CN109310753A - 用于治疗疱疹病毒感染的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供疱疹病毒，比如EBV，所述疱疹病毒缺少至少一种病毒miRNA。此类缺少至少一种病毒miRNA的疱疹病毒有利地不能将其基因组包装到衣壳中，由此产生HVLP，该HVLP基本上不含其疱疹病毒基因组或编码HVLP的蛋白质部分的核酸分子和病毒miRNA。这种HVLP可以用作疫苗。

Description

用于治疗疱疹病毒感染的手段和方法

背景技术

Epstein-Barr病毒(EBV)是一种致癌性疱疹病毒，其感染全世界人口的90％以上，但特别对免疫受损的宿主造成巨大威胁。EBV导致许多急性和慢性、炎性、自身免疫和恶性障碍，包括几种类型的免疫抑制患者中严重的和危及生命的淋巴组织增生性疾病。有风险的患者是实体器官或造血干细胞移植(SOT/SCT)候选者以及HIV感染患者，和先天性免疫缺陷患者。EBV-相关的PTLD的一个重要危险因素是移植时的血清阴性，这解释了PTLD在儿童中特别高的发生率。根据移植类型的不同，高达15％的儿科移植患者会受到影响，最终其中有20％的患者死于PTLD(Mynarek等，Clin Dev Immunol.2013；2013：814973)。

EBV是普遍存在的且具有免疫原性。这种致癌性疱疹病毒(IARC Working Group，IARC Monogr.Eval.Carcinog.Risks Hum.94，46-70(2010))已经进化出多种基因从而在其感染建立时抵御免疫应答(Ressing等，Semin.Cancer Biol.18，397-408(2008))。然而，这些病毒基因不会在B淋巴细胞(EBV的主要靶细胞)感染时立即积聚。因此，早期感染应该是EBV致命的弱点，这是EBV不免除宿主免疫反应的窗口。

预防性疫苗被认为是减轻EBV-相关的恶性和非恶性疾病负担的最有效步骤。在儿童和青少年中不仅PTLD而且传染性单核细胞增多症(IM)以及地方性Burkitt淋巴瘤均是被识别为预防性EBV疫苗的适应症的疾病(Balfour，Curr Opin Virol.，2014，vol.6，pp.1-5；Cohen等，Sci Transl Med.，2011，3(107)：107fs7；Cohen等，Vaccine，2013，31Suppl 2：B194-6)。这些疾病也是计划性VLP疫苗的功效试验的次要目标。在几乎40年前Epstein制定了第一个疫苗提案，但仍然没有可行的疫苗。除了类人灵长类动物之外的易处理的动物模型的缺乏以及病毒的复杂性显著阻碍了进展。大多数预防EBV感染或相关疾病的疫苗努力均集中在gp350上，gp350是病毒粒子的最丰富的糖蛋白，也是天然存在的中和抗体的主要靶标。具有可溶性形式gp350的疫苗接种降低了EBV血清阴性成人中的IM率，但对EBV感染率没有影响(Sokal等，J Infect Dis.，2007，196(12)：1749-53)。另一种基于gp350的疫苗在等待移植的具有慢性肾疾病的EBV阴性儿童中诱导抗体应答，但未能预防EBV-相关疾病的移植后不良后果(Rees等，Transplantation，2009，88(8)：1025-9)。总之，少数临床疫苗接种试验表明，针对EBV-相关疾病的预防性疫苗接种是可行的，但该试验还证明，目前的疫苗接种策略需要大大改进，以预防所有疫苗接种者的原发感染和/或EBV-相关疾病。因此，迫切需要一种针对EBV的疫苗。

本申请的发明人揭示，EBV在感染原代B-细胞时利用其编码的miRNA有效地抑制了适应性免疫应答的多个分支。这些miRNA控制抗原特异性T细胞活化和识别所需的全部三种信号：(i)抗原肽加工并呈递至T细胞；(ii)EBV感染的B细胞上的调节T细胞活化的重要辅助受体(co-receptor)的水平；和(iii)将初始(naive)CD4⁺T细胞极化为抗病毒Th1辅助细胞的促炎和其它细胞因子的分泌，由此miRNA保护新感染的B淋巴细胞免于免疫消灭，从而使EBV终生成功。即，本申请的发明人发现EBV的miRNA直接靶向细胞基因以抑制细胞因子的分泌、抗原加工、EBV特异性CD4+和CD8+T细胞对病毒感染细胞的识别和/或初始T细胞向抗病毒Th1细胞的分化。单一病原体的多种miRNA对适应性免疫应答的多种和大规模抑制是出乎意料且前所未有的。

本申请的发明人得到的结果也可说明在复杂持久性病毒中miRNA的丰度，并阐明人类病原体是如何能够在具有强烈的适应性免疫应答的情况下在其宿主的生命周期中逃避消除的。这种全局抑制允许病毒在细胞中表达建立其终生感染最初所需的抗原功能，从而避免被T细胞破坏。

通过使用密切模拟自然感染的人细胞模型，本申请的发明人发现，EBV的miRNA抵抗(counteract)多种抗病毒适应性免疫通路，详见所附实施例的描述和在附图中阐释。

鉴于本申请的发明人关于EBV miRNA在感染中的突出作用的惊人发现，人们希望不仅从EBV中，而且也从EBV所属的其它疱疹病毒中消除此类miRNA。事实上，已知除EBV外，其它疱疹病毒也具有miRNA，设想这些miRNA也具有与EBV的miRNA同样显著的作用(Boss等，2009，Trends in Microbiology，vol.17，issue 12，pp.544-553)。

因此，本发明提供了疱疹病毒，比如γ疱疹病毒，如EBV，所述疱疹病毒缺少至少一种病毒miRNA或优选地缺少全部病毒miRNA。这种缺少至少一种病毒miRNA或优选地缺少全部病毒miRNA的疱疹病毒同样有利地不能将它们的基因组或编码病毒的蛋白质部分的核酸分子包装到衣壳中，由此产生疱疹病毒样颗粒(HVLP)或Epstein-Barr病毒样颗粒(EBVLP)，所述HVLP或EBVLP基本上不含其疱疹病毒基因组或编码病毒的蛋白质部分的核酸分子和miRNA。

病毒样颗粒(VLP)与成熟病毒粒子结构相似，但缺少病毒基因组。因此，VLP是有希望的疫苗接种的候选者。因此，本发明的这种HVLP和EBVLP可用作疱疹病毒疫苗。

发明内容

因此，本发明提供一种包含疱疹病毒蛋白的疱疹病毒样颗粒(HVLP)，所述疱疹病毒蛋白由至少一种核酸分子编码，所述至少一种核酸分子仍包含编码疱疹病毒miRNA的miRNA编码基因座，其中所述miRNA编码基因座中的至少一种是遗传修饰的。

术语“疱疹病毒样颗粒”和“HVLP”在本文中互换使用并涉及这样的颗粒，该种颗粒与传染性疱疹病毒颗粒具有共同的形态学和免疫学特性，但缺少病毒基因组，因此优选地该种颗粒不能在合适的宿主细胞中传播感染和/或复制。原则上，根据本发明的HVLP可以包含野生型病毒的全部疱疹病毒蛋白，因此优选具有可以通过电子显微术分析的典型疱疹病毒结构，即本发明的HVLP具有衣壳、被膜和外膜。因此，本发明的HVLP可包含疱疹病毒衣壳或衣壳前体蛋白、表面蛋白、包膜蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、糖蛋白、被膜蛋白、产生B细胞和/或T细胞表位的蛋白。然而，如本文所述，与野生型病毒株相比，本发明的HVLP的某些疱疹病毒蛋白可以是遗传修饰的。此外，还设想所述HVLP缺少一种或多种非必需病毒蛋白。这种非必需病毒蛋白被包含在野生型HVLP中，但对于HVLP的形成不是必需的，这可以通过在没有由所述基因编码的多肽的情况下根据本文描述的方法产生的HVLP的电子显微术检测。优选地，本发明的HVLP包含源自一种疱疹病毒(如Epstein-Barr病毒)的蛋白或由源自一种疱疹病毒(如Epstein-Barr病毒)的蛋白组成，和甚至更优选地，本发明的HVLP包含源自一种疱疹病毒株(如Epstein-Barr病毒株B95.8、1型Epstein-Barr病毒或2型Epstein-Barr病毒，其中Epstein-Barr病毒株B95.8是优选的)的蛋白或由源自一种疱疹病毒株(如Epstein-Barr病毒株B95.8、1型Epstein-Barr病毒或2型Epstein-Barr病毒，其中Epstein-Barr病毒株B95.8是优选的)的蛋白组成。

本文所用术语“疱疹病毒蛋白”不仅包含野生型疱疹病毒株的蛋白，还包含这样的蛋白，就序列而言该种蛋白与野生型疱疹病毒株的蛋白不同，但与野生型疱疹病毒株的蛋白具有至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。举例而言，野生型Epstein-Barr病毒蛋白优选由原型Epstein-Barr病毒B95.8(基因库登录号V01555)编码。此外，野生型Epstein-Barr病毒蛋白可由1型Epstein-Barr病毒(基因库登录号NC_007605.1)或由2型Epstein-Barr病毒(基因库登录号NC_009334.1)编码。

“序列同一性”或“序列同源性”是指使用标准化算法比对的至少两个多肽或多核苷酸序列之间的残基匹配的百分数。为了使两条序列之间的比对最佳，这种算法可以以标准化的和可重现的方式在被比较的序列中插入间隙(gap)，因此达到两条序列的更有意义的比较。对于本发明的目的，采用NCBI BLAST程序2.3.0版本(2016年1月13日)(Altschul等，NucleicAcids Res.(1997)25：3389-3402)测定两条氨基酸序列之间的序列同一性。可以采用设定如下参数的blastp测定两条氨基酸序列的序列同一性：矩阵：BLOSUM62，字长：3；期望值：10；空位代价：存在＝11，延伸＝1；组合调整(Compositional adjustment)：有条件的组合评分矩阵调整。

除疱疹病毒蛋白外，本发明的HVLP还可包含一种或多种人工蛋白。本文所用术语“人工蛋白”涉及不是由野生型疱疹病毒编码的蛋白。人工蛋白可选自另外的外源抗原序列、细胞因子、CpG基序、g-CMSF、荧光蛋白、可用于颗粒纯化目的的蛋白或用于附着标记的蛋白、转运过程所需的蛋白质样结构等等。

本发明的HVLP涉及一种颗粒，其蛋白质样部分由所述至少一种核酸分子编码。因此，所述至少一种核酸分子可包含野生型疱疹病毒的全部基因从而编码该野生型疱疹病毒的全部疱疹病毒蛋白，并且所述至少一种核酸分子可进一步也包含该疱疹病毒的全部非编码核酸序列(如miRNA编码基因座、顺式作用元件)。因此，所述至少一种核酸分子可包含所述野生型病毒的全部编码和非编码核酸序列。然而，如本文所述，与野生型疱疹病毒相比，所述至少一种核酸分子的某些基因、编码序列或非编码序列可以被修饰。此外，与野生型病毒相比，所述至少一种核酸分子可能缺少对HVLP形成不是必需的一种或多种基因，这可以通过在没有由所述基因编码的多肽的情况下根据本文描述的方法产生的HVLP的电子显微术确定。因此，所述至少一种核酸分子能够在合适的宿主细胞中使本发明的HVLP产生。举例来说，编码Epstein-Barr病毒样颗粒(EBVLP)的所述至少一种核酸分子可包含野生型Epstein-Barr病毒(如EBV株B95.8)的全部编码和/或非编码序列，所述序列可包含一种或多种遗传修饰，比如(i)B细胞转化所需的一种或多种病毒致癌基因(如EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、LMP1、LMP2、EBNA3A和EBNA3C)的功能性失活，(ii)一种或多种顺式作用元件(如末端重复、TR)的功能性失活或编码对所述至少一种核酸分子的剪切和包装必需的门户蛋白的病毒基因(如BFLF1、BBRF1、BGRF1、BDRF1、BALF3、BFRF1A和BFRF1)的功能性失活，(iii)诱导病毒合成所需的一种或多种病毒基因(如BZLF1、BRLF1和BMLF1)的功能性失活，和/或(iv)至少一种miRNA编码基因座的功能性失活。因此，在本发明的优选的实施方案中，所述至少一种核酸分子是一种与野生型EBV基因组的区别仅在于上述已识别的特征的核酸分子。然而，还设想所述EBVLP缺少一种或多种非必需病毒蛋白。这种非必需病毒蛋白被包含在野生型EBVLP中，但对于EBVLP的形成不是必需的，这可以通过在没有由所述基因编码的多肽的情况下根据本文描述的方法产生的EBVLP的电子显微术检测。此外，优选地，所述至少一种核酸分子包含源自一种疱疹病毒(如Epstein-Barr病毒)的核酸序列或由源自一种疱疹病毒(如Epstein-Barr病毒)的核酸序列组成，和甚至更优选地，所述至少一种核酸分子包含源自一种疱疹病毒株(如Epstein-Barr病毒株B95.8、1型Epstein-Barr病毒或2型Epstein-Barr病毒，其中Epstein-Barr病毒株B95.8是优选的)的核酸序列或由源自一种疱疹病毒株(如Epstein-Barr病毒株B95.8、1型Epstein-Barr病毒或2型Epstein-Barr病毒，其中Epstein-Barr病毒株B95.8是优选的)的核酸序列组成。在本发明进一步优选的实施方案中，编码EBVLP的所述至少一种核酸分子不编码功能性BHRF1蛋白。

