CN110755382A - 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110755382A
CN110755382A CN201911116618.3A CN201911116618A CN110755382A CN 110755382 A CN110755382 A CN 110755382A CN 201911116618 A CN201911116618 A CN 201911116618A CN 110755382 A CN110755382 A CN 110755382A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
nucleic acid
hyaluronic acid
propane
cationic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911116618.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110755382B (zh
Inventor
姚红娟
李亮
宋文凭
周晓菲
李睿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Original Assignee
Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS filed Critical Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority to CN201911116618.3A priority Critical patent/CN110755382B/zh
Publication of CN110755382A publication Critical patent/CN110755382A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110755382B publication Critical patent/CN110755382B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途。所述靶向性核酸药物包含氨基脂质‑透明质酸偶联物、阳离子脂质体以及含有鱼精蛋白、硫酸软骨素和核酸药物的复合物，其中所述氨基脂质‑透明质酸偶联物的氨基脂质部分与阳离子脂质体结合，并且所述阳离子脂质体包裹所述复合物。所述靶向性核酸药物通过特异性阻断细胞自我增殖分化的Hedgehog信号转导通路，抑制癌细胞的自我更新和迁移侵袭，诱导细胞凋亡，能够有效抑制肿瘤的复发。

Description

一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，尤其涉及一种透明质酸修饰的靶向性 药物及其制备方法和用途。
背景技术
近几年，国内外一些研究者采用脂质体或纳米粒包载抗肿瘤干细胞药 物，使得抗肿瘤干细胞药物在肿瘤组织的蓄积增加(参见Liu Y,Lu WL, Guo J,et al.A potentialtarget associated with both cancer and cancer stem cells:A combinationtherapy for eradication of breast cancer using vinorelbine stealthy liposomesplus parthenolide stealthy liposomes.J.Control Release, 2008,129(1):18-25；LiRJ,Ying X,Zhang Y,et al.All-trans retinoic acid stealth liposomes prevent therelapse of breast cancer arising from the cancer stem cells.J.ControlRelease,2011,149:281-291)。然而，由于这些脂质体 或纳米粒对肿瘤细胞，尤其是肿瘤干细胞缺乏特异性，这种蓄积并不能保 证抗肿瘤细胞药物有效地到达肿瘤干细胞内部。
透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)是由两个双糖单位D-葡萄糖醛 酸及N-乙酰葡糖胺组成的一种酸性粘多糖，其广泛分布于软结缔组织细胞 外基质中，在皮肤、肺和肠中含量较高。由于透明质酸具有粘弹性、生物 相容性、润滑性、可降解性以及特殊保水作用，细胞毒性小，因而被广泛 运用在生物医药、食品以及高级化妆品等领域。但是由于透明质酸具有较 强的亲水性、易降解等性质，其运用受到了限制。因此，往往需要对透明 质酸进行疏水改性，以扩展其应用范围。中国发明专利申请CN105199012A 公开了一种基于疏水改性透明质酸自组装胶体的胶体颗粒剂，其利用疏水 改性的透明质酸，使得该胶体颗粒具有良好的乳化特性、生物相容性以及 光响应性，然而该胶体颗粒不能实现药物的靶向输递。
中国发明专利申请CN106552268A公开了一种靶向性碳纳米管药物输 送系统，实现抗肿瘤药物向耐药肿瘤细胞内的输递。然而，碳纳米管存在
基于这些存在的问题，有必要构建一种新型的肿瘤细胞靶向性药物输 送系统，实现抗肿瘤细胞药物或基因向肿瘤细胞内的高效输递。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明采用CD44的天然配体 透明质酸作为靶向分子，构建一种新型的细胞靶向性核酸药物，其特异性 地结合细胞膜上的CD44标志物来实现对细胞的主动靶向，其目的是提供 一种毒性小、生物相容性好且能靶向肿瘤细胞的靶向性药物输送系统。
为实现上述目的，本发明提供了一种靶向性核酸药物，其包含氨基脂 质-透明质酸偶联物、阳离子脂质体以及含有鱼精蛋白、硫酸软骨素和核酸 药物的复合物；其中，所述氨基脂质-透明质酸偶联物的氨基脂质部分与阳 离子脂质体结合，并且所述阳离子脂质体包裹所述复合物。
根据本发明所述的靶向性核酸药物，其中所述氨基脂质-透明质酸偶联 物选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DSPE-HA)偶联物、1,2-油酰基 磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DOPE-HA)偶联物、二芥酰基磷脂酰乙醇胺-透 明质酸(DEPE-HA)偶联物、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DMPE -HA)偶联物和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DPPE-HA)偶联物；
优选地，所述氨基脂质-透明质酸偶联物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-透 明质酸偶联物。
在本发明的一个实施方案中，所述阳离子脂质体包含阳离子脂质和辅 助脂。
阳离子脂质可以为本领域中熟知的可用于制备阳离子脂质体的各种 阳离子脂质。优选地，所述阳离子脂质选自：十八酰胺(SA)；溴化月桂 基三甲基铵；溴化十六烷基三甲基铵；溴化肉豆蔻基三甲基铵；溴化二甲 基二-十八铵(DDAB)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆 固醇(DC-胆固醇)；1,2-二-十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)；1,2- 二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和DOTAP衍生物，例如1,2-二-(9Z- 十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷；1,2- 二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)和DODAP衍生物， 例如1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷 和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷；1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵-丙烷 (DOTMA)；1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)和二-十八酰胺-丙氨酰基精胺中的一种或多种；
