CN112451504B - 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用 - Google Patents

一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112451504B
CN112451504B CN202011239305.XA CN202011239305A CN112451504B CN 112451504 B CN112451504 B CN 112451504B CN 202011239305 A CN202011239305 A CN 202011239305A CN 112451504 B CN112451504 B CN 112451504B
Authority
CN
China
Prior art keywords
core
mrna
ebv
lmp2
shell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011239305.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112451504A (zh
Inventor
彭星辰
陈美婉
宋相容
魏于全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by West China Hospital of Sichuan University filed Critical West China Hospital of Sichuan University
Priority to CN202011239305.XA priority Critical patent/CN112451504B/zh
Publication of CN112451504A publication Critical patent/CN112451504A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112451504B publication Critical patent/CN112451504B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种载EBV‑LMP2 mRNA的核‑壳纳米粒的制备方法及应用，所解决的技术问题是提供一种具有抗癌治疗效果好、毒副作用小的载EBV‑LMP2 mRNA的核‑壳纳米复合物，它是以载有EBV‑LMP2 mRNA为原料，与载体结合后，可有效递送至细胞内表达相应的蛋白进而激发免疫治疗的效果，对EBV病毒引起的疾病的治疗效果明显，为临床有效应用EBV‑LMP2 mRNA提供了一种新的选择。

Description

一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
根据国际癌症研究机构的数据，2018年，鼻咽癌新发病例约为12.9万例，占2018年全部确诊病例的0.7％。然而，其全球分布极不平衡，在东亚和东南亚尤为普遍，占新发病例的70％以上。男性鼻咽癌发病率高于女性，2015年中国鼻咽癌发病率比例约为2.5。鼻咽癌以其独特的地理分布为特征，鼻咽癌在生物学、流行病学、组织学、自然史以及治疗反应等方面均不同于其他头颈癌，因而鼻咽癌的治疗有其特殊性。这些发现表明，遗传、种族和环境因素的结合可能会影响鼻咽癌的发病机制。
放疗是目前治疗鼻咽癌的主要手段，也是未播散的鼻咽癌治疗的基本方式。由于鼻咽部解剖的特殊性，手术不适用于鼻咽癌的初治。但放疗对机体的非特异性损伤巨大。局部复发和远处转移是鼻咽癌治疗失败的两个原因。因此，在常规治疗的基础上迫切需要寻找新的综合治疗手段，近几十年来，随着分子生物学和肿瘤免疫学的研究进展，使用分子生物学手段提高患者细胞免疫，预防鼻咽癌复发和转移并作为传统治疗方法的补充，已受到人们越来越多的重视。
在恶性肿瘤中病毒性抗原是最具有免疫原性的分子，并且是保护性肿瘤免疫中最具显著意义的肿瘤抗原，EB病毒作为疱疹病毒科成员，是第一个被发现的与人类肿瘤有关的病毒。现已明确EB病毒是导致鼻咽癌、淋巴瘤及免疫抑制后淋巴瘤的主要病因之一。EB病毒表达的潜在膜蛋白LMP1、LMP2发挥多重致瘤作用，可通过激活多重信号转导以及调控各种致肿瘤基因的表达发挥作用。在治疗性疫苗方面，EBV核抗原 EBNA1、潜伏膜抗原LMP1和LMP2是主要的治疗靶点。
LMP2是鼻咽癌等EB病毒相关肿瘤的组织中持续表达的病毒蛋白之一，并且不引起B淋巴细胞转化，体内外研究已证明EB病毒LMP2基因可很好的诱导产生特异性细胞免疫应答。因此，LMP2成为在诱导EB病毒特异性细胞免疫应答、预防和治疗相关肿瘤的良好靶抗原。为引发针对LMP2的特异性细胞免疫应答，就必须首先选择一个适合治疗应用的LMP2表达系统。
目前针对LMP2的疫苗，只有多肽、DNA疫苗及CTL细胞治疗处于临床研究阶段，而mRNA疫苗未见文献报导。
发明内容
有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种用于治疗EBV病毒引起的各类疾病的载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒，该核-壳纳米粒能有效递送EBV-LMP2 mRNA到细胞内表达相应的蛋白，激发相关免疫，发挥免疫治疗的效果。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒，其特征在于，它是由载有表达EBV-LMP2mRNA与核-壳纳米粒形成的纳米复合物；其中，核-壳纳米粒中纳米粒和脂质的质量比为0.1～5∶1。
