CN115944590A - 一种基因/药物共载脂质体及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因/药物共载脂质体及其制备方法与用途。本发明脂质体包括脂质膜、小分子药物和基因；所述脂质膜为阳离子脂质膜；所述小分子药物为STAT3通路抑制剂；所述基因针对JAK/STAT3信号通路。本发明提供的共载脂质体可以同时载荷针对银屑病中关键信号通路JAK/STAT3的基因和小分子药物，将基因和小分子药物共同递送到细胞内，分别从基因和蛋白质水平阻断STAT3信号通路，发挥协同作用，具有良好的生物相容性和安全性，达到更好的治疗银屑病的目的。

Description

一种基因/药物共载脂质体及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及药物输送技术领域，特别是一种基因/药物共载脂质体及其制备方法与用途。

背景技术

银屑病是一种慢性、复发、炎症性皮肤病，其发病机制尚不明确，目前通常认为由遗传、环境、免疫等因素共同导致。银屑病严重影响患者生活质量，并增加心理疾病、心血管疾病、代谢综合征、银屑病关节炎等多种风险。我国银屑病的发生率约为0.5％，可能存在多达700余万的银屑病患者。

银屑病目前主要有三种治疗形式：局部治疗；光照疗法；全身治疗。治疗方法的选择基于银屑病的严重程度。轻度银屑病通常采用局部治疗，例如局部涂抹糖皮质激素或维生素D3类似物的乳膏、泡沫或者凝胶；若效果不佳再采用光照疗法。中度至重度银屑病则需要全身性治疗，常用口服或注射甲氨蝶呤、环孢素、阿维A等。甲氨蝶呤、环孢素等缺乏选择性，通过系统给药治疗银屑病时，往往会引起全身性的副作用。近年来，我国先后批准上市了一些生物制剂用于银屑病治疗，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)拮抗剂、白细胞介素12/23(IL-12/23)拮抗剂和白细胞介素17A(IL-17A)拮抗剂等。生物制剂需要皮下注射给药，患者依从性差，难以坚持长期治疗。因此，迫切需要开发新的、安全有效、便于使用的疗法，以支持银屑病治疗尚未满足的临床需求。

在银屑病的多种治疗方法中，除维甲酸外，其余方法的目的均为抗炎，减缓表皮角质细胞更新速度和平整斑块。JAK-STAT信号通路在生长、存活、分化等多条细胞化学通路的信号传导中发挥重要作用。其中，JAK/STAT3是银屑病发生发展中的关键信号通路之一。作为一种重要的转录因子，STAT3通过参与Th17细胞分化、角质形成细胞过度增生与异常分化、与炎症细胞相互作用、真皮血管增生等重要病理过程，在银屑病发病中具有关键作用。近年来，临床试验结果表明，JAK激酶抑制剂治疗银屑病具有良好的有效性和安全性，如JAK靶向抑制剂托法替尼目前已处于临床试验Ⅲ期阶段。但目前针对STAT3的研究相对较少，有待进一步探究。

基因治疗与小分子化药的联合使用可发挥两者的协同作用，即分别从基因水平和蛋白水平发挥调控作用。基因/药物共载制剂可同时递送两者于同一细胞，增强治疗效果的同时，有利于降低小分子药物的给药剂量，减少化学药物产生的不良反应，并改善单一基因转染效率低下的状况。此外，基于纳米平台的共递送还可减少给药次数，提高患者依从性。基因和化疗药物的联合给药已在肿瘤多药耐药性治疗中受到了广泛关注。多药耐药性治疗性基因可通过适当载体运送至肿瘤细胞，通过下调耐药相关蛋白的表达或沉默其他调控肿瘤功能的基因以实现治疗的目的。研究表明，借助纳米载体将小分子药物与基因治疗联合应用可发挥两者的协同作用，是一种具有广阔前景的治疗策略。

然而，基因和小分子的共递送仍然面临诸多挑战：(1)基因药物和小分子药物理化性质、作用机制差异较大，主要表现为基因药物的亲水性和高度的不稳定性，而小分子药物的亲水性和亲脂性各异。(2)基因药物一般需要进入细胞质或细胞核发挥作用，而小分子药物由于靶点不同需要在细胞内或胞外发挥作用。(3)控制好小分子药物和基因药物释放的时间间隔是有必要的。如小干扰RNA(siRNA)常被用来逆转多药耐药性，另外，化疗药物应在siRNA沉默耐药相关基因后释放，以获得最佳协同效应，但如何在不同时间点精确控制不同物质释放仍是目前研究的巨大挑战。(4)尽管研究者设计的载体类型众多，但转染效率低下和内涵体/溶酶体逃逸困难仍严重限制了siRNA的临床用途。(5)共递送两类药物的要求增加了载体设计的复杂性，而合成复杂载体时需要使用多种原材料，需评估每种原材料的安全性以降低载体毒性或脱靶效应。应对上述挑战，寻找一种能够实现小分子药物和基因药物共递送，稳定性高、转染效率高、具有良好的生物相容性和安全性的纳米药物制剂具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种同时载荷小分子药物和基因药物的脂质体来解决现有载体稳定性差、生物相容性和安全性低、递送效率差以及无法精确控释的问题。

为达到此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种基因/药物共载脂质体，脂质体包括脂质膜、小分子药物和基因；所述脂质膜为阳离子脂质膜；所述小分子药物为STAT3通路抑制剂；所述基因针对JAK/STAT3信号通路。

本发明中所述脂质体为具有脂质双分子层结构的封闭囊泡，所述小分子药物包封于所述脂质双分子层中。脂质体由两亲性脂质分子自组装形成，脂质双分子层使脂质体具有相对独立的内水相，因此作为药物输送载体时，亲水性或亲脂性的药物分子可分别装载于脂质体的内水相或双分子层中。与其他载体相比，脂质体具有优秀的生物相容性和安全性、载药量高，可同时满足亲水和疏水性药物的共载需求。

本发明中所述阳离子脂质膜中至少含有一种阳离子脂质，所述基因与阳离子脂质通过静电作用结合。阳离子脂质可以通过静电作用，高效结合带相反电荷的核酸药物，例如siRNA，并通过质子海绵效应介导内涵体逃逸，从而将siRNA输送到细胞质中特异性降解mRNA，保证转染效率。

本发明中所述基因选自针对JAK/STAT3信号通路的小干扰RNA、小RNA、信使RNA或DNA。小干扰RNA(siRNA)是一种长度约为20-25个核苷酸的双链RNA。siRNA能够整合形成RNA诱导沉默复合体，并引导其靶向到目标RNA，阻止目的基因翻译成有功能的蛋白质，从而在基因水平起效。然而，siRNA是一种带负电荷的水溶性物质，易被核酸酶降解、血液循环时间短，并且无法扩散进入细胞质中发挥作用，因此siRNA必须借助输送载体才能进入细胞质中发挥作用。在本发明的一些优选实施例中，所述基因为STAT3 siRNA。

本发明中所述小分子药物选自土木香内酯、异土木香内酯、其他选择性STAT3抑制剂中的任一种或几种。在本发明的一些实施例中，所述小分子药物为土木香内酯。土木香内酯(Alantolactone，ALA)是一种从土木香中提取出的倍半萜内酯类化合物，分子式是C₁₅H₂₀O₂。研究表明，土木香内酯具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等多种药理作用。土木香内酯对STAT3有抑制作用，但是由于其不溶于水，常规制剂难以达到有效治疗浓度。

本发明中所述脂质体的粒径范围为140～600nm，优选地，可以为小于200nm，也可以为150～250nm，可以为250～300nm，还可以为300～500nm，更优选为小于200nm。

在本发明的一些实施例中，脂质体中所述小分子药物与所述脂质分子的摩尔比为0.025～0.2:1，优选为0.1:1。

在本发明的一些实施例中，脂质体中所述阳离子脂质中的氮原子与所述基因中磷酸基团的摩尔比为1～20:1，优选为6:1。

在本发明的一些实施例中，所述基因为双链RNA和/或shRNA，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与STAT3基因中的靶序列相同，所述第一链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明中所述阳离子脂质膜包括阳离子脂质、中性磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。磷脂和胆固醇是构成脂质纳米载体的材料，二者均为两亲性分子。因此，脂质纳米载体中天然存在由疏水基团(主要是磷脂的脂肪酸烃链和胆固醇甾体结构)形成的疏水性结构区域，以及由磷酸头部和聚乙二醇构成的亲水性结构区域。这样的结构特征为疏水性小分子化合物和核酸药物的共载提供了可能。

在本发明的一些实施例中，所述阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、二油酰丙基氯化三甲铵、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂钟的任一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述中性磷脂选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的任一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述聚乙二醇化磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇，1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000，甲氧基-PEG-2-豆蔻酸锡酰-3-磷脂乙醇胺中的任一种或几种。更优选为二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000。聚乙二醇化磷脂的引入，可以增加纳米颗粒之间的空间位阻，减少脂质体聚集，增强稳定性。

在本发明的一些优选实施例中，所述基因/药物共载脂质体的包封率为71.2％。

本发明第二方面提供一种基因/药物共载脂质体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、制备载有小分子药物的阳离子脂质体；

步骤二、将基因与步骤一所得阳离子脂质体共孵育，得到基因/药物共载脂质复合物；

步骤三、对步骤二所得基因/药物共载脂质复合物进行透析，得到基因/药物共载脂质体。

在本发明的一些实施例中，步骤一中载有小分子药物的阳离子脂质体采用薄膜分散法制备。具体包括以下步骤：S1、将阳离子脂质、中性磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂加入乙醇中，配制成脂质混合物；S2、将小分子药物加入S1配制得到的脂质混合物中，减压蒸发除去乙醇，得到含有小分子药物的脂质膜，加入超纯水水合，得到脂质悬浮液；S3、用脂质体挤出器将脂质悬浮液挤出数次，得到载有小分子药物的脂质复合物；S4、将S3制得的脂质复合物转移至透析袋中透析，除去游离药物，即得载有小分子药物的阳离子脂质体。

在本发明的一些实施例中，步骤一中所述小分子药物与所述脂质分子的摩尔比为0.025～0.2:1。在本发明的一些优选实施例中，步骤一中所述小分子药物与所述脂质分子的摩尔比为0.1:1。

在本发明的一些实施例中，步骤二中孵育温度为室温，时间为10～30min。在本发明的一些优选实施例中，步骤二中孵育温度为室温，时间为20min。

在本发明的一些实施例中，步骤二中所述阳离子脂质中的氮原子与所述基因中磷酸基团的摩尔比为1～20:1。在本发明的一些优选实施例中，步骤二中所述阳离子脂质中的氮原子与所述基因中磷酸基团的摩尔比为6:1。

在本发明的一些实施例中，步骤三中透析所用透析袋截留量为10KD，所用透析介质为超纯水。

本发明第三方面提供一种上述基因/药物共载脂质体在制备小分子药物和基因药物共递送制剂中的用途。作为优选，所述小分子药物为土木香内酯，所述基因药物为STAT3siRNA。

本发明第四方面提供一种上述基因/药物共载脂质体在制备治疗银屑病药物中的用途。本发明提供的基因/药物共载脂质体可以作为土木香内酯作为STAT3抑制剂联合STAT3 siRNA的共递送载药系统，一方面利用siRNA特异性沉默STAT3 mRNA，另一方面采用小分子抑制剂土木香内酯协同作用于STAT3，分别从基因和蛋白质水平阻断STAT3信号通路，实现银屑病治疗的目的。

本发明所述基因/药物共载脂质体至少具有以下功用之一：1)抑制角质形成细胞的过度增殖；2)减轻银屑病皮肤的红疹面积；3)减轻银屑病皮肤的鳞屑程度；4)减轻银屑病皮肤的皱缩程度；5)降低银屑病皮肤的表皮厚度；6)抑制银屑病的过度免疫反应。

本发明提供的基因/药物共载脂质体体系采用的载体是一种由阳离子脂质、胆固醇、中性磷脂和聚乙二醇磷脂形成的脂质体。其中，阳离子脂质可以通过静电作用高效结合带相反电荷的核酸药物，并通过质子海绵效应介导内涵体逃逸，从而将siRNA输送到细胞质中特异性降解mRNA，保证转染效率；脂质体中存在由疏水基团(主要是磷脂的脂肪酸烃链和胆固醇甾体结构)形成的疏水性结构区域，以及由磷酸头部和聚乙二醇构成的亲水性结构区域，这样的结构特征为疏水性小分子药物和核酸药物的共载提供了可能；同时，聚乙二醇磷脂的引入可以增加纳米颗粒之间的空间位阻，减少脂质体聚集，增强稳定性。因此，该载体可以实现基因/药物的共同递送，达到基因水平和蛋白质水平协同调控的目的，增强疗效，减少不良反应。此外，脂质体成分与皮肤磷脂高度相似，能够促进药物的渗透并到达作用部位，显著提高递送效率。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1、本发明提出基于脂质纳米载体的难溶性药物和基因药物共载脂质体，具有更好的稳定性，具有优良的生物相容性和安全性，能高效地将小分子化合物和基因共同递送到细胞内发挥协同作用。同时，所选用的载体材料保证了siRNA的溶酶体逃逸和转染效率，解决了基因和小分子药物共递送的挑战。

2、本发明针对银屑病中关键信号通路JAK/STAT3的基因/小分子药物的共载脂质体，一方面利用STAT3 siRNA特异性沉默STAT3 mRNA，另一方面采用小分子抑制剂土木香内酯协同作用于STAT3 siRNA，分别从基因和蛋白质水平阻断STAT3信号通路，应用于治疗银屑病治疗取得了良好的效果。

附图说明

图1为土木香内酯HPLC方法的专属性图谱，其中A为超纯水；B为空白阳离子脂质体；C为空白溶剂；D为土木香内酯标准溶液。

图2为土木香内酯的HPLC标准曲线。

图3为不同脂质处方下脂质体在不同药脂比时对土木香内酯的包封率。

图4为不同氮磷比时基因/药物共载脂质体的粒径及电势。

图5为琼脂糖凝胶阻滞实验评价基因/药物共载脂质体对siRNA的结合情况。

图6为不同氮磷比时基因/药物共载脂质体的储存稳定性和形貌表征，其中A为粒径变化情况；B为电位变化情况；C为包封率变化情况；D为基因/药物共载脂质体的透射电镜图。

图7为不同制剂中土木香内酯的体外释放情况。

图8为不同浓度土木香内酯对HaCaT细胞增殖的影响。

图9为不同浓度空白脂质体对HaCaT细胞增殖的影响。

图10为不同载药制剂对HaCaT细胞增殖的影响。

图11为不同载药制剂对银屑病模型小鼠背部皮肤的影响。

图12为不同载药制剂对银屑病模型小鼠PASI评分的影响。

图13为不同载药制剂对银屑病模型小鼠体重的影响。

图14为不同载药制剂对银屑病模型小鼠肝功能的影响。

图15为不同载药制剂对银屑病模型小鼠肾功能的影响。

图16为不同载药制剂对银屑病模型小鼠脾脏系数的影响。

图17为不同载药制剂治疗后小鼠皮肤病理切片。

图18为不同载药制剂对银屑病模型小鼠表皮厚度的影响。

图19为不同载药制剂对银屑病模型小鼠皮肤组织中细胞增殖的影响。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明一方面利用STAT3siRNA特异性沉默STAT3 mRNA，另一方面采用小分子抑制剂土木香内酯作为小分子药物协同作用于STAT3，以小单室脂质体作为载体，小分子药物包封于小单室脂质体的双分子层中，STAT3siRNA通过静电作用与脂质膜中的阳离子脂质结合，制备得到针对银屑病中关键信号通路JAK/STAT3的基因/小分子药物的共载脂质体，实现基因药物和小分子药物的有序释放，分别从基因和蛋白质水平阻断STAT3信号通路，实现银屑病治疗的目的。

以下实施例中所涉及的缩略语如下：

所涉及的术语定义如下：

包封率：包裹入脂质体中的药物与投入脂质体溶液中的总药物量的比值。

药脂比：脂质体中药物与脂质的摩尔比。

氮磷比：脂质体中阳离子脂质中的氮原子与核酸中磷酸基团的摩尔比。

所用STAT3 siRNA序列如下：

实施例1：土木香内酯的HPLC检测方法

土木香内酯的结构中含有共轭双键，在紫外区有较强的信号吸收。本实施例建立并验证土木香内酯的高效液相色谱(HPLC)检测方法。

1.1色谱条件

流动相：水和乙腈，体积比为40：60；流速为1mL/min；时间12min；色谱柱温35℃；DAD检测器检测波长210nm；进样体积20μL；色谱柱型号Agilent ZORBAX SB-C184.6*150mm5μm。

1.2标准储备液及标准溶液配制

精密称量土木香内酯固体粉末5mg，转移至5mL容量瓶，加入超纯水溶解并定容，即得土木香内酯标准储备液，终浓度为1.0mg/mL。向容量瓶中加入适量标准储备液，用超纯水进行梯度稀释，得到浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL和10μg/mL的系列浓度梯度的标准溶液。

1.3HPLC检测方法学验证

1)专属性：在本色谱条件下，取超纯水、土木香内酯标准溶液、空白阳离子脂质体上机，进行HPLC检测，记录色谱图，排除杂质等物质对检测方法的影响，考察方法专属性。

2)线性：在本色谱条件下，取浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL和10μg/mL的土木香内酯标准溶液上机进行检测，记录色谱图和峰面积。溶液浓度和对应的峰面积用最小二乘法进行线性回归，建立拟合方程，确定检测浓度的线性范围。检测结果如表1所示。

表1不同浓度土木香内酯HPLC检测值

根据表1的结果建立标准曲线。工作曲线如图2所示。土木香内酯的标准曲线为Y＝Y＝57.42*X-1.584(R＝6)，R²＝0.9999，拟合良好，线性范围是0.5-10.0μg/mL。

3)精密度：在本色谱条件下，取土木香内酯标准溶液，连续上机检测，记录六次检测的峰面积，考察精密度。

表2HPLC检测土木香内酯含量的方法精密度考察

4)回收率：在本色谱条件下，分别取高、中、低浓度(10.0μg/mL，5.0μg/mL，1.0μg/mL)的标准溶液上机进行HPLC检测，计算待测品浓度，考察所建立方法的回收率。

表3HPLC检测土木香内酯含量的方法准确度考察

如图1和表1，2，3所示，所建立的土木香内酯的HPLC检测方法专属性较好，空白溶剂、脂质体均对测定无干扰。精密度实验的RSD为0.172％，提示方法重复性好，HPLC检测方法的回收率在100±5％范围内，符合要求。综上，所建立的土木香内酯的HPLC检测方法专属性好，线性关系良好，精密度及回收率结果均符合要求，适合用于土木香内酯的定量检测。

实施例2：土木香内酯脂质体(ALAlip)的制备与性能测定

2.1土木香内酯脂质体的制备

(1)分别将(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇(CHOL)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(2000)-氨基(DSPE-PEG2000)的乙醇储备溶液在5mL圆底烧瓶中混合，得到脂质混合物(DOTAP/DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000–50:10:37.5:2.5mol％)。

(2)将10mg/mL土木香内酯(溶于乙醇)添加到(1)中脂质混合物中，达到总脂质摩尔数的0，2.5％，5％，10％或20％。减压蒸发除去乙醇，得到含有土木香内酯的脂质膜。加入超纯水在40℃下水合30分钟，得到脂质悬浮液；用脂质体挤出器(Lipexextruder，NorthernLipid公司)在50℃下将脂质悬浮液依次挤出通过聚碳酸酯膜(200nm、100nm和80nm)，各挤出数次，得到土木香内酯脂质体。

2.2土木香内酯脂质体的性能测定

2.2.1粒径、电位的测定

取制备的土木香内酯脂质体50μL，加950μL超纯水稀释20倍，测量平均粒径和Zeta电位(Malvern Zetasizer，英国Malvern公司)每个样品重复测定三次。

2.2.2包封率的测定

取透析后的土木香内酯脂质体，按1:9的体积比加入甲醇，涡旋混合1分钟，10000rpm离心10分钟，取上清，用实施例1建立的HPLC方法测定土木香内酯的浓度，计算土木香内酯的包封率，公式如下：

包封率＝(脂质体中测得的药物量)÷(投入的总药量)×100％

测定结果如图3所示，结果表明：随着药脂比的提高，脂质体对ALA的包封率下降，药脂比为0.1时包封率约为70％，药脂比为0.2时包封率急剧下降至42％，表明该处方条件下脂质体所能包载的ALA已达最大限度。因此，药脂比优选为0.1。

实施例3：土木香内酯/si-STAT3共载脂质体(ALA-STAT3 lip)的制备与性能测定

3.1土木香内酯/si-STAT3共载脂质体的制备

(1)si-STAT3粉末使用前从-30℃冰箱取出，恢复至室温，短时高速离心，加入适量的DEPC水pH＝4的溶解粉末，即得到20μM储备液，分装至无酶离心管中，转移至-30℃冰箱保存。

(2)将实施例2中优选得到的ALA单载纳米颗粒(土木香内酯脂质体)，与si-STAT3以不同N/P混合并在室温、400rpm下孵育20分钟，即得土木香内酯/si-STAT3共载脂质体。

3.2ALA-STAT3 lip的性能测定

采用实施例2中的表征方法测定不同N/P时共载脂质体的粒径、电势，ALA包封率、对siRNA的结合能力。

3.2.1粒径、电势的测定

粒径的测定结果如图4所示，与空白阳离子脂质体相比，引入10％摩尔比的ALA后，脂质体的粒径、PDI无明显变化，均分布在180nm左右，且PDI小于0.1，表明制剂均一性良好。当N/P为0，1，2时，各组粒径均集中在170nm左右。当N/P为4和5时，粒径急剧增大到400nm以上，PDI增大至0.2-0.4，表明该状态下纳米颗粒稳定性较差。当N/P为6～20时，粒径逐渐趋于稳定，分布在200nm左右，且PDI小于0.1。

电势的测量结果如图5所示，电势测量结果表明随着N/P的升高，电势逐渐增大，当N/P大于5时逐渐趋于稳定。

3.2.2琼脂糖凝胶电泳

使用2％琼脂糖凝胶电泳分离游离的si-STAT3和制剂包载的si-STAT3。取不同氮磷比的制剂配成si-STAT3终浓度为20ng/μL的上样溶液，每组T后缀表明该组加入1％Triton使脂质体破裂暴露出全部si-STAT3，从而判断si-STAT3的降解情况。电泳溶液为0.5×TBE，在100V电压下电泳15min。

琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，结果表明：当N/P高于4时，制剂可以完全与si-STAT3结合。

因此，综合粒径、PDI、电势和si-STAT3包封率的数据，N/P优选为6，此时复合纳米制剂稳定性、均一性良好，且完全包封si-STAT3。

实施例4：土木香内酯/si-STAT3共载脂质体的储存稳定性和形貌表征

4.1储存稳定性测试

(1)将上述不同N/P的复合脂质载体(土木香内酯/si-STAT3共载脂质体)储存于4℃冰箱内，在制备的第1天和第15天，采用实施例2中的方法，对各组制剂的粒径、电势进行测定，每次检测重复3次。

(2)选取N/P＝6的土木香内酯/si-STAT3共载脂质体和ALA单载制剂，考察两组在药脂比均为0.1的情况下，ALA的载药量在在4℃环境下15天的储存稳定性。

测定结果如下表4和图6中A～C所示，各组在4℃冰箱中储存15天后粒径、PDI、电势、ALA载药量均无明显变化，表明共载脂质体制剂稳定性良好。

表4不同氮磷比的ALA/si-STAT3共载脂质体的稳定性

4.2形貌表征

Vitrobot Mark IV冷冻制样系统中，将3μL ALA-STAT3共载脂质体分别滴加到铜网表面，用滤纸吸去过量溶液，快速投入液态乙烷中。采用生物型场发射透射电镜(TalosF200S G2200kV)观察脂质体的形貌。电压为200kV，选择Cryo-TEM系统和低辐射量(lowdoes)模式，在放大倍数115-480000范围内观察。

ALA-STAT3 lip的形貌结果如图6中D所示。共载脂质体均为小单室脂质体，其直径约在170nm左右，与动态光散射法测定结果一致。由于ALA是疏水性结构，根据相似相溶原理载药，土木香内酯主要装载在脂质膜的疏水性区域。电镜结果显示部分共载脂质体的形状呈非正球形，可能与ALA插入干扰了脂质双分子层的排列有关。

实施例5：土木香内酯单载或共载脂质体的体外释放研究

使用空气摇床对ALA lip和ALA-STAT3 lip的体外药物释放率进行测定。实验步骤为：首先，将所制备的试剂放置于恒温的振荡器中，在100pm，37℃的条件下振荡。在预定的时间点(1小时，2小时，4小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时及96小时)取样，并以1000pm的转速离心15min，吸去上清液。最后，将沉淀用适量甲醇溶解，用HPLC测定其在210nm处的峰面积，与刚制备好时溶液的峰面积进行比较，得出土木香内酯的释放曲线。

在体外释放方面，如图7所示，ALA lip和ALASTAT3 lip的体外释放曲线走势相似，其释放率均在前2小时内快速升至20％左右，然后基本保持缓慢释放，直至第96小时，累积释放约90％。结果表明，所制备的ALA-STAT3-Lip可在4天内持续缓慢释放，具备较高的稳定性，适用于局部透皮施用。

实施例6：土木香内酯/si-STAT3共载脂质体的细胞毒性

6.1细胞培养

HaCaT是一种人类的永生化角质形成细胞的细胞系，具有良好的体外分化和增殖能力而被利用于多项研究，作为可重现的模型常用于银屑病的体外研究。HaCaT是一种贴壁细胞，在37℃，5％CO2的恒温培养箱中培养。完全培养基采用DMEM细胞培养基配制，并添加5％FBS和1％双抗。细胞传代时加入适量的0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，加入适量完全培养基终止消化。收集细胞悬液，低速离心，新鲜培养基重悬细胞沉淀，按照1:3进行传代。

6.2CCK-8法检测细胞活性

1)细胞密度达到80％以上，消化并收集细胞，接种至96孔板。

2)待细胞密度达到要求后进行后续给药操作，继续培养。

3)药物孵育结束后，换液，向新鲜培养基中添加10％体积比的CCK8溶液，混匀后向96孔板每孔添加100μL。

4)将孔板转移至培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定450nm吸光值。根据说明书中的公式，计算细胞的相对活性或增殖能力。

图8细胞增殖实验结果显示，ALA浓度超过10μM后，对HaCaT的有明显的增殖抑制作用，48h内可显著抑制HaCaT细胞生长。图9结果表明空白阳离子脂质体总脂质浓度超过200μg/ml后也能显著抑制HaCaT细胞增殖。后续体外实验拟使用的浓度约为100μg/mL，基于本实验结果可知，在此浓度范围内制剂不会对细胞活性产生明显影响，安全性较好。图10结果显示，不同制剂对增殖抑制的结果表明，si-STAT3对HaCaT增殖无影响，si-STAT3与ALA合用之后对HaCaT增殖抑制作用显著加强。

实施例7：土木香内酯/si-STAT3共载脂质体的体内治疗效果

咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病模型是得到普遍用途的实验模型。IMQ为Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)7/8激动剂，激活固有免疫系统，促进或加重银屑病样皮损改变，包括红斑、鳞屑和表皮增厚等，且模型的建立快速简单，成本较低，易于复制。此外，在研究中常使用市售的卡泊三醇倍他米松软膏作为治疗银屑病的阳性对照药物(卡泊三醇倍他米松软膏己被证实可用于局部透皮抗银屑病的治疗中)。

根据文献中常见的方法，使用市售的IMQ构建小鼠银屑病模型。将8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为12组，每组5只，具体分组见表5。

表5动物实验分组及给药剂量

实验开始前，用宠物专用修毛器剃除小鼠背部的毛发，剃毛面积为2*3cm，不易剔除的细软毛发用剪刀剪除，涂抹脱毛膏以完全根除，并用生理盐水擦洗背部皮肤表面，避免脱毛膏带来的影响。除对照组外，在背部3cm²的皮肤每日涂抹62.5mg的咪喹莫特乳膏，持续7天，以构建出银屑病炎症症状。

除对照组和模型组外，每组在IMQ造模4h后给予125μl相对应的制剂，并在阳性对照组中的小鼠的背部涂抹浓度为125mg/cm²

(卡泊三醇倍他米松软膏)，持续7天。并通过以下指标评价各组制剂的治疗效果。实验材料如表6所示：

表6试剂和耗材

(1)小鼠背部炎症和银屑病面积与严重性指数(PASI评分)：

PASI评分在临床中广泛用途于银屑病患者的病情评估，评估指标为红斑、鳞屑、厚度和面积。红斑指施用咪喹莫特后小鼠背部皮肤出现的红疹面积，鳞屑指出现炎症症状后皮肤的鳞屑程度，厚度指患银屑病症状后皮肤的增厚程度。评估指数范围为0-4分，0分表示无明显病变，1分表示轻度病变，2分表示中度病变，3分表示明显病变，4分表示在3分的基础上病变继续加重。以上三种分数的总和(0-12分)用于评估银屑病炎症的严重程度。从实验当天开始，每天记录PASI评分，共持续7天，PASI评分具体标准如表7所示：

表7PASI评分(小鼠)

连续造模和治疗七天后，空白组小鼠背部无明显变化，模型组小鼠背部皮肤呈红色，且有较多红斑，出现鳞屑且皱缩，即典型的银屑病症状，表明造模成功。阳性对照组经卡泊三醇倍他米松软膏治疗后，红斑、鳞屑和皱缩情况明显缓解，具体背部炎症状况见图11。

研究结果表明(图12)，低中高三个不同浓度的土木香内酯脂质体均能降低小鼠的PASI评分，且随浓度升高，PASI评分降低。且ALA+STAT3的组合在低浓度时(48μM ALA+和1nmolSTAT3 siRNA)联合治疗的效果优于相同剂量时的单药治疗，表明STAT3 siRNA和土木香内酯联用之后治疗效果增强。

(2)小鼠体重变化：记录小鼠给药第1天和最后一天的体重，判断制剂对小鼠正常生长的影响。图13结果显示，IMQ造模后各组小鼠体重与空白组无明显变化，但是使用阳性药物治疗后，小鼠体重下降17.3％，表明该药物对小鼠的副作用较大，而各组土木香内酯制剂安全性和有效性良好。

(3)小鼠肝肾功能：取材当天，每只小鼠异氟烷麻醉后收集200μL眼眶静脉血滴入EDTA抗凝管，轻弹管壁，使血液和EDTA混合均匀，防止血液凝固析出，样本在室温静置2小时，3500r/min，离心10分钟，离心结束后血清位于上层，呈淡黄色透明状，收集至新的离心管中用于后续生化检测。使用全自动生化分析仪检测血清中的肝功能指标ALT、AST，肾功能指标CREA-S，剩余部分转移至-80℃冰箱备用。

图14和图15分析结果显示，各组载药制剂治疗后的小鼠ALT，AST，CREA-S与正常组相比无显著性差异，表明各组制剂安全性良好。

(4)小鼠脏器系数：实验第8天时人道处死小鼠，游离小鼠脾脏，用PBS洗净后，滤纸吸去多余液体并称量湿重，记录各组脾脏形态，并计算上述器官的脏器系数，公式如下：

脏器系数＝(小鼠脏器质量)/小鼠体重*100％。

图16结果显示，用途IMQ造模7天后，小鼠脾脏系数显著提高，低浓度土木香内酯脂质体不能降低小鼠脾脏系数，STAT3 siRNA单载脂质体能显著降低脾脏系数(P＜0.05)，两者联用后抑制免疫反应的效果增强(P＜0.01)。

(5)皮肤染色病理切片：在实验的第8天，将各组小鼠以乙醚麻醉的方式处死，将其背部造模区域皮肤切下，用锡纸固定皮肤形态防止卷曲，立即放入十倍体积以上4％的多聚甲醛组织固定溶液中，浸泡24小时。接着，将用二甲苯透明好的小鼠皮肤放入石蜡中包埋，切成薄片，移入体积比为1：1的二甲苯－乙醇混合液中。5分钟后加入不同浓度的乙醇－水溶液，随后，用苏木精染液染色、流水冲洗，并用0.5％的伊红染液染色。接着，依次经不同浓度的乙醇－水溶液脱水、二甲苯处理。最后，立即添加适量的中性树胶以固定皮肤切片，上覆一层薄薄的盖玻片以杜绝外界空气。切片制作完成后，用正置荧光显微镜观察皮肤组织，主要观察表皮层细胞排列均匀程度，并用标尺记录表皮层的厚度。

图17和图18皮肤横切片HE染色结果表明，造模后表皮层(最外层深红色结构)显著增厚，表皮皮肤向下延伸呈钉突状，表明成功诱导小鼠银屑病样症状。同时不同载药制剂治疗后，各组表皮厚度均显著下降，表明治疗效果良好。

(6)免疫组化染色：

Ki67是细胞内一种抗原分子，主要参与细胞内的增殖活动，在细胞的有丝分裂期可以很容易被检测到。因此，Ki67常被用于标记处于增殖状态的活跃细胞。实验中可利用抗原抗体的特异性结合，来定位这些分子，可以直观的观察组织的增殖状态。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，提示为强阳性。

免疫组化实验步骤包括：1)脱蜡、水化；2)抗原修复；3)3％过氧化氢室温孵育10min，PBS洗涤3次；4)滴加5％的BSA溶液封20分钟，37℃，PBS洗3次，甩去多余液体；5)滴加一抗，4℃过夜；6)室温PBS洗3次，滴加1滴聚合物增强剂，室温孵育20分钟；7)除去PBS，加入辣根过氧化物酶，室温孵育30分钟；8)PBS洗3次，加入DAB显色液，出现明显砖红色时终止反应；9)蒸馏水洗，苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化；10)脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化结果表明(图19)，IMQ造模后表皮层显著增厚，同时视野内出现大范围棕黄色，表明Ki67显著增多，细胞过度增殖，为典型的银屑病样症状。各组治疗后表皮层厚度降低，且棕黄色显著减少，表明不同制剂对细胞过度增殖均有抑制作用。ALA和si-STAT3联用后Ki67表达量低于STAT3 siRNA和ALA脂质体(48μM)单药治疗组，表明联合治疗加强了药物的细胞增殖抑制作用，同时降低小分子药物所需剂量。

上述实验结果表明本发明提供的基因/药物共载脂质体能够抑制角质形成细胞的过度增殖，降低银屑病患者的PASI评分，降低银屑病皮肤的表皮厚度，抑制银屑病的过度免疫反应，在银屑病治疗药物开发方面具有良好的应用前景。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基因/药物共载脂质体，其特征在于，脂质体包括脂质膜、小分子药物和基因；所述脂质膜为阳离子脂质膜；所述小分子药物为STAT3通路抑制剂；所述基因针对JAK/STAT3信号通路。

2.如权利要求1所述的基因/药物共载脂质体，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：

(ⅰ)所述脂质体为具有脂质双分子层结构的封闭囊泡，所述小分子药物包封于所述脂质双分子层中；

(ⅱ)所述阳离子脂质膜中至少含有一种阳离子脂质，所述基因与阳离子脂质通过静电作用结合；

(ⅲ)所述基因选自针对JAK/STAT3信号通路的小干扰RNA、小RNA、信使RNA或DNA；

(ⅳ)所述小分子药物选自土木香内酯、异土木香内酯、其他选择性STAT3抑制剂中的任一种或几种；

(ⅴ)所述脂质体的粒径范围为140～600nm。

3.如权利要求2所述的基因/药物共载脂质体，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：

1)脂质体中所述小分子药物与所述脂质分子的摩尔比为0.025～0.2:1，优选为0.1:1；

2)脂质体中所述阳离子脂质中的氮原子与所述基因中磷酸基团的摩尔比为1～20:1，优选为6:1；

3)所述基因为双链RNA和/或shRNA，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与STAT3基因中的靶序列相同，所述第一链的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求2所述的基因/药物共载脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质膜包括阳离子脂质、中性磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。

5.如权利要求4所述的基因/药物共载脂质体，其特征在于，包括以下特征中的一项或几项：

(1)所述阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、二油酰丙基氯化三甲铵、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂中的任一种或几种；

(2)所述中性磷脂选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的任一种或几种；

(3)所述聚乙二醇化磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇，1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000，甲氧基-PEG-2-豆蔻酸锡酰-3-磷脂乙醇胺中的任一种或几种。

6.一种基因/药物共载脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、制备载有小分子药物的阳离子脂质体；

步骤二、将基因与步骤一所得阳离子脂质体共孵育，得到基因/药物共载脂质复合物；

步骤三、对步骤二所得基因/药物共载脂质复合物进行透析，得到基因/药物共载脂质体。

7.如权利要求6所述的基因/药物共载脂质体的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：

(a)步骤一中载有小分子药物的阳离子脂质体采用薄膜分散法制备；

(b)步骤一中所述小分子药物与所述脂质分子的摩尔比为0.025～0.2:1；

(c)步骤二中孵育温度为室温，时间为10～30min；

(d)步骤二中所述阳离子脂质中的氮原子与所述基因中磷酸基团的摩尔比为1～20:1；

(e)步骤三中透析所用透析袋截留量为10KD，所用透析介质为超纯水。

8.如权利要求1～5任一项所述的基因/药物共载脂质体或权利要求6～7中任一项所述的制备方法制得的基因/药物共载脂质体在制备小分子药物和基因药物共递送制剂中的用途。

9.如权利要求1～5任一项所述的基因/药物共载脂质体或权利6～7中任一项所述的制备方法制得的基因/药物共载脂质体在制备治疗银屑病药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述治疗银屑病药物至少具有以下功用之一：

1)抑制角质形成细胞的过度增殖；

2)减轻银屑病皮肤的红疹面积；

3)减轻银屑病皮肤的鳞屑程度；

4)减轻银屑病皮肤的皱缩程度；

5)降低银屑病皮肤的表皮厚度；

6)抑制银屑病的过度免疫反应。

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