更优选地，所述阳离子脂质选自：溴化二甲基二-十八铵、1,2-二油酰 基-3-三甲基铵-丙烷、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇 和1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷中的一种或多种。
辅助脂可以为本领域中熟知的可用于制备阳离子脂质体的各种辅助 脂。优选地，所述辅助脂为1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰 磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰胆碱和(DOPC)、二芥酰基卵磷脂 和二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)中的一种或多种；更优选地，所述辅助脂 为1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺和胆固醇；优选地，所述阳离子脂质体还包含冷冻保护剂；更优选地，所述冷冻保护剂选自单糖、二糖、寡聚糖、多糖 和多元醇中的一种或多种；进一步优选地，所述冷冻保护剂为二糖；更进 一步优选地，所述冷冻保护剂为海藻糖、麦芽糖、蔗糖或乳糖；
优选地，所述阳离子脂质与辅助脂的摩尔比＝(0.1～100):1；更优选 地，所述阳离子脂质与辅助脂的摩尔比为(0.2～50):1；特别优选地，所 述阳离子脂质与辅助脂的摩尔比为(0.5～10):1；
优选地，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷与1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺的 摩尔比为1:1；
优选地，核酸药物与硫酸软骨素的质量比为1:1，核酸药物和硫酸软 骨素的混合物与鱼精蛋白的质量比为1:0.98-1.05，优选地为1:1；
优选地，由阳离子脂质和辅助脂构成的总脂材与核酸的摩尔比为 800～1600:1，更优选地为1000:1；
优选地，脂质-透明质酸偶联物与由阳离子脂质和辅助脂构成的总脂材 的摩尔百分比为1％-20％，优选为3％-7％，更优选为5％。
根据本发明所述的靶向性核酸药物，其中，所述核酸药物选自siRNA、 miRNA、寡核苷酸和反义核酸中的一种或多种；优选地，所述核酸药物为 siRNA或miRNA，更优选地，所述核酸药物为Gli1 siRNA；
优选地，所述Gli1siRNA具有如下序列：
SEQ ID NO:1正义链：5′-GGCUCAGCUUGUGUGUAAUTT-3′；
SEQ ID NO:2反义链：5′-AUUACACACAAGCUGAGCCTT-3′。
本发明还提供了一种靶向性药物组合物，其含有所述的靶向性核酸药 物，以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在本发明的一个具体实施方案中，所述脂质-透明质酸偶联物，例如二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DSPE-HA)偶联物的合成基于以下原理： HA是水溶性的，而DSPE是水难溶性的。为了实现这两种完全不同溶解 性物质间的偶联反应，本发明将钠盐形式的HA转化为TBA(四丁基铵) 盐形式的HA，这样HA-TBA就能溶于有机溶剂如DMSO中，有利于与 DSPE的偶联(如图1A所示)。然后，以三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3) 作为还原剂，利用还原胺化反应将DSPE的胺基与HA还原末端的醛基进 行单点偶联。
本发明还提供了一种靶向性核酸药物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备氨基脂质-透明质酸偶联物；
(2)制备阳离子脂质体；
(3)制备包含鱼精蛋白、硫酸软骨素和核酸药物的复合物；
(4)将步骤(2)制备的阳离子脂质体与步骤(3)制备的包含鱼精 蛋白、硫酸软骨素和核酸药物的复合物混合，制得核酸药物纳米粒；
(5)将步骤(1)制备的脂质-透明质酸偶联物与步骤(4)制备的核 酸纳米粒混合，制得靶向性核酸药物；
优选地，在步骤(1)中，通过氨基脂质与透明质酸的单点偶联反应 制备氨基脂质-透明质酸偶联物；
更优选地，所述制备氨基脂质-透明质酸偶联物包括以下步骤：透明质 酸与季铵反应形成铵盐后，在还原剂的存在下与氨基脂质通过还原胺化反 应进行偶联，然后在酸性条件下脱除季铵，得到氨基脂质-透明质酸偶联物； 进一步优选地，透明质酸、氨基脂质和还原剂的摩尔比为1:(1～5): (1～10)；优选地，所述还原胺化反应的溶剂为二甲基亚砜；
优选地，在步骤(2)中，制备阳离子脂质体的方法为超声分散法、 薄膜分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法或注入法；更优 选地，制备阳离子脂质体的方法为超声分散法、薄膜分散法或反相蒸发法；
进一步优选地，所述超声分散法包括以下步骤：
(i)将阳离子脂质和辅助脂溶于有机溶剂，通过减压旋蒸除去有机溶 剂，形成脂质薄膜；
(ii)加入葡萄糖溶液，超声水化步骤(1)获得的脂质薄膜，在超声 波细胞粉碎机中进一步破碎，依次使用0.45μm、0.22μm滤膜优选水系 滤膜过滤脂质体溶液3次，形成阳离子脂质体；和
优选地，所述超声波细胞粉碎机的工作条件为：工作时间为10s，间 歇时间为10s，全程时间为8min，保护温度为35℃，功率为200W；
(iii)任选地，将阳离子脂质体冷冻干燥，形成阳离子脂质体粉末；
优选地，在步骤(i)中，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷和甲醇中 的一种或多种；更优选地，所述有机溶剂是氯仿与甲醇的混合溶剂；优选 地，氯仿与甲醇的体积比为3:1；更优选地，以1:1的摩尔比将1,2-二油 酰基-3-三甲基铵-丙烷和1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺溶于体积比为3:1的氯仿 与甲醇的混合溶剂中，40℃下减压旋转蒸发除去有机试剂，形成脂质薄膜；
优选地，在步骤(ii)中，加入DEPC水(用焦碳酸二乙酯处理过并 经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体，下同)配制的的葡萄糖溶液， 超声水化步骤(i)获得的脂质薄膜，过0.45μm、0.22μm滤膜，利用脂 质体挤出器过聚碳酯膜，形成阳离子脂质体；更优选地，加入DEPC配制 的的质量浓度为50克/升的葡萄糖溶液，超声水化脂质薄膜，过0.45μm、 0.22μm滤膜三次，形成阳离子脂质体；
优选地，在步骤(2)中，以1:1的摩尔比将1,2-二油酰基-3-三甲基 铵-丙烷和1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺溶于体积比为3:1的氯仿与甲醇的混合 溶剂中，40℃下减压旋转蒸发除去有机试剂；加入DEPC水配制的质量浓 度为50克/升的葡萄糖溶液，超声水化脂质薄膜，利用脂质体挤出器过 0.1μm聚碳酯膜三次，形成阳离子脂质体；
优选地，在步骤(3)中，将核酸、硫酸软骨素(CS)、鱼精蛋白分别 用DEPC水配制的的葡萄糖溶液配制成储备液，将核酸储备液、硫酸软骨 素储备液和鱼精蛋白储备液混合，制得鱼精蛋白/硫酸软骨素/核酸复合物； 更优选地，将核酸、硫酸软骨素(CS)、鱼精蛋白分别用DEPC水配制的 质量浓度为50克/升的葡萄糖溶液配制成储备液，将核酸储备液、硫酸软 骨素储备液混合，得到核酸与硫酸软骨素混合物；在核酸与硫酸软骨素混 合物中加入鱼精蛋白储备液，制得鱼精蛋白/硫酸软骨素/核酸复合物。在 步骤(4)中，优选地，将步骤(2)制备的阳离子脂质体与步骤(3)制 备的鱼精蛋白/硫酸软骨素/核酸复合物混合，使得由阳离子脂质和辅助脂 构成的总脂材与核酸的摩尔比为800～1600，制得核酸纳米粒；