优选的，所述的载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒，其特征在于：核-壳纳米粒中纳米粒和脂质的质量比为0.5～3∶1。
进一步优选的，所述的载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒，其特征在于：核-壳纳米粒中纳米粒和脂质的质量比为1～2.5∶1。
本发明的另一目的在于提供载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法，该方法制备的核-壳纳米粒具有粒径均一、包封率高、稳定性好等优点。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法，其特征在于：先制备出PLGA 纳米粒，然后在其表面包敷一层脂质双分子层获得核壳型纳米粒，再与mRNA溶液进行混合，得载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒。
进一步的，所述的载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法，其特征在于，载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备步骤为：
A、称取PLGA材料溶于有机溶剂中，水浴超声溶解，制备油相；称取表面活性剂溶于RNase-free水中，制成水相溶液。
B、将步骤A制备的油相快速注入水相中，迅速置于冰浴条件下，100～600W超声乳化1～5分钟。超声结束后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，水浴条件下旋转蒸发，得到PLGA纳米粒。
C、取阳离子脂质材料和胆固醇，加入有机溶液溶解，加入到旋转瓶中，旋蒸成膜，完全除去有机溶剂后，加入RNase-free水，水化脂质膜，将水化液超声波细胞破碎仪超声后过0.22μm无菌水系滤膜挤出，即得空白脂质膜。
D、取步骤B制备的PLGA纳米粒加入到步骤C制备的脂质膜中水化30min，再将水化后的溶液液，探头超声均质，即得核-壳脂质纳米粒。
E、取步骤D制备的核-壳纳米粒，加入RNase-free水稀释至一定的体积后，加入EBV-LMP2 mRNA溶液，混匀，孵育即得。
优选的，所述的载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤B所述表面活性剂为F68、PVA、TPGS中的任意一种，其中，PVA分子量为20000～70000道尔顿、PVA使用时配制成浓度为0.5％～6％的溶液，F68使用时配制成浓度为 0.1％～3％的溶液，TPGS使用时配制成浓度为0.5％～5％的溶液；
或步骤b所述表面活性剂为F68、PVA、TPGS中至少两种的混合物，其中，PVA 分子量为20000～70000道尔顿、PVA使用时配制成浓度为0％～6％的溶液，F68使用时配制成浓度为0％～3％的溶液，TPGS使用时配制成浓度为0％～5％的溶液；两两混合时，第三种为0％；三者混合时，三者均不取0％。
优选的，载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤C 所述磷脂材料为阳离子磷脂材料及其与附加剂的组合物，所述阳离子磷脂材料选自 DOTAP、DOTMA、DOTIM、DDA、DC-Chol、C核-壳纳米粒、diC14-脒、DOTPA、 DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DORIE及其衍生物、DPRIE、DSRIE、DMRIE、 DOGS、DOSC、LPLL、DODMA、DDAB、DOPE中的一种或多种的组合物，所述附加剂选自磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)等中的一种或多种的组合物；所述有机溶剂选自可溶解磷脂材料的乙醇、甲醇、氯仿、乙醚等有机溶剂。
本发明的目的之三在于提供载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒在制备治疗EBV 病毒引起的各类疾病的药物中的用途。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒可用于治疗以鼻咽癌为代表的一系列由该病毒感染导致的癌症；
2)本发明提供的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒制备方法制备的核-壳纳米粒具有粒径小且均一，包封率高，稳定性好等特点，该方法可简便的拓展到其他类似mRNA 产品的设计和制备中，具有通用性。
附图说明
图1：(A) 不同超声功率 、(B)不同超声时间、(C)不同PVA浓度以及(D)不同PLGA含量条件下PLGA纳米粒的粒径及PDI
图2：超声功率对核-壳纳米粒粒径、PDI(A)和Zeta电位(B)的影响
图3：超声时间对PLGA-脂质杂化纳米粒粒径、PDI(A)和Zeta电位(B)的影响
图4：不同PLGA/脂质质量比条件下，核-壳纳米粒的粒径、PDI(A)和Zeta电位 (B)
图5：PLGA纳米粒与核-壳纳米粒的外观(A)及丁达尔现象(B)
图6：不同PLGA/脂质质量比的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的凝胶阻滞结果
图7：不同PLGA/脂质质量比的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的转染情况。(A) 代表流式图、(B)统计结果图
图8：EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒制剂的外观、丁达尔现象和电镜图。
图9：血清蛋白吸附前后EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的粒径、PDI和Zeta 电位变化
图10：不同浓度EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒在DC2.4细胞上的毒性研究
图11：不同剂量的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒-Cy5在DC2.4细胞(上)和 BMDC细胞(下)孵育不同时间的摄取情况。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1阳离子脂质体的制备
采用薄膜分散-水化-超声法制备LP，具体方法如下：将DOTAP与Chol均用无水乙醇配制为10mg/mL的储备液，将DOTAP与Chol分别按1:1的比例加入到1000mL旋转瓶中，补加相应体积的无水乙醇至2mL。旋蒸结束后，将旋转瓶放置于真空条件下，进一步除去有机溶剂制备脂质膜。成膜后，加入2mL RNase-free水，水化脂质膜。水化完成后，将所得粗脂质体转移至10mL EP管中，用超声波细胞破碎仪对粗LP溶液进行破碎，超声功率设为80W，超声3s、停3s，超声总时间为3min。将超声后得到的 LP用0.22μm无菌水系滤膜过滤，即得。进一步进行粒径、PDI和电位测定，结果显示其粒径为54.1±2.4nm，PDI为0.16，电位为45mV。
实施例2 PLGA纳米粒的制备筛选
称取PLGA 20mg于2mL EP管中，加入1mL乙酸乙酯溶剂，制备油相。同时，称取80mgPVA于10mL EP管中，加入4mL 95℃的RNase-free水，配制成含有PVA 2％(w/v)的水相溶液。将油相快速注入水相中，迅速置于冰浴条件下，超声乳化，超声功率为300W，超声3s，间歇3s，总超声时间设为3min。超声结束后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，于37℃水浴中，75rpm条件下进行旋转蒸发即得。
超声功率筛选
称取20mg PLGA，并置于2mL EP管中，加入1mL乙酸乙酯，水浴超声溶解，制备油相。同时，称取40mg PVA于10mL EP管中，加入4mL 95℃的RNase-free水，使之溶解，配制成PVA浓度为1％(w/v)的水相溶液。用注射器将油相快速注入水相中，迅速置于冰浴条件下，超声乳化，超声功率分别设为150W、300W和450W，超声3s，间歇3s，总超声时间为3min。超声结束后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，于37℃水浴中，75rpm条件下进行旋转蒸发，得到PLGA纳米粒，粒径结果如附图1(A)。
超声时间筛选
称取PLGA 20mg于2mL EP管中，加入1mL乙酸乙酯，水浴超声溶解，制备油相。同时，称取40mg PVA于10mL EP管中，加入4mL 95℃的RNase-free水，使之溶解，配制成PVA浓度为1％(w/v)的水相溶液。用注射器将油相快速注入水相中，迅速置于冰浴的条件下，探头超声乳化，超声功率设置为300W，超声3s，间歇3s，总超声时间分别设为1min、3min和5min。超声结束后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，于37℃水浴中，75rpm条件下进行旋转蒸发，得到PLGA纳米粒。粒径结果如附图1(B)。
PVA用量筛选
称取PLGA 20mg于2mL EP管中，加入1mL乙酸乙酯，水浴超声溶解，制备油相。同时，分别称取20mg、40mg、60mg和80mg PVA于10mL EP管中。向上述EP 管中分别加入4mL 95℃的RNase-free水，使之溶解，配制成PVA浓度分别为0.5％、 1％、1.5％和2％(w/v)的水相溶液。用注射器将油相快速注入水相中，并迅速置于在冰浴的条件下，超声乳化，超声功率设为300W，超声3s，间歇3s，总超声时间设为3min。超声结束后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，于37℃水浴中，75rpm条件下进行旋转蒸发，得到PLGA纳米粒。粒径结果见附图1(C)。
PLGA浓度筛选
称取PLGA分别为5mg、10mg、20mg、30mg和40mg于2mL EP管中，分别加入1mL乙酸乙酯，水浴超声溶解，制备油相。同时，称取80mg PVA于10mL EP管中，加入4mL 95℃的RNase-free水，使之溶解，配制成含有PVA 2％(w/v)的水相溶液。将油相快速注入水相中，迅速置于冰浴条件下，超声乳化，超声功率为300W，超声3s，间歇3s，总超声时间设为3min。超声结束后，将该乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，于 37℃水浴中，75rpm条件下进行旋转蒸发，得到浓度分别为0.125％、0.25％、0.5％、 0.75％和1％(w/v)的PLGA纳米粒。粒径结果如附图1(D)。
实施例3核-壳纳米粒的制备筛选
超声功率筛选
按照实施例1的制备方法制备脂质膜，其中，DOTAP与Chol的摩尔比为1:1，总脂质浓度为6mM。将实施例2制备的PLGA纳米粒2mL加入到脂质膜中水化30min，再将水化后的溶液液转移至10mL EP管中，探头超声均质。超声功率分别设为30W、 50W、80W和100W，超声3s，间歇3s，总超声时间设为3min。超声结束后用马尔文粒径电位分析仪进行测定，结果如附图2。
由结果可知，直接水化后的粗核-壳纳米粒粒径为279.2±8.8nm，PDI为0.402±0.081。可见，水化得到的粗核-壳纳米粒粒径较大，且粒径分布不均匀。而随着超声功率的增加，核-壳纳米粒的粒径先减小后增大，当功率为50W时，所得核-壳纳米粒的粒径最小(117.9±4.7nm)，PDI小于0.2。此外，Zeta电位随超声功率的增加略有下降。当超声功率为50W时，Zeta电位约为30mV。因此，优选择超声功率为50W进行核- 壳纳米粒的制备。
超声时间筛选
按照实施例1的制备方法制备脂质膜，其中，DOTAP与Chol的摩尔比为1:1，总脂质浓度为6mM。将实施例2制备的PLGA纳米粒2mL加入到脂质膜中，水化30min。将水化后的溶液转移至10mL EP管中，探头超声均质。超声功率设为50W，超声3s，间歇3s，总超声时间分别设为1min、3min和5min。超声结束后用马尔文粒径电位分析仪进行测定，结果如附图3。
由结果可知，核-壳纳米粒的粒径和Zeta电位随着超声时间的延长均逐渐下降，当超声时间为5min时，所得核-壳纳米粒粒径最小(117.9±1.2nm)，PDI小于0.2，Zeta 电位约为30mV。
PLGA与磷脂比例筛选
按实施例1的制备方法制备脂质膜(DOTAP与Chol的摩尔比为1:1，总脂质浓度为6mM)。将实施例2制备的PLGA纳米粒按照PLGA与总脂质质量分别为2:1、1.5:1、 1:1、1:1.5、1:2和0:1调整浓度。取2mL调整浓度后的PLGA纳米粒加入到脂质膜中，水化30min。将水化后的溶液转移至10mL EP管中，探头超声均质。超声功率设为50W，超声3s，间歇3s，总超声时间设为5min。试验结束后用马尔文粒径电位分析仪进行测定，结果如附图4。
由结果可知，与PLGA纳米粒相比，核-壳纳米粒的粒径增大，这是由于PLGA纳米粒表面带有负电荷(Zeta电位：-5.11±0.61mV)，可以通过静电相互作用吸附带正电荷的脂质，粒径的增大说明脂质膜成功包裹在了PLGA纳米粒的表面。并且，随着PLGA 纳米粒比例的降低，核-壳纳米粒的粒径略有下降。Zeta电位呈升高趋势，说明PLGA 纳米粒比例的降低使得单个纳米粒表面可以吸附更多的阳离子脂质。此外，相比于 RNase-free水水化的LPDOTAP空白阳离子脂质体，以2％PVA水溶液水化的制剂粒径(即 PLGA与总脂质质量比为1:1)增大(101.4±10.9nm)，PDI增大(0.351±0.045)，Zeta 电位减小(26.6±1.4mV)。这说明高分子材料会影响脂质体的粒径和表面性质。
制剂外观检测
将上述制备的PLGA纳米粒和核-壳纳米粒置于EP管中，用照相机对其外观拍照；然后用激光笔进行照射并拍照，观察其丁达尔现象，结果如附图5。由图可知，PLGA 纳米粒及核-壳纳米粒溶液外观均匀，有淡蓝色乳光。激光照射后，可观察到丁达尔现象，说明核-壳纳米粒为胶体溶液且分布均匀。
实施例4 EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒复合物的处方筛选
不同PLGA/脂质质量比EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的凝胶电泳
以GFP-mRNA为模式mRNA，对不同PLGA/脂质质量比的核-壳纳米粒制剂负载 mRNA的能力进行考察，结果如附图6。由结果可知，PLGA NPs与mRNA的混合物中，出现mRNA条带，说明单纯PLGA纳米粒不能负载mRNA；而在试验设定的PLGA/脂质质量比条件下，均未发现mRNA条带，说明经过阳离子脂质包被的核-壳纳米粒均可以成功负载GFP-mRNA。
不同PLGA/脂质质量比EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的DC2.4细胞转染
以GFP-mRNA为模式mRNA，采用DC2.4细胞，考察不同PLGA/脂质质量比 EBV-LMP2mRNA的核-壳纳米粒的转染情况，结果如附图7。由结果可知，随着阳离子脂质比例的增加，EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的转染效率逐渐升高。当质量比为 1:2时，EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的转染效率达到70％以上。而比例为0:1时， EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的转染效率仅为54％。由此可以看出，PLGA纳米粒内核的嵌入提高了阳离子脂质体的转染效率。
综上，根据试验结果，本试验选择质量比为1:2的核-壳纳米粒为最优载体进行后续试验。
试验例1 EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒复合物的制剂学性质考察
粒径和Zeta电位
对空白LP、空白核-壳纳米粒及EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的粒径、PDI和 Zeta电位进行测定，结果如表1。
表1 LP、空白核-壳纳米粒及EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的粒径、PDI和Zeta电位
Figure BDA0002767896620000081
由结果可知，孵育LMP2-mRNA后，EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的粒径较孵育之前增大，且Zeta电位降低。
制剂外观及形态
将制备的核-壳纳米粒和EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒置于小瓶中，以水作为对照，用照相机对其外观拍照；然后用激光笔进行照射并拍照，观察其丁达尔现象，结果见附图8，核-壳纳米粒与EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒呈现淡蓝色乳光，激光照射后，两制剂可观察到丁达尔现象，说明其为均匀的胶体溶液。
采用透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)表征EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的形态及结构特征。具体操作如下：将EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒溶液滴加到有碳支持膜覆盖的铜网上，静置1min后，用滤纸吸去大部分溶液，于室温放置至表面干燥，滴加1％(w/v)的磷钨酸负染5min，除去多余染液，于室温自然干燥后，置于TEM中观察并拍照，结果如附图8。
由TEM照片可以看出EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒呈类球形，多室脂质体结构。而EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒呈圆整的球形，并且可以看到边界清晰的核- 壳结构，由此可以证明，本课题制备的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒是由PLGA纳米粒内核和脂质外壳构成。
实验例2血清蛋白吸附试验
将EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒与等体积的20％FBS或生理盐水注射液混匀，于37℃孵育2h。达到孵育时间后，于4℃条件下离心60min，转速为10000rpm，小心弃去上清。重新加入1.5mL生理盐水注射液混匀，4℃条件下再次离心2次，最后一次离心结束后弃上清，用生理盐水注射液重悬，进行粒径和电位测定。EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒血清蛋白吸附后粒径和电位变化的结果如附图9。
对比血清蛋白吸附前后EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的粒径和PDI可知，未用血清处理的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的粒径为191.07±3.30nm。血清处理后， EBV-LMP2mRNA的核-壳纳米粒的粒径增大，为404.47±12.89nm，且粒径分布增大。
实验例3安全性评价
细胞毒性研究
取制备的EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒制剂，分别用无血清培养基稀释至总脂质浓度为0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM和1μM，备用。
将融合度达到80％的DC2.4细胞消化、并计数，加入培养基稀释，以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，放置于培养箱中培养24h。培养结束后，弃去旧的培养基，将含有不同浓度EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的培养基加入到96孔板中，每孔100 μL，每个浓度平行6个孔。同时，对照组中采用不含血清的新鲜培养基。将96孔板置于培养箱中孵育24h后，向每孔中加入的MTT溶液(5mg/mL)20μL，然后，置于培养箱中孵育4h，弃上清，另在每孔加入150μL DMSO，于振荡器上震荡，溶解蓝紫色甲瓒结晶。采用多功能酶标仪检测各孔吸光度值，检测波长为492nm。测定完成后，采用如下公式计算细胞存活率(cell viability)：
Cell viability＝Abstest/Abscontrol*100％
其中，Abstest：含免疫制剂培养液培养细胞测得的吸光度值；Abscontrol：培养基培养细胞所测得的吸光度值。结果如附图10，EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒与DC2.4细胞孵育后，细胞存活率均在90％以上，说明EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的细胞毒性较低，安全性较好。
实验例4 DC2.4细胞与BMDC核-壳纳米粒摄取
参照EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒制备工艺，将其中的LMP2-mRNA替换为模式Cy5-mRNA，制备Cy5-mRNA核-壳纳米粒溶液，使Cy5-mRNA含量为0.01和0.02 mg/mL。培养DC2.4细胞，当细胞融合度达到80％时，收集DC2.4细胞，并计数，用培养基稀释细胞悬液，并将细胞接种于12孔板中，接种密度为1.5×105个/孔，体积为1mL，培养24h。试验前，轻轻吸去旧的培养基，用PBS轻柔地清洗细胞表面2次，然后，加入1mL不含血清的RPMI-1640基础培养基。将细胞放置于37℃培养箱中孵育30min 后，分别给予EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒-Cy5(每孔含Cy5-mRNA核-壳纳米粒溶液100ul)，然后，将培养板放置在培养箱中分别孵育0.5h、1h、2h、4h和6h。孵育结束后，快速吸去上清，并加入4℃PBS终止摄取，用PBS轻柔地清洗细胞表面3 次。最后一次清洗结束后，加入胰酶消化，收集细胞，并转移至流式管中，再用PBS 清洗2次。最后一次离心后，向每只流式管加入300μL PBS重悬细胞。采用流式细胞仪测定细胞中Cy5的荧光强度，结果如图11。
参照EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒制备工艺，将其中的LMP2-mRNA替换为模式Cy5-mRNA，制备Cy5-mRNA核-壳纳米粒，使Cy5-mRNA含量为0.01和0.02mg/mL。培养BMDC细胞，取纯度大于80％、未成熟的BMDC细胞用于细胞摄取试验。收集 BMDC细胞，于1000rpm条件下离心3min，弃去上清，另取不含血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，并接种于12孔板中，接种密度为1.5×105个/孔，体积为1mL，将培养板放置于37℃培养箱中培养2h后，进行细胞摄取试验。向每孔中分别给予EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒-Cy5(每孔含Cy5-mRNA核-壳纳米粒溶液100ul)，将培养板置于培养箱中分别孵育0.5h、1h、2h、4h和6h。培养结束后，收集BMDC细胞于流式管中，用PBS清洗细胞表面3次。清洗结束后，每只流式管加入300μL PBS重悬细胞。采用流式细胞仪测定细胞中Cy5的荧光强度，结果如附图11。

Claims (8)

1.一种载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒，其特征在于，它是由载有表达EBV-LMP2的mRNA与核壳纳米粒形成的纳米复合物；所述核壳纳米粒是由PLGA纳米粒和阳离子脂质体制备得到，其中，核-壳纳米粒中PLGA纳米粒和脂质的质量比为0.1～2/3∶1。
2.根据权利要求1所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒，其特征在于：核-壳纳米粒中纳米粒和脂质的质量比为0.1～0.5∶1。
3.根据权利要求1所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒，其特征在于：核-壳纳米粒中纳米粒和脂质的质量比为0.5～2/3∶1。
4.权利要求1～3任一项所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒的制备方法，其特征在于：先制备出PLGA纳米粒，然后在其表面包敷一层脂质双分子层获得核壳型纳米粒，再与mRNA溶液进行混合，得载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒。
5.根据权利要求4所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒的制备方法，其特征在于，载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒的制备步骤为：
A、称取PLGA材料溶于有机溶剂中，水浴超声溶解，制备油相溶液；称取表面活性剂溶于RNase-free水中，制成水相溶液；
B、将步骤A制备的油相溶液快速注入水相溶液中，迅速置于冰浴条件下，100～600W超声乳化1～5分钟，超声制备乳化溶液；超声结束后，将所述乳化溶液迅速转移至茄型瓶中，水浴条件下旋转蒸发，得到PLGA纳米粒；
C、取阳离子脂质材料和胆固醇，加入有机溶液溶解，加入到旋转瓶中，旋蒸成膜，完全除去有机溶剂后，加入RNase-free水，水化脂质膜，将水化液超声波细胞破碎仪超声后过0.22μm无菌水系滤膜挤出，即得空白脂质膜；
D、取步骤B制备的PLGA纳米粒加入到步骤C制备的脂质膜中水化30min，再将水化后的溶液，探头超声均质，即得核-壳脂质纳米粒；
E、取步骤D制备的核-壳纳米粒，加入RNase-free水稀释至一定的体积后，加入EBV-LMP2的mRNA溶液，混匀，孵育即得。
6.根据权利要求5所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤B所述表面活性剂为F68、PVA、TPGS中的任意一种，其中，PVA分子量为20000～70000道尔顿、PVA使用时配制成浓度为0.5％～6％(w/v) 的溶液，F68使用时配制成浓度为0.1％～3％(w/v) 的溶液，TPGS使用时配制成浓度为0.5％～5％(w/v) 的溶液；
或步骤B所述表面活性剂为F68、PVA、TPGS中至少两种的混合物，其中，PVA分子量为20000～70000道尔顿、PVA使用时配制成浓度为0％～6％(w/v) 的溶液，F68使用时配制成浓度为0％～3％(w/v) 的溶液，TPGS使用时配制成浓度为0％～5％(w/v) 的溶液。
7.根据权利要求5所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤C所述空白脂质膜为阳离子磷脂与附加剂的组合物，所述阳离子磷脂选自DOTAP、DOTMA、DOTIM、DDA、DC-Chol、CCS、diC14-脒、DOTPA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DORIE及其衍生物、DPRIE、DSRIE、DMRIE、DOGS、DOSC、LPLL、DODMA、DDAB、DOPE中的一种或多种的组合物，所述附加剂选自磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种或多种的组合物；步骤C所述有机溶剂选自可溶解磷脂的乙醇、甲醇、氯仿、乙醚有机溶剂。
8.权利要求1～3任一项所述的载EBV-LMP2 mRNA的核壳纳米粒在制备治疗EBV病毒引起的疾病的药物中的用途。
CN202011239305.XA 2020-11-09 2020-11-09 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用 Active CN112451504B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011239305.XA CN112451504B (zh) 2020-11-09 2020-11-09 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011239305.XA CN112451504B (zh) 2020-11-09 2020-11-09 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112451504A CN112451504A (zh) 2021-03-09
CN112451504B true CN112451504B (zh) 2022-10-18

Family

ID=74825231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011239305.XA Active CN112451504B (zh) 2020-11-09 2020-11-09 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112451504B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023064612A2 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of viral antigens and related methods
CN114848831A (zh) * 2022-03-16 2022-08-05 成都威斯津生物医药科技有限公司 包裹型纳米制剂及其载体的制备方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102727907B (zh) * 2011-04-13 2015-03-11 苏州瑞博生物技术有限公司 一种小干扰rna药物的给药系统和制剂
CN102362861B (zh) * 2011-11-04 2014-03-26 无锡中科光远生物材料有限公司 一种空心核壳结构复合纳米粒子及其制备方法
US9884026B2 (en) * 2013-11-01 2018-02-06 Yale University Modular particles for immunotherapy
CN104434806B (zh) * 2014-11-06 2017-05-03 中国人民解放军第四军医大学 一种具有高载药量及主动靶向效应的脂质混合plga纳米粒
CN104491857B (zh) * 2014-12-24 2018-08-31 深圳市中美康士生物科技有限公司 一种用于免疫治疗ebv相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法
CN109310753A (zh) * 2016-03-01 2019-02-05 德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心（有限公司） 用于治疗疱疹病毒感染的手段和方法
CN106177986B (zh) * 2016-08-16 2019-05-03 国家纳米科学中心 一种脂质体-聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用
CN112237628A (zh) * 2019-07-17 2021-01-19 四川大学华西医院 靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
CN110638788A (zh) * 2019-10-25 2020-01-03 广州医科大学 一种能够沉默Pcsk9蛋白的siRNA、其纳米递送系统及应用
CN111690050B (zh) * 2020-06-12 2021-10-22 深圳市因诺转化医学研究院 识别ebv-lmp2抗原的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficient inhibition of ovarian cancer by short hairpin RNA targeting claudin-3;Sun, Chuntang;《Oncology Reports》;20111231;193-200 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112451504A (zh) 2021-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023279836A1 (zh) 一种用于核酸递送的可电离脂质化合物及其lnp组合物
CN112451504B (zh) 一种载EBV-LMP2 mRNA的核-壳纳米粒的制备方法及应用
WO2019223728A1 (zh) 甘露糖靶向的纳米制剂及其制备和应用
AU2017216525B2 (en) pH-SENSITIVE CARRIER AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF, pH-SENSITIVE MEDICINE AND pH-SENSITIVE PHARMACEUTICAL COMPOSITION EACH CONTAINING SAID CARRIER, AND CULTURE METHOD USING SAID pH-SENSITIVE MEDICINE OR SAID pH-SENSITIVE PHARMACEUTICAL COMPOSITION
WO2021043231A1 (zh) 一种双靶向材料及其在药物传递中的应用
CN112076158A (zh) 一种治疗慢性肾炎的脂质体-纳米粒复合体
CN115252582A (zh) 红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用
CN109432049B (zh) 一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒及应用
WO2022262050A1 (zh) 一种非病毒载体及其制备方法与应用
Lei et al. Oral hydrogel nanoemulsion co-delivery system treats inflammatory bowel disease via anti-inflammatory and promoting intestinal mucosa repair
EP2891495B1 (en) Lipid membrane structure including bacterial cell component having dispersibility in non-polar solvent, and method for producing same
CN112237628A (zh) 靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
CN111228222A (zh) 纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用
CN113975244B (zh) 一种仿生磁靶向阳离子脂质体及其制备方法和应用
CN116763757A (zh) 一种包裹型复合物及其制剂的制备方法和应用
CN114288400A (zh) 一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用
CN114053225A (zh) 一种高效低毒且稳定性良好的用于基因递送的阳离子脂质体及其应用
CN112972377B (zh) 一种姜黄素和胡椒碱复方自微乳制剂及其制备方法和应用
CN117363652B (zh) 一种双转录因子调控的双启动质粒、纳米材料及其制备方法和应用
CN114712343B (zh) 一种携载光甘草定的脾靶向纳米药物的制备方法及应用
CN113995852B (zh) Arg-脂质体微囊、微囊包封的鱼精蛋白-siRNA复合体及其制备方法和应用
CN116712407A (zh) 一种基于化疗-基因治疗协同的无载体纳米粒及其制备和抗肝癌应用
Zhang et al. Regulation of CTLs/Tregs via Highly Stable and Ultrasound‐Responsive Cerasomal Nano‐Modulators for Enhanced Colorectal Cancer Immunotherapy
CN117205332A (zh) 一种基于表观遗传调控的pH响应型脂质体及其制备方法和应用
Xiang et al. Construction of a novel amphiphilic peptide paclitaxel rod micelle: Demonstrating that the nano-delivery system shape can affect the cellular uptake efficiency of paclitaxel and improve the therapeutic efficacy for breast cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant