，例如使得固形物浓度在4～15％范围内，例如使得固形物浓度在4～10％范围内。
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
Figure BDA0002691625080000031
Figure BDA0002691625080000041
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
miR185i： 0.2mg
DOTAP： 5.7mg
DOPE： 1.5mg
胆固醇： 3.2mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 0.5mg
葡萄糖： 0或75mg，
水： 0或1.5mL。
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
miR185i： 0.8mg
DOTAP： 1.5mg
DOPE： 6.2mg
胆固醇： 0.8mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 2.5mg
葡萄糖： 0或75mg，
水： 0或1.5mL。
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
miR185i： 0.4mg
DOTAP： 4.5mg
DOPE： 2.5mg
胆固醇： 2.5mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 2mg
葡萄糖： 0或75mg，
水： 0或1.5mL。
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
Figure BDA0002691625080000042
Figure BDA0002691625080000051
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
miR185i： 0.5mg
DOTAP： 3mg
DOPE： 4mg
胆固醇： 2mg
DSPE-PEG<sub>1000</sub>： 1.5mg
葡萄糖： 0或50mg，
水： 0或1mL。
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
miR185i： 0.5mg
DOTAP： 3.5mg
DOPE： 4mg
胆固醇： 2mg
DSPE-PEG<sub>3000</sub>： 1.5mg
葡萄糖： 0或100mg，
水： 0或2mL。
根据本发明的脂质药物组合物，其中包含如本发明任一具体实例所示比例的组份。
根据本发明的脂质药物组合物，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用水或者5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围，得到脂质体混悬液；任选地对该混悬液冷冻干燥以除去水分，得到冷冻干粉末。
进一步的，本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述脂质药物组合物的方法，其包括如下步骤：精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用水或者5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围，得到脂质体混悬液；任选地对该混悬液冷冻干燥以除去水分，得到冷冻干粉末。
在本发明的任一方面，所制备的呈液体形式的药物组合物或者进一步制成冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物，其可以通过控制制备工艺的方式，将该组合物制成供无菌方式使用的无菌制剂。这种工艺的控制是容易的，例如先控制方式，即将各原辅料经无菌处理，再以全程无菌操作制备成无菌制剂；还可以是后控制的方式，即将制备得到的呈液体形式的组合物经例如但不限于微孔滤膜过滤的方式除菌。因此，根据本发明的任一方面，所制备的呈液体形式的药物组合物或者进一步制成冷冻干燥粉针剂形式的药物组合物是无菌制剂。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中如未另外说明，涉及的％是重量/重量百分数。
脂质体的经典制备方法包括薄膜分散法[Yang,Z.Z.；Li,J.Q.；Wang,Z.Z.；Dong,D.W.；Qi,X.R.Tumor-targeting dual peptides-modified cationic liposomes fordelivery of siRNA and docetaxel to gliomas.Biomaterials 2014,35,5226-5239]和乙醇注射法[Yung,B.C.；Li,J.；Zhang,M.；Cheng,X.；Li,H.,Yung,E.M.；Kang,C.；Cosby,L.E.；Liu,Y.；Teng,L.；Lee,R.J.Lipid nanoparticles composed of quaternary amine-tertiary amine cationic lipid combination(QTsome)for therapeutic delivery ofantimiR-21for lung cancer.Mol.Pharm.2016,13,653-662]。在本发明中主要采用薄膜分散法制备脂质体，虽然乙醇注射法亦可以使用。
在本发明中，所述DOTAP是1,2-二油酰基-3-三甲基丙铵氯化物，其英文名为1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,chloride。
在本发明中，所述DOPE是1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，其英文名为1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine。
在本发明中，所述PEG2000-DSPE或者DSPE-PEG2000是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，其英文名为1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，具有不同PEG分子量的基团的DSPE-PEG亦采用类似称谓。
本发明提供的脂质体组合物呈现优良技术效果，这些技术效果已记载在本发明具体实施方式部分。此外，本发明人还发现，通过额外添加门冬酰胺和果糖可以克服由于DSPE-PEG而引发的缺陷。具体的试验是如下述补充试验A～C所记载的。补充试验A：分别参照实施例1～8的配方和制法，不同的仅是其中不添加DSPE-PEG，得到8种脂质体，照试验例1～3的方法测定它们的各项性能，结果：粒径均值均在153～196nm范围内、zeta电位均值均在9.3～13.2mV范围内、肝脏累积率均在453～491％范围内、包封率均在71～77％范围内、血清稳定性试验残余率均在79～86％范围内，例如参照实施例1所得脂质体的粒径均值为176nm、zeta电位均值为12.4mV、肝脏累积率为468％、包封率为73.2％、血清稳定性试验残余率为83.6％；这表明，在本发明体系的脂质体中，添加DSPE-PEG未见对粒径、zeta电位、肝脏累积有明显影响，有助于提高包封率，但是其添加会造成血清稳定性降低。补充试验B：分别参照实施例1～8的配方和制法，不同的仅是其中还分别额外添加门冬酰胺和果糖(与miR185i一起添加，即它们与miR185i一起溶解于葡萄糖溶液中)，各实施例添加量分别为(门冬酰胺/果糖)0.2mg/5mg、0.1mg/7mg、0.3mg/3mg、0.15mg/5mg、0.25mg/5mg、0.2mg/5mg、0.2mg/5mg，得到8种脂质体，照试验例1～3的方法测定它们的各项性能，结果：粒径均值均在144～191nm范围内、zeta电位均值均在9.7～12.8mV范围内、肝脏累积率均在467～522％范围内、包封率均在91～95％范围内、血清稳定性试验残余率均在82～88％范围内，例如参照实施例1所得脂质体的粒径均值为156nm、zeta电位均值为11.6mV、肝脏累积率为493％、包封率为92.8％、血清稳定性试验残余率为86.3％。补充试验C：参照补充试验B的配方和制法不同的仅是不添加门冬酰胺得到8种脂质体；参照补充试验B的配方和制法不同的仅是不添加果糖得到8种脂质体；照试验例1～3的方法测定这14种脂质体的各项性能，结果：粒径均值均在152～188nm范围内、zeta电位均值均在10.2～13.4mV范围内、肝脏累积率均在436～502％范围内、包封率均在90～94％范围内、血清稳定性试验残余率均在62～66％范围内；例如，参照实施例1且增补添加果糖所得脂质体的粒径均值为177nm、zeta电位均值为12.2mV、肝脏累积率为446％、包封率为91.3％、血清稳定性试验残余率为64.6％；这表明，在本发明体系的脂质体中，当不添加DSPE-PEG时包封率低但是miR185i血清稳定性高(补充试验A)、当添加DSPE-PEG时包封率明显提高但是miR185i血清稳定性低(实施例1～8)，表明DSPE-PEG有助于提高包封率但是会对miR185i血清稳定性产生不利影响；在同时增补添加门冬酰胺和果糖后，有助于克服上述DSPE-PEG对miR185i血清稳定性的不利影响，同时仍然能够保持相当高的包封率，而且对脂质体的其它性能未见有不良影响(补充试验B)；另外，若仅仅是增补添加门冬酰胺或果糖之一时，不能克服上述DSPE-PEG的缺陷(补充试验C)。另外，将补充试验B所得8种脂质体(混悬液)照本发明试验例4的方法考察LipomiR185i的体内安全性结果显示它们的体内安全性与实施例1脂质体的结果基本相同。据此，在本发明任一方面的任一实施方案中，所述脂质药物组合物中还包含门冬酰胺和果糖；例如，所述脂质药物组合物包含：0.2～1重量份的miR185i、1～6重量份的DOTAP、1～7重量份的DOPE、0.5～4重量份的胆固醇、0.5～3重量份的DSPE-PEG、0.1～0.3重量份的门冬酰胺、3～5重量份的果糖、50～100重量份的葡萄糖；例如，所述脂质药物组合物包含：0.2～0.9重量份的miR185i、1.4～5.8重量份的DOTAP、1.5～6.5重量份的DOPE、0.7～3.2重量份的胆固醇、0.5～2.5重量份的DSPE-PEG、0.1～0.3重量份的门冬酰胺、3～5重量份的果糖、60～80重量份的葡萄糖；例如，所述脂质药物组合物包含：0.2～0.85重量份的miR185i、1.4～5.8重量份的DOTAP、1.5～6重量份的DOPE、0.8～3.2重量份的胆固醇、0.5～2.2重量份的DSPE-PEG、0.1～0.3重量份的门冬酰胺、3～5重量份的果糖、70～80重量份的葡萄糖。在一个实施方案中，所述门冬酰胺和果糖是与miR185i一起添加到所述脂质体组合物中的。
微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是最近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，通过对其靶基因的表达的调控，影响了生物体内的多种信号通路。典型的miR包括miR185。miR是一类高度保守的单链非编码小RNA，由约20-22个单核苷酸组成，广泛存在于真核生物中，参与转录后水平或翻译水平的调控。miRNA在真核生物基因调控中起着重要作用，广泛参与了细胞增殖、分化、发育、代谢、凋亡等多种基本生命活动。miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性等特征，通过与靶基因不完全互补结合，每个miRNA都具有调节多个mRNAs的潜能。miRNA表达水平的稳定对于生命体正常生理机能的发挥以及维持新陈代谢的动态平衡至关重要。近年研究发现，miRNA除了调控正常生理过程，对于肿瘤、糖脂代谢性疾病等众多病理过程中同样非常重要，在疾病的诊断与治疗中可能发挥关键性作用。miRNA在调控心血管系统的发育中及其病理过程中起重要作用，心肌肥厚、心脏衰竭、心肌梗死后重构和血管重塑等多种心血管疾病状态下，呈现出高度特异的miRNA表达模式。不同病理状态下，miRNA的表达谱不尽相同。肿瘤及心血管疾病等各种疾病状态下，差异表达的特异miRNA可作为生物学标记应用于各种疾病的诊断与分型。miRNA相关的疾病数据库也已经陆续建立起来。miRNA的细胞靶点与心血管疾病表型的相关性研究，阐明了新的生物学途径和病理机制。miRNA表达量的增加或减少均能引发严重的病理后果，因此稳定靶器官中相应miRNA表达水平可能成为疾病治疗的一个新思路。在生物体内使用寡核苷酸抑制剂或miRNA，改变内源性miRNA丰度，人为控制体内单个或多个miRNA水平，使得以miRNA为基础的治疗策略应用于临床成为可能。如果这些方法能够安全有效的运用于人体，将大大促进心血管疾病等人类重大疾病问题的解决。
本发明出人意料地发现miR185i在采用本发明方法/配方制备成脂质组合物时呈现优良的技术效果。
附图说明
图1：LipomiR185i的实物图。
图2：LipomiR185i的粒径分布图(A)和zeta电位图(B)。
图3：LipomiR185i的透射电镜图。
图4：LipomiR185i在血清条件下的稳定性。
本发明涉及的miR185i的序列为下述SEQ NO：1所示的核苷酸序列：
5’-UCAGGAACUGCCUUUCUCUCCA-3’(SEQ ID NO：1)
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
在以下具体实例部分，在制备脂质体时，如未另外提及，以相应量和比例的物料来列明配方，但是每次投料量以制备所得脂质体量计不少于500ml。
一、仪器和材料
旋转蒸发仪，R300，
Figure BDA0002691625080000091
Labortechnik公司，瑞士；超声波细胞破碎机，JY92-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国；马尔文粒径仪，Nano-ZS，MalvernInstruments公司，英国；小动物活体光学成像系统，IVIS Spectrum，PerkinElmer公司，美国。
1,2-二油酰基-3-三甲基丙基氯化铵(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,chloride，DOTAP，>99％)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE，>99％)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，PEG2000-DSPE，或称DSPE-PEG2000等，>99％)、其它分子量的DSPE-PEG例如DSPE-PEG1000和DSPE-PEG3000等、胆固醇(Chol，>99％)均购自A.V.T.公司(上海)；人microRNA185抑制剂5’-UCAGGAACUGCCUUUCUCUCCA-3’，miR185i)、人microRNA185抑制剂-3’-Cy5(miR185i-Cy5)由广州RiboBio公司提供；琼脂糖购自基因科技公司(上海)。
Balb/c裸鼠(雌性，18-20g)购自AniKeeper公司(北京)，动物安置在北京协和医学院医药生物技术研究所实验动物房饲养的特定的无病原体动物设施中，可以自由摄取食物和水(SPF级，22℃，55％湿度，12小时白天/黑夜)，所有动物实验均经医药生物技术研究所动物护理与使用委员会批准[许可证号：SYXK(京)2017-0023]。
二、制备脂质体的实施例部分
实施例1：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.5mg
DOTAP： 3.5mg
DOPE： 4mg
胆固醇： 2mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 1.4mg
5％葡萄糖溶液： 1.5mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体，呈混悬液状态。其可称为LipomiR185i或miR185i荷载脂质体，或者类似的称谓。
另外，参照实施例1的方法，不同的是(a)miR185i添加量为0、(b)miR185i改用miR185i-Cy5，分别得到(a)空白脂质体、(b)Cy5标记miR185i脂质体，后者可称为LipomiR185i-Cy5，或者类似的称谓，其用于相关的试验。
实施例2：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.2mg
DOTAP： 5.7mg
DOPE： 1.5mg
胆固醇： 3.2mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 0.5mg
5％葡萄糖溶液： 1.5mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体。
实施例3：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.8mg
DOTAP： 1.5mg
DOPE： 6.2mg
胆固醇： 0.8mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 2.5mg
5％葡萄糖溶液： 1.5mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体。
实施例4：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.4mg
DOTAP： 4.5mg
DOPE： 2.5mg
胆固醇： 2.5mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 2mg
5％葡萄糖溶液： 1.5mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体。
实施例5：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.6mg
DOTAP： 2.5mg
DOPE： 5mg
胆固醇： 1.5mg
DSPE-PEG<sub>2000</sub>： 2mg
5％葡萄糖溶液： 1.5mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体。
实施例6：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.5mg
DOTAP： 3mg
DOPE： 4mg
胆固醇： 2mg
DSPE-PEG<sub>1000</sub>： 1.5mg
5％葡萄糖溶液： 1mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体。
实施例7：制备miR185i脂质体
处方：
miR185i： 0.5mg
DOTAP： 3.5mg
DOPE： 4mg
胆固醇： 2mg
DSPE-PEG<sub>3000</sub>： 1.5mg
5％葡萄糖溶液： 2mL
制备方法：
精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用5％葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100～250nm的范围(探头超声5min，功率130w，超声2s，间歇2s)，得到miR185i脂质体。
实施例8：制备miR185i脂质体
参照实施例1进行，不同的仅是将其中所添加的5％葡萄糖溶液更换为等体积的水，得到miR185i脂质体。
三、考察脂质体的试验例部分
试验例1：脂质体结构表征
采用Zetasizer Nano-ZS仪，在25℃下动态光散射法(DLS)测量了LipomiR185i的平均粒径和zeta电位。用透射电镜(TEM)观察LipomiR185i的形态。具体地说，将5μL的LipomiR185i悬浮液添加到覆碳铜板栅(200目)上，保持1分钟后用滤纸吸干，使LipomiR185i与碳膜结合，用5μL 1％醋酸铀染色1min，用1％醋酸铀洗涤两次，室温下自然干燥。透射电镜(TEM)成像是在JEM-1400plus显微镜下(日本东京)在100千伏电压下获得的。
结果显示，实施例1的LipomiR185i外观均匀、带有淡蓝色乳光(典型的样品结果如图1所示)；粒径(162±13nm)，zeta电位(11.2±3.1mV)，粒径分布窄、粒径适中、zeta电位适宜(典型的样品结果如图2所示)；在透射电镜下，LipomiR185i为类球形纳米囊泡，具有双层膜结构(典型的样品结果如图3所示)。TEM测得的尺寸与DLS测量的结果一致。以上结果表明，成功地制备了粒径分布窄、粒径适中、zeta电位适宜的LipomiR185i。
另经测定，实施例2～8所得miR185i脂质体的粒径均值均在138～184nm范围内，实施例2～8所得miR185i脂质体的zeta电位均值均在9.7～12.6mV范围内，并且这些脂质体的粒度分布均相当窄。
试验例2：miR185i脂质体包封率的测定
采用琼脂糖凝胶电泳法测定miR185i脂质体的包封率。
结果：miR185i在载药孔中沿电泳方向在凝胶中快速前进，检出miR185i信号；而实施例1脂质体中miR185i则被卡住，难以向前移动，miR185i信号检测量小，经计算，实施例1脂质体的包封率为92.6％。
为了验证miR185i真实被包裹在脂质体中且未被破坏，在miR185i脂质体(10μL)中加入10％的Triton X-100(v/v，2μL)对脂质体进行破乳，使miR185i从脂质体中释放出来，然后检测miR185i信号，将信号强度与理论加样量信号强度比较以计算回收率，结果回收率为99.6％，表明miR185i确实被装载在脂质体中，并且没有降解。
另经测定，实施例2～8所得miR185i脂质体的包封率均在89～94％范围内。
试验例3：LipomiR185i的血清稳定性
裸RNA在血浆中不稳定，因为它被核酸酶快速降解[Whitehead,K.A.；Langer,R.；Anderson,D.G.Knocking Down Barriers:Advances in siRNA Delivery.Nat.Rev.DrugDiscovery 2009,8,129–138]。为评价LipomiR185i对核酸酶的稳定性，将LipomiR185i与50％胎牛血清在37℃孵育适时，同时以miR185i为对照，然后用琼脂糖凝胶电泳分析。用Image Lab软件对得到的谱带强度进行量化。实施例1脂质体的典型样品的电泳条带结果如图4所示，图中显示电泳条带。结果显示，miR185i组产生的条带强度在8h内急剧下降，而LipomiR185i组在孵育4、8、12、24和48h时显著增强。结果表明，LipomiR185i能显著提高miR185i的血清稳定性。对于每一试验谱带，以其0h信号强度为100％，计算其8h相对于其0h信号强度的百分数作为残余率(即，残余率＝(8h信号强度÷0h信号强度)×100％)，其值越接近100％表示RNA在血浆中的稳定性越好，结果显示，miR185i的残余率为18.4％，实施例1脂质体的残余率为64.8％，表明本发明脂质体可以大大提高miR185i抵御核酸酶降解的稳定性。
另经测定，实施例2～8所得miR185i脂质体的残余率均在63～66％范围内。
试验例4、LipomiR185i在体内的分布
鉴于肝脏是胆固醇代谢的主要器官，miR185i在胆固醇清除中起着至关重要的作用，因此miR185i在肝脏中的大量积累是可以预料的。为了确定LipomiR185i在体内的肝脏传递效率，我们用Cy5探针标记miR185i，并与主要富集于膀胱的miR185i-Cy5进行了比较，LipomiR185i-Cy5的荧光信号最好积聚在miR185i调节胆固醇代谢的肝脏中。
为了进一步观察LipomiR185i-Cy5在肝脏中的滞留水平，在正常喂养7天后，取供活体显像的器官处死小鼠。在体外荧光检测中观察到与上述体内一致的结果。即：168小时活体成像之后再正常喂养7天后的脑、心、肺、脾基本未检测到荧光信号，miR185i-Cy5组和LipomiR185i-Cy5组肾脏的荧光信号基本相同，miR185i-Cy5组肝脏检测到微弱的荧光信号但是LipomiR185i-Cy5组肝脏的荧光信号非常弱，显示LipomiR185i-Cy5在肝脏中的荧光强度远强于miR185i-Cy5。
进一步对小鼠肝脏荧光信号进行定量分析，结果显示LipomiR185i-Cy5组肝脏荧光强度在4h达到最大值，并维持到168h，在1h～168h的不同对应时间点远强于miR185i-Cy5组，对于miR185i-Cy5组或LipomiR185i-Cy5组的荧光强度-时间曲线，分别计算其在1h～168h期间的曲线下面积，以下式计算脂质体miR185i肝脏累积率：
脂质体miR185i肝脏累积率＝(LipomiR185i-Cy5组曲线下面积÷miR185i-Cy5组曲线下面积)×100％
本发明实施例1脂质体miR185i肝脏累积率463.7％，表明脂质体有助于提高miR185i在肝脏中的积累。
另经测定，实施例2～8所得miR185i脂质体的肝脏累积率均在427～478％范围内。
试验例4：LipomiR185i的体内安全性
通过组织病理学分析评价LipomiR185i在体内的毒性。Balb/c裸鼠(雌性，6～7周，18～20g)静脉注射实施例1的LipomiR185i脂质体14mg/kg，7d一次，共2次。治疗7天和14天后处死小鼠。收集器官(心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠和骨髓)，然后在10％福尔马林中固定48小时，包埋于石蜡块中，切片并用H&E染色[Sullivan-Brown,J.；Bisher,M.E.；Burdine,R.D.Embedding,serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4resin.Nat.Protoc.2011,6,46-55]，随后在显微镜下观察。组织病理学观察LipomiR185i在体内的安全性。给药后第7天(14mg/kg，7d×1)和14d(14mg/kg，7d×2)对小鼠进行完全尸检。观察8个主要器官的组织学分析，显示LipomiR185i组小鼠各脏器组织学形态正常，无明显组织损伤，尤其是肝脏；具体地说，对于8个器官的每一个，其对照组、LipomiR185i于7天、LipomiR185i于14天三个样品的镜下视野基本一致，组织学形态均正常，无明显差异，且无明显组织损伤。结果表明，在实验条件下，实施例1的LipomiR185i在小鼠体内是相对安全的。
另经测定，实施例2～8所得miR185i脂质体的体内安全性与实施例1脂质体的结果基本相同。
需要说明的是，本发明制备脂质体的方法是经典方法，在本发明配方组成规定下，其它制备方法亦将是适用的。
试验例5：制备冷冻干燥型的脂质体
使实施例1～8所制得的七种混悬液型脂质体采用经典的冷冻干燥工艺除去水(使含水量降至2％以下)，得到冷冻干燥粉末状态的组合物(可将其称为冻干粉X)，使补充试验B所制得的七种混悬液型脂质体采用经典的冷冻干燥工艺除去水(使含水量降至2％以下)，得到冷冻干燥粉末状态的组合物(可将其称为冻干粉B)。
将冻干粉A和冻干粉B加注射用水复溶至其冷冻干燥前的体积，可以重新获得外观均匀、带有淡蓝色乳光的脂质体混悬液；接着使此脂质体混悬液照试验例1～3的方法测定它们的各项性能，结果：冻干粉A所得脂质体混悬液测得的粒径均值均在144～181nm范围内、zeta电位均值均在9.3～12.1mV范围内、包封率均在88～95％范围内、血清稳定性试验残余率均在62～66％范围内、肝脏累积率均在443～490％范围内，显示它们与实施例1～8的结果基本相同；冻干粉B所得脂质体混悬液测得的粒径均值均在138～184nm范围内、zeta电位均值均在9.9～12.6mV范围内、包封率均在90～96％范围内、血清稳定性试验残余率均在84～88％范围内、肝脏累积率均在458～507％范围内。这些结果表明本发明所得脂质体经冷冻干燥后依然呈现优良性能。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
序列表
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> miRNA185抑制剂的脂质体及其制法
<130> Y20044-SJS2003
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ucaggaacug ccuuucucuc ca 22

Claims (15)

1.一种脂质药物组合物，其包含：0.2~1重量份miR185i、1~6重量份DOTAP、1~7重量份DOPE、0.5~4重量份胆固醇、0.5~3重量份DSPE-PEG、0.1~0.3重量份门冬酰胺、3~5重量份果糖、50~100重量份葡萄糖；所述miR185i是具有如下序列所示的miR185抑制剂：5’-UCAGGAACUGCCUUUCUCUCCA-3’。
2.根据权利要求1的脂质药物组合物，其中所述DSPE-PEG所结合的PEG其分子量范围为1000~3000。
3.根据权利要求1的脂质药物组合物，其包含：0.2~0.9重量份miR185i、1.4~5.8重量份DOTAP、1.5~6.5重量份DOPE、0.7~3.2重量份胆固醇、0.5~2.5重量份DSPE-PEG、0.1~0.3重量份门冬酰胺、3~5重量份果糖、60~80重量份葡萄糖。
4.根据权利要求1的脂质药物组合物，其包含：0.2~0.85重量份miR185i、1.4~5.8重量份DOTAP、1.5~6重量份DOPE、0.8~3.2重量份胆固醇、0.5~2.2重量份DSPE-PEG、0.1~0.3重量份门冬酰胺、3~5重量份果糖、70~80重量份葡萄糖。
5.根据权利要求1的脂质药物组合物，其是冷冻干燥粉末。
6.根据权利要求5的脂质药物组合物，该冷冻干燥粉末中的水分含量小于5%。
7.根据权利要求5的脂质药物组合物，该冷冻干燥粉末中的水分含量小于3%。
8.根据权利要求5的脂质药物组合物，该冷冻干燥粉末中的水分含量小于2%。
9.根据权利要求1的脂质药物组合物，其中还包含水。
10.根据权利要求9的脂质药物组合物，水的量是使得其中固形物浓度在3~20%范围内。
11.根据权利要求9的脂质药物组合物，水的量是使得其中固形物浓度在4~15%范围内。
12.根据权利要求9的脂质药物组合物，水的量是使得其中固形物浓度在4~10%范围内。
13.根据权利要求1的脂质药物组合物，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.5mg，DOTAP：3.5mg，DOPE：4mg，胆固醇：2mg，DSPE-PEG2000：1.4mg，门冬酰胺：0.2mg，果糖：5mg，葡萄糖：0或75mg，水：0或1.5mL；或者，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.2mg，DOTAP：5.7mg，DOPE：1.5mg，胆固醇：3.2mg，DSPE-PEG2000：0.5mg，门冬酰胺：0.1mg，果糖：7mg，葡萄糖：0或75mg，水：0或1.5mL；或者，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.8mg，DOTAP：1.5mg，DOPE：6.2mg，胆固醇：0.8mg，DSPE-PEG2000：2.5mg，门冬酰胺：0.3mg，果糖：3mg，葡萄糖：0或75mg，水：0或1.5mL；或者，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.4mg，DOTAP：4.5mg，DOPE：2.5mg，胆固醇：2.5mg，DSPE-PEG2000：2mg，门冬酰胺：0.15mg，果糖：5mg，葡萄糖：0或75mg，水：0或1.5mL；或者，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.6mg，DOTAP：2.5mg，DOPE：5mg，胆固醇：1.5mg，DSPE-PEG2000：2mg，门冬酰胺：0.25mg，果糖：5mg，葡萄糖：0或75mg，水：0或1.5mL；或者，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.5mg，DOTAP：3mg，DOPE：4mg，胆固醇：2mg，DSPE-PEG1000：1.5mg，门冬酰胺：0.2mg，果糖：5mg，葡萄糖：0或50mg，水：0或1mL；或者，其中包含如下比例的组份：
miR185i：0.5mg，DOTAP：3.5mg，DOPE：4mg，胆固醇：2mg，DSPE-PEG3000：1.5mg，门冬酰胺：0.2mg，果糖：5mg，葡萄糖：0或100mg，水：0或2mL。
14.根据权利要求1的脂质药物组合物，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG、门冬酰胺、果糖和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用水或者5%葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100~250nm的范围，得到脂质体混悬液；任选地对该混悬液冷冻干燥以除去水分，得到冷冻干粉末。
15.制备权利要求1~14任一项所述脂质药物组合物的方法，其包括如下步骤：精密称取处方量的DOTAP、DOPE、DSPE-PEG、门冬酰胺、果糖和胆固醇，加氯仿溶解，旋转蒸发去除有机溶剂，形成均匀薄膜；用水或者5%葡萄糖溶液溶解miR185i得溶液，用miR185i溶液水化脂膜，在冰浴中，探头超声处理至平均粒径100~250nm的范围，得到脂质体混悬液；任选地对该混悬液冷冻干燥以除去水分，得到冷冻干粉末。
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