优选地，在步骤(5)中，将步骤(1)制备的脂质-透明质酸偶联物 (DSPE-HA)与步骤(4)制备的核酸纳米粒混合，使得DSPE-HA偶联 物与由阳离子脂质和辅助脂构成的总脂材的摩尔百分比为1％-20％，优选 为3-7％。
本发明还提供了一种所述的靶向性药物输送系统在制备预防/治疗肿 瘤或抑制肿瘤的生长、增殖、迁移或侵袭的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，所述靶向性药物输送系统或药物组合物 能够特异性靶向表达CD44细胞表面标记物的肿瘤细胞，例如胃癌、乳腺 癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性白血病细 胞等。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤为多药耐药肿瘤。
本发明还提供一种预防/治疗肿瘤或抑制肿瘤的生长、增殖、迁移或侵 袭的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的靶向性药物输送 系统或所述的药物组合物。优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动 物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、 灵长类动物；其中，特别优选的受试者为人。
本发明还提供所述的靶向性药物输送系统或所述的靶向性药物组合 物用于制备药物的用途，所述试剂用于抑制肿瘤细胞的生长、增殖、迁移 或侵袭。
本发明通过修饰的透明质酸制备得到靶向性核酸药物输送系统，避免 了细胞毒性大、靶向性不佳等问题。本发明以细胞的表面标志CD44为靶 点，以CD44的天然配体透明质酸为靶向分子，可以特异性地提高核酸药 物在细胞内的富集。在本发明的一个实施方案中，透明质酸作为靶向分子 用于构建胃癌干细胞靶向性Gli1 siRNA纳米粒，其表面上修饰的透明质酸 一方面提供对胃癌干细胞的主动靶向作用，另一方面提供纳米粒的“隐形” 作用，阻止网状内皮系统(RES)的识别和摄取，减少其体内循环时间。 靶向性Gli1 siRNA纳米粒通过特异性阻断胃癌干细胞自我增殖分化的 Hedgehog信号转导通路，抑制胃癌干细胞的自我更新能力和迁移侵袭能 力，诱导胃癌干细胞凋亡，有效抑制肿瘤的复发。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了DSPE-HA偶联物的合成与表征。
图2示出了胃癌干细胞靶向性Gli1 siRNA纳米粒的制备示意图。
图3示出了胃癌干细胞靶向性Gli1 siRNA纳米粒制备的方案筛选。其 中，图3A代表Gli1 siRNA和硫酸软骨素CS混合物的质量与鱼精蛋白的 质量比对鱼精蛋白/CS/Gli1siRNA复合物的粒径和Zeta电位的影响。图3B 代表总脂材/Gli1 siRNA摩尔比对Gli1siRNA纳米粒的粒径和Zeta电位的 影响。图3C代表总脂材/Gli1 siRNA摩尔比对细胞摄取Gli1 siRNA纳米粒 的影响。图3D代表DSPE-HA修饰率(DSPE-HA占总脂材的摩尔百分比) 对靶向性Gli1 siRNA纳米粒的粒径和Zeta电位的影响。图3E代表DSPE-HA修饰率(DSPE-HA占总脂材的摩尔百分比)对细胞摄取靶向性 Gli1 siRNA纳米粒的影响。
图4示出了胃癌干细胞靶向性Gli1 siRNA纳米粒的粒径和Zeta电位。 图4A示出通过最优方案制备的各阶段纳米粒的粒径；图4B示出通过最优 方案制备的各阶段纳米粒的zeta电位测定结果图。
图5示出了CD44+细胞和CD44-细胞内Gli1的表达。
图6示出了CD44+细胞对靶向性FAM siRNA纳米粒的摄取及 分布。其中，图6A中1.PBS；2.FAM标记的siRNA纳米粒；3.靶 向FAM标记siRNA纳米粒；4.用过量游离HA预孵育30min的靶 向FAM标记的siRNA纳米粒；图6B中，由上至下依次为游离FAM siRNA、FAM siRNA纳米粒、靶向性FAM siRNA纳米粒和靶向性 FAM siRNA纳米粒+HA。
图7示出了靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞的抑制效应。
图8示出了靶向性Gli1 siRNA纳米粒对CD44+细胞内Gli1表达量的 影响。
图9示出了靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞成球能力的影响。
图10示出了靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞迁移能力的影响。
图11示出了靶向性Gli1 siRNA纳米粒对复发肿瘤生长的抑制作用。
图12示出了各给药组处理后小鼠体重的变化
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施 例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DSPE-HA)偶联物的合 成与表征
DSPE-HA偶联物的合成路线如图1A所示。
0.2g透明质酸钠溶于20mL去离子水，在0.01M HCl中透析24h，接 着在去离子水中透析24h得到酸基形式的透明质酸。然后逐滴加入四丁基 氢氧化铵溶液，调节pH至9，室温搅拌2h。最后在去离子水中透析48h 以除去过量的四丁基氢氧化铵，冷冻干燥得到透明质酸的四丁基铵盐 (HA-TBA)。
将10μmol HA-TBA溶于8mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，60℃搅 拌至溶解，将50μmolDSPE和15μL三乙胺溶解在2mL氯仿中，二者混合 后60℃搅拌2h。接下来，100μmol NaBH(OAc)3溶于2mL无水DMSO， 逐滴加入到上述混合溶液中，60℃下搅拌反应72h，然后冷却到室温，N2吹直至除去氯仿，剩余的混合物加入到30mL去离子水中，10000g离心 30min，弃沉淀，上清液即为DSPE-HA-TBA溶液。
最后，将上清液转移到再生纤维素透析袋(截留分子量3500Da)，在 0.01M HCl中透析24h将四丁基铵盐形式的DSPE-HA转化为酸基形式的 DSPE-HA，去离子水中透析48h后冻干，得到DSPE-HA白色粉末，并使 用核磁共振氢谱(1H NMR)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行检测。
使用氢谱标准添加法对产物混合物中的DSPE-HA进行定量。由于反 应后HA上的N-乙酰基氢会保留在产物DSPE-HA上，因此其氢谱信号可 用作定量使用。将一系列已知量的HA添加到定量的反应产物中，分别进 行氢谱测量HA上的N-乙酰基氢(～2.01ppm)的峰高，得到一条随HA的 添加量线性递增的信号强度曲线。通过这条斜线对反应产物中的DSPE-HA进行定量。
图1B为HA、DSPE和DSPE-HA分子的1H NMR谱图。从图中可以 看出，还原胺化反应后，DSPE-HA分子保留了HA上的N-乙酰基氢信号 (～2.01ppm)以及DSPE烷基链上的亚甲基氢(～1.23ppm)和末端的甲基 氢(～0.77ppm)。DSPE-HA分子的收率约为82％。
图1C为HA、DSPE和DSPE-HA分子的FTIR红外谱图。从图中可 以看出，HA的特征峰为3200-3600cm-1之间的羟基振动峰和1617cm-1处的 羧基振动峰；DSPE的特征峰为1742cm-1处的羰基振动峰和2850-2918cm-1间的亚甲基振动峰。HA及DSPE分子的特征峰都可在反应产物DSPE-HA 的FTIR谱图中找到。
1H NMR和FTIR证明了DSPE-HA的成功合成。
实施例2胃癌干细胞靶向性Gli1 siRNA纳米粒的制备与表征
胃癌干细胞靶向性Gli1 siRNA纳米粒的制备过程如图2所示。
1.靶向性Gli1 siRNA纳米粒的制备
①阳离子脂质体的制备
精密称取1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-油酰基磷脂 酰乙醇胺(DOPE)(1:1，摩尔比)适量，溶解于氯仿与甲醇(3:1，体积 比)的混合溶剂中，40℃减压旋转蒸发除去有机试剂，并放置过夜进一步 除去残留有机溶剂。加入DEPC水配制的5％葡萄糖溶液，超声水化脂质 薄膜，然后于超声波细胞粉碎机中进一步破碎(设置工作时间为10s，间 歇时间为10s，全程时间为8min，保护温度为35℃，功率为200W)，依 次使用0.45μm、0.22μm滤膜过滤脂质体溶液三次，得空白脂质体，4℃ 冷藏备用。
制备阳离子脂质体的1,2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、1,2- 油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)两种脂材量的总和构成了总脂材。
②鱼精蛋白/硫酸软骨素/Gli1 siRNA复合物的制备
Gli1siRNA，其由上海吉玛制药技术有限公司合成，并具有如下序列：
SEQ ID NO:1正义链：5′-GGCUCAGCUU GUGUGUAAUTT-3′；
SEQ ID NO:2反义链：5′-AUUACACACAAGCUGAGCCTT-3′。
将Gli1siRNA、硫酸软骨素(CS)、鱼精蛋白分别用DEPC水配制的 的5％葡萄糖溶液配制成储备液，4℃保存。取质量比1:1的Gli1 siRNA与 CS混合，涡旋状态下，滴加一定量的鱼精蛋白溶液，使得(Gli1 siRNA+ CS)与鱼精蛋白质量比分别为0.80、0.85、0.90、0.95、1.00及1.05，室 温孵育10min后，得到鱼精蛋白/硫酸软骨素/Gli1 siRNA复合物。
鱼精蛋白/硫酸软骨素/Gli1 siRNA复合物的粒径和Zeta电位随(Gli1 siRNA+CS)与鱼精蛋白质量比的变化如图3A所示。随着(Gli1 siRNA+CS) /鱼精蛋白质量比的增加，复合物电位降低，由正到负。而粒径则先增加后 减小，在质量比为0.95时粒径达到440nm，主要原因是此比例时复合物的 电位接近中性，导致复合物聚集产生了大的颗粒复合物。当质量比为1.0 时，复合物粒径约为100nm，Zeta约为-20mV，有利于下一步加入的阳离 子脂质体对其进行压缩和包裹，因此确定(Gli1 siRNA+CS)/鱼精蛋白质 量比的最优比例为1.0。
③Gli1 siRNA纳米粒的制备
取(Gli1 siRNA+CS)/鱼精蛋白质量比1.0的鱼精蛋白/硫酸软骨素/Gli1 siRNA复合物，涡旋状态下，滴加一定量的脂质体溶液，使得总脂材与 Gli1 siRNA的摩尔比分别为0、20、100、400、700、1000、1400及1600， 室温孵育10min后，得到Gli1 siRNA纳米粒。
图3B显示了Gli1 siRNA纳米粒的粒径和Zeta电位随总脂材/Gli1 siRNA摩尔比的变化情况。从图中可以看出，随着总脂材/Gli1 siRNA摩尔 比的增加，Zeta电位逐步升高，由负到正。而粒径则先增加后减小，在摩 尔比为20时粒径突增到约800nm，其原因是，此比例时Gli1 siRNA纳米 粒的Zeta电位接近中性，聚集产生了大的粒子。当摩尔比达到400之后， Zeta电位增加缓慢，粒径无明显变化，因此仅仅根据粒径和Zeta电位并不 能确定最优的总脂材/Gli1 siRNA摩尔比。需要通过荧光分光光度法测定细 胞内FAM-siRNA的荧光强度来研究总脂材与Gli1 siRNA摩尔比对细胞摄 取的影响。
由于Gli1 siRNA没有荧光，所以我们采用有荧光的FAM siRNA来代 替Gli1 siRNA进行细胞摄取研究。将CD44+细胞以每孔30万接种到6孔 板中，24h后将培养基更换为OPTI-MEM培养基，加入不同的总脂材与 FAM siRNA摩尔比(0、20、100、400、700、1000、1400和1600)制备 的FAM siRNA纳米粒，其中FAM siRNA终浓度为100nM，在37℃、5％ CO2培养箱中孵育4h后，用预冷的PBS洗涤两遍，每孔加入500L细 胞裂解液(含0.3％Triton X-100的PBS溶液)，37℃孵育30min，用荧光 分光光度计测定溶裂液中FAM荧光强度，激发波长为488nm，发射波长 为518nm。
由图3C可以看出，总脂材与FAM siRNA摩尔比为1000时最能促进 细胞摄取。低于1000时，脂质体未能将鱼精蛋白/CS/FAM siRNA复合物 颗粒包裹完全，不能有效地促进吸收；高于1000时，过量的阳离子脂质 体反而会竞争性抑制FAM siRNA纳米粒的细胞摄取。故确定总脂材与 FAM siRNA摩尔比的最优比例为1000。
④靶向性Gli1 siRNA纳米粒的制备
以后插法的方式加入DSPE-HA对Gli1 siRNA纳米粒进行修饰来制备 靶向性Gli1siRNA纳米粒。
将实施例1制备的DSPE-HA溶于5％葡萄糖溶液中配制成储备液。取 总脂材与Gli1siRNA摩尔比为1000的Gli1 siRNA纳米粒，涡旋状态下， 滴加一定量的DSPE-HA溶液，使得DSPE-HA占总脂材的摩尔百分比分 别为0％、1％、2％、5％、10％、15％及20％，50℃孵育10min后，得到靶 向性Gli1 siRNA纳米粒，即DSPE-HA修饰Gli1 siRNA纳米粒。图3D为DSPE-HA修饰率(DSPE-HA占总脂材的摩尔百分比)对靶向性Gli1 siRNA 纳米粒的粒径和Zeta电位的影响。从图3D中可以看出，DSPE-HA的修 饰比例对靶向性Gli1 siRNA纳米粒的粒径几乎没有影响。而随着DSPE-HA 修饰率的增加，Zeta电位明显降低，表明DSPE-HA成功修饰到Gli1 siRNA 纳米粒表面，DSPE-HA偶联物上阴离子的HA对Zeta电位起到了一定的屏蔽作用。但是，仅仅根据粒径和Zeta电位无法确定DSPE-HA的最优修 饰率，还需进一步进行细胞摄取实验。
通过荧光分光光度法测定胃癌干细胞CD44+细胞内FAMsiRNA的荧 光强度来研究不同的DSPE-HA修饰率对细胞摄取的影响。将CD44+细胞 以每孔30万接种到6孔板中，24h后将培养基更换为OPTI-MEM培养基， 加入不同DSPE-HA修饰率(0％、1％、2％、5％、10％、15％和20％)制 备的靶向性FAM siRNA纳米粒，其中FAM siRNA终浓度为100nM，在 37℃、5％CO2培养箱中孵育4h后，用预冷的PBS洗涤两遍，每孔加入 500L细胞裂解液(含0.3％Triton X-100的PBS溶液)，37℃孵育30min， 用荧光分光光度计测定裂解液中FAM荧光强度。
从图3E可以看出，当DSPE-HA修饰率为1％和2％时，相比于没有 修饰的FAM-siRNA纳米粒，靶向性FAM-siRNA纳米粒的摄取没有明显的 变化。当DSPE-HA修饰率在3～5％之间时，随着修饰率的增加，摄取量明 显增加。当DSPE-HA修饰率高于5％后，摄取量反而下降，这可能是由于 过多的DSPE-HA导致了细胞表面CD44受体的饱和，从而抑制了细胞的 摄取。因此，DSPE-HA修饰的最优摩尔百分比确定为5％。
最终确定的最优方案为：(siRNA+CS)/鱼精蛋白质量比为1.00，总脂 材/siRNA摩尔比为1000，DSPE-HA的摩尔百分比为5％。
通过最优方案制备的各阶段纳米粒的粒径和zeta电位测定结果见图 4A和4B。靶向性Gli1 siRNA纳米粒的粒径大于Gli1 siRNA纳米粒和空 白阳离子脂质体，表明Gli1siRNA和DSPE-HA成功组装到了纳米粒上。 Zeta电位测量结果进一步证实了靶向性Gli1siRNA纳米粒的制备过程。由 于过量负电荷的存在，鱼精蛋白/硫酸软骨素/Gli1 siRNA复合物的zeta电 位为-20.37±0.93mV。进一步用阳离子脂质体包裹后，由于负电荷的内核与正电荷磷脂的外壳间强烈的静电作用，Gli1 siRNA纳米粒的zeta电位增加 到34.91±3.89mV。这一表面电荷从负到正的逆转表明磷脂外壳是包裹在鱼 精蛋白/硫酸软骨素/Gli1 siRNA复合物的表面，形成了一种阳离子的核-壳 实心纳米粒。经带负电荷的DSPE-HA修饰后，靶向性Gli1 siRNA纳米粒 的zeta电位明显降低到-14.54±2.22mV，证实了负电荷DSPE-HA插入到 了磷脂表面。
实施例3靶向性Gli1 siRNA纳米粒抗胃癌干细胞的作用制剂
4.1细胞内Gli1的表达
将分选到的CD44+细胞和CD44-细胞悬液接种到放有盖玻片的6孔板 中，在37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。0.1mol/L磷酸盐PBS洗三次， 每次3min；4％的多聚甲醛室温固定20-30分钟；PBS洗三次，每次3min； 0.5％Triton X-100室温10分钟；PBS洗三次，每次3min；5％BSA室温封 闭1h，加入一抗anti-Gli1 antibody(Abcam公司)，4℃过夜；PBS洗三次， 每次3min；加入FITC标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育1h；PBS洗三次， 每次3min；然后用5μg/mL的DAPI进行细胞核染色室温10min，PBS漂 洗三次。用激光共聚焦显微镜进行图像分析。细胞免疫荧光分析CD44+ 细胞和CD44-细胞内Gli1的表达显示，CD44+细胞内具有很高的Gli1荧 光(图5)，说明Gli1在胃癌干细胞中高度表达。
4.2胃癌干细胞对纳米粒的摄取和分布
采用流式和共聚焦显微镜技术来研究胃癌干细胞对靶向性纳米粒的 摄取和分布情况。
采用流式细胞分析法研究胃癌干细胞对靶向性纳米粒的定量摄取。将 CD44+细胞4×105个/孔接种于6孔板中，培养24h后更换培养基，加入 OPTI-MEM培养基，分别与FAMsiRNA、FAM siRNA纳米粒或靶向性FAM siRNA纳米粒(FAM siRNA终浓度为50nM)在37℃孵育4h后，消化离 心，预冷的PBS洗涤两遍后PBS重悬，用流式细胞仪测量细胞中FAM荧 光强度(激发波长为488nm，发射波长为518nm)。在受体竞争性抑制实 验中，CD44+细胞预先用5mg/mL过量游离HA孵育30min用以饱和 CD44+细胞表面的CD44受体，然后分别与靶向性FAMsiRNA纳米粒在 37℃孵育4h后同法操作。
采用激光共聚焦法研究胃癌干细胞对靶向性纳米粒的定性摄取。将 CD44+细胞接种到放有盖玻片的6孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中 孵育24h后更换为OPTI-MEM培养基；加入FAM siRNA、FAM siRNA 纳米粒或靶向性FAM siRNA纳米粒(FAM siRNA终浓度为50nM)，置二 氧化碳培养箱中，37℃培养4小时，依次用冰冷PBS漂洗三次，4％多聚 甲醛固定10min，然后用5μg/mL的DAPI进行细胞核染色室温10min， PBS漂洗三次。用激光共聚焦显微镜进行图像分析。蓝色荧光代表细胞核， 绿色荧光代表FAM siRNA。在受体竞争性抑制实验中，CD44+细胞预先用5mg/mL过量游离HA孵育30min用以饱和CD44+细胞表面的CD44受体，然后分别与靶向性FAM siRNA纳米粒(FAM siRNA终浓度为50nM)在 37℃孵育4h后同法操作。
Gli1 siRNA没有荧光，所以我们采用有荧光的FAM siRNA来代替Gli1 siRNA进行需要荧光检测的这个流式分析实验以及下面的激光共聚焦实 验，流式结果显示，与FAMsiRNA纳米粒相比，靶向性FAM siRNA纳米 粒具有明显高的细胞内摄取。在竞争性试验中，预先用游离HA饱和CD44+ 细胞表面CD44受体后，CD44+细胞对靶向性FAM siRNA纳米粒的摄取 量显著性减少，如图6A(a1为流式细胞仪测定与细胞结合的FAM siRNA 荧光强度分布，收集细胞数为10000个。a2为荧光强度统计结果)所示。 激光共聚焦结果(图6B)与细胞摄取的定量结果一致。表明靶向性FAM siRNA纳米粒可以特异性识别CD44+细胞表面的CD44受体，通过受体介 导的内吞实现对胃癌干细胞的主动靶向。
4.3靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞的抑制效应
将CD44+细胞以5000/孔的量接种到96孔板上，在37℃、5％CO2 培养箱中孵育24h后更换为OPTI-MEM培养基。加入空白靶向性纳米粒、 靶向性N.C.siRNA纳米粒、Gli1 siRNA纳米粒或靶向性Gli1 siRNA纳米 粒，siRNA的浓度为2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM， 转染6h后，更换OPTI-MEM培养基为含10％牛血清的DMEM/F12培养 液，继续培养48小时，细胞培养结束后，取出培养板，移去培养孔中的 培养液，用无菌PBS洗涤后，每孔加入100μL PBS和10μL CCK-8试剂， 继续孵育2h。使用酶标仪于450nm波长处测定光密度值。细胞存活百分 数按照下式计算：细胞存活百分数(％)＝(药物处理后的吸光度值/空白 对照孔的吸光度值)×100％。
靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞的抑制效应结果显示(图7)， 相比于CD44-细胞，Gli1 siRNA纳米粒对CD44+细胞的增殖均具有较强的 抑制效应，表明胃癌干细胞比胃癌细胞对Gli1 siRNA更敏感。靶向性FAM siRNA纳米粒对CD44+细胞的增殖具有最强的抑制效应。
4.4靶向性Gli1 siRNA纳米粒的基因沉默作用
将CD44+细胞3×105个/孔接种于6孔板中，培养24h后更换为 OPTI-MEM培养基，分别加入PBS(pH7.4，0.1M)、靶向性N.C.siRNA纳 米粒、游离Gli1 siRNA、Gli1 siRNA纳米粒或靶向性Gli1 siRNA纳米粒 (Gli1 siRNA终浓度为100nM)在37℃孵育24h后收集蛋白。将收集的 细胞离心5min，1000r/min，弃上清，每管加入100μl的细胞裂解液并 重悬打匀后移入1ml的离心管中，冰上裂解30min。裂解完毕后4℃离 心15min，12 000r/min，取上清液并用BCA蛋白定量法测各组蛋白含 量。用水将各组蛋白稀释并加入相应体积的5倍上样缓冲液，使得样品终 浓度为1mg/mL，混匀后于100℃煮沸5min使蛋白变性。取20μg每组， 用8％SDS-PAGE凝胶电泳(80V，30min；120V，90min)；转膜(300mA， 90min)至PDVF膜；5％脱脂牛奶封闭2h；一抗(兔抗人Gli1，抗体浓度 1∶1000)，4℃过夜；PBST洗3次，10min/次；山羊抗兔二抗1∶5000， 室温孵育1h；PBST洗3次，每次10min；采用凝胶成像系统获取图像， 并进行统计学分析。
基因沉默效果显示(图8)，与空白对照组及阴性对照组(靶向性N.C. siRNA纳米粒)相比，靶向性Gli1 siRNA纳米粒能够明显下调Hedgehog 信号通路最下游Gli1蛋白的表达，表明靶向性Gli1 siRNA纳米粒能特异 性阻断胃癌干细胞自我增殖分化的Hedgehog信号转导通路，诱导胃癌干 细胞凋亡。
4.5靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞成球能力的影响
采用悬浮细胞培养技术来检测靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细 胞成球能力的影响。将CD44+细胞重悬于无血清的DMEM/F12培养液 (1％N2，2％B27，10ng/mL bFGF，20ng/mL EGF)中，置于无菌低吸附6孔 培养板中，密度为10000个/孔，分别加入PBS(pH7.4，0.1M)、空白靶向 性纳米粒、靶向性N.C.siRNA纳米粒、游离Gli1 siRNA、Gli1 siRNA纳 米粒或靶向性Gli1 siRNA纳米粒，siRNA的浓度为100nM，转染6h后， 更换培养基为含10％牛血清的DMEM/F12培养液，继续培养7天后，在 倒置显微镜下观察各组悬浮细胞球的形成情况并拍照记录。
图9代表靶向性Gli1 siRNA纳米粒对CD44+细胞悬浮细胞球形成能 力的影响。结果发现，相比于对照，空白靶向性纳米粒和靶向性N.C.siRNA 纳米粒对CD44+细胞悬浮细胞球的形成能力几乎没有影响，而含Gli1 siRNA的剂型都明显降低了形成细胞球的数量和大小，其中经靶向性Gli1 siRNA纳米粒处理的CD44+细胞几乎完全失去了细胞球的形成能力，表 明靶向性Gli1 siRNA纳米粒可以选择性地抑制胃癌干细胞的生长。
4.6靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细胞迁移能力的影响
采用Transwell迁移实验来研究靶向性Gli1 siRNA纳米粒对胃癌干细 胞迁移能力的影响。将孔径为8μm的transwell细胞小室放置于24孔板 中。取对数生长期的CD44+干细胞，Transwell上室中按照100μL 5×104个 /孔的量接种细胞，分别加入100μL PBS(pH7.4，0.1M)、空白靶向性纳米 粒、靶向性N.C.siRNA纳米粒、游离Gli1 siRNA、Gli1siRNA纳米粒或 靶向性Gli1 siRNA纳米粒，siRNA的浓度为100nM，下室中分别加入800μl培养液，置于37℃、5％CO2孵箱中孵育。24小时后，弃上室中培养液， PBS漂洗2-3次，常温下置于4％多聚甲醛固定15分钟。用棉签洗去上室 内液体，Giemsa染色10分钟。蒸馏水洗涤三次。镜下观察并照像。
图10代表靶向性Gli1 siRNA纳米粒对CD44+细胞迁移能力的影响。 结果显示，相比于对照，空白靶向性纳米粒和靶向性N.C.siRNA纳米粒 对CD44+细胞的迁移能力几乎没有影响。三种Gli1 siRNA剂型对CD44+ 细胞的迁移均有明显的抑制，其中靶向性Gli1siRNA纳米粒具有最强的抑 制效应。
实施例5动物体内抗胃癌复发效果研究
在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内，经皮下 异种接种从胃癌AGS细胞分选的CD44+细胞建立胃癌复发模型。将 5.0×104个CD44+细胞混悬于200μl无血清培养基中，皮下注射到5周 龄NOD/SCID小鼠腋下。大概接种CD44+细胞第19天后，肿瘤体积达 到150-180mm3，将小鼠随机分成五组，每组6只。于接种后的第20、 22、24、26、28和30天分别尾静脉给予5％葡萄糖、靶向性N.C.siRNA 纳米粒、游离Gli1 siRNA、Gli1 siRNA纳米粒或靶向性Gli1 siRNA纳米 粒，siRNA的剂量为1mg/kg。从第一次给药起，每天观察肿瘤生长情况， 用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积(V)用下面公式计算：V＝ 长×宽2/2，并绘制肿瘤体积-时间变化图。同时，每天给小鼠称重，绘制小 鼠体重-时间变化图。NOD/SCID小鼠体内抗肿瘤复发结果如图11所示， 与5％葡萄糖组相比，未包载Gli1 siRNA的空白靶向纳米粒(靶向性N.C. siRNA纳米粒)对肿瘤的生长没有明显的抑制作用。Gli1siRNA纳米粒和 靶向性Gli1 siRNA纳米粒组肿瘤生长得到了明显的抑制，并且靶向性Gli1siRNA纳米粒组的抑瘤效果强于非靶向Gli1 siRNA纳米粒组，说明靶向性 Gli1 siRNA纳米粒组体内递送Gli1 siRNA最有效。这与体外细胞实验结果 一致，进一步说明透明质酸修饰的纳米粒具有优良的主动靶向作用。
整个实验过程中NOD/SCID小鼠体重均无明显变化(图12)，说明载 体以及Gli1siRNA对小鼠的全身毒性不明显。
靶向性Gli1 siRNA纳米粒通过特异性阻断胃癌干细胞自我增殖分化 的Hedgehog信号转导通路，抑制胃癌干细胞的自我更新和迁移侵袭，诱 导胃癌干细胞凋亡，有效抑制肿瘤的复发。
序列表
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途
<130> DIC19110006
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcucagcuu guguguaaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auuacacaca agcugagcct t 21

Claims (10)

1.一种靶向性核酸药物，其包含氨基脂质-透明质酸偶联物、阳离子脂质体以及含有鱼精蛋白、硫酸软骨素和核酸药物的复合物；其中，所述氨基脂质-透明质酸偶联物的氨基脂质部分与阳离子脂质体结合，并且所述阳离子脂质体包裹所述复合物。
2.根据权利要求1所述的靶向性核酸药物，其中所述氨基脂质-透明质酸偶联物选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DSPE-HA)偶联物、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DOPE-HA)偶联物、二芥酰基磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DEPE-HA)偶联物、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DMPE-HA)偶联物和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-透明质酸(DPPE-HA)偶联物；
优选地，所述氨基脂质-透明质酸偶联物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-透明质酸偶联物。
3.根据权利要求1或2所述的靶向性核酸药物，其中，所述阳离子脂质体包含阳离子脂质和辅助脂；
优选地，所述阳离子脂质选自：十八酰胺(SA)；溴化月桂基三甲基铵；溴化十六烷基三甲基铵；溴化肉豆蔻基三甲基铵；溴化二甲基二-十八铵(DDAB)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)；1,2-二-十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)和DOTAP衍生物，例如1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷；1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)和DODAP衍生物，例如1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷；1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵-丙烷(DOTMA)；1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(DOTB)和二-十八酰胺-丙氨酰基精胺中的一种或多种；
更优选地，所述阳离子脂质选自：溴化二甲基二-十八铵、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷、3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇和1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷中的一种或多种；
优选地，所述辅助脂选自1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二芥酰基卵磷脂和二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)中的一种或多种；更优选地，所述辅助脂为1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺；
优选地，所述阳离子脂质体还包含冷冻保护剂；更优选地，所述冷冻保护剂选自单糖、二糖、寡聚糖、多糖和多元醇中的一种或多种；进一步优选地，所述冷冻保护剂为二糖；更进一步优选地，所述冷冻保护剂为海藻糖、麦芽糖、蔗糖或乳糖；
优选地，所述阳离子脂质与辅助脂的摩尔比＝(0.1～100):1；更优选地，所述阳离子脂质与辅助脂的摩尔比为(0.2～50):1；特别优选地，所述阳离子脂质与辅助脂的摩尔比为(0.5～10):1；
优选地，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷与1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1；
优选地，核酸药物与硫酸软骨素的质量比为1:1，核酸药物和硫酸软骨素的混合物与鱼精蛋白的质量比为1:0.98-1.05，优选地为1:1；
优选地，由阳离子脂质和辅助脂构成的总脂材与核酸的摩尔比为800～1600:1，更优选地为1000:1；
优选地，脂质-透明质酸偶联物(DSPE-HA)与由阳离子脂质和辅助脂构成的总脂材的摩尔百分比为1-20％,优选为3％-7％，更优选为5％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的靶向性核酸药物，其中，所述核酸药物选自siRNA、miRNA、寡核苷酸和反义核酸中的一种或多种；优选地，所述核酸药物为siRNA或miRNA；更优选地，所述核酸药物为Gli1siRNA；
优选地，所述Gli1siRNA具有如下序列：
SEQ ID NO:1正义链：5′-GGCUCAGCUU GUGUGUAAUTT-3′；
SEQ ID NO:2反义链：5′-AUUACACACAAGCUGAGCCTT-3′。
5.一种药物组合物，其含有根据权利要求1至4中任一项所述的靶向性核酸药物，以及任选的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的靶向性核酸药物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备氨基脂质-透明质酸偶联物；
(2)制备阳离子脂质体；
(3)制备包含鱼精蛋白、硫酸软骨素和核酸药物的复合物；
(4)将步骤(2)制备的阳离子脂质体与步骤(3)制备的包含鱼精蛋白、硫酸软骨素和核酸药物的复合物混合，制得核酸药物纳米粒；
(5)将步骤(1)制备的脂质-透明质酸偶联物与步骤(4)制备的核酸纳米粒混合，制得靶向性核酸药物；
优选地，在步骤(1)中，通过氨基脂质与透明质酸的单点偶联反应制备氨基脂质-透明质酸偶联物；
更优选地，所述制备氨基脂质-透明质酸偶联物包括以下步骤：透明质酸与季铵反应形成铵盐后，在还原剂的存在下与氨基脂质通过还原胺化反应进行偶联，然后在酸性条件下脱除季铵，得到氨基脂质-透明质酸偶联物；进一步优选地，透明质酸、氨基脂质和还原剂的摩尔比为1:(1～5):(1～10)；优选地，所述还原胺化反应的溶剂为二甲基亚砜；
优选地，在步骤(2)中，制备阳离子脂质体的方法为超声分散法、薄膜分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法或注入法；更优选地，制备阳离子脂质体的方法为超声分散法、薄膜分散法或反相蒸发法；
进一步优选地，所述超声分散法包括以下步骤：
(i)将阳离子脂质和辅助脂溶于有机溶剂，通过减压旋蒸除去有机溶剂，形成脂质薄膜；
(ii)加入葡萄糖溶液，超声水化步骤(1)获得的脂质薄膜，在超声波细胞粉碎机中进一步破碎，依次使用0.45μm、0.22μm滤膜优选水系滤膜过滤脂质体溶液3次，形成阳离子脂质体；和
优选地，所述超声波细胞粉碎机的工作条件为：工作时间为10s，间歇时间为10s，全程时间为8min，保护温度为35℃，功率为200W；
(iii)任选地，将阳离子脂质体冷冻干燥，形成阳离子脂质体粉末；
优选地，在步骤(i)中，所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷和甲醇中的一种或多种；更优选地，所述有机溶剂是氯仿与甲醇的混合溶剂；优选地，氯仿与甲醇的体积比为3:1；更优选地，以1:1的摩尔比将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷和1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺溶于体积比为3:1的氯仿与甲醇的混合溶剂中，40℃下减压旋转蒸发除去有机试剂，形成脂质薄膜；
优选地，在步骤(ii)中，加入DEPC水配制的的葡萄糖溶液，超声水化步骤(i)获得的脂质薄膜，超声波细胞粉碎机中进一步破碎，过0.45μm、0.22μm滤膜，形成阳离子脂质体；更优选地，加入DEPC水配制的质量浓度为50克/升的葡萄糖溶液，超声水化脂质薄膜，过0.22μm滤膜，形成阳离子脂质体；
优选地，在步骤(2)中，以1:1的摩尔比将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷和1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺溶于体积比为3:1的氯仿与甲醇的混合溶剂中，40℃下减压旋转蒸发除去有机试剂；加入DEPC水配制的质量浓度为50克/升葡萄糖溶液，超声水化脂质薄膜，过0.22μm滤膜三次，形成阳离子脂质体；
优选地，在步骤(3)中，将核酸、硫酸软骨素(CS)、鱼精蛋白分别用DEPC水配制的的葡萄糖溶液配制成储备液，将核酸储备液、硫酸软骨素储备液和鱼精蛋白储备液混合，制得鱼精蛋白/硫酸软骨素/核酸复合物；更优选地，将核酸、硫酸软骨素(CS)、鱼精蛋白分别用DEPC水配制的质量浓度为50克/升的葡萄糖溶液配制成储备液，将核酸储备液、硫酸软骨素储备液混合，得到核酸与硫酸软骨素混合物；在核酸与硫酸软骨素混合物中加入鱼精蛋白储备液，制得鱼精蛋白/硫酸软骨素/核酸复合物。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的靶向性核酸药物或权利要求5所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的靶向性核酸药物或权利要求5所述的药物组合物在制备抑制肿瘤的生长、增殖、迁移或侵袭的药物中的用途。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中所述药物特异性靶向表达CD44细胞表面标记物的肿瘤细胞；
优选地，所述肿瘤选自胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌或急性白血病。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的用途，其中所述肿瘤为多药耐药肿瘤。
CN201911116618.3A 2019-11-15 2019-11-15 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途 Active CN110755382B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911116618.3A CN110755382B (zh) 2019-11-15 2019-11-15 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911116618.3A CN110755382B (zh) 2019-11-15 2019-11-15 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110755382A true CN110755382A (zh) 2020-02-07
CN110755382B CN110755382B (zh) 2022-07-12

Family

ID=69338382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911116618.3A Active CN110755382B (zh) 2019-11-15 2019-11-15 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110755382B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111904934A (zh) * 2020-09-21 2020-11-10 中国医学科学院医药生物技术研究所 miRNA185抑制剂的脂质体及其制法
CN114699538A (zh) * 2022-04-02 2022-07-05 中国药科大学 一种核-壳式高效基因药物递送系统及其制备方法
WO2022152145A1 (zh) * 2021-01-13 2022-07-21 上海交通大学医学院 一种纳米复合物及其制备方法和用途
CN114886849A (zh) * 2022-05-23 2022-08-12 郑州大学 一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液
WO2022173895A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Virginia Commonwealth University Methods for preventing cancer relapse

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030007957A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-09 Calvin Britton Novel wound healing composition not containing bovine-derived activating reagents