术语“疱疹病毒基因”和“野生型疱疹病毒基因”在本文中互换使用，其不仅包含野生型病毒株的基因，还包含这样的基因，就序列而言该种基因与野生型疱疹病毒株的基因不同，但与野生型疱疹病毒株的基因具有至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同源性。举例而言，野生型Epstein-Barr病毒基因优选由原型Epstein-Barr病毒B95.8编码。此外，野生型1型Epstein-Barr病毒基因由1型Epstein-Barr病毒(基因库登录号NC_007605.1)编码，野生型2型Epstein-Barr病毒基因由2型Epstein-Barr病毒(基因库登录号NC_009334.1)编码。

因此，当在合适的宿主细胞中表达至少一种核酸时，表达所述疱疹病毒蛋白，从而形成HVLP。因此，本发明的HVLP可通过宿主细胞获得，所述宿主细胞包含编码疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸，所述至少一种核酸仍包含编码疱疹病毒miRNA的miRNA编码基因座，其中所述miRNA编码基因座中的至少一种是遗传修饰的。然而，本发明的HVLP是优选通过内体分拣转运复合体(ESCRT)在形成后从宿主细胞释放的。因此，本发明的HVLP还包含源自宿主细胞的细胞组分，比如脂质、蛋白质、糖蛋白(如CD63)、核酸(如mRNA和miRNA)、细胞膜等等。

本文所用术语“细胞膜”涉及通过自发排列形成脂质双分子层而天然形成细胞膜的脂质(比如两亲性磷脂)，其中在自组装后，两亲性磷脂的疏水区域形成该双分子层的内部部分而亲水区域形成膜的外表面。优选地，这种细胞膜源自本发明的HVLP来源的宿主细胞，并形成本发明的HVLP的外膜。此外，这种细胞膜包含蛋白质，如EBV结构蛋白(比如gp350)和/或EBVLP情况下的LMP-1。

本文所用术语“疱疹病毒”涉及疱疹病毒科(Herpesviridae)的任何病毒。然而，优选为感染人的疱疹病毒，比如人疱疹病毒1(单纯疱疹病毒1或HSV-1)、人疱疹病毒2(单纯疱疹病毒2或HSV-2)、人疱疹病毒3(水痘-带状疱疹病毒或VZV)、人疱疹病毒4(Epstein-Barr病毒或EBV)、人疱疹病毒5(人巨细胞病毒或HCMV)、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8(卡波西肉瘤相关疱疹病毒或KSHV)。甚至更优选的是人疱疹病毒4(Epstein-Barr病毒或EBV)，其涉及1型EBV和2型EBV和优选为EBV株B95.8。然而，还设想的是鼠疱疹病毒4(如鼠γ疱疹病毒68或MHV-68)和牛疱疹病毒1(如牛传染性鼻气管炎病毒)。

术语“蛋白”或“多肽”在本文中互换使用，指一种包含通过肽键连接在一起的氨基酸聚合物的分子。在本文中，所述术语并不意指特定长度的分子。多肽包含氨基酸序列，并且因此有时包含氨基酸序列的多肽在本文中称为“包含多肽序列的多肽”。因此，本文中术语“多肽序列”与术语“氨基酸序列”互换使用。

术语“氨基酸”或“aa”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及之后经过修饰的那些氨基酸，如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，具有与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳原子，比如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但是以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的化学化合物。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核苷酸分子”或“核酸”在本文中互换使用并指聚合物形式的核苷酸，其通常将一个脱氧核糖或核糖与另一个脱氧核糖或核糖连接。优选地，术语“多核苷酸”包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可包括RNA(含有核糖核苷酸)的有义链和反义链、cDNA、基因组DNA以及上述的合成形式和混合聚合物。

本发明的HVLP的疱疹病毒蛋白由至少一种核酸分子编码。因此，所述HVLP的疱疹病毒蛋白可以由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种核酸分子编码。然而，在本发明的优选的实施方案中，所述HVLP的疱疹病毒蛋白由一种核酸分子编码。

编码疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子仍包含编码HVLP的疱疹病毒miRNA的miRNA编码基因座，其中所述miRNA编码基因座中的至少一种是遗传修饰的。此类miRNA编码基因座源自疱疹病毒并因此编码病毒miRNA。因此，在上下文中，术语“仍包含”意指miRNA编码基因座源自疱疹病毒，优选源自与所述蛋白质来源相同的疱疹病毒，并且仍由编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子包含。或者换言之，所述至少一种核酸分子包含包括该miRNA编码基因座的疱疹病毒编码和非编码核酸序列。此类病毒miRNA通常在宿主细胞中表达并因此在病毒合成时包装在病毒颗粒中。因此，如本文所述，在产生HVLP时，所述病毒miRNA也包装在HVLP中。然而，此类病毒miRNA可以抵抗宿主的抗病毒免疫，这在采用HVLP接种时可能是有害的。因此，所述至少一种核酸分子的至少一种miRNA编码基因座(其编码至少一种miRNA)是遗传修饰的。然而，也可以是超过一种，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多的miRNA编码基因座是遗传修饰。在本发明的一个优选的实施方案中，全部病毒miRNA编码基因座都是遗传修饰的。在进一步的实施方案中，所述疱疹病毒的每个miRNA簇的至少一种miRNA编码基因座是遗传修饰的(如，在Epstein-Barr病毒的情况下，BART簇的至少一种miRNA编码基因座和BHRF1簇的至少一种miRNA编码基因座)。

本文所用术语“miRNA”涉及长度为约21至25个核苷酸的小的非编码单链RNA。miRNA的5′-末端(即所谓的种子序列)通常在3′非翻译区内识别部分互补的mRNA靶标并抑制这些mRNA的翻译。miRNA编码基因座通常首先通过RNA聚合酶II转录成较长的初级miRNA(pri-miRNA)。然后RNase III酶Drosha识别并切割pri-miRNA以得到发夹结构，该发夹结构通常为60至80nt长，称为pre-miRNA，其被转运至细胞质中并由另一种名为Dicer的RNaseIII酶进一步加工以产生RNA双链体。所述RNA双链体与Argonaute(Ago)蛋白、Dicer和GW182在RNA诱导的沉默复合物(RISC)中结合，并在该处所述RNA双链体被解开。通常，在此阶段，一条链(“星链(star strand)”)被降解，而另一条链(成熟的miRNA)被保留。miRNA指导所述RISC特异性识别和调节靶mRNA。因此，miRNA是许多生物过程的关键调节剂，所述生物过程不仅包括发育定时、分化和染色体编组(pattering)，还包括细胞增殖、细胞死亡、免疫应答、造血作用以及细胞转化或瘤形成。一个单一的miRNA可以直接调节数百种不同mRNA的表达。

举例而言，疱疹病毒miRNA为单纯疱疹病毒1的H1至H8和H11至H18，单纯疱疹病毒2的H2至H7和H9至H13和H19至H25，巨细胞病毒的miR-UL36-5p、miR-UL36-3p、miR-UL112、miR-US4、miR-US5-1、miR-US5-2、miR-US25-1-5p、miR-US25-1-3p、miR-US25-2-5p、miR-US25-2-3p、miR-US33-3p、miR-UL22A-5p、miR-UL22A-3p、miR-UL70-5p、miR-US33-5p、miR-UL70-3p和miR-UL112-1，卡波西肉瘤相关病毒的miR-K1-5p、miR-K2-5p、miR-K3-5p、miR-K3_+1_5、miR-K4-3p、miR-K4-5p、miR-K5-3p、miR-K6-3p、miR-K6-5p、miR-K7-3p、miR-K7-5p、miR-K8-3p、miR-K8-5p、miR-K9-3p、miR-K9-5p、miR-K10a(-3p)、miR-K10b-(-3p)、miR-K10b_+1_5(-3p)、miR-K10b_+1_5(-3p)、miR-K11-3p、miR-K12-3p、miR-K12-5p和Epstein-Barr病毒pre-miRNA、miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1、miR-BART2、miR-BART3、miR-BART4、miR-BART5、miR-BART6、miR-BART7、miR-BART8、miR-BART9、miR-BART10、miR-BART11、miR-BART12、miR-BART13、miR-RART14、miR-BART15、miR-BART16、miR-BART17、miR-BART18、miR-BART19、miR-BART20、miR-BART21、miR-BART22，产生四种成熟的BHRF1miRNA和40种BART miRNA。然而，目前还未识别出针对疱疹病毒水痘-带状疱疹病毒和HHV-7的miRNA。因此，本发明的优选的疱疹病毒是人疱疹病毒1(单纯疱疹病毒1或HSV-1)、人疱疹病毒2(单纯疱疹病毒2或HSV-2)、人疱疹病毒4(Epstein-Barr病毒或EBV)、人疱疹病毒5(人巨细胞病毒或HCMV)、人疱疹病毒6、人疱疹病毒8(卡波西肉瘤相关疱疹病毒或KSHV)。甚至更优选的是人疱疹病毒4(Epstein-Barr病毒或EBV)，其涉及1型EBV和2型EBV，并且优选地为EBV株B95.8。在进一步的实施方案中，本发明不涉及源自不表达miRNA的疱疹病毒的HVLP。

本文关于miRNA编码基因座所用的术语“遗传修饰的”通常涉及任何遗传修饰或突变，其导致病毒miRNA的功能性失活，使得该病毒miRNA不再能够干扰靶向的mRNA的转录。在本发明的优选的实施方案中，打乱miRNA编码基因座的核苷酸序列，使得病毒miRNA的前体转录，但不进一步加工以产生功能性miRNA。不受理论的束缚，这种乱序的miRNA编码序列消除了宿主细胞中成熟miRNA的表达，并因此产生不含病毒miRNA或其功能前体的HVLP。这种乱序的miRNA编码基因座优选产生具有错误的3D结构的初级miRNA(pri-miRNA)。

本文所用术语“错误的3D结构”涉及遗传修饰的pri-miRNA，该种pri-miRNA不能折叠成pri-miRNA的特定发夹结构，并因此不被核RNaseIII酶Drosha加工成成熟miRNA。然而，也可以使miRNA编码基因座缺失。因此，本文所用的遗传修饰实现：至少一种疱疹病毒miRNA不表达或仅部分表达，至少一种疱疹病毒miRNA不与其靶序列结合，至少一种疱疹病毒miRNA、pri-miRNA或前体有错误的3D结构，疱疹病毒miRNA的至少一种前体不被进一步加工，至少一种疱疹病毒miRNA或其前体被细胞降解，至少一种疱疹病毒miRNA编码基因座具有乱序的序列，至少一种疱疹病毒miRNA编码基因座缺失，和/或至少一种疱疹病毒miRNA或其前体包含突变、缺失或插入。在优选的实施方案中，本文所用的遗传修饰实现：至少一种疱疹病毒miRNA不表达或仅部分表达，至少一种疱疹病毒miRNA不与其靶序列结合，至少一种疱疹病毒miRNA、pri-miRNA或前体具有错误的3D结构，疱疹病毒miRNA的至少一种前体不被进一步加工，至少一种疱疹病毒miRNA或其前体被细胞降解，至少一种疱疹病毒miRNA编码基因座具有乱序的序列，和/或至少一种疱疹病毒miRNA或其前体包含突变或插入，但无疱疹病毒miRNA编码基因座缺失或包含缺失。优选地，这种遗传修饰不改变野生型核苷酸组成和所述病毒的基因组结构。可以通过将所述遗传修饰的miRNA编码基因座的核苷酸序列与野生型病毒(即在EBV的情况下具有基因库登录号AJ507799的EBV参考株)的相应miRNA编码基因座的核苷酸序列进行比较来识别遗传修饰的miRNA编码基因座。因此，本发明的miRNA编码基因座的遗传修饰导致偏离野生型病毒(如，EBV株AJ507799)的相应基因座的序列，并实现：所述miRNA不表达或仅部分表达，所述miRNA不与其靶序列结合，所述miRNA或其前体具有错误的3D结构，所述miRNA不被进一步加工，所述miRNA或其前体由细胞降解，所述miRNA编码基因座具有乱序的序列，所述miRNA编码基因座缺失，和/或至少一种疱疹病毒miRNA或其前体包含突变、缺失或插入。

本申请的发明人惊讶地发现，Epstein-Barr病毒的miRNA编码免疫抑制功能并抑制宿主的适应性免疫应答。因此，当与包含由不含遗传修饰的疱疹病毒miRNA编码基因座的至少一种核酸编码的疱疹病毒蛋白的HVLP相比时，由所述至少一种核酸分子包含的miRNA编码基因座中的至少一种的遗传修饰导致增强的免疫应答，其中如在本文所述的分析中测定的，所述增加为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多或优选地至少5％。

本文所述的关于增加的免疫应答的检测的术语“分析”通常涉及适于检测(优选地淋巴细胞，比如B细胞、T细胞、NKT细胞的)免疫应答的任何分析。举例而言，通过使用合适的免疫学分析(比如定量ELISA(酶联免疫吸附测定))可以测量由免疫细胞(优选淋巴细胞，比如B细胞、T细胞或任何其他淋巴细胞)新合成或释放的促炎细胞因子。在本文中，这种定量ELISA可以与本发明一起使用以测量免疫细胞(优选淋巴细胞，比如B细胞、T细胞或任何其他淋巴细胞，更优选地为B细胞)上清液中的细胞因子浓度。可以根据本发明测量的细胞因子通常是所有促炎细胞因子，如IL-6和TNF-α和其他细胞因子，如IL-12(包含分别由基因IL12A和IL12B编码的蛋白p35和p40)、IL-12B(包含由基因IL12B编码的两个p40蛋白)和IL-23(包含分别由基因IL12B和IL23A编码的蛋白p40和p19)。在IL-12的情况下，已知若干EBVmiRNA抑制基因IL12B的转录物，因此减少细胞因子IL12、IL12B和IL23的分泌。因此，优选地通过采用定量ELISA测量B细胞的上清液中的细胞因子(如，IL-12、IL-6、TNF-α)浓度来测量所述增加的免疫应答，所述B细胞已与HVLP或EBVLP一起温育，所述HVLP或EBVLP缺少至少一种根据本发明的疱疹病毒或EBV miRNA(即所述HVLP或EBVLP的疱疹病毒蛋白或EBV蛋白由至少一种核酸分子编码，所述至少一种核酸分子仍包含编码疱疹病毒或EBV miRNA的miRNA编码基因座，其中所述miRNA编码基因座中的至少一种是遗传修饰的)，然后将测量的细胞因子浓度与在另一种B细胞上清液中测量的细胞因子浓度进行比较，所述另一种B细胞已与不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP一起温育，其中优选地所述不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP由包含与野生型病毒(即在EBV的情况下，参考株AJ507799)相同的miRNA编码基因座的核酸分子编码。可以将所述分析中的B细胞温育至少3小时、至少6小时、至少9小时、至少12小时、至少15小时、至少18小时、至少21小时、至少24小时、至少27小时、至少30小时、至少36小时、至少39小时、至少42小时、至少45小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少66小时、至少72小时、至少84小时、至少96小时或更长，优选24小时或36小时或更长，优选24小时至36小时之间的任何时间。此外，可以使用利用对细胞因子转录物(IL-6、TNF-α、IL-12或其他细胞因子转录物)特异性的引物的定量RT-PCR来测量新合成的细胞因子。因此，可以通过例如如下方式测量所述增加的免疫应答：通过采用使用IL-12和优选IL-12B转录物特异性引物的定量RT-PCR测量已与本文所述HVLP或EBVLP一起温育的B细胞的IL-12转录物，并将自已与根据本发明缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP一起温育的B细胞获得的结果与自已与不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP一起温育的B细胞获得的结果进行比较，其中优选地所述不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP由包含与野生型病毒(即在EBV的情况下，参考株AJ507799)相同的miRNA编码基因座的核酸分子编码。此外，所述分析可以是这样一种分析，该种分析采用免疫细胞(优选淋巴细胞，比如T细胞、NKT细胞或其他淋巴细胞)作为读数来测量增加的免疫应答。这种称为效应细胞的免疫细胞识别与HVLP或EBVL一起温育的B细胞(即呈现源自HVLP或EBVL的抗原表位的B细胞)。表位识别后，所述免疫细胞以增加的细胞因子分泌响应或甚至杀伤与HVLP或EBVLP一起温育的B细胞。因此，可以例如通过测量所述免疫效应细胞的上清液中的细胞因子(如GM-CSF或IFN-γ)浓度来测量增加的免疫应答，所述免疫效应细胞已经与采用缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP温育的B细胞一起温育，与另一种免疫效应细胞的上清液中的细胞因子浓度比较，所述另一种免疫效应细胞已经与采用不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP温育的B细胞一起温育，其中优选地所述不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP由包含与野生型病毒(即在EBV的情况下，参考株AJ507799)相同的miRNA编码基因座的核酸分子编码。所述增加的免疫应答可以进一步通过如下方式测量：通过对效应细胞表面的分泌的细胞因子染色来测量效应细胞的细胞因子释放。所述效应细胞的增加的免疫应答还可以通过测量采用HVLP或EBVL温育的B细胞的杀伤来测量。在杀伤实验之前，使用染料(如钙黄绿素乙酰氧甲酯)对采用缺少至少一种病毒miRNA的HVLP或EBVLP温育的B细胞和对采用不缺少至少一种病毒miRNA的HVLP或EBVLP温育的B细胞进行染色。在效应细胞介导的杀伤后，钙黄绿素释放到上清液中，上清液中钙黄绿素的浓度与被杀死细胞的数量成比例并可以通过荧光测量来量化。因此，钙黄绿素的增加表明免疫应答增加。因此，可以通过比较采用缺少至少一种病毒miRNA的HVLP或EBVLP温育的B细胞上清液中的钙黄绿素浓度与采用不缺少至少一种病毒miRNA的HVLP或EBVLP温育的B细胞上清液中的钙黄绿素浓度来测量增加的免疫应答，其中优选地所述不缺少至少一种疱疹病毒或EBV miRNA的HVLP或EBVLP由包含与野生型病毒(即在EBV的情况下，参考株AJ507799)相同的miRNA编码基因座的核酸分子编码。

本文所用术语“增加的免疫应答”涉及在向受试者施用本发明的HVLP时或在体外分析中增加的免疫应答。当将由本发明的HVLP引起的免疫应答与由包含疱疹病毒蛋白的HVLP引起的免疫应答进行比较时，这种增加变得明显，所述疱疹病毒蛋白由至少一种核酸编码，所述至少一种核酸不包含经遗传修饰的编码疱疹病毒miRNA的miRNA编码基因座。优选地，受试者中这种增加的免疫应答是增加的适应性免疫应答，比如体液或细胞免疫应答，即B细胞应答或T细胞应答。更优选地，所述增加的免疫应答是增加的T细胞应答，比如CD8+或CD4+T细胞应答。甚至更优选地为增加的CD8+T细胞应答。最优选地，所述增加的免疫应答是增加的B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞应答。在EBVLP的情况下，此类CD8+T细胞应答是令人惊讶的，因为EBVLP是已知不诱导CD8+T细胞应答的灭活疫苗。因此，在本发明的EBVLP内化后，人们可能只预期CD4+T细胞应答而不预期CD8+T细胞应答。

本文所用术语“受试者”涉及动物，优选地为哺乳动物，更优选地为人。

在本发明进一步的实施方案中，编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸是遗传修饰的，使得该核酸不被包装在HVLP中。通常，疱疹病毒包含顺式作用元件和病毒颗粒中病毒基因组包装所需的蛋白质。示例性地，疱疹病毒包含病毒DNA在其线性构造的两端的参与包装的序列，比如Epstein-Barr病毒和卡波西肉瘤相关病毒的“末端重复”(TR)或人巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1的“序列”。举例而言，在Epstein-Barr病毒的情况下，参与病毒基因组包装的蛋白质是BFLF1、BBRF1、BGRF1、BDRF1、BALF3、BFRF1A和BFRF1；在单纯疱疹病毒1的情况下，参与病毒基因组包装的蛋白质是UL6、UL15、UL17、UL25和UL28；在单纯疱疹病毒2的情况下，参与病毒基因组包装的蛋白质是UL6、UL15、UL17、UL25、UL28、UL32和UL33、UL51；在人巨细胞病毒的情况下，参与病毒基因组包装的蛋白质是UL56和UL89；在水痘-带状疱疹病毒的情况下，参与病毒基因组包装的蛋白质是ORF54；以及在卡波西肉瘤相关病毒的情况下，参与病毒基因组包装的蛋白质是ORF7、ORF29和ORF43。因此，包装病毒DNA所需的顺式作用元件和/或蛋白质中的一种或多种的功能性失活导致核酸分子的包装受损，并因此如本文所述在诱导裂解期时导致HVLP的产生。

关于病毒组装的术语“包装”是本领域熟知的并且涉及在病毒颗粒组装期间将线性疱疹病毒DNA引入疱疹病毒颗粒的过程，并且在本文中具体涉及在病毒颗粒组装期间将所述至少一种核酸分子引入病毒颗粒的过程。

因此，在本发明的优选的实施方案中，编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸缺少包装所需的功能性顺式作用元件。本文所用术语“包装所需的顺式作用元件”涉及疱疹病毒DNA包装-信号序列，这些序列是将病毒DNA包装在病毒颗粒中所需的。因此，在不存在顺式作用元件的情况下，在病毒裂解期，合成病毒时不将所述至少一种核酸分子包装到野生型病毒颗粒或本发明的HVLP中。

在本发明进一步优选的实施方案中，编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸包含编码包装所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能，即所述包装所需的蛋白质失去了其包装能力。因此，可以对所述编码包装所需的疱疹病毒蛋白的基因进行遗传修饰，使得该蛋白的包装能力在功能上失效而优选地保留了免疫原性。虽然可能修饰包装所需的一种顺式作用元件或蛋白质即足以使得其功能失效，但也可以使蛋白质和顺式作用元件的组合的包装能力失效，从而排除病毒DNA包装的可能性。

本文关于编码疱疹病毒蛋白的核酸序列使用的术语“遗传修饰的”通常涉及使病毒编码的蛋白质无功能或阻止这种蛋白质表达的任何遗传修饰。举例而言，这种遗传修饰可以是编码功能结构域或其部分或整个蛋白质的核酸序列的缺失。可进一步通过插入、缺失或置换编码疱疹病毒蛋白质的一个或多个氨基酸的，优选编码所述蛋白的功能结构域的一个或多个核苷酸对编码疱疹病毒蛋白的核酸序列进行进一步遗传修饰。这种修饰在编码序列中引入了点突变，产生如终止密码子或开放阅读框的移位并因此得到截短的蛋白。这种修饰可以进一步得到无生物功能或生物功能降低的蛋白质。此外，也可以通过其他遗传修饰来抑制编码疱疹病毒蛋白的基因的表达，所述其它遗传修饰如，缺失或置换所述基因的开放阅读框的起始密码子的核苷酸(即起始密码子不再存在)，或使启动子序列或基因表达所需的其他调控核酸序列功能性失活或其它本领域熟知的方法。

因此，在进一步的实施方案中，本发明的HVLP基本上不含疱疹病毒基因组和/或至少一种核酸分子。本文所用术语“基本上不含疱疹病毒基因组和/或至少一种核酸分子”涉及每1ml上清液中包含少于1000个疱疹病毒基因组或核酸分子的HVLP、每1ml上清液中包含少于100个疱疹病毒基因组或核酸分子的HVLP、每1ml上清液中包含少于10个疱疹病毒基因组或核酸分子的HVLP、每1ml上清液中包含少于1个疱疹病毒基因组或核酸分子的HVLP、每1ml上清液中包含少于0.1个疱疹病毒基因组或核酸分子的HVLP、每1ml上清液中包含少于0.01个疱疹病毒基因组或核酸分子的HVLP，这可由本领域技术人员采用定量PCR容易地确定。优选地，通过定量PCR的检测包括采用DNAse的温育步骤，以便去除游离DNA或膜相关DNA。因此，优选地，所述HVLP基本上不含与疱疹病毒DNA序列相同的DNA序列，其中优选地所述序列涉及疱疹病毒基因序列。此外，优选地，所述HVLP基本上不含这样的核酸序列，该种核酸序列与野生型疱疹病毒核酸序列具有至少(对于每个值)99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％和至少75％的序列同一性。举例而言，用编码BZLF1的表达载体转染采用缺少TR元件和BZLF1编码区的B95.8EBV基因组转染的HEK293细胞以便诱导裂解期。三天后，可以收获上清液，并可以通过超速离心使EBVLP沉淀。可以采用对由所述B95.8基因组和参考EBV基因组包含的EBV基因特异性的引物，通过定量RT-PCR定量EBV基因组的数量。作为定量的参考，人们可以使用Namalwa DNA的连续稀释，Namalwa DNA是一种每个细胞含有两个EBV基因组拷贝的人Burkitt淋巴瘤细胞系。在WO2013/098364中进一步描述了EBVLP中EBV基因组拷贝的定量，而通过使用超过1ml的上清液可以提高所述定量的灵敏度。在优选的实施方案中，本发明的HVLP不包含可检测的病毒基因组，其中所述检测方法是定量PCR。

然而，如本文所述，可以对编码诱导病毒合成所需蛋白质的疱疹病毒的至少一种基因进行遗传修饰，使得所述疱疹病毒蛋白质(如在EBV的情况下的BZLF1)不表达或无功能。在这种情况下，必须将所述至少一种基因提供给宿主细胞以便诱导病毒合成以产生本发明的HVLP。可以通过将包含至少一种基因的表达载体转染到宿主细胞以提供所述至少一种基因。因此，不受理论束缚，可能的情况是本发明的HVLP包含编码所述至少一种基因的表达载体。然而，应理解，术语“基本上不含疱疹病毒基因组”和“基本上不含至少一种核酸分子”不涉及编码诱导病毒合成所需的至少一种基因的表达载体。

在另一实施方案或本发明中，编码所述疱疹病毒蛋白的至少一种核酸分子包含编码细胞转化所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能。

已知一些疱疹病毒，比如Epstein-Barr病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒引起细胞转化并因此引发肿瘤性疾病。为了增加包含本发明的HVLP的组合物在施用于受试者时的安全性，可对编码细胞转化所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因进行遗传修饰，使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能。因此，可以对所述编码细胞转化所需的疱疹病毒蛋白的基因进行遗传修饰，使得该蛋白质的转化能力在功能上失效而优选地保留了免疫原性。虽然可能修饰细胞转化所需的一种蛋白质即可，但可优选地修饰细胞转化所需的超过一种，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种蛋白质，以便排除细胞转化的可能性。本领域熟知细胞转化所需的疱疹病毒基因。举例而言，在Epstein-Barr病毒的情况下，这种基因为EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、LMP1、LMP2、EBNA3A和EBNA3C；和在卡波西肉瘤相关疱疹病毒的情况下，这种基因为LANA、K13、卡波西A、卡波西B、卡波西C、K1、vIL-6、vIRF-1和vGPCR。

在本发明进一步的实施方案中，编码所述疱疹病毒蛋白的至少一种核酸分子包含编码诱导病毒合成所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能。

疱疹病毒的生命周期包括潜伏期和裂解期，在潜伏期内仅表达一组减少的病毒基因并且不产生子代病毒，在裂解期内出现病毒合成并将子代病毒自宿主细胞中释放。在裂解复制期间，表达不同类别的裂解基因，并扩增病毒基因组以形成所谓的多联体(concatamer)，最终这些多联体以包装于预先形成的原衣壳中的单位长度线性病毒基因组被切割。含有病毒DNA的衣壳将经受进一步的构象和结构改变并作为包膜病毒颗粒从感染细胞中排出(egress)。因此，所述病毒生命周期的裂解期是导致病毒颗粒的细胞内组装的过程。然而，如本文所述，如果编码HVLP的蛋白质样部分的至少一种核酸分子缺少包装所需的一种或多种顺式作用元件和/或蛋白质，则在组装病毒颗粒时没有包装病毒DNA，并因此在诱导裂解期时产生HVLP。

在某些疱疹病毒蛋白(如在Epstein-Barr病毒的情况下为BZFL1、BRLF1和BMLF1、在卡波西肉瘤相关病毒的情况下为RTA、在单纯疱疹病毒蛋白的情况下为VP16)表达时诱导和维持疱疹病毒的裂解期。

作为进一步的安全措施，可能需要遗传修饰编码诱导裂解期所需的蛋白质的一种或多种基因，因此防止从可能的残留病毒基因组的病毒复制。因此，可以对编码诱导病毒合成所需的疱疹病毒蛋白的基因进行遗传修饰，使得蛋白质的裂解诱导能力在功能上失效，而优选地保留了免疫原性。

如果病毒合成所需的一种或多种基因功能性失活或缺失，则必须将所述一种或多种基因提供给包含至少一种核酸分子的宿主细胞，以便诱导病毒的裂解期，并因此诱导病毒合成并因此允许产生本发明的HVLP。可以通过转染包含所述一种或多种基因的表达载体向宿主细胞提供所述一种或多种基因，其中优选地所述表达载体为稳定的表达载体，并且优选地其中诱导裂解期所需的一种或多种基因的表达为诱导性调节的(induciblyregulated)。

本文所用术语“诱导性调节的”或“诱导的表达”涉及允许随意诱导基因表达的任何方法，如，通过采用四环素诱导型启动子、Dox-诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子或重金属诱导型启动子。本领域技术人员熟知其它合适的启动子。可选地，也可以通过将所述蛋白编码序列与雌激素受体编码序列融合来调节表达，并因此在添加雌激素时激活。

在本发明进一步的实施方案中，编码疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子包含疱疹病毒基因组，其中所述疱疹病毒选自单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人巨细胞病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、牛疱疹病毒1、牛疱疹病毒2、牛疱疹病毒3、牛疱疹病毒4、牛疱疹病毒5和鼠γ疱疹病毒68。

因此，所述至少一种核酸分子可包含疱疹病毒基因组或由疱疹病毒基因组组成。然而，如本文所述，与野生型疱疹病毒基因组相比，所述疱疹病毒基因组可以是遗传修饰的。

在本发明进一步的实施方案中，所述HVLP是Epstein-Barr VLP(EBVLP)，其包含Epstein-Barr病毒(EBV)蛋白和EBV miRNA。

举例而言，包含在颗粒中的EBV多肽属于EBV结构多肽和EBV裂解多肽组。如本领域技术人员所理解的，EBV的特定多肽可以属于超过一种的上述多肽组。换言之，EBV多肽可以代表结构多肽以及裂解多肽。根据本发明，EBV的结构多肽涉及参与EBV结构设置的多肽。优选地，所述多肽选自膜多肽、被膜多肽和衣壳多肽。EBV膜多肽包含选自BALF4、BLLF1(也称为gp350)、BDLF2、BDLF3、BKRF2、BLRF1、BNLF1(也称为LMP-1)、TP(也称为LMP-2a)、BXLF2、BZLF2以及它们的任何组合的多肽。EBV被膜多肽包含选自BBRF2、BGLF2、BMLF1、BNRF1、BOLF1、BPLF1、BTRF1、BVRF1以及它们的任何组合的多肽。EBV衣壳多肽包含选自BBRF1、BcLF1、BDLF1、BFRF3以及它们的任何组合的多肽。EBV的裂解多肽涉及参与诱导和维持EBV裂解期和/或由于裂解期的诱导而被表达的EBV多肽。优选地，所述裂解多肽选自包含即早基因、早期基因和晚期裂解基因的组(Kieff和Rickinson，2007)。通过BZLF1和BRLF1(两者均为即早蛋白)的表达，然后早期和晚期蛋白的表达来引发所述裂解期。诱导后，已经变得允许病毒复制的细胞经受疱疹病毒特有的病理变化(Kieff和Rickinson，2007)。

本发明还涉及包含EBV蛋白的EBVLP，所述EBV蛋白由至少一种核酸分子编码，所述至少一种核酸分子仍包含编码EBV miRNA的miRNA编码基因座，其中所述miRNA编码基因座中的至少一种是遗传修饰的，其中所述至少一种miRNA编码基因座选自miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1、miR-BART2、miR-BART3、miR-BART4、miR-BART5、miR-BART15。EBV的任何其它miRNA编码基因座可以以未修饰的形式存在(即，在EBV的情况下与参考菌株AJ507799相同)或可以缺失。

在EBVLP的情况下，由所述至少一种核酸分子包含的所述至少一种遗传修饰的编码EBV miRNA的miRNA编码基因座选自miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1、miR-BART2、miR-BART3、miR-BART4、miR-BART5、miR-BART15。因此，可以以任何可能的组合对所述miRNA编码基因座中的至少一个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个进行遗传修饰。在本发明的优选的实施方案中，如本文所述，所述EBVmiRNA编码基因座的全部均为遗传修饰的。因此，本发明不涉及EBV株B95.8(基因库登录号V01555)。然而，本发明涉及任何EBV株B95.8，其包含如本文所述的至少一种miRNA编码基因座的遗传修饰。在本发明进一步的实施方案中，在EBVLP的情况下，由所述至少一种核酸分子包含的所述至少一种遗传修饰的编码EBV miRNA的miRNA编码基因座选自miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1、miR-BART2、miR-BART3、miR-BART4、miR-BART15。在甚至进一步优选的实施方案中，如本文所述的全部EBV miRNA编码基因座均是遗传修饰的。

作为在施用本发明的EBVLP时(如，疫苗接种时)增加安全性的特征，由所述至少一种核酸分子包含的编码B细胞转化所需的EBV蛋白的至少一种基因是遗传修饰的，使得所述EBV蛋白不表达或无功能，所述EBV蛋白选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、LMP1、LMP2、BHRF1、BALF1、EBNA3A和EBNA3C。

根据本发明，术语“B细胞转化所需的”意指所述一种或多种EBV多肽是在B细胞感染野生型EBV后使其转化所必需的。换言之，在不存在所述一种或多种必需的EBV多肽时，B细胞在感染后不转化。因此，EBVLP在与B细胞融合后不能转化B细胞。虽然使一种必需EBV多肽的B细胞转化能力失效即可，但为了排除B细胞转化的可能性，可选地可以使EBV多肽的必需组合的B细胞转化能力失效，从而实现与使仅一种必需多肽失效时所获得的相同的结果，即实现排除B细胞转化的可能性。优选地，使超过一种的必需EBV多肽或EBV多肽的必需组合的B细胞转化能力失效。在B细胞转化中必需的相应EBV多肽是EBNA2，并且B细胞转化中必需的EBV多肽的组合是BHRF1和BALF1的组合。使EBNA2或BHRF1和BALF1的B细胞转化能力失效足以排除B细胞转化的可能性。B细胞转化所需的EBV多肽和EBV多肽的组合是LMP1、EBNA3A和EBNA3C、EBNA1和EBNA3A或EBNA-LP和EBNA3C。在一个实施方案中，EBV基因EBNA2、LMP1、EBNA1、EBNA3A和EBNA3C是遗传修饰的，使得所述EBV蛋白不表达或无功能。在进一步的实施方案中，所述基因的全部是遗传修饰的，使得所述EBV蛋白不表达或无功能。

在本发明进一步的实施方案中，由至少一种核酸分子包含的编码诱导病毒合成所需的EBV蛋白的至少一种基因是遗传修饰的，使得所述EBV蛋白不表达或无功能，所述EBV蛋白选自BZFL1、BRLF1和BMLF1，其中所述基因优选为BZLF1。

作为进一步的安全措施，可能需要遗传修饰编码诱导裂解期(在本文中与术语“复制期”互换使用)所需的蛋白质的一种或多种基因，并因此防止从可能的残留病毒基因组合成病毒。举例而言，EBV即早多肽BZLF1介导潜伏EBV感染的破坏，并且通常被认为是诱导EBV裂解期的关键调节剂。EBV的持续感染的特征在于存在裂解和潜伏期的交替，其中由于BZLF1的表达而诱导裂解期。因此，在使BZLF1缺失或功能性失活后，防止了EBV裂解期的诱导。因此，必须向包含所述至少一种核酸分子的宿主细胞提供已经缺失或功能性失活的所述一种或多种基因(如BZLF1)，以便诱导EBV的裂解期，并因此诱导病毒合成，因此产生本发明的EBVLP。可以通过转染包含所述一种或多种基因的表达载体向宿主细胞提供所述一种或多种基因，其中优选地，所述表达载体为稳定的表达载体，并且其中优选地诱导裂解期所需的一种或多种基因的表达为诱导性调节的。

可以通过使顺式作用元件缺失或功能性失活来修饰编码EBV蛋白的所述至少一种核酸，使得所述至少一种核酸不被包装在EBVLP中。在本发明的优选的实施方案中，编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子缺少包装元件TR。EBV基因组DNA的包装起始于末端重复(TR)，所述末端重复在病毒基因组在其线性状态的两端处直接重复。被称为“终止酶”的酶识别所述末端重复。因此，如果缺少包装元件TR，则所述至少一种核酸分子或EBV基因组不被包装到EBV的原衣壳中，从而产生本发明的EBVLP。如果用于产生EBVLP的至少一种核酸分子或EBV基因组缺少所述包装元件TR，则EBV基因BALF4可能不在用于产生EBVLP的宿主细胞中共表达。

在本发明进一步的实施方案中，编码EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含编码包装EBV DNA所需的EBV蛋白的至少一种基因，所述EBV蛋白选自BFLF1、BBRF1、BGRF1、BDRF1、BALF3、BFRF1A和BFRF1，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述EBV蛋白不表达或或无功能，其中BFRF1A是优选的。所述基因的蛋白是将病毒DNA(即EBV基因组或所述至少一种核酸分子)包装到EBV的原衣壳中所需的。因此，如果所述基因中的一种或多种是遗传修饰的使得所述EBV蛋白不表达或无功能，则所述至少一种核酸分子或EBV基因组不被包装到EBV的原衣壳中，并因此导致产生本发明的EBVLP。

在本发明进一步的实施方案中，编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含EBV基因组。在这种情况下，编码EBVLP的所述至少一种核酸分子可包含EBV基因组或由EBV基因组组成，如本文所述，与野生型EBV基因组相比，所述EBV基因组可以是遗传修饰的，并且其中编码EBVLP的所述至少一种核酸分子仍包含EBV编码的miRNA。

示例性地，本申请的发明人Delecluse等(PNAS，vol.96，pp.5188-5193，1999)和Ruiss等(Journal of Virology，pp.13105-13113，2011)的出版物以及文献WO2012/025603和WO2013/098364公开了核酸分子，该核酸分子在合适的细胞系(如HEK293细胞)中表达时使EBVLP产生。所述核酸分子已经根据本发明进行了修饰但是仍包含miRNA编码基因座。因此，通过采用上文引用的出版物和文献中公开的所述核酸分子之一并使本文所述的至少一种miRNA编码基因座缺失可以获得本发明的核酸分子，其中可以如本文所述对获得的核酸分子进行进一步修饰。

本发明进一步涉及编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的核酸分子。本发明还涉及包含编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的核酸分子的载体。

本文关于编码疱疹病毒蛋白或EBV蛋白的至少一种核酸分子使用的术语“载体”是指这样一种核酸序列，可以将一种或多种包含编码目的蛋白质的基因的表达盒插入或克隆到该种核酸序列中。此外，优选地，所述载体编码赋予宿主细胞选择性的抗生素抗性基因和/或表型标记物(例如，比如GFP、RFP、YFP、BFP等的荧光蛋白)。优选地，所述载体是质粒或病毒载体。所述载体可包含用于在细菌(如大肠杆菌)、酵母菌(如酿酒酵母)、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞中繁殖的元件。优选地，所述载体包含允许在大肠杆菌中繁殖的细菌mini-F因子质粒元件。

本发明进一步的实施方案提供一种物质组合物，其包含编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的至少两种核酸分子。在本发明甚至进一步的实施方案中，所述至少两种核酸分子由至少两个载体包含(即，两种核酸分子由两个载体包含，三种核酸分子由三个载体包含，四种核酸分子由四个载体包含等等)。

本发明进一步提供一种宿主细胞，其由编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的核酸分子，或由包含所述核酸分子的载体或由包含编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的至少两种核酸分子的物质组合物转染，其中优选地所述至少两种核酸分子由至少两个载体包含。

本文所用术语“宿主细胞”涉及一种细胞，该种细胞允许疱疹病毒或EBV的裂解复制，从而形成HVLP或EBVLP。优选地，这种宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地为灵长类动物细胞，甚至更优选地为人细胞和最优选地为HEK293细胞。若疱疹病毒或EBV缺少诱导病毒合成(即裂解期)所需的一种或多种功能性蛋白质，则设想所述宿主细胞可提供一种或多种蛋白质(如在EBV的情况下为BZLF1)。通过转染的载体、稳定转染的载体或通过编码一种或多种蛋白质的核酸序列的染色体整合，所述宿主细胞可提供一种或多种蛋白质，其中优选地所述一种或多种蛋白质的表达是诱导性调节的。

本文所用术语“转染”涉及将核酸引入到细胞中的过程。可以通过多种方法实现转染，比如，如基于化学品的方法如磷酸钙介导的转染或脂质体介导的转染(脂质转染)。此外，本领域已知非化学的方法，如电穿孔或超声穿孔或基于颗粒的方法(如基因枪介导的转染或磁转染)以及病毒介导的方法。

本发明进一步涉及一种用于产生HVLP或EBVLP的方法，所述方法包括：

(i)在允许所述疱疹病毒蛋白或所述EBV蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞；和

(ii)获得所述HVLP或EBVLP。

本发明进一步涉及通过本发明的用于产生HVLP或EBVLP的方法可获得的HVLP或EBVLP。本发明还涉及一种疫苗，所述疫苗包含通过本发明的用于产生HVLP或EBVLP的方法可获得的HVLP或EBVLP。

优选地，本发明的方法是一种体外方法。示例性地，在本申请的发明人Delecluse等(PNAS，vol.96，pp.5188-5193，1999)和Ruiss等(Journal of Virology，pp.13105-13113，2011)的出版物中以及文献WO2012/025603和WO2013/098364中公开了EBVLP的产生。

本文所用术语“培养”涉及使生物体外的细胞在细胞培养基中生长，并且该术语是本领域技术人员已知的。合适的细胞培养基使细胞存活和复制，并且可商购获得。培养基可包含营养素、盐、生长因子、抗生素、血清(如胎牛血清)和pH指示剂(如酚红)。

本文所用术语“获得”涉及分离和/或纯化所述HVLP或EBVLP，优选地从细胞培养上清液中分离和/或纯化所述HVLP或EBVLP。这种分离和/或纯化步骤是本领域技术人员已知的，并且涵盖例如以下方法：比如密度梯度离心、尺寸排阻色谱、亲和色谱、沉淀和在EBV的情况下通过抗gp350的抗体使EBVLP与磁珠结合。

本发明的方法可进一步包括在步骤(i)之后和步骤(ii)之前的另一步骤(i’)，所述步骤(i’)包括诱导所述疱疹病毒或Epstein-Barr病毒的复制期，其中通过表达编码诱导疱疹病毒合成或EBV合成所需的疱疹病毒蛋白或EBV蛋白的至少一种基因诱导所述复制期，其中在编码所述HVLP的疱疹病毒蛋白或EBVLP的EBV蛋白的所述至少一种核酸分子中的所述疱疹病毒蛋白或EBV蛋白已经被遗传修饰，使得所述疱疹病毒蛋白或EBV蛋白不表达或无功能。

在本发明方法进一步的实施方案中，所述至少一种基因由所述宿主细胞中稳定转染的载体表达和/或所述基因是诱导性调节的，所述至少一种基因编码诱导疱疹病毒合成或EBV合成所需的疱疹病毒蛋白或EBV蛋白。在本发明方法进一步的优选的实施方案中，所述编码诱导EBV合成所需的EBV蛋白的至少一种基因选自BZLF1、BRLF1和BMLF1，其中BZLF1是优选的。

在进一步的实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含至少99.99％、99.9％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或优选地95％本文限定的HVLP或EBVLP。因此，无论包含何种如本文所述的HVLP或EBVLP，此类组合物可进一步包含不符合本文描述的HVLP或EBVLP，例如，此类组合物可以包含在形态上与病毒颗粒不相似的缺陷型HVLP或EBVLP，这可以使用电子显微术确定。

在另一实施方案中，本发明涉及一种疫苗组合物，其包含本文所述的HVLP或EBVLP或含有本文所述的HVLP或EBVLP的组合物。

术语“疫苗”和“疫苗组合物”在本文中互换使用，并涉及一种包含本发明的HVLP或EBVLP的组合物，当将该种组合物施用于受试者时，其引发针对疱疹病毒或EBV的免疫应答。因此，将所述疫苗组合物施用于受试者刺激免疫系统并建立或改善针对疱疹病毒或EBV的新的和/或持续感染的免疫。优选地，根据本发明的疫苗允许建立或改善针对EBV的新的和/或持续感染的免疫。优选地，所述免疫引起特异性识别EBV抗原(如EBV结构抗原)的T细胞和/或B细胞的活化和扩增。甚至更优选地，所述免疫引起CD8+T细胞的活化和扩增。还优选的是，所述免疫导致产生预防EBV感染体细胞的抗体。

在进一步的实施方案中，本发明的疫苗组合物进一步包含赋形剂。

术语“载体”和“赋形剂”在本文中互换使用。药学上可接受的载体包括但不限于稀释剂(填充剂、增积剂(bulking agent)，如乳糖、微晶纤维素)、崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠)、粘合剂(如PVP、HPMC)、润滑剂(如硬脂酸镁)、助流剂(如胶体SiO₂)、溶剂/共溶剂(如水性媒剂、丙二醇、甘油)、缓冲剂(如柠檬酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐)、防腐剂(如苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯(Me、Pr和Bu)、BKC)、抗氧化剂(如BHT、BHA、抗坏血酸)、润湿剂(如聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯)、消泡剂(如二甲基硅油)、增稠剂(如甲基纤维素或羟乙基纤维素)、甜味剂(如山梨糖醇、糖精、阿司帕坦、安赛蜜)、矫味剂(如薄荷、柠檬油、奶油糖等)、保湿剂(如丙烯、乙二醇、甘油、山梨糖醇)。其他药学上可接受的载体是(可生物降解的)脂质体；由生物可降解聚合物聚(D，L)-乳酸-共乙醇酸(PLGA)制成的微球、白蛋白微球；合成聚合物(可溶性)；纳米纤维、蛋白质-DNA复合物；蛋白质缀合物；红血球；或病毒颗粒。各种基于载体的剂型包含固体脂质纳米颗粒(SLN)、聚合物纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、水凝胶纳米颗粒、共聚肽纳米颗粒、纳米晶体及纳米悬浮液、纳米晶体、纳米管及纳米线、功能化纳米载剂、纳米球、纳米胶囊、脂质体、脂质乳液、脂质微管/微柱体、脂质微泡、脂质球、脂质聚合物复合体(lipopolyplexe)、逆脂质胶束、树枝状聚合物、醇质体、多复合物超薄胶囊、aquasome、药物体(pharmacosome)、胶质体(colloidosome)、类脂质体(niosome)、盘状体(discome)、前泡囊(proniosome)、微球、微乳液及聚合物胶束。其它合适的药学上可接受的赋形剂尤其阐述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack PublishingCo.，New Jersey(1991)及Bauer等，Pharmazeutische Technologie，第5版，Govi-VerlagFrankfurt(1997)。根据如药物组合物的剂型和给药途径，本领域技术人员将能够容易地选择合适的药学上可接受的载体。

在进一步的实施方案中，所述疫苗组合物包含一种或多种病毒或非病毒多肽、一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或疫苗佐剂，其中，所述一种或多种病毒多肽或所述一种或多种病毒核酸序列与所述疫苗组合物中的HVLP或EBVLP来自不同的病毒。

如本文所用术语“佐剂”是指这样一类物质，其增强、提高或强化针对抗原或其片段的(抗体和/或细胞介导的)宿主的免疫应答。根据本发明使用的示例性佐剂包括无机化合物(比如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙)、TLR9激动剂CpG寡脱氧核苷酸、TLR4激动剂单磷酰脂质(MPL)、TLR4激动剂吡喃葡萄糖脂质(GLA)、油包水乳液Montanide ISA 51和720、矿物油(如石蜡油)、病毒颗粒、细菌产物(比如经杀灭的细菌百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis))、类毒素、非细菌有机物(比如角鲨烯、乙汞硫柳酸钠(thimerosal))、清洁剂(Quil A)、细胞因子(比如IL-1、IL-2、IL-10及IL-12)及复合物组合物(例如弗氏(Freund′s)完全佐剂及弗氏不完全佐剂)。一般而言，根据本发明所用的佐剂优选强化对本发明的多聚体复合物的免疫应答和/或将其朝向所期望的免疫应答进行调节。

术语“药学上可接受的”是指不干扰根据本发明的多聚体复合物的生物活性的有效性的无毒材料。

在进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的HVLP或EBVLP或包含本文所述的HVLP或EBVLP的组合物或包含本文所述的HVLP或EBVLP的疫苗组合物在受试者的疫苗接种或治疗中的用途。

有效免疫必需的量和治疗方案可以变化，并且取决于比如个体大小、体表面积、年龄、性别、施用时间和途径、一般健康以及同时施用的其它药物等因素。预期所述有效量处于较宽的范围内，并且该范围对于任何给定的情况可以容易地通过常规实验测定并在普通临床医生或医师的技能和判断范围内。施用模式可以是任何施用模式，所述施用模式导致使暴露于疫苗以进行免疫的个体产生免疫作用，并包括肠胃外施用，比如静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、关节内注射或输注和吸入，以及肠内施用。优选地，为了使免疫作用最大化，所述疫苗施用至少2次。

本文所用术语“疫苗接种”涉及向受试者施用抗原材料以便刺激受试者的免疫系统，从而预防性或治疗性针对疱疹病毒或EBV感染或与所述病毒相关的疾病免疫受试者。根据本发明，预防性免疫是指第一次将个体免疫系统(即，初始免疫系统(immunesystem))暴露于疱疹病毒或EBV抗原。所述第一次暴露导致所述抗原从所暴露个体的体内清除并产生疱疹病毒-或EBV-抗原特异性的CD4+和CD8+T-细胞和产生抗体的记忆B-细胞。当第二次暴露时，所述免疫系统能够更有效地防止疱疹病毒或EBV感染和/或清除所述感染，由此预防或缓解疱疹病毒相关或EBV相关疾病的发展。具体而言，所述预防性免疫的效果表现为下列至少之一：预防免疫个体的疱疹病毒或EBV感染，改变或限制感染，辅助、改善、增强或刺激所述个体从感染中恢复，和产生将预防或限制随后疱疹病毒或EBV感染的免疫记忆。通过本领域技术人员已知的常规方法可以测试和检测任一所述效果的存在。优选地，用一种或多种疱疹病毒或EBV抗原攻击患者，所述疱疹病毒或EBV抗原已经是所用疫苗的一部分，然后测定抗体滴度和针对所述一种或多种抗原的T-细胞的数目。另外，可以测定体外抑制人B-细胞感染的中和抗体的诱导作用。虽然等同地引发针对疱疹病毒或EBV抗原的免疫应答，根据本发明的治疗性免疫在个体上进行，所述个体在所述免疫之前已经暴露于疱疹病毒或EBV，即，这些个体已经感染疱疹病毒或EBV。在这种情况下，免疫作用导致静息T效应细胞的再活化，所述静息T效应细胞以这样一种形式面对同源抗原：这些抗原由专门抗原呈递细胞与MHC I类和/或MHC II类分子结合呈递。可以证明在以下情况中针对EBV的治疗性免疫作用是尤其相关的：在其中病毒再活化是不希望的情况中，比如，如在移植物接受者或其他免疫受损患者(HIV阳性个体、癌症患者、患有严重炎性或自身免疫性疾病的患者)中，或在其中EBV再活化可能导致或已经导致疾病发展的情况中，所述疾病如移植后淋巴增生紊乱症(PTLD)和非霍奇金淋巴瘤、慢性活动性EBV感染(CAEBV)、口腔毛状白斑，或在其中EBV的B-细胞转化能力已经导致疾病发展的情况中，所述疾病比如癌症。

在进一步的实施方案中，本发明涉及编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的至少两种核酸分子的物质组合物(其中优选地所述至少两种核酸分子由至少两个载体包含)，由所述核酸分子、所述载体或所述组合物转染的宿主细胞在生产HVLP或EBVLP中的用途。

本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含本文所述的HVLP、本文所述的EBVLP、编码HVLP疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含编码HVLP的疱疹病毒蛋白或编码EBVLP的EBV蛋白的至少两种核酸分子的物质组合物(其中优选地所述至少两种核酸分子由至少两个载体包含)，由所述核酸分子、所述载体或所述组合物转染的宿主细胞，所述组合物包含至少95％的本文所述的HVLP或EBVLP和/或本文所述的疫苗组合物。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包含/包括”及其变形应当理解为是指包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其它的整数或步骤或者整数或步骤的组。本文使用的术语“包含/包括”可以被术语“含有”或有时在本文使用的术语“具有/有”替代。本文使用的“由......组成”排除任何未在要求保护的要素中具体规定的元素、步骤或成分。本文使用的“实质上由......组成”并不排除不实质影响权利要求的基础和新颖性特征的材料或步骤。在本文的每一实例中，术语“包含/包括”、“实质上由......组成”和“由......组成”中的任一个可以被另外两个术语中任一个替换。

本文所用术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的20％内，优选地在10％内，和更优选地在5％内。该术语还包括具体数字，如，约20包括20。

除非本文中另有定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常根据本领域熟知的常规方法来实施本发明的方法和技术。通常，本文所描述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的命名法是本领域熟知并常用的那些。

除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常可根据本领域熟知的常规方法和如本说明书中引用和讨论的各种概述和更具体的参考文献所述而进行。参见，如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，J，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Handbookof Biochemistry：Section A Proteins，Vol I 1976CRC Press；Handbook ofBiochemistry：Section A Proteins，Vol II 1976CRC Press。与本文所述的分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学和药物和药物化学相关使用的命名法和实验室程序及技术是本领域公知并常用的那些。

附图说明

图1：EBV miRNA影响免疫的主要途径。(A)感染后5天，在6个供体(供体Ad1-Ad6)的感染wt/B95-8EBV或ΔmiR EBV的B细胞中，最强调节的基因的热图。示出了具有绝对z-得分＞1.6的差异表达的基因转录物。蓝色和红色分别表示与感染ΔmiR EBV的细胞相比在感染wt/B95-8EBV的细胞中下调和上调的转录物。(B)与适应性免疫应答或p53信号传导通路相关的选定基因的调节。还示出了先前报道的EBV miRNA靶标和常见管家基因(housekeepinggene)。蓝色背景阴影表明被病毒miRNA下调的基因。(C)所有miRNA中EBV miRNA的分数。示出了6个供体的均值。

图2：EBV miRNA抑制促炎细胞因子的分泌和参与抗原加工和呈递的分子的表达。(A)由感染wt/B95-8EBV或ΔmiR EBV的B细胞分泌的各种细胞因子。将之前已经感染4或11天(感染后天数，dpi)的B细胞另外培养4天以通过ELISA测定细胞因子水平(n＝3)。如图所示添加了CpG DNA。(B)EBV miRNA调节IL12B和TAP2。如图所示(n＝3)，用miRNA表达载体和携带野生型或突变的3′-UTR(图7)的荧光素酶报告基因质粒共转染HEK293T细胞。将所述荧光素酶活性相对于来自用野生型3′-UTR报告基因和空质粒共转染的细胞的溶解产物标准化。wt：野生型3′-UTR，mut：突变的3′-UTR，空质粒。通过未配对的双尾T检验计算P值。星号(*)表示相对于用空质粒共转染的野生型报告基因的荧光素酶活性p＜0.05。(C)EBV感染的B细胞中TAP1和TAP2的蛋白质印迹分析。将微管蛋白(TUBB)和β-肌动蛋白(ACTB)用作管家对照。阳性对照为IPO7。示出了代表性实例(顶部)和相对于微管蛋白标准化的蛋白质表达(底部；n＝3-5)。(D-E)由EBV miRNA调节的HLA分子(D)及共刺激和粘附分子(E)的细胞表面表达。在免疫染色单个表面蛋白后测量了平均荧光强度(MFI)，并示出了比率(感染wt/B95-8EBV的B细胞除以感染ΔmiR EBV的B细胞)(n＝5-10)。示出了平均值±SD。n.d：未检测到；wt：wt/B95-8；*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

图3：EBV miRNA阻止通过EBV特异性CD4⁺T细胞的Th1分化和识别。(A)共培养实验的示意图，以评价病毒miRNA对辅助T细胞分化的影响。(B)与感染EBV的B细胞共培养后初始CD4⁺T细胞的Th1分化。将初始CD4⁺T细胞用自体新感染的B细胞和αCD3/αCD28抗体以指定比率培养7天(n＝5-6)。通过细胞内IFN-γ染色对增殖的、用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和离子霉素再刺激的Th1细胞进行定量。左：代表性流式细胞术分析；右：所有实验的总结。(C)抗-IL12B抗体(5μg/ml)抑制初始CD4⁺T细胞的Th1细胞分化，所述初始CD4⁺T细胞与感染wt/B95-8或ΔmiR的B细胞以1∶1的B∶T细胞比率共培养(n＝8)。将相同同种型的无关抗体用作对照。(D)研究病毒miRNA对EBV特异性CD4⁺T细胞的抗病毒功能的影响的共培养实验的示意图。(E)通过多克隆EBV特异性CD4⁺T细胞释放的IFN-γ，所述CD4⁺T细胞与感染EBV的自体(auto)、HLA匹配的或错配(mis.)的B细胞共培养(n＝3；图12)。B∶T细胞比率为1∶1。图中示出了匹配的HLA II类等位基因。仅T细胞；n.a.：不适用。(F)EBV特异性CD4⁺T细胞的细胞毒活性。通过钙黄绿素释放分析，以多种B∶T细胞比率分析了感染EBV的B细胞的杀伤。描述了采用HLA匹配的感染EBV的靶B细胞的代表性实验(左；n＝3)和采用HLA匹配的B细胞的全部实验的概述(右)。示出了均值±SD。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

图4：EBV miRNA抑制EBV特异性CD8⁺T细胞识别感染EBV的B细胞。(A)研究病毒miRNA对EBV特异性CD8⁺T细胞的抗病毒作用的影响的共培养实验的示意图。(B)通过多克隆EBV特异性CD8⁺T细胞释放的IFN-γ，所述CD8⁺T细胞与感染EBV的自体(auto)、HLA匹配的或错配(mis.)的B细胞共培养(n＝3；图12)。B∶T细胞比率为1∶1。示出了匹配的HLA I类等位基因。仅T细胞；n.a.：不适用。(C)EBV特异性CD8⁺T细胞的细胞毒活性。在钙黄绿素释放分析中，以多种B∶T细胞比率分析了感染EBV的B细胞(wt/B95-8或ΔmiR EBV)的杀伤。描述了采用HLA匹配的感染EBV的靶B细胞的代表性实验(左；n＝3)和采用HLA匹配的B细胞的全部实验的概述(右)。(D)针对LMP2表位IED(HLA-B^*40∶01-限制的)的CD8⁺T细胞克隆的反应性。用已经感染15天的HLA-B*40∶01阳性B细胞培养T细胞16小时。描述了用ELISA定量的IFN-γ分泌水平(左；n＝3)和HLA-B*40的MFI比率(感染wt/B95-8EBV的B细胞除以感染ΔmiR EBV的B细胞)(右；n＝4)。仅T细胞；肽：加载对照肽的T细胞。wt：wt/B95-8。示出了均值±SD。*：p＜0.05，**：p＜0.01。

图5：EBV miRNA对功能性基因组(gene group)的调节。

将KEGG通路类别用于基因功能的分类。按照统计显著性将通路分类。橙色点的大小表示-log10p-值得分。对于六个供体中的每一个，绘制差异表达的转录物的倍数变化值。如图1a中所示，蓝色或红色分别表示通过EBV miRNA的下调或上调。

图6：RISC-IP后EBV miRNA的定量

EBV的BHRF和BART miRNA在感染wt/B95-8EBV的B细胞中积累，但在感染ΔmiR EBV的B细胞中几乎检测不到。示出了均值±SD。

图7：3’-UTR报告基因及其突变

在图2b中分析的所选转录物的3′-UTR的部分序列与相应miRNA和报告基因载体中3′-UTR内的突变一起示出。互补性基于根据RNAhybrid算法的计算机芯片预测，并描绘为Watson-Click(′|′)或G：U(′：′)。未匹配的核苷酸残基表示为(X)。它们由报告基因质粒中突变的mRNA靶序列产生。

图8：多克隆EBV特异性CD4⁺T细胞的反应性

将EBV特异性CD4⁺T细胞与5天前感染的自体B细胞共培养16小时。然后用ELISA定量IFN-γ分泌水平。采用如图所示的多种B∶T细胞比率。

图9：gp350特异性CD4⁺T细胞克隆的反应性

将gp350特异性CD4⁺T细胞克隆，表位FGQ(HLA-DRB1*1301)用作效应细胞。以B∶T细胞比率为1∶1，在感染所示两种EBV株后5和15天，将来自供体JM的自体B细胞(表S2)用作靶细胞。共培养16小时后，通过ELISA定量IFN-γ和GM-CSF分泌水平。示出了均值±SD。

图10：研究病毒miRNA对抗原呈递至LMP2特异性CD8⁺T细胞克隆的影响的共培养实验的示意图。

图11：EBV miRNA对病毒基因的调节

(A)感染后第15天，感染wt/B95-8EBV或ΔmiR EBV的B细胞中LMP2A表达的蛋白质印迹分析。描述了代表性实例(顶部)和相对于微管蛋白标准化的蛋白质表达(底部n＝4)。示出了均值±SD。(B)通过病毒miRNA的两种LMP2基因变体的Log₂倍数变化。如图1B所示进行分析，但是逐个外显子地(exon-wise)进行表达水平的量化，从而正确分析剪接变体。

图12：HLA等位基因

通过深度测序识别的供体HLA等位基因(MVZ Martinsried，德国)的列表，所述供体的B和T细胞已用于本研究中的共培养实验。n.a.：没有得到。

图13：采用Epstein-Barr VLP的CD4⁺T细胞的活化

将人EBV-永生化的B细胞系(LCL)用相似数量的具有miRNA或缺少全部miRNA(ΔmiRNA)的VLP(1×10⁴颗粒/细胞)温育24小时，然后用对EBV被膜蛋白BNRF1特异性的HLA匹配的CD4⁺T细胞克隆共培养另外24小时。在IFNγ-ELISA分析中定量T细胞的活化。对照是LCL或未与LCL共培养的T细胞(仅T细胞)。

实施例

以下实施例阐释本发明，但不应解释为限制本发明的范围。

材料和方法

人原代细胞的分离

通过Ficoll-Hypaque梯度离心自腺状单核细胞(MNC)或外周血单核细胞(PBMC)制备人原代B细胞和T细胞。分别采用MACS分离器(Miltenyi Biotec)与CD19微磁珠、CD4微磁珠、CD8微磁珠和初始CD4⁺T细胞分离试剂盒II自腺状MNC或PBMC分离B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和初始CD4⁺T细胞。

细胞系和细胞培养

将EBV阳性Burkitt淋巴瘤细胞系Raji和基于HEK293的EBV生产细胞系(Seto等，PLoS Pathog.6，e1001063(2010))，感染的人原代B细胞和分离的T细胞维持在RPMI 1640培养基(Life Technologies)中。将HEK293T细胞维持在DMEM培养基中。全部培养基均补充有10％FBS(Life Technologies)、青霉素(100U/ml；Life Technologies)和链霉素(100mg/ml；Life Technologies)。在5％CO₂培养箱中于37℃下培养细胞。

感染性EBV原种(stock)的制备和人原代B细胞的感染

如所述(Seto，上文引用)制备感染性EBV原种。简而言之，用编码BZLF1和BALF4的表达质粒瞬时转染ΔmiR(4027)和wt/B95-8(2089)EBV株的EBV生产细胞系以诱导EBV的裂解期。转染后三天收集上清液，并通过以3000rpm离心15分钟清除碎片。根据此前报道(Seto，上文引用)，在Raji细胞上测定病毒原种的效价。对于病毒感染，用每种病毒原种培养原代B细胞18小时。在用新鲜培养基替换后，将感染的细胞以5×10⁵个细胞/ml的初始密度接种。

RNA-Seq和RISC-IP

在感染人原代B细胞后5天时，采用Trizol(Life Technologies)和Direct-ZolRNA MiniPrep(Zymo Research)，根据制造商的方案，自六个不同供体(Ad1至Ad6)提取全部RNA用于RNA-Seq。同时，如前所述(Kuzembayeva等，PLoS ONE.7，e47409(2012))实施RISC免疫沉淀(RISC-IP)。简言之，将裂解的细胞用抗-Ago2抗体(11A9)-缀合的免疫磁珠(dynabead；Life Technologies)温育、洗涤并提取共沉淀的RNA。制备cDNA文库(vertisBiotechnologie AG，Freising，Germany)。对于RNA-Seq，将全部RNA通过Ribo-Zero rRNA移除试剂盒(Illumina)耗竭rRNA，通过超声波处理片段化，并用随机引物进行第一链合成。对于RISC-IP，将RNA进行聚(A)-加尾，在5′-磷酸处与RNA衔接子连接以促进Illumina TruSeq测序，并用寡-(dT)引物进行第一链合成。对cDNA进行PCR扩增，并用威斯康星大学生物技术中心DNA测序设施中的Illumina HiSeq2000仪器测序。

深度测序的分析

对于RNA-Seq，采用FastQC和R2M(RawReadManipulator)进行配对端读数(聚(A)-尾过滤、N-过滤、衔接子移除)的处理。通过STAR将读数映射至人基因组(hg19‘核心’染色体组)，并使用featureCounts和GencodeCV19注释连同EBV注释(基因库：AJ507799)确定每个转录物的特征计数(feature count)。为了筛选被病毒miRNA差异调节的基因，使用基于逐个供体/复制(donor/replicate wise)倍数变化等级的简单但有效的评分算法。对于每个基因g和复制k，计算基因特异性等级得分：

其中，n是全部复制的数目，m是全部基因/转录物的数目，r_gk为样品k中基因g的等级。

为了选择高度差异表达的基因，将等级得分转化为z得分并选择绝对z得分＞1.6的所有转录物。

对于RISC-IP，使用用R封装DEseq2评估的尺寸因子将映射的读数进行标准化，并使用Gencode v19过滤映射到带注释的3′UTR区域的读数。为了识别感染wt EBV的B细胞与感染ΔmiR EBV的B细胞之间在3′UTR上读数富集的局部定量差异，计算逐个供体(donor-wise)的相对富集得分。对于每个基因组位置p，如下计算相对表达esp：

其中e_tp是感染wt EBV的细胞中位置p处的表达值，e_cp是感染ΔmiR EBV的B细胞中的局部表达值。

引入标准化因子n_pu＝e_tp/max(e_u)以校正目的UTR序列中的局部最大值，其中max(e_u)是UTR序列u中的最大表达值。最后，使用高斯滤波使局部噪声最小化。为了选择由病毒miRNA结合的3′-UTR，阈值设定如下：对于在两个或更多个供体的3′-UTR中＞20个核苷酸的延伸(stretch)，富集得分＞0.6。

KEGG富集通路

通过实施经由KEGG API Web Service的超几何分布检验来评估特异性通路的富集。所有计算均使用Matlab(Mathworks)完成。

ELISA

为了检测自感染的B细胞的细胞因子分泌，将1×10⁶个细胞于感染后4或11天接种在6孔板中，用环孢霉素(1μg/ml；Novartis)培养4天。收获上清液并储存在-20℃。按照制造商的方案(Mabtech)进行白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、IL12B(IL-12p40)、IL-12、IL-23和TNF-α的酶联免疫吸附分析(ELISA)。对于IL-6、IL-10和TNF-α，如前所述(Iskra等，J.Virol.84，3612-3623(2010))加入CpG DNA以刺激感染的B细胞。按照制造商的方案(Mabtech)进行IFN-γ水平的ELISA。

流式细胞术和抗体

在用荧光团缀合的抗体进行免疫染色后，用LSRFortessa或FACSCanto(BD)流式细胞仪和FACSDiva软件(BD Biosciences)测量单细胞悬浮液。使用FlowJo软件Ver.9.8(FlowJo)分析获取的数据。使用以下对人抗原反应性的荧光团缀合的抗体：抗人IFN-γAPC(4S.B3，IgG1；Biolegend)、抗-CD40PE(5c3，IgG2b；BioLegend)、抗-ICOS-L(B7-H2)PE(2D3，IgG2b；BioLegend)、抗-PD-L1(B7-H1)APC(29E.2A3，IgG2b；BioLegend)、抗-CD86(B7-2)PE(37301，IgG1；R&D Systems)、抗-CD54(ICAM-1)APC(HCD54，IgG1；BioLegend)、抗-HLA-ABCAPC(W6/32，IgG2a；BioLegend)、抗-CD80PE-Cy5(L307.4；BD Pharmingen)、抗-FAS(CD45)PE(Dx2，IgG1；BioLegend)、抗-HLA-DR未标记的(L234，IgG2a；BioLegend)、抗-HLA-DQ未标记的(SPV-L3，IgG2a；AbD Serotec)、抗-HLA-DP未标记的(B7/21，IgG3；Abcam)、抗-小鼠F(ab′)2APC(多克隆，IgG；eBioscience)、HLA-Bw6PE(REA143，IgG1；Miltenyi Biotec)、同种型IgG1PE(MOPC-21；BioLegend)、同种型IgG2b PE(MPC-11；BioLegend)、同种型IgG1APC(MOPC-21；BD Bioscience)、同种型IgG2a APC(MOPC-173；BioLegend)、同种型IgG2b APC(MG2b-57；BioLegend)。

蛋白质印迹

用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8)、150mM NaCl、0.1％SDS、1％NP-40、0.5％DOC)裂解细胞，并用Laemmli缓冲液煮沸提取物。将蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶(CarlRoth)上分离，并使用Mini-PROTEAN Tetra Cell(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜(GEHealthcare Life Science)。将膜用Roti-Block(Carl Roth)封闭30分钟，然后进行抗体温育。使用与辣根过氧化物酶缀合的二抗(Cell Signaling)并将其暴露于CEA膜(AgfaHealthCare)。用ImageJ软件量化蛋白质水平。使用以下对人蛋白质反应性的一抗：抗-人微管蛋白(B-5-1-2；Santa Cruz)、抗-人肌动蛋白(AC-74；Sigma)、抗-人IPO7(ab88339；Abcam)、抗-人TAP1(1.28；Acris)和抗-人TAP2(2.17，Acris)。Elisabeth Kremmer提供了对EBV蛋白LMP2反应性的(TP-14B7)单克隆抗体。

荧光素酶报告基因分析

将IL12B(Ensembl：ENST00000231228)和TAP2(Ensembl：ENST00000374897)的3′-UTR克隆到表达质粒psiCHECK-2(Promega)中的萤火虫荧光素酶(Fluc)的下游。为了构建病毒miRNA表达载体，将TagBFP(Evrogen)在EF1α启动子的控制下克隆到pCDH-EF1-MCS(System Biosciences)中。将单个目的miRNA克隆到TagBFP编码基因的下游。通过PCR从p4080质粒(Seto，上文引用)获得病毒miRNA。通过Metafectene Pro(Biontex)将psiCHECK-2报告基因和pCDH-EF1miRNA表达质粒DNA共转染至HEK293T细胞中。转染24小时后，用双荧光素酶分析试剂盒(Promega)和Orion II微孔板光度计(Titertek-Berthold)测量荧光素酶活性。将Fluc的活性相对于在psiCHECK-2报告基因中编码的海肾荧光素酶(Rluc)的活性标准化。主要使用TargetScan(www.targetscan.org)和雇佣的RNAhybrid(bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid)对3′-UTR上的EBV miRNA结合位点进行计算机芯片预测，以筛选6mer结合位点(Bartel，Cell.136，215-233(2009))。用重叠的寡DNA和Phusion聚合酶(NEB)进行定点诱变。

EBV刺激的效应T细胞和T细胞克隆的建立

自多克隆T细胞系建立EBV特异性CD8⁺T细胞克隆，所述多克隆T细胞系由淋巴母细胞样细胞系(LCL)或如前所述的PBMC的mini-LCL刺激产生(Adhikary等，PLoS ONE.2，e583(2007))。

T细胞分化和识别

通过共培养分选的初始CD4⁺T细胞和感染后5天的感染的B细胞来评价Th1分化。在96孔板中用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)培养被CellTrace Violet(Life Technologies)染色的1×10⁵个初始CD4⁺T细胞和0.5或1×10⁵个感染的B细胞并培养7天。添加针对IL12B的中和抗体(C8.6；BioLegend)或相应的同种型对照抗体(MOPC-21；BioLegend)以5μg/ml用于若干实验。将细胞用PMA和离子霉素(CellStimulation Cocktail；eBioscience)再刺激5小时，并在固定前用布雷菲德菌素A和莫能菌素(Biolegend)处理2.5小时。通过用FIX&PERM细胞透化试剂盒(Life Technologies)对细胞内IFN-γ染色和随后的流式细胞术分析来测量Th1群。将Th1群定义为增殖T细胞的通过CellTrace Violet染色识别的部分中的IFN-γ阳性T细胞。用ELISA和钙黄绿素释放分析测量EBV特异性效应T细胞的活性。对于来自T细胞的IFN-γ检测，将效应细胞和靶细胞以各5×10⁴个细胞/ml(1∶1比率)接种，并在96孔板(V底)中共培养16小时。用ELISA检测IFN-γ水平。将低于16pg/ml的IFN-γ浓度认为未检测到。

T细胞细胞毒性分析

通过Ficoll-Hypaque梯度离心纯化原代感染的B细胞，并用0.5μg/ml的钙黄绿素标记5×10⁵个靶细胞。在采用PBS进行三次洗涤步骤后，以不同比率将靶细胞和效应细胞在96孔板(V底)于RPMI无酚红培养基中共培养以减少背景信号。共培养4小时后，通过Infinite F200PRO荧光计(Tecan)测量释放的钙黄绿素的荧光强度。作为对照，将未用效应细胞培养的靶细胞和用0.5％Triton-X100裂解的细胞的自发钙黄绿素释放分别用于定义未裂解和完全裂解的靶细胞的水平。

统计分析

除非另有说明，将Prism 6.0软件(GraphPad)用于统计分析和应用双尾比T检验。

实施例1

采用设计为检测细胞mRNA的方法，查找了EBV miRNA的靶标，即病毒所靶向的以促进其有效感染的靶标。将两种EBV原种，一种表达13种miRNA的实验室株(wt/B95-8)及其一种都不表达的缺失的衍生物(ΔmiR)，用于感染来自六个供体的新鲜分离的B细胞。感染后第5天分离RNA并测序。识别那些图1A所示的具有z-得分＞1.6的差异表达的基因。这些基因包括病毒miRNA靶标LY75/DEC205(Skalsky等，PLoS Pathog.8，e1002484(2012))和IPO7(等，Cell Host Microbe.7，324-334(2010))。基于在wt/B95-8EBV感染的细胞中一致下调的基因，根据京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路类别(图5)对识别的、调节的基因进行分组。这一分组在与凋亡、细胞周期调节和p53信号传导相关的通路中富集(Seto等，PLoS Pathog.6，e1001063(2010))。这一分组也令人惊讶地揭示了，在新感染的细胞中，EBV的miRNA调节广泛的免疫功能，包括抗原加工、HLA和共刺激分子以及细胞因子-细胞因子受体相互作用(图1B、图5)。将RNA诱导的沉默复合物(RISC-IP)免疫沉淀，并发现全部miRNA的14.5％(±2.4％SD)均为wt/B95-8EBV感染细胞中的病毒来源的(图1C和图6)。正如已经在PAR-CLIP实验(Skalsky，上文引用)(GEO：GSE41437)中所发现的，还发现在细胞样品之间不同地在RISC中检测到不同的mRNA。因此，所述分析主要集中在通过mRNA在所有样品中的差异表达识别的候选mRNA上(图1A)并使用RISC-IP结果来确认它们。

实施例2

已证实EBV的miRNA调节对免疫功能至关重要的细胞因子。分析来自感染两种EBV株的B细胞的上清液中白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、TNF-α、IL12B(IL-12p40)、IL-12(p35/p40)和IL-23(p19/p40)的水平。添加刺激TLR9的CpG DNA以检测自EBV感染的细胞分泌的IL-6和TNF-α(Iskra等，J.Virol.84，3612-3623(2010))。与感染ΔmiR EBV的B细胞相比，感染wt/B95-8EBV的B细胞分泌更少的IL-6、TNF-α和IL-12p40。相对地，与转录组分析(图1B)一致，抗炎细胞因子IL-10的释放似乎不受病毒miRNA的影响(图2A)。与ΔmiR EBV感染的细胞相比，wt/B95-8EBV感染的细胞中IL-12(p35/p40)和IL-23(p19/p40)(两者均含有IL-12p40亚基(Szabo等，Annu.Rev.Immunol.21，713-758(2003)))的分泌显著降低(图2A)。

实施例3

已经发现，EBV miRNA直接调节细胞因子编码基因IL12B，该基因IL12B编码IL-12p40。这一发现已得到荧光素酶报告基因分析验证。EBV的miR-BHRF1-2、miR-BART1或miR-BART2抑制该IL12B报告基因的荧光素酶活性(图2B)。使miR-BART1或miR-BART2的预测的结合位点突变，这消除了它们抑制IL12B报告基因的能力(图2B和图7)，从而证实了病毒miRNA对该基因转录物的直接控制。分析MiR-BART10和miR-BART22，类似地，它们存在于EBV的野生株中但不存在于wt/B95-8EBV中(图2B和图7)。它们预测的靶位点的突变仅部分地减轻了通过两种miRNA的抑制，表明IL12B转录物中存在这些miRNA的另外的结合位点。总之，证明细胞因子受EBV miRNA调节，并且验证了IL12B作为多种病毒miRNA的直接靶标。

实施例4

此外，量化了对抗原加工和呈递重要的蛋白的水平(图1B)，所述蛋白包括TAP1和TAP2，与感染ΔmiR EBV的细胞中相比在感染wt/B95-8的细胞中它们的转录水平下降。EBV的miRNA降低了TAP1和TAP2(图2C)。TAP1和TAP2形成异二聚体，该异二聚体介导抗原肽向ER腔中的细胞质转运，在ER腔中将它们加载到使其稳定的MHC I类分子上(Horst等，J.Immunol.182，2313-2324(2009))。感染后15天，如共刺激和粘附分子那样，MHC I类分子和MHC II类分子的全部三个亚类(HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)减少(图2，D和E)。

实施例5

RISC-IP和计算机芯片上的算法表明EBV miRNA靶向TAP2的3’-UTR。在荧光素酶报告基因分析中，miR-BHRF1-3抑制TAP2报告基因(图2B)。靶基序的突变消除了荧光素酶的抑制，表明TAP2是miR-BHRF1-3的直接靶标(图2B和图7)。类似地，由EBV的野生株编码的miR-BART17直接靶向TAP2转录物的3’-UTR(图2B和图7)。因此，EBV miRNA下调在感染后早期的肽抗原加工、转运和呈递中具有关键功能的基因。

实施例6

在感染后的早期，病毒miRNA抑制IL-12分泌(图1B和2A)。这种抑制阻断了1型辅助T(Th1)细胞的分化，该分化是IL-12至关重要的过程(Szabo，上文引用)。将初始CD4⁺T细胞与自体感染EBV的B细胞共培养(图3A)。与感染ΔmiR EBV的细胞相比，感染wt/B95-8EBV的B细胞抑制Th1分化(图3B)。当细胞与感染ΔmiR EBV的细胞共培养时，中和IL12B功能的抗体而非同种型对照抗体抑制Th1分化(图3C)，这表明从EBV感染的或活化的B细胞分泌的IL-12本身驱动Th1细胞的产生。因此，EBV miRNA抑制IL-12从感染细胞中释放，这一功能可以消除病毒特异性Th1细胞的抗病毒控制。

实施例7

此外，EBV miRNA对MHC II类、共刺激和粘附分子的抑制(图1B和2D、E)损害了由MHC II类介导的CD4⁺T细胞对感染细胞的识别。通过用经辐照的感染wt/B95-8EBV的自体淋巴母细胞样细胞系(LCL)重复刺激，离体扩增CD4⁺T细胞。然后将EBV特异性CD4⁺T细胞与5天前已经感染两种EBV株的自体B细胞共培养(图3D)。当与作为靶标的感染ΔmiR EBV的细胞共培养时，EBV特异性CD4⁺T细胞的IFN-γ释放是大量的(substantial)，但是当与感染wt/B95-8EBV的B细胞共培养时，在测试的所有细胞比率下，EBV特异性CD4⁺T细胞的IFN-γ的释放持续减少(图8)。在自体和HLA匹配的情况下观察到这种效应，但在HLA错配的情况下没有观察到这种效应(图3E和图12)，这表明观察到的CD4⁺T细胞活化是HLA II类限制性的。针对FGQ测试EBV抗原特异性CD4⁺T细胞克隆，所述FGQ是来自EBV糖蛋白gp350的表位(Adhikary，J.Exp.Med.203，995-1006(2006))，并在感染后5天观察到，与采用感染ΔmiR EBV的靶B细胞相比，采用感染wt/B95-8EBV的靶B细胞时降低的T细胞活化(图9)。当病毒抗原gp350不再存在时，在感染后15天几乎检测不到针对B细胞的T细胞活性，因为gp350是病毒颗粒的组分并且在B细胞感染后立即呈递(Adhikary，上文引用)，但是并不在潜伏期间合成(Kalla等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107，850-855(2010))。

EBV特异性CD4⁺T细胞具有溶细胞活性(Adhikary，上文引用)。在同种异体HLA匹配的条件下，EBV特异性CD4⁺T细胞始终表现出感染ΔmiR EBV的靶B细胞比感染wt/B95-8EBV的细胞更强的细胞溶解(图3F)。EBV miRNA明显抑制感染后早期HLA II类限制性CD4⁺T细胞对感染的B细胞的识别。

还发现，EBV miRNA损害除CD4⁺T细胞外的MHC I类限制性、EBV特异性CD8⁺T细胞对感染的B细胞的识别。这些试验采用利用EBV感染的B细胞和多克隆EBV特异性CD8⁺T细胞以及对某些EBV抗原特异性的CD8⁺T细胞克隆的共培养分析。在用15天前用两种不同EBV株感染的原代B细胞过夜培养后测量CD8⁺T细胞的IFN-γ分泌(图4A)。根据它们的HLA限制性(并且仅在自体和匹配的设置中)，CD8⁺T细胞在与感染ΔmiR EBV的B细胞共培养后释放IFN-γ，但当CD8⁺T细胞与感染wt/B95-8EBV的B细胞共培养时释放更少的IFN-γ(图4B和图12)。类似地，相对于用表达miRNA的wt/B95-8EBV感染的B细胞，EBV特异性CD8⁺T细胞显著杀死用ΔmiR EBV感染的B细胞(图4C)。最后，相比ΔmiR EBV-感染的B细胞，当与wt/B95-8EBV-感染的B-细胞共培养时，CD8⁺T细胞克隆的IFN-γ释放强烈且持续地降低(图4D)，其中所述CD8⁺T细胞克隆对由HLA-B*40呈递的病毒蛋白LMP2的IED表位具有特异性(图10)(Lautscham等，J.Exp.Med.194，1053-1068(2001))。EBV miRNA影响了HLA-B*40而非LMP2表达(图4D和图11)。这些结果表明EBV miRNA控制抗原加工和呈递以保护感染的B细胞免于被EBV特异性CD8⁺T细胞识别。

实施例8

在大多数人中，EBV最终驻留于非增殖性B细胞中，而这些B细胞在很大程度上对于宿主的免疫应答是不可见的(Thorley-Lawson，J.Allergy Clin.Immunol.116，251-261(2005))。然而，EBV诱导了其最初感染的B细胞的增殖并促进它们的存活。发现了EBV编码miRNA，该种miRNA调节新感染的B细胞中宿主的适应性免疫应答的多个方面。缺少病毒miRNA的EBV感染的B细胞在影响这些应答和其他miRNA依赖性功能(包括抑制细胞凋亡)方面均是不足的(Seto，上文引用)。后面这些缺陷使得在人源化小鼠模型中无法进行新感染wt/B95-8或ΔmiR的B细胞的比较，因为后一种细胞的存活存在缺陷(C.Münz，个人沟通)。培养中的功能分析令人叹服地示出了，EBV的miRNA抑制细胞因子的分泌、抑制抗原加工和呈递、抑制CD4⁺T细胞的分化及其对感染的B细胞的识别，并抑制EBV特异性CD8⁺T细胞对这些细胞的识别。EBV使用其miRNA抑制适应性和先天性免疫应答的广度(Nachmani等，Cell HostMicrobe.5，376-385(2009))是前所未有的，并将促进其终身感染的有效建立。

实施例9

如在Hettich等(Gene Therapy，2006，Vol.13，844-856页)中所述，通过转染生产细胞诱导VLP产生。将上清液通过1.2μm过滤器过滤，并以100,000xg通过超速离心2小时浓缩。最后，将沉淀重悬于1.5mL PBS中。

将人EBV-永生化B细胞系(LCL)铺平板到96孔板(5×10⁴个细胞/孔)中，并与含有miRNA或缺少全部miRNA(ΔmiRNA)的VLP(1×10⁴个颗粒/细胞)以200μL/孔的总体积一起温育。温育24小时后，除去100μl培养基，通过加入100μl不含补充物的RPMI并以300×g离心5分钟洗涤细胞。再次，移除100μl培养基并将LCL与HLA匹配的CD4+T细胞克隆(100μl含有5×10⁴个细胞的细胞培养基)混合，然后共培养24小时，所述克隆对EBV被膜蛋白BNRF1具有特异性(LCL∶T细胞比率＝1∶1)。在IFNγ-ELISA分析中，根据制造商的方案(人IFNγ-ELISA显影试剂盒(ALP)，Mabtech)定量T细胞的活化。这一分析进行5次技术重复。分析结果示于图13。

除非另有说明，表示说明书和权利要求中所用的成分、性质(比如分子量、反应条件等)的量的全部数字被理解为在全部的情况中是用术语“约”修饰的。如本文所用，术语“约”或“大约”是指在10％至15％内，优选地在5％至10％内。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附的权利要求中阐明的数字参数是约数，其可以根据本发明所寻求获得的期望的性能而变化。最起码，并且并非打算将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数字参数应当至少按照所报告的有效数字的位数和通过使用普通的四舍五入技术来解释。虽然阐明本发明宽的范围的数字范围和参数是约数，但是在具体实施例中所述的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值本质上包含了由它们各自的测试测量中存在的标准偏差所必然形成的某些误差。

在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求的上下文中)所用的术语“一个”、“一种”、“该”和类似术语被解释为包括单数和复数，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。本文中引用的数值范围仅仅旨在用作分别指落入该范围的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值均并入说明书，就像其在本文中被单独引用一样。除非在本文中另有说明或明显地与上下文矛盾，否则本文中描述的所有方法均可以以任何合适的顺序实施。本文中提供的任何和所有实例，或示例性语言(例如，“比如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并非对本发明本来要求保护的范围设定限制。说明书中的语言不应被解释为表示对实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

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本文描述了本发明的某些实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当然，在阅读前面的说明书时，这些所描述的实施方案的变化对本领域普通技术人员是显而易见的。本发明人预期技术人员恰当地利用所述变化，并且本发明人预期本发明可按照除本文所具体描述的方式之外的方式实施。因此，本发明包括在随附的权利要求书中列举的主题的所有修改和等价物，如适用的法律所允许的。另外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本发明涵盖上面所描述的元素以它们的所有可能的变化形式的任何组合。

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另外，本说明书通篇已经引用了众多专利和印刷出版物。上面所引用的参考文献和印刷出版物中的每一篇各自以引用的方式全文并入本文。

总而言之，应该理解，本文所公开的本发明的实施方案是本发明的原理的阐述。可以使用的其他修改在本发明的范围内。因此，通过实例而非限制，可根据本文的教导利用本发明的替代配置(configuration)。相应地，本发明不局限于所精确地示出和描述的。

Claims (33)

1.一种包含疱疹病毒蛋白的疱疹病毒样颗粒(HVLP)，所述疱疹病毒蛋白由仍包含编码疱疹病毒miRNA的miRNA编码基因座的至少一种核酸分子编码，其中所述miRNA编码基因座中的至少一种是遗传修饰的。

2.根据权利要求1所述的HVLP，其中所述遗传修饰实现：所述至少一种疱疹病毒miRNA不表达或仅部分表达，所述至少一种疱疹病毒miRNA不结合其靶序列，所述至少一种疱疹病毒miRNA或其前体具有错误的3D结构，所述至少一种疱疹病毒miRNA的前体不被进一步加工，所述至少一种疱疹病毒miRNA或其前体被细胞降解，所述至少一种疱疹病毒miRNA编码基因座具有乱序的序列，所述至少一种疱疹病毒miRNA编码基因座缺失，和/或所述至少一种疱疹病毒miRNA或其前体包含突变、缺失或插入。

3.根据权利要求1或2所述的HVLP，其中与不含遗传修饰的疱疹病毒miRNA编码基因座的HVLP相比，所述遗传修饰导致免疫应答增加，其中如在定量ELISA中测定的，所述增加为至少5％，所述定量ELISA包括测量采用权利要求1或2所述的HVLP温育的免疫细胞的上清液中促炎细胞因子的浓度并将所述细胞因子浓度与采用由包含与野生型病毒相同的miRNA编码基因座的核酸分子编码的HVLP温育的免疫细胞的上清液中所述细胞因子浓度进行比较。

4.根据前述权利要求中任一项所述的HVLP，其中编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子是遗传修饰的，使得所述至少一种核酸分子不被包装在所述HVLP中。

5.根据权利要求4所述的HVLP，其中编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子缺少包装所需的功能性顺式作用元件。

6.根据权利要求4所述的HVLP，其中编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子包含编码包装所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能。

7.根据前述权利要求中任一项所述的HVLP，其中所述HVLP基本上不含疱疹病毒基因组和/或所述至少一种核酸分子。

8.根据前述权利要求中任一项所述的HVLP，其中编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子包含编码细胞转化所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能。

9.根据前述权利要求中任一项所述的HVLP，其中编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子包含编码诱导病毒合成所需的疱疹病毒蛋白的至少一种基因，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述疱疹病毒蛋白不表达或无功能。

10.根据前述权利要求中任一项所述的HVLP，其中编码所述疱疹病毒蛋白的所述至少一种核酸分子包含疱疹病毒基因组，其中所述疱疹病毒选自单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、人巨细胞病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、牛疱疹病毒1、牛疱疹病毒2、牛疱疹病毒3、牛疱疹病毒4、牛疱疹病毒5和鼠γ疱疹病毒68。

11.根据前述权利要求中任一项所述的HVLP，所述HVLP是Epstein-Barr VLP(EBVLP)，其包含Epstein-Barr病毒(EBV)蛋白和EBV miRNA。

12.根据权利要求11所述的EBVLP，其中所述至少一种修饰的miRNA编码基因座选自miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1、miR-BART2、miR-BART3、miR-BART4、miR-BART5和miR-BART15。

13.根据权利要求11或12所述的EBVLP，其中编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含至少一种基因，所述至少一种基因编码B-细胞转化所需的EBV蛋白，所述EBV蛋白选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、LMP1、LMP2、EBNA3A和EBNA3C，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述EBV蛋白不表达或无功能。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的EBVLP，其中编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含至少一种基因，所述至少一种基因编码诱导病毒合成所需的EBV蛋白，所述EBV蛋白选自BZFL1、BRLF1和BMLF1，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述EBV蛋白不表达或无功能，其中所述基因优选地为BZLF1。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的EBVLP，其中编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子缺少包装元件TR。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的EBVLP，其中编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含编码包装EBV DNA所需的EBV蛋白的至少一种基因，所述EBV蛋白选自BFLF1、BBRF1、BGRF1、BDRF1、BALF3、BFRF1A和BFRF1，所述至少一种基因是遗传修饰的使得所述EBV蛋白不表达或无功能。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的EBVLP，其中编码所述EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含EBV基因组。

18.一种核酸分子，其编码权利要求1至10中任一项所述的HVLP的疱疹病毒蛋白或权利要求11至17中任一项所述的EBVLP的EBV蛋白。

19.一种载体，其包含权利要求18所述的核酸分子。

20.一种物质组合物，其包含编码权利要求1至10中任一项所述的HVLP的疱疹病毒蛋白或权利要求11至17中任一项所述的EBVLP的EBV蛋白的至少两种核酸分子。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述至少两种核酸分子由至少两个载体包含。

22.一种宿主细胞，其采用权利要求18所述的核酸分子、权利要求19所述的载体或权利要求20或21所述的组合物转染。

23.一种用于产生HVLP或EBVLP的方法，所述方法包括：

(i)在允许所述疱疹病毒蛋白或所述EBV蛋白表达的条件下培养权利要求22所述的宿主细胞；和

(ii)获得所述HVLP或EBVLP。

24.根据权利要求23所述的方法，所述方法在步骤(i)之后和步骤(ii)之前包括另一步骤(i’)，所述步骤(i’)包括诱导所述疱疹病毒或Epstein-Barr病毒的复制期，其中通过表达编码诱导疱疹病毒合成或EBV合成所需的疱疹病毒蛋白或EBV蛋白的至少一种基因诱导所述复制期，其中由编码所述HVLP的疱疹病毒蛋白或EBVLP的EBV蛋白的所述至少一种核酸分子包含的、编码所述疱疹病毒蛋白或EBV蛋白的所述至少一种基因已经被遗传修饰，使得所述疱疹病毒蛋白或EBV蛋白不表达或无功能。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述基因自由所述宿主细胞包含的稳定转染的载体表达和/或其中所述基因的表达是可诱导性调节的。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中编码所述EBV蛋白的所述基因选自BZLF1、BRLF1和BMLF1，其中BZLF1是优选的。

27.一种组合物，其包含至少95％的如权利要求1至10中任一项所定义的HVLP或如权利要求11至17中任一项所定义的EBVLP。

28.一种疫苗组合物，其包含权利要求1至10中任一项所述的HVLP、权利要求11至17中任一项所述的EBVLP或权利要求27所述的组合物。

29.根据权利要求28所述的疫苗组合物，其进一步包含赋形剂。

30.根据权利要求28或29所述的疫苗组合物，其进一步包含一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或疫苗佐剂，其中所述一种或多种病毒多肽或所述一种或多种病毒核酸序列不是来自与所述疫苗组合物中的HVLP或EBVLP相同的病毒。

31.权利要求1至10中任一项所述的HVLP或权利要求11至17中任一项所述的EBVLP、权利要求27所述的组合物或权利要求28至30中任一项所述的疫苗组合物在受试者的疫苗接种或治疗中的用途。

32.权利要求18所述的核酸分子、权利要求19所述的载体、权利要求20或21所述的组合物或权利要求22所述的宿主细胞在生产HVLP或EBVLP中的用途。

33.一种试剂盒，其包含权利要求1至10中任一项所述的HVLP、权利要求11至17中任一项所述的EBVLP、权利要求18所述的核酸分子、权利要求19所述的载体、权利要求20或21所述的组合物、权利要求22所述的宿主细胞、权利要求27所述的组合物和/或权利要求28至30所述的疫苗组合物。