CN110680804A - 递送siRNA药物的阳离子脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：包含如下组分：DOTAP、HSPC、DOPE、Chol和DSPE‑PEG2000，各组分的重量比例为DOTAP：HSPC：DOPE：Chol：DSPE‑PEG2000=60：68：64：89‑X：X，其中，X=35~45。经发明人试验发现，本发明制备的递送siRNA药物的阳离子脂质体，转染效果好，能使siRNA高比率快速到达靶部位发挥作用，脂质体与siRNA结合牢固，在血液中不易降解，且作为药物在放置过程稳定性好，毒副作用低。

Description

递送siRNA药物的阳离子脂质体及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种递送siRNA药物的阳离子脂质体。
背景技术
小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)是双链的小分子核酸，在转录后发挥基因沉默作用，可特异性抑制疾病相关靶基因的mRNA的表达从而发挥治疗效果。随着siRNA生物学机制的阐明和siRNA合成方法的快速发展，绝大多数的基因可通过siRNA技术进行沉默，以弥补小分子药物的不足。目前，已有多个 siRNA 药物进入不同阶段的临床实验。但是，siRNA体内应用存在着如下的难题：siRNA注射给药后血液中的稳定性差，体内滞留时间短，细胞摄取效率低，缺少细胞内溶酶体的逃逸能力等。
脂质体是由一层或者多层的磷脂双分子层组成的封闭的囊泡状结构。当磷脂膜分散在过量的水中即可形成此结构。脂质体具有很高的生物相容性和生物可降解性，因此它可以被用来递送多种活性成分，包括化疗药物、反义寡核苷酸、DNA、siRNA、抗原和蛋白质。脂质体的内部与外部均为亲水相，磷脂双分子层中为亲油相，药物可根据其极性包裹于磷脂双分子中或内外水相中。目前已经有七种以脂质体作为载体的药物经FDA批准进入临床中应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子脂质体，其与siRNA混合后可包载siRNA，并以较高的转染率向体内的细胞中递送siRNA，并可避免siRNA在转染前在体内被降解。
本发明提供的技术方案如下：
一种递送siRNA药物的阳离子脂质体，其包含如下组分：DOTAP、HSPC、DOPE、Chol和DSPE-PEG2000，各组分的重量比例为DOTAP：HSPC：DOPE：Chol：DSPE-PEG2000 = 60：68：64：89-X：X，其中，X=35~45。
本领域技术人员熟知，DOTAP是指(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、HSPC是指氢化大豆卵磷脂、Chol是指胆固醇、DOPE是指二油酰磷脂酰乙醇胺、DSPE-PEG2000是指二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
进一步地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述阳离子脂质体粒径为100~150nm。
进一步优选地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述阳离子脂质体粒径为110~130nm。
进一步地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述阳离子脂质体Zeta电位为50~70 mV。
优选地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所包含的各组分的比例为：各组分的重量比例为DOTAP：HSPC：DOPE：Chol：DSPE-PEG2000 = 60：68：64：50：39。
进一步地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其由以下方法制备而成：
称取所述DOTAP、HSPC、Chol、DSPE-PEG2000和DOPE，溶于混合有机溶剂中，40~45℃减压旋转蒸发2~4h除去有机溶剂，加入纯水60℃水浴下水化40~55 min，冰浴条件下超声处理脂质体10 min，通过挤出器挤出200 nm膜5~15次得到的阳离子脂质体。
进一步地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中所述混合有机溶剂为氯仿和甲醇按体积比4：1混合制成。
优选地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中减压旋转蒸发的温度为42℃，旋转蒸发时间为2h。
优选地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中水浴下水化时间为45min。
优选地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中所述超声条件为100W，工作1 s和间隔1 s重复进行。
优选地，本发明所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中通过挤出器挤出200 nm膜15次得到的阳离子脂质体。
本发明能实现的技术效果为：
阳离子脂质DOTAP可与带负电荷的无义siRNA通过静电作用形成脂质体／siRNA复合物，具有高效的体外转染效率。同时复合物也易于与带负电荷的细胞表面结合，有利于将siRNA通过细胞膜融合或者受体介导的胞吞作用递送入细胞内。
DOPE可以帮助转染，其与DOTAP产生协同作用，加入DOPE可进一步提高转染效率。
加入HSPC和胆固醇可增加脂质体的磷脂膜的刚性，提高脂质体的稳定性，同时使得siRNA与脂质体结合的更加牢固，从而提高转染效率。
DSPE-PEG2000可以为脂质体提供保护，减少脂质体与血清中的物质结合，防止siRNA/载体被血液中的血浆蛋白所吸附，提高载体在体内的循环时间。但是DSPE-PEG2000的加入对脂质体粒径、PDI和Zeta电位产生较大影响，从而影响转染效率，因此发明人对配方进行了优化，得到了即能保持高效转染，又能在血浆中保持稳定的siRNA脂质体载体。
经发明人试验发现，本发明制备的递送siRNA药物的阳离子脂质体，转染效果好，能使siRNA高比率快速到达靶部位发挥作用，脂质体与siRNA结合牢固，在血液中不易降解，且作为药物在放置过程稳定性好，毒副作用低。本发明脂质体为100~150nm，优选为110~130nm，根据EPR效应，脂质体的粒径在200 nm以下，才能保证脂质体能更好的进入肿瘤部位，使siRNA发挥治疗作用，本发明脂质体Zeta电位为50~70 mV，电位过小，不利于脂质体通过静电吸附作用吸附基因（RNA或者质粒），电位过大，会引起较大的细胞毒性，产生较大的副作用。
附图说明
图1 实施例1阳离子脂质体的粒度分布图；
图2 实施例1阳离子脂质体透射电镜图；
图3 实施例1阳离子脂质体4℃储存2周粒径和Zeta电位图。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：阳离子脂质体的制备
精密称取6.0 mg DOTAP，6.8 mg HSPC，5.0 mg Chol，3.9 mg DSPE-PEG2000和6.4 mgDOPE溶于混合有机溶剂（8 mL氯仿，2 mL甲醇），水浴超声2 min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2 h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0 mL超纯水60℃水浴下水化45 min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10 min（100 W，工作1 s，间隔1 s），通过挤出器挤出200 nm膜15次得到最终的阳离子脂质体。
实施例2：阳离子脂质体的制备
精密称取6.0 mg DOTAP，6.8 mg HSPC，5.4 mg Chol，3.5 mg DSPE-PEG2000和6.4 mgDOPE溶于混合有机溶剂（8 mL氯仿，2 mL甲醇），水浴超声2 min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2 h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0 mL超纯水60℃水浴下水化45 min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10 min（100 W，工作1 s，间隔1 s），通过挤出器挤出200 nm膜15次得到最终的阳离子脂质体。
实施例3：阳离子脂质体的制备
精密称取6.0 mg DOTAP，6.8 mg HSPC，4.4 mg Chol，4.5 mg DSPE-PEG2000和6.4 mgDOPE溶于混合有机溶剂（8 mL氯仿，2 mL甲醇），水浴超声2 min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2 h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0 mL超纯水60℃水浴下水化45 min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10 min（100 W，工作1 s，间隔1 s），通过挤出器挤出200 nm膜15次得到最终的阳离子脂质体。
对比例1：
称取8.9 mg Chol，0 mg DSPE-PEG2000，其他操作同实施例1。
对比例2：
称取6.4 mg Chol，2.5 mg DSPE-PEG2000，其他操作同实施例1。
对比例3：
称取3.4 mg Chol，5.5 mg DSPE-PEG2000，其他操作同实施例1。
实施例4：阳离子脂质体的制备
精密称取6.0 mg DOTAP，6.8 mg HSPC，5.0 mg Chol，3.9 mg DSPE-PEG2000和6.4 mgDOPE溶于混合有机溶剂（8 mL氯仿，2 mL甲醇），水浴超声2 min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2 h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0 mL超纯水60℃水浴下水化45 min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10 min（100 W，工作1 s，间隔1 s），通过挤出器挤出200 nm膜5次得到最终的阳离子脂质体。
实施例5：阳离子脂质体的粒径及表面电位(Zeta potential)的测定
将实施例1~3、对比例1~3阳离子脂质体用超纯水稀释10倍后，采用马尔文粒度仪NanoZS90测定其粒径分布（实施例1脂质体粒径分布见附图1）及其表面电位，结果见表1：
表1 不同Chol和Dspe-PEG2000质量比对脂质体粒径、电位及PDI影响
Figure 569298DEST_PATH_IMAGE001
从表1中可以发现，当阳离子脂质体修饰PEG之后，粒径会变小，这是因为DSPE-PEG2000的增加了整个脂质体的压缩性。随着DSPE-PEG2000的含量增加，PDI减小，同时，PEG屏蔽了表面的正电荷，导致Zeta电位减小。PDI小于0.2的脂质体具有更好的分散性，Zeta电位大于50mV更有利于吸附负电荷的siRNA药物。因此，我们选取Chol：DSPE-PEG2000=89-X：X，其中，X=35~45。
注：PDI（polydispersity index）为多分散系数，是由累积距法得到的一个无纲量的值，代表的是粒子尺寸的分布宽度。由DSL测得的值大小在0-1之间，PDI值越小，表明样品的粒子尺寸分布越狭窄。
实施例6：阳离子脂质体透射电镜（TEM）检测
利用透射电镜负染技术，对制备好的脂质体进行透射电镜检测，目的是观察实施例1所制备脂质体的形态。
结果如附图2所示，观察到所制备的脂质体外观呈圆球形，通过对脂质体颗粒半高宽的测量，结果得到脂质体粒径大约为110~130 nm。
实施例7：阳离子脂质体的体外稳定性考察
将实施例1制备的阳离子脂质体保存在4℃冰箱中保存，在两周内每隔一定时间取出，用超纯水稀释10倍后测定其粒径和Zeta电位，结果如表2所示，说明实施例1阳离子脂质体在2周内粒径和电位没有发生明显的变化，表明其在4℃下的保存稳定性较好，如附图3所示。
表2 实施例1脂质体稳定性考察
Figure 323627DEST_PATH_IMAGE002
实施例8：细胞摄取实验
实验组为脂质体组，将AGS细胞（小鼠胃癌细胞）按照300000个细胞每孔的密度接种于12孔板，每孔添加2 mL含10%胎牛血清和1%双抗（耐氨苄青霉素和卡那霉素）的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2条件培养箱培养24 h后，弃去培养基，用PBS清洗两次，每孔加入10 µLFam-siRNA（浓度：0.008 OD/µL，序列（5’-3’）为：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ）和30 µL实施例1制备的阳离子脂质体，补充1%双抗的RPMI 1640培养基至2 mL，继续在培养箱中培养1 h、4h、6 h后吸去培养液，用预冷的PBS洗两次，采用2 mL 4%的多聚甲醛固定20 min，加入2 mLHoechst 33258细胞核染料（2 μg/mL），室温孵育10 min，冰PBS润洗五次，在荧光显微镜下观察并拍照。另一组为空白对照组，以无脂质体载体的siRNA在其他条件相同情况下进行转染。
FAM-siRNA在激发的条件下，FAM基团能够发出绿色荧光，用Hoechst 33258细胞核染料，使得细胞核在激发的条件下，细胞核显示为蓝色。我们选取转染后1 h、4 h、 6 h为观察时间点，观察绿色荧光和蓝色荧光的表达情况。在每个时间点，采用相同的条件在显微镜下拍照，利用ImageJ定量每个时间点的绿色荧光和蓝色荧光的荧光强度，绿色荧光强度用Fam-siRNA表示，蓝色荧光用Hochest表示。检测结果如表3：
表3 细胞摄取试验检测结果（光密度值）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Hochest的荧光强度在上述3个时间点变化不大，代表选取的拍照区域细胞数目基本无变化。Fam-siRNA的荧光强度，随着时间的推移显著上升，4h和6h相对于1h的荧光信号分别上升到3.6倍和5.7倍，说明绿色荧光代表的FAM-siRNA随脂质体穿过细胞膜进入细胞内部，随时间推移，进入细胞内部的比例增加。以上说明说明包载FAM-siRNA的阳离子脂质体能被细胞所摄取，并且具有较高的转染效率。
实施例9：转染效果试验
为验证本发明的脂质体转染效果，我们选取了Keratin 17（KRT17）作为靶基因，利用本发明的实施例1制备的脂质体，向胃癌细胞系AGS细胞中转染一条针对KRT17的siRNA，5’-3’方向的序列为：CGUCAGGUGCGUACCAUUG，对照siRNA的序列为：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。
在siRNA转染AGS细胞24h后，利用实时定量PCR的方法，检测了AGS细胞中KRT17mRNA的相对表达量。具体方法如下：
1、细胞RNA的提取及cDNA的逆转录
吸去AGS细胞培养液，并用PBS缓冲液清洗后，用Trizol（Invitrogen, Carlsbad, CA,USA）裂解细胞。按1ml Trizol加入0.2ml氯仿的量加入适量氯仿，震荡混匀，冰上静置15min后12,000rpm，4℃离心15min。取上层水相（约0.5ml）于新的RNAase-free的1.5mlEP管中，加等体积异丙醇混匀，于-20℃静置30min以沉淀RNA，12,000rpm，4℃离心15min。弃上清，沉淀的RNA用1ml预冷75%乙醇洗一遍，于室温晾干后加入适量DEPC水溶解。用分光光度计检测充分溶解的RNA在260nm处光吸收值，以确定RNA的含量及纯度。取适量提取的总RNA，利用RNA快速逆转录试剂盒（Takara,Japan）逆转录成cDNA。逆转录的cDNA通过RT-PCR仪（Roche,Switzerland）检测相关基因mRNA的相对表达量。
2、qPCR检测
1)反应体系为20μl，10μl YBRmix（Takara，Japan），1μl cDNA，1μl引物，8μl超纯水。
2)反应在RocheLight Cycler480或Rotorgene2000仪器上进行。
3)反应条件为：95℃，2min，94℃，30s，60℃，1min，共40个循环，PCR结束后自动进入熔解曲线分析，以确定PCR产物的特异性。
4）数据分析：采用ΔΔCT法分析KRT17 mRNA在AGS细胞中的表达情况。
与对照siRNA相比，KRT17 siRNA能够显著降低，结果见表4：
表4 转染效果试验数据
Figure 787287DEST_PATH_IMAGE004
实施例10：空白阳离子脂质体毒性考察
将对数生长期的AGS细胞以 1×104 cells/孔的密度接种到 96 孔细胞培养板中，培养 24 h 后，加入系列不同浓度的空白阳离子脂质体溶液（以不含血清的培养基进行稀释，并过0.45 μm水膜除菌），平行操作三份。常规培养条件下避光孵育48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续孵育1 h，并用酶标仪检测其吸光度值(A)。
结果见表5：
表5 阳离子脂质体毒性考察数据
Figure 748289DEST_PATH_IMAGE005
从结果可见，空白阳离子脂质体对AGS细胞显示出一定的细胞毒性，这是由于脂质体表面的正电荷增加了细胞膜的通透性，使培养液中的双抗被细胞摄取，产生细胞毒性，是使用阳离子脂质体不可避免的问题。在最高浓度1000μg/mL条件下孵育48 h后，细胞生存率大约在80%左右。而在50μg/mL和10μg/mL的浓度条件下孵育48 h后，细胞生存率分别为95%和100%。根据上述数据，我们认为在浓度50μg/mL以下，载体对细胞的影响可控，有比较高的安全性。

Claims (10)

1. 一种递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：包含如下组分：DOTAP、HSPC、DOPE、Chol和DSPE-PEG2000，各组分的重量比例为DOTAP：HSPC：DOPE：Chol：DSPE-PEG2000 =60：68：64：89-X：X，其中，X=35~45。
2.根据权利要求1所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：粒径为110~150nm。
3.根据权利要求2所述的递送siRNA的阳离子脂质体，其特征在于：所述阳离子脂质体粒径为120~130nm。
4. 根据权利要求1或2所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：所述阳离子脂质体Zeta电位为50~70 mV。
5. 根据权利要求1~4中任一项所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：各组分的重量比例为DOTAP：HSPC：DOPE：Chol：DSPE-PEG2000 = 60：68：64：50：39。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于其由以下方法制备而成：
称取所述DOTAP、HSPC、Chol、DSPE-PEG2000和DOPE，溶于混合有机溶剂中，40~45℃减压旋转蒸发2~4h除去有机溶剂，加入纯水60℃水浴下水化40~55 min，冰浴条件下超声处理脂质体10 min，通过挤出器挤出200 nm膜5~15次得到的阳离子脂质体。
7.根据权利要求6所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：所述制备方法中所述混合有机溶剂为氯仿和甲醇按体积比4：1混合制成。
8.根据权利要求6所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：所述制备方法中减压旋转蒸发的温度为42℃。
9.根据权利要求6所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：所述制备方法中水浴下水化时间为45min。
10. 根据权利要求6所述的递送siRNA药物的阳离子脂质体，其特征在于：所述超声条件为100W，工作1 s和间隔1 s重复进行。
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