CN101217946A (zh) * 2004-11-02 2008-07-09 特拉维夫大学未来技术研发有限公司 水不溶性的或低水溶性药物在脂质化糖胺聚糖颗粒中的制剂和它们的诊断和治疗用途
CN103194489A (zh) * 2013-03-26 2013-07-10 中国科学院过程工程研究所 新型阳离子脂质体核酸类药物制剂，及其制备方法和应用
CN108096189A (zh) * 2016-11-25 2018-06-01 国家纳米科学中心 一种脂质体纳米颗粒及其药物组合物和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030007957A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-09 Calvin Britton Novel wound healing composition not containing bovine-derived activating reagents
CN101217946A (zh) * 2004-11-02 2008-07-09 特拉维夫大学未来技术研发有限公司 水不溶性的或低水溶性药物在脂质化糖胺聚糖颗粒中的制剂和它们的诊断和治疗用途
CN103194489A (zh) * 2013-03-26 2013-07-10 中国科学院过程工程研究所 新型阳离子脂质体核酸类药物制剂，及其制备方法和应用
CN108096189A (zh) * 2016-11-25 2018-06-01 国家纳米科学中心 一种脂质体纳米颗粒及其药物组合物和应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111904934A (zh) * 2020-09-21 2020-11-10 中国医学科学院医药生物技术研究所 miRNA185抑制剂的脂质体及其制法
CN111904934B (zh) * 2020-09-21 2022-02-25 中国医学科学院医药生物技术研究所 miRNA185抑制剂的脂质体及其制法
WO2022152145A1 (zh) * 2021-01-13 2022-07-21 上海交通大学医学院 一种纳米复合物及其制备方法和用途
WO2022173895A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Virginia Commonwealth University Methods for preventing cancer relapse
CN114699538A (zh) * 2022-04-02 2022-07-05 中国药科大学 一种核-壳式高效基因药物递送系统及其制备方法
CN114886849A (zh) * 2022-05-23 2022-08-12 郑州大学 一种蒙花苷脂质体纳米胶束及其制备方法、滴眼液

Also Published As

Publication number Publication date
CN110755382B (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110755382B (zh) 一种靶向性核酸药物及其制备方法和用途
US20220211878A1 (en) Cross-linked polymer modified nanoparticles
Shi et al. A tumor-targeting near-infrared laser-triggered drug delivery system based on GO@ Ag nanoparticles for chemo-photothermal therapy and X-ray imaging
Zhu et al. pH-responsive hybrid quantum dots for targeting hypoxic tumor siRNA delivery
US10583084B2 (en) Liposomal formulations for delivery of nucleic acids
EP3241852B1 (en) Hyaluronic acid-based amphiphilic polymer, preparation method and application thereof
Mu et al. Iron oxide nanoparticle targeted chemo-immunotherapy for triple negative breast cancer
Wang et al. Cetuximab conjugated and doxorubicin loaded silica nanoparticles for tumor-targeting and tumor microenvironment responsive binary drug delivery of liver cancer therapy
CN108635593B (zh) 一种e-选择素肽配体修饰的靶向热敏脂质体的制备和应用
EP3714903A1 (en) Nanoparticles stabilized with niitrophenylboronic acid compositions
EP3092012B1 (en) Magnetic nanoparticles functionalized with cathecol, production and use thereof
WO2016023456A1 (zh) 靶向癌干细胞的碳纳米管-药物递送系统、其制备方法及用途
JP2022531010A (ja) 薬物送達キャリア及びそれを用いた医薬製剤
Thirumalaivasan et al. In vitro and in vivo approach of hydrogen-sulfide-responsive drug release driven by azide-functionalized mesoporous silica nanoparticles
CN108339124B (zh) 一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统的制备方法和应用
Li et al. Dual targeting mesoporous silica nanoparticles for inhibiting tumour cell invasion and metastasis
CN109091468B (zh) 一种抗体、多肽和核酸组合治疗靶向载体及制法和用途
Kazemi et al. PNA-ATP aptamer-capped doxorubicin-loaded silica nanoparticles for targeted cancer therapy
KR101809795B1 (ko) 폴리올계 삼투압적 폴리디자일리톨 폴리머 유전자 전달체 및 이의 용도
CN109481400B (zh) 一种肝靶向阿霉素/Bcl-2 siRNA共载纳米胶束及其制备方法和应用
EP2907876B1 (en) Reduction stimuli-responsive gene vector system and preparation and use thereof
Yang et al. AS1411 and EpDT3-conjugated silver nanotriangle-mediated photothermal therapy for breast cancer and cancer stem cells
Shi et al. Amphiphilic copolymer and TPGS mixed magnetic hybrid micelles for stepwise targeted co-delivery of DOX/TPP–DOX and image-guided chemotherapy with enhanced antitumor activity in liver cancer
CN110954514B (zh) 适用于研究脂质体体内外分布的荧光示踪系统和方法
CN114848831A (zh) 包裹型纳米制剂及其载体的制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant