CN103328003A - 爱泼斯坦-巴尔病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含颗粒的疫苗，所述颗粒包含(i)至少一种爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)结构多肽，(ii)至少一种EBV溶解多肽，(iii)膜脂类，所述颗粒缺乏EBV DNA，其中(a)如所述颗粒中包含的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽的B-细胞转化能力被失活而它们的免疫原性被保持;和/或(b)所述颗粒缺乏B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。此外，本发明涉及产生颗粒的方法，涉及在本发明方法中获得的细胞，包含根据本发明方法产生的疫苗或颗粒的试剂盒。而且，本发明涉及根据本发明方法产生的疫苗或颗粒用于产生EBV抗原特异性的CD8+细胞的用途。

Description

爱泼斯坦-巴尔病毒疫苗

技术领域

本发明涉及包含颗粒的疫苗，所述颗粒包含(i)至少一种爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)结构多肽，(ii)至少一种EBV溶解多肽，(iii)膜脂类，所述颗粒缺乏EBV DNA，其中(a)如所述颗粒中包含的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽的B-细胞转化能力被失活而其免疫原性被保持；和/或(b)所述颗粒缺乏B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。此外，本发明涉及产生颗粒的方法，涉及在本发明方法中获得的细胞，包含根据本发明方法产生的所述疫苗或颗粒的试剂盒。而且，本发明涉及根据本发明方法产生的所述疫苗或颗粒用于产生EBV抗原特异性的CD8+细胞的用途。

在本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请和厂商手册。这些文献的公开内容，尽管并不认为与本发明的专利性相关，都以其全部内容结合于本文中作为参考。更具体地，所有参考文献都引入本文中作为参考，其程度就像每个单独的文献被明确地并且单独地指出引入本文作为参考。

背景技术

爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)是一种广泛存在的人类疱疹病毒，感染了全球超过90％的人口，在其宿主中具有长期保留时间。在大多数情况下，初次感染发生在儿童早期且通常无症状。相反，如果感染延迟并且发生在青春期或成年期，经常会有症状，在高达50％的病例中引起良性的，通常自限性的淋巴组织增生综合症，称为传染性单核细胞增多症(IM)(Rickinson and Kieff，2007)。虽然这种疾病通常是自限性的，已经报告(Lu et al.，2009；Imashuku，2007)具有致命结果的IM(Tobi et al.，1982)或慢性活性EBV感染(CAEBV)的长时间形式。还发现临床表观IM显著地增加生命后期发展霍奇金病和其他类型淋巴瘤的风险(Becker et al.，2009，Goldacre et al.，2009)。今天，还普遍接受的是IM是生命后期多发性硬化症的独立危险因素(Thacker et al.，2006；Zaadstra et al.，2008)。此外，EBV与不同组的恶性疾病像鼻咽癌，胃癌，和各类淋巴瘤有因果关联(Lopes et al.，2003)，使得WHO将EBV分类为I级致癌物质(Niedobitek，1999)。

除了上述由EBV引起的医学病症，患有原发性或继发性免疫缺陷的患者，如移植物接受者，对EBV相关疾病是尤其高危的，因为免疫抑制剂对EBV感染的B-细胞的免疫控制具有不利影响。EBV相关的PTLD是移植后并发症的一种重要形式，出现在高达20％的器官接受者中(Everlyet al.，2007；Taylor et al.，2005)。重要的是，在免疫抑制发生时对EBV免疫幼稚(immnologically naive)的免疫受损的移植物接受者，对于由于原发性EBV感染(例如，通常由于EBV的高发病率在移植之后通过供体器官经由病毒传播而引起的)发展成威胁生命的EBV+移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)是尤其高危的。由于暴露于免疫抑制药物导致T-细胞免疫受损，这些患者无法有效地引发在控制EBV感染的B-细胞的增殖中发挥了关键作用的EBV特异性T-细胞。相比之下，在移植时EBV血清学阳性的患者具有发展PTLD的低得多的风险，证实EBV特异性T细胞具有消除病毒感染细胞的重要作用。在一般情况下，在移植前EBV血清阴性患者具有发展EBV相关疾病的高得多的风险，因为在移植器官中供体EBV的传播或病毒的天然感染会在移植后在EBV-i血清阴性受体中引起淋巴增生性疾病(例如，Mendoza et al.，2006；Swerdlow et al.，2000)。对于许多病毒相关疾病，用于预防和/或治疗宿主体内病毒感染及其后果的很有前途的方法是接种疫苗，在移植之前通过使其对EBV免疫来降低血清阴性患者中PTLD的高风险的情况下，也是如此。

这些EBV相关疾病为开发省钱且高效地处理后续病毒感染和病毒相关疾病的EBV疫苗提供了强有力的论据。对人类采用候选疫苗的首次试验已在20世纪90年代完成，使用表达主要EBV膜抗原，BLLF-1，的重组痘苗病毒，产生EBV中和抗体的滴度增加(Gu et al.，1995)。最近，有人已经描述旨在健康的志愿者(Elliott et al.，2008；Moutschen et al.，2007；Sokal et al.，2007)和等待肾脏移植的儿童(Rees et al.，2009)中IM的血清转化和预防的不同肽基预防性疫苗。在这些儿童中，在四个受体中检测到中和抗体。然而，免疫反应迅速下降，并不太可能影响到移植后的事件。

活的减毒病毒是有效地保护免受野生型病毒和相关疾病感染的多价疫苗。遗传减毒通常通过在允许细胞中将病毒连续传代而实现。不幸的是，与其他疱疹病毒如Varizella带状疱疹相反，对于EBV并不存在允许自发遗传减毒的溶解系统。通过有意地用野生型EBV感染人而进行血清转化原则上是容易的，但这被认为是不道德的，因为这种病毒本身是明确地致癌的。而且因为严重副作用和播散性感染的风险(Duchini et al.，2003；Succi and Farhat，2006)活的减毒疫苗通常不推荐用于具有原发性和继发性免疫缺陷的多组免疫受损的患者(Pickering et al.，2009)。

依靠gp350亚单位疫苗的单价EBV疫苗研究了20多年，具有不同的结果：在临床I/II期研究中招募的健康自愿者中一种制剂成功地诱导中和抗体(Moutschen et al.，2007)，而在等待肾脏移植的儿童中另一种疫苗制剂并未影响移植后EBV滴度以及保护免受PTLD(Rees et al.，2009)，可能是因为gp350通常不表达于PTLD和其他EBV相关的恶性肿瘤中。因此，gp350疫苗能够降低发展EBV相关癌症的风险，可能是值得怀疑的。

在WO2009/068615中，描述了病毒样颗粒(VLP)的产生，其特征在于它们不包含病毒DNA或不包含转化EBV DNA。所述颗粒应用于根据其产生EBV结构抗原-特异性的CD4+细胞的体外方法中。由于在缺乏转化EBV DNA的DNA中潜在存致癌基因且在VLP中存在转化蛋白，出于安全性和伦理方面的原因，它们不能应用于人类。此外，生成的CD4+细胞不能被认为是一种有效的疫苗，更不要说用作预防性疫苗，因为CD4+细胞仅产生于EBV阳性供体，而它们不能在EBV-幼稚个体中引发EBV特异性免疫细胞。

本发明下面的技术问题是鉴别允许对抗EBV感染和EBV相关疾病的治疗和预防接种的替代和/或改进的装置和方法。

发明内容

该技术问题的解决方案通过提供在权利要求中表征的实施方式而实现。

因此，在第一实施方式中本发明涉及包含颗粒的疫苗，所述颗粒包含(i)至少一种爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)结构多肽，(ii)至少一种EBV溶解多肽，(iii)膜脂类，所述颗粒缺乏EBV DNA，其中(a)如所述颗粒中包含的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽的B-细胞转化能力被失活而其免疫原性被保持；和/或(b)所述颗粒缺乏B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。

如本发明中所用的，术语“疫苗”是指预防性或治疗性使个体对EBV免疫。根据本发明的疫苗使个体对EBV感染和EBV-相关疾病免疫。免疫作用涉及针对疫苗之中的抗原刺激和敏化免疫系统的方法。根据本发明，预防性免疫作用是指第一次将个体免疫系统(即，幼稚的免疫系统(naiveimmune system))暴露于EBV抗原。所述第一次暴露导致所述抗原从所暴露个体的体内清除并发展EBV-抗原特异性的CD4+-和CD8+-细胞和产生抗体的记忆型B-细胞。当第二次暴露时免疫系统能够更有效地防止EBV感染和/或清除所述感染，由此预防或缓解EBV-相关疾病的发展。具体而言，所述预防性免疫作用的作用自身在以下至少一项中表明：预防用EBV免疫的个体的感染，改变或限制感染，辅助、改善、增强或刺激所述个体从感染中恢复和产生可以预防或限制随后EBV感染的免疫记忆。所需效应的任何一种的存在都能够通过本领域技术人员已知的常规方法进行测试和检测。优选地，患者用一种或多种EBV抗原攻击，所述EBV抗原已经是所用疫苗的一部分并测定抗体滴度和抗所述一种或多种抗原的T-细胞的数目。另外，能够测定体外抑制人类B-细胞感染的中和抗体的诱导作用。

虽然同样引起针对EBV抗原的免疫响应，根据本发明的治疗性免疫作用在个体上实现，所述个体在所述免疫作用之前暴露于EBV，即，他们已用EBV感染。在这种情况下，免疫作用导致静止T效应器细胞的重新激活，这会遇到处于这些抗原通过专门的抗原呈递细胞与MHC I类和/或MHC II类分子相结合呈递的形式的同源抗原。在以下情况中针对EBV的治疗性免疫作用可以证明是尤其相关的：在其中病毒再活化是不希望的情况中，像例如，在移植物接受者或其他免疫受损患者(HIV阳性个体，癌症患者，患有严重炎症或自身免疫性疾病的患者)中，或在其中EBV再活化可能导致或已经导致疾病发展的情况中例如移植后淋巴增生紊乱症(PTLD)和非霍奇金淋巴瘤，慢性活动性EB病毒感染(CAEBV)，口腔毛状白斑，或在其中EBV的B-细胞转化能力已经导致疾病发展的情况中，像例如，癌症。

除了包含的EBV抗原之外，如以下详细说明的，根据本发明这些EBV抗原包含于颗粒中，根据本发明的疫苗可以进一步包含药用载体，所述药用载体包括本身不会诱发免疫响应或对接受疫苗的个体有害的任何其他不良反应的任何载体。合适的载体一般是较大的，代谢缓慢的大分子，如蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和脂聚结体，像例如，油滴或脂质体。其他合适的药用载体是本领域已知的。此外，所述载体可以进一步起到免疫刺激剂作用，这将在下面更详细地进行说明。此外，这种疫苗可以包括稀释剂，像例如，水，盐水，甘油，乙醇等。此外，为了制剂目的所需物质可以包含在疫苗中，如乳化剂和/或pH缓冲物质。上述物质的任何组合可以按需作为根据本发明疫苗的部分。

有效免疫的需要量和治疗方案可以会有所不同并且取决于多种因素，如个体大小、体表面积、年龄、性别、给药时间和途径，一般健康状况和同时给药的其他药物。所述有效用量预计处于较宽范围内，并且对于任何给定的情况可以容易地通过常规实验测定，并且在普通临床医生或医师的技能和判断范围内。给药模式可以是任何给药模式，所述给药模式导致使暴露于疫苗的个体产生免疫作用而进行免疫，并包括非肠道给药，如静脉内，肌肉内，腹腔内，胸骨内，皮下，关节内注射或灌注和吸入，以及肠内给药。优选地，所述疫苗给药至少2次，用来使免疫作用最大化。

如本发明所使用的，术语“颗粒”是指EBV多肽和膜脂类的颗粒状聚结体，同时缺乏EBV DNA。术语“多肽”是指由超过30个连续氨基酸构成的分子。按照本发明还设想使用“肽”，即，含有高达30个氨基酸的分子，代替多肽。在所述肽有助于所述颗粒的免疫效果的方面，应该理解的是它们包括EBV抗原表位。术语“多肽”还包括多肽片段。术语“多肽片段”是指可能或不可能与全长多肽的(生物)活性相关联的多肽部分。优选地，活性可归因于这种片段。多肽可以进一步形成二聚物，三聚物和更高级低聚物，即，由一个以上的多肽分子构成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同或不同的。因此这些相应的较高级别的结构称为均-或杂-二聚体，均-或杂三聚体等。均-或杂二聚体等也落在术语“多肽”的定义下。术语“多肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用并且也称为天然修饰多肽，其中所述修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、磷酰化等实现。这类修饰是本领域众所周知的。根据本发明称为“EBV多肽”的多肽是氨基酸序列与EBV多肽相同的多肽。如本文中所用的，术语“EBV”是指任何野生型，即，天然生成的EBV菌株而并非限于一种具体菌株。具体而言，EBV1型和EBV2型在本领域内是众所周知的并且已经进行了广泛表征。这些两种EBV-型主要不同之处在于编码EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B和EBNA-3C的核多肽基因。除了关于编码EBNA-家族的多肽的基因差异，1型和2型的基因组几乎没有不同。1型主要盛行于发达国家人群中，而2型还盛行于赤道非洲和新几内亚(Kieff andRickinson，2007，进行了综述)。另外，术语EBV多肽还包含在序列方面不同于野生型EBV菌株的多肽，但包含与野生型EBV多肽共享至少(对于每个值)99％，98％，97％，96％，95％，90％，85％，80％和至少75％序列一致性的蛋白。多肽序列一致性程度能够通过本领域技术人员以众所周知的方法进行计算，并可以包含进行序列数据比对和序列同源性计算的算法的自动执行。颗粒的EBV多肽可以源于不同EBV菌株；优选它们源于一个菌株。

如上文所述，要求包含于颗粒中的EBV多肽属于EBV结构多肽和EBV溶解多肽的组。如技术人员应当理解的，EBV的具体多肽可以属于不只一种上述多肽的组。换句话说，如从以下段落中提及的具体EBV多肽应当清楚的，EBV多肽能够表示结构多肽以及溶解多肽。在后者的情况下(具体EBV多肽)，颗粒不需要包括作为结构多肽或溶解多肽的其他EBV多肽。优选地，这种颗粒包含针对每个上述组的EBV-多肽至少一种单独的EBV多肽，因为这通常会增加疫苗的抗原性潜力。更优选的是，至少(对于每个值)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或至少12个单独的多肽独立地是被疫苗颗粒包含的每个所述多肽组的部分。

根据本发明，术语EBV的“结构多肽”是指涉及EBV的结构设置的多肽。所述多肽优选地选自由膜多肽，外被多肽和衣壳多肽组成的组。EBV膜多肽包含选自由以下组成的组中的多肽：BALF4、BLLF1(也称为gp350)、BDLF2、BDLF3、BKRF2、BLRF1、BNLF1(也称为LMP-1)、TP(也称为LMP-2a)、BXLF2、BZLF2以及它们的任何组合。EBV外被多肽包含选自由以下组成的组中的多肽：BBRF2、BGLF2、BMLF1、BNRF1、BOLF1、BPLF1、BTRF1、BVRF1、以及它们的任何组合。EBV衣壳多肽包含选自由以下组成的组中的多肽：BBRF1、BcLF1、BDLF1、BFRF3以及它们的任何组合。优选至少一种结构多肽选自由以下组成的组中：BLLF1，BMLF1，BNRF1或它们的任何组合如BLLF1和BMLF1，BLLF1和BNRF1，或BMLF1和BNRF1。

术语“溶解多肽”是指涉及EBV溶解循环的诱导和维持(本文也称为复制期)和/或表达为所述溶解循环的诱导结果的EBV多肽。所述溶解多肽优选地选自包含立即早期基因，早期基因和晚期溶解基因的组(Kieffand Rickinson，2007)。通过BZLF1和BRLF1(两者都为立即早期蛋白)的表达引发溶解循环，接着表达早期和晚期蛋白。在诱导之后，允许病毒复制的细胞经历疱疹病毒的细胞病变改变特征(Kieff and Rickinson，2007)。根据本发明有待使用的示例性溶解多肽选自包含以下的组：BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BALF2、BALF5、BGL2、BHRF1、BALF4、BDLF3以及它们的任何组合。优选地，至少一种溶解多肽是BLLF1(也称为gp350)或它们的任何组合。

如根据本发明所用的，术语“膜脂类”是指能够自发地排列以形成脂质双层的脂类。这类膜脂类是包含疏水区和亲水区的脂类，其中在自组装后膜脂类的疏水区形成双层的内部部分而亲水区形成膜的外表面。优选地膜脂类是天然形成细胞膜的脂类，如两亲性磷酸脂类。还优选的是，所述膜脂类源于野生型EBV能够复制的宿主细胞。更优选地，所述膜脂类源于根据本发明的细胞。根据本发明，包含在颗粒中的膜以足以形成构成颗粒外壳的膜的量存在。该颗粒必须具备所述膜外壳，所述膜外壳优选地包含至少一种EBV结构多肽。如下面概述的，膜-结合EBV结构多肽的优选实施例是gp350多肽和LMP-1多肽。如以下进一步详细说明的，LMP-1的B-细胞转化能力可能被失活。还优选的是，颗粒膜包含也天然地发现于EBV膜中的其他膜组分，像例如，在膜内部、外部或跨膜可能发现的其他膜多肽。

颗粒“缺乏EBV DNA”是指所述颗粒并不包含EBV DNA，即，未能够检测到EBV DNA。具体而言，根据本发明，术语“DNA”，包括任何DNA，如cDNA或基因组DNA。如本文上下文中所用的，术语“DNA”进一步包括本领域已知的DNA模拟分子如合成的或半合成的DNA衍生物和混合聚合物，正义链和反义链两者。根据本发明这类DNA模拟分子或DNA衍生物包括硫代磷酸酯核酸，氨基磷酸酯核酸，2’-O-甲氧基乙基核糖核酸，吗啉基核酸，己糖醇核酸(HNA)和锁核酸(LNA)(Braaschand Corey，2001)。LNA是RNA衍生物，其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基连接限定。如本领域技术人员容易理解的，它们可以包含其他非天然的或衍生的核苷酸碱基。因此，颗粒必须不包含与EBV DNA序列一致的DNA序列，其中所述序列优选地是指EBV基因序列。而且，所述颗粒必须不包含与野生型EBV核酸序列共享至少(对于每个值)99％，98％，97％，96％，95％，90％，85％，80％和至少75％序列一致性的核酸序列。核酸序列的序列一致性程度能够通过本领域那些技术人员通过众所周知的方法进行计算并可以包含进行序列数据比对和序列同源性计算的算法的自动执行。另外，所述颗粒可以不包含当表达时产生功能上类似于EBV多肽的多肽的DNA序列，其中所述功能相似之处优选地涉及B-细胞转化能力。用于测试多肽功能相似性的方法包括计算机测试以及本领域技术人员众所周知的体内，体外和离体测试。例如，为了测定功能相似性，人们能够产生EBV的缺失突变体并进行互补分析。具体而言，EBV的缺失突变体特征在于编码，例如，在B-细胞转化中至关重要的多肽的基因序列缺失。因此，所述缺失突变体不能转化B-细胞。为了测试DNA序列与缺失EBV序列的功能相似性，将所述有待测试的DNA供给给所述缺失突变体，例如，通过将所述有待测试DNA结合到所述缺失突变体的基因组DNA中。随后，确定这样修饰的缺失突变体是否能够转化B-细胞，即，互补缺失并且产生功能上与野生型EBV相似的EBV。所述互补分析的变化在本领域内也是已知的并且能够根据技术人员在本领域内的技术知识进一步适合其具体需求。

在进一步的实施方式中，设想没有任何类型的DNA包含于所述疫苗中或包含在所述疫苗中的颗粒中。

然而，所述颗粒可以包含EBV RNA。应该理解的是，如本文中所用的，术语“RNA”包括所有形式的RNA，包括mRNA，ncRNA(非编码RNA)，tRNA和rRNA。术语“非编码RNA”包括天然存在的siRNA(小干涉RNA)，miRNA(微RNA)，rasiRNA(重复相关RNA)，snoRNA(小核仁RNA)和snRNA(小核RNA)。病毒mRNA当在各个实施方式中包含于如本文中所述的颗粒中时能够在感染的细胞中被翻译并且衍生于翻译的多肽的肽能够结合MHC I类抗原呈递从而使得它们引发或再活化CD8+T细胞。相应的EBV病毒的mRNA是其转录本以上提及属于EBV“结构多肽”和“溶解多肽”的mRNA分子。例如，所述颗粒可以包含编码以下的病毒EBV mRNA：BALF4、BLLF1(也称为gp350)、BDLF2、BDLF3、BKRF2、BLRF1、BNLF1(也称为LMP-1)、TP(也称为LMP-2a)、BXLF2、BZLF2、BBRF2、BGLF2、BMLF1、BNRF1、BOLF1、BPLF1、BTRF1、BVRF1、BBRF1、BcLF1、BDLF1、BFRF3(作为“结构多肽”)；和/或BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BALF2、BALF5、BGL2、BHRF1、BALF4、BDLF3(作为“溶解多肽”)；和/或其转化能力已经被失活而其免疫原性被保持的相应多肽。优选地，根据本发明包含于所述颗粒中的所述EBV病毒mRNA分子编码优选的“结构多肽”和/或“溶解多肽”和/或其转化能力已经被失活而其免疫原性被保持的相应多肽，或如包含于颗粒中或由其构成的本文以上描述的它们优选的组合，换句话说，包含于所述颗粒中的mRNA分子的转录本反映根据本发明所述颗粒的EBV多肽组成。同样设想的是所述颗粒可以可替代地或另外地包含其转录本并不包含于所述颗粒中的EBV mRNA。例如，编码BZLF1和/或BRFL1的mRNA能够包含于根据本发明的颗粒中而BZLF1和/或BRLF1多肽并未包含于所述颗粒中。还设想的是所述颗粒并未包含编码根据本发明包含于所述颗粒中的每种多肽的mRNA分子，即，反映所述颗粒的EBV多肽组成。优选地，编码EBV mRNA的至少BRLF1和/或BZLF1包含于根据本发明的所述颗粒中。将mRNA结合到所述颗粒中能够，例如，用本文中以下描述的方法实现，在这种方法中将在表达修饰EBV基因组的细胞中存在的EBVmRNA分子结合到颗粒中。根据本发明将EBV mRNA结合到所述颗粒中的其他方法包括，例如，电穿孔，脂质体转染或本领域已知的其他方法，用于将核酸传送通过脂质膜。根据本发明应该理解的是，在本发明颗粒中存在的任何mRNA分子能够诱导所述感染的细胞转化成增殖状态。本领域内的技术人员应该理解的是由于mRNA分子的不稳定性和所表达的EBV多肽的所获得的低速率，从包含于所述颗粒中的所述EBV mRNA潜在地转化EBV多肽的表达将并不足以诱导感染细胞的转化。然而，熟练技术人员能够确定使用哪些mRNA和/或必须进行针对EB病毒mRNA的哪种修饰来排除单独地或与其他EBV多肽结合地具有转化活性的EBV多肽的表达(如果这在批准作为药物活性剂的过程中对于调节目的是必要的)。

在另一实施方式中，设想没有任何类型的RNA包含于所述疫苗或所述疫苗包含的颗粒中。

而且可以设想的是没有任何类型的核酸包含于所述疫苗或所述疫苗包含的颗粒中。

所述颗粒缺乏至少EBV DNA是由于野生型EBV将B-细胞转化成能够无限生长的细胞的能力。这是由于在野生型EBV基因组中存在潜在的致癌基因，即涉及发展成癌的基因。因此，有关当给予有待免疫的个体时本发明疫苗的安全性，作为疫苗接种的直接结果，从所述疫苗，更具体而言从所述颗粒中排除EBV DNA会导致所述有待免疫的个体经历B-细胞转化或发展成癌的风险降至最低。在以前没有暴露于EBV和被其感染的个体的情况下，这是特别重要的；参见本文上面的介绍部分。

由于当给药时疫苗安全性提高的另外的特性同时有助于免疫原性，所述颗粒可以包含其B-细胞转化能力被失活而其免疫原性被保持的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。在体外，通过EBV的B-细胞转化导致感染的B-细胞增殖持续延长的寿命。根据本发明，术语“B-细胞转化所需的”是指当用野生型EBV感染时，所述一种或多种EBV多肽在转化B-细胞中是至关重要的。换句话说，在所述一种或多种重要的EBV多肽不存在的情况下，当感染时，B-细胞并不发生转化。因此，当与所述B-细胞融合时，所述颗粒不能转化所述B-细胞。尽管其能够足以使一种基本EBV多肽的所述B-细胞转化能力失活以便排除B-细胞转化的可能性，可替代地人们能够使EBV多肽的基本组合的所述B-细胞转化能力失活从而实现当仅一种基本多肽被失活时获得相同结果，即，实现排除B-细胞转化的可能性。优选地，超过所述一种基本EBV多肽或EBV多肽的基本组合的所述B-细胞转化能力被失活。在B-细胞转化中非常重要的对应的EBV多肽是EBNA2、LMP1、EBNA-LP。使这些EBV多肽之一的所述B-细胞转化能力失活就足以排除B-细胞转化的可能性。B-细胞转化所需的EBV多肽的基本组合是EBNA3A和EBNA3C，LMP-2A和EBNA3A，或LMP-2A和EBNA3C。如技术人员容易理解的，如果相应的基本组合中仅一个成员存在于所述颗粒中，因为其独自地仍能够转化B-细胞，其B-细胞转化能力必须被失活。这同样适用于存在组合中多个成员的情况，只要组合不完全，即，颗粒中并非存在排除B-细胞转化可能性所需要的所有成员。换句话说，仅当基本组合的所有成员都失活时，才能够排除B-细胞转化的可能性。

应该理解的是为了确保疫苗的安全性，包含其B-细胞转化已经被失活的B-细胞转化所需的所述一种或多种EBV多肽的颗粒不能同时包含相应功能的EBV多肽对应物。

上述内容在细节上进行必要改变用于以下实施方式中。

转化B-细胞的能力失活能够通过例如修饰在功能上涉及B-细胞转化过程的多肽结构域的方法来实现。所述修饰能够通过多种方法实现(像例如，缺失所述功能域或其部分，空间阻抑所述功能域或整个多肽，或取代所述功能域的一个或多个氨基酸)从而使该功能受损。当使多肽的B-细胞转化能力失活时，其免疫原性将被维持。本领域技术人员能够通过采用计算机方法以及体内、体外或离体的常规实验方法毫不费力地确定蛋白的抗原区域和所述区域内的特异性抗原决定簇。在确定所述抗原区之后，他能够选择适合维持多肽免疫原性同时使其B-细胞转化能力失活的策略。这样，人们能够获得功能性失活的但是具有免疫原性的EBV多肽。例如且在具有B-细胞转化能力的跨膜多肽如，例如，LMP-1(也称为BNLF1)的情况下，人们能够通过仅缺失所述多肽的跨膜部分但是保留在所述病毒颗粒外部的所述多肽的膜外部分来截短所述多肽。

可替代地或另外地，所述颗粒可以缺乏B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。B-细胞转化所需的任何上述EBV多肽或B-细胞转化所需的EBV多肽组合可以从所述颗粒中缺失。然而并且根据本发明，所述颗粒由于存在其他EBV颗粒(如所述至少一种EBV结构多肽和所述至少一种EBV溶解多肽)仍然是免疫原性的。在其中缺失一种或多种转化多肽并且至少一种EBV多肽被失活的情况下，应该理解的是缺失的所述一种或多种EBV多肽不能同时被失活。换句话说，如果所述一种或多种EBV多肽被失活，则其不能同时缺失。如果EBV多肽的组合在B-细胞转化中是很重要的，则所述组合中第一成员可以被失活同时第二成员可以缺失。

对于该实施方式提供的定义和解释除非另外明确指出，在细节上做必要的修正用于所有以下的实施方式中。

一般而言并且还根据本发明，令人希望的是所述疫苗包含尽可能多的不同EBV多肽以使疫苗的抗原潜力最大化。因此，在替代实施方式中本发明涉及包含颗粒的疫苗，所述颗粒包含修饰的EBV，其中与野生型EBV相比较所述修饰的EBV缺乏EBV DNA，并且其中(a)如所述颗粒中包含的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽的B-细胞转化能力被失活而其免疫原性被保持；和/或(b)所述颗粒缺乏B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。

在所述替代实施方式的优选实施方式中，仅在上述特性方面所述修饰的EBV不同于野生型EBV。

这种替代实施方式实现了野生型EBV的全抗原能力但是排除了疫苗在有待免疫的个体中诱导B-细胞转化或其他EBV-相关疾病(像例如，感染性单核细胞增多症(IM)、肿瘤)的潜力。因此，免疫个体的免疫系统响应于密切相似野生型EBV的疫苗中宽范围的EBV抗原而引发，由此导致从医疗的角度被认为在对抗EBV感染中是非常有效的免疫系统的调节。

在所述替代实施方式的更优选的实施方式中，所述修饰的EBV另外地不同于野生型EBV之处在于EBV多肽EBNA-2、EBNA-3a、EBNA-3b、EBNA-3c缺失。甚至更优选的是LMP-1被失活和/或BZLF1是所述修饰的EBV的部分。

本发明的疫苗中包含的所述颗粒能够通过涉及标准克隆和细胞培养技术领域内众所周知的方法以及所述方法(例如Sambrook，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.，“Practical Cell Culture Techniques”，Boulton et Baker(eds)，Humana Press(1992)，ISBN0896032140；“Human Cell Culture Protocols”，Gareth E。Jones，Humana Press(1996)，ISBN 089603335X)进行制备。例如，所述EBV多肽能够通过在允许所述颗粒聚结和排出的宿主细胞中由DNA序列表达而重组地产生。所述颗粒还能够部分地或全部地基于合成进行生产。优选地，所述颗粒通过以下详细描述的任何方法进行制备。

虽然EBV因果关系地涉及如上文所述的多种严重医学病症并且尽管关于对抗不同病毒株进行深入研究并取得成功，但是EBV疫苗的研发迄今依然未成功，尽管近年来已然见到对抗，例如，人类乳头状瘤病毒，以及B型肝炎病毒的病毒疫苗获得批准。本发明人能够首次生成一种疫苗，所述疫苗有效地引发EBV幼稚个体中的EBV特异性免疫应答，以及有效地再活化EBV阳性个体中的EBV特异性免疫应答，并且由此为EBV疫苗长期需要提供了答案。

最令人惊讶的是本发明的疫苗能够在动物模型中引起EBV特异性CD8+免疫应答，即，除了较强的体液免疫应答之外的细胞免疫应答，并且能够再活化来自EBV-血清阳性的人类供体的EBV特异性CD8+T细胞，尽管由于其B-细胞转化能力EBNA3多肽已经被缺失。这是令人惊讶的，因为众所周知的是当EBV感染时产生的CD8+细胞主要针对EBNA3多肽并且人们可以预期缺乏所述EBNA3多肽的疫苗将不会产生较强的EBV特异性CD8+细胞应答。此外，人类B-细胞，它是本发明EBV疫苗的靶，据推测不会具有交叉呈递源于病毒颗粒的MHC I类限制性表位的潜力(Keller et a1.，2009)。

本发明人使用携带EBV辅助细胞基因组的细胞系，所述EBV辅助细胞基因组被修饰使得其不能包装到作为本发明疫苗部分的颗粒中。为了进一步确保疫苗的安全性，所述疫苗优选缺乏由于在所述宿主细胞系中优选因此修饰的EBV(辅助细胞)基因组能够转化B-细胞的EBV多肽。因此，甚至在EBV辅助细胞基因组异常地包装到颗粒中的罕见的情况下，仍能够完全排除B-细胞转化和病毒再活化。

总之，本发明人提供不含病毒DNA且在幼稚宿主中(naive host)可靠地诱导较强的多价中和体液和细胞免疫应答的颗粒。因此，它们对于具有任何种类的血清状态的个体都构成有效且安全的疫苗，特别是对于等待，例如，移植的EBV-幼稚患者，其中它们降低了在免疫受损患者中EBV相关疾病的风险。

在本发明疫苗的优选实施方式中，所述颗粒包含选自BZLFl和gp350的至少一种EBV多肽和/或进一步包含至少一种EBV潜伏多肽。

EBV多肽gp350(醣蛋白350)是一种膜结合醣蛋白。所述gp350通过结合至B-细胞的细胞表面上的CD21负责B-细胞的特异性(向性)。其他辅助病毒多肽可以有助于全效感染(Chesnokova et al.，2009；Omerovicet al.，2005；Silva et al.，2004；Sorem and Longnecker，2009)。而且，低效感染还采用缺乏gp350的重组EBV颗粒进行证实(Janz et al.，2000)。最近的研究还假设在内化步骤之后以及推测地在从内体室中释放所述病毒衣壳期间gp350的作用(implication)(Busse et al.，2010)。尽管根据本发明对于疫苗并非至关重要的，优选gp350包含于所述颗粒的膜中，因为当给予疫苗时，所产生的免疫应答更紧密地类似于当通过野生型EBV感染时引起的免疫应答。

EBV立即早期多肽BZLF1介导潜伏EBV感染的中断，并且通常认为是在诱导EBV的溶解阶段中的关键调节剂。在野生型EBV中，BZLF1并非一直表达。当进入宿主体内时，BZLF1并不表达，仅在B-细胞感染之后BZLF1才表达，导致诱导所述溶解循环。所述溶解循环被维持直至宿主的免疫应答适合EBV并且能够包含所述感染，这是当EBV进入感染潜伏阶段时的时刻。在所述阶段中，BZLF1并不表达。用EBV持续感染特征在于存在溶解和潜伏期的交替，其中诱导所述溶解阶段是由于BZLF1的表达，在那些时候将其呈递给免疫细胞。因此，包含BZLF1的疫苗会引发免疫个体的免疫系统从而使得由于诱导溶解阶段在新病毒颗粒实际排出之前使其被动员。

术语“潜伏多肽”是指涉及EBV潜伏周期的诱导和维持和/或表达为潜伏周期的诱导结果的EBV多肽。优选地，所述至少一种潜伏多肽是LMP-1(也称为BNLF1)和/或LMP-2。

本发明还涉及产生颗粒的方法，包括以下步骤：(a)用修饰的EBV基因组转染细胞，其中与野生型EBV基因组相比较，所述修饰的EBV基因组至少(aa)缺乏包装所述野生型EBV基因组所需的一种或多种序列，缺乏编码所述包装所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其包装能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列；(ab)缺乏编码B-细胞转化所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其B-细胞转化能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列；和(ac)缺乏编码诱导EBV复制所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其诱导EBV复制的能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列；(b)在允许表达所述修饰的EBV基因组的条件下培养在步骤(a)中获得的所述细胞；(c)诱导EBV的所述复制期；以及(d)分离出所述颗粒。

术语“转染”结合本发明根据本领域内接受的含义使用，即，将核酸引入细胞中的过程。转染能够通过各种方法实现，像例如，化学类方法，例如磷酸钙介导的转染或脂质体介导的转染。而且，多种非化学方法，如电穿孔或声孔作用或基于颗粒的方法例如基因枪介导的转染或磁转染以及病毒介导的方法，在本领域是已知的。

“修饰的EBV基因组”是与野生型EBV基因组相比较进行修饰的。如以上部分中的概述，存在数种野生型EBV菌株。其遗传构成在本领域是众所周知的(Rickinson and Kieff，2007)。如由以上内容应当清楚的，所述修饰的EBV基因组仅在所有EBV菌株共有的序列方面进行修饰。在病毒组装方面，术语“包装”是本领域内众所周知的并且涉及在病毒颗粒组装期间将线性EBV病毒DNA引入到病毒颗粒中的过程。EBV基因组DNA的包装在所述基因组DNA的两端处直接重复的序列(TR)处开始。具体而言，所述修饰的EBV基因组缺乏包装野生型EBV基因组所需的一种或多种序列。根据本发明，术语“包装所需的”是指所述一种或多种序列在将EBV DNA包装到野生型EBV颗粒中是很重要的。换句话说，在缺少所述一种或多种序列时，所述EBV DNA并未包装到野生型EBV颗粒和由本发明方法产生的颗粒中(也可以包含于本发明的疫苗中)。因此，当缺乏包装所需的所述一种或多种序列时，所述修饰的EBV基因组并未包装到如本文中所述的颗粒中。例如，EBV的端部重复序列的序列能够缺失。所述端部重复序列通过称为“末端酶”的酶来识别。可替代地或另外地，人们能够缺失编码所述包装所需的EBV多肽的一种或多种序列。这类EBV多肽是例如末端酶的酶。并且，所述包装所需的所述EBV多肽可以被失活使得它们失去其包装能力。所述失活能够通过多种方法来实现，例如修改在功能上涉及包装过程的多肽的结构域。所述修饰能够通过多种方法来实现，像例如，缺失所述功能域或其部分，立体阻抑所述功能域或整个多肽，或取代所述功能域的一个或多个氨基酸。

当足以缺失包装所需的一个序列或编码所述包装所需的EBV多肽的一个序列和/或使一个基本EBV多肽的包装能力失活从而排除包装的可能性时，人们能够可替代地使EBV多肽组合的包装能力失活，也会导致排除EBV DNA包装的可能性。

另外，所述修饰的EBV基因组缺乏编码B-细胞转化所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其B-细胞转化能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列。具体的EBV多肽及其组合在前面本文中已经进行了介绍。技术人员能够直接地并且清楚地识别编码所述一种或多种多肽的基因组序列。此外他还能够实施导致从EBV基因组中缺失所述一种或多种序列和/或修饰所述一种或多种序列的那些步骤，导致当表达时其转化能力被失活的一种或多种EBV多肽。

并且，所述修饰的EBV基因组缺乏编码诱导EBV复制所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其诱导EBV复制的能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列。涉及EBV复制的EBV多肽大多数是称为溶解多肽的多肽，它们参与所述病毒基因组的复制以及所述EBV基因组的表达，最终导致病毒颗粒从所述感染的宿主细胞中排出。术语“所需的”具有与前面本文中对于其他多肽的解释相同含义，即，在特定方面一种或多种多肽是绝对必要的。在本发明的这方面，编码EBV多肽的所述一种或多种序列的存在对于诱导EBV复制是绝对必要的。对应多肽能够选自由以下组成的下组中：BZLF1、BRLF1、BMLF1及其组合。而且，在这方面，本领域的技术人员能够直接地并且清楚地识别编码所述一种或多种多肽的基因组序列以及实施导致所述一种或多种序列从EBV基因组中缺失和/或修饰所述一种或多种序列的那些步骤，导致当表达时其诱导EBV复制的能力被失活的一种或多种EBV多肽。

术语“培养”根据在本领域内其被接受的含义使用。一般而言，细胞培养方法，像例如，培养基组分，标记物选择和挑选，细胞量化和分离，都是本领域内众所周知的方法，并且描述于，例如，“Practical Cell CultureTechniques”，Boulton et Baker(eds)，Humana Press(1992)，ISBN0896032140；“Human Cell Culture Protocols”，Gareth E.Jones，Humana Press(1996)，ISBN089603335X中，并示例性地描述于实施例部分中。不同细胞类型的培养条件是不同的，并且能够导致针对具体细胞类型表达的不同表型。一般而言，使细胞生长和维持在合适的温度和气体混合物下，即，通常37℃，5％CO₂，在生长培养基中(a)伴随搅拌，传送和稀释流体同时维持细胞内和细胞外的渗透平衡，(b)为细胞提供水和对于正常细胞代谢重要的某些批量无机离子，(c)其(与碳水化合物如葡萄糖混合)提供细胞代谢的主要能源以及(d)其提供缓冲系统用于将培养基维持在生理pH值范围内，即，保持细胞存活。生长培养基的配方根据细胞类型有很大的变化且包含，例如而不限于，生长因子，营养组分，葡萄糖，维持pH值的缓冲剂和抗真菌剂和抗生素。在培养物中用于培养和维持细胞的方法在本领域内是众所周知的；对于成功培养细胞的生长培养基和其他细胞培养相关的材料以及说明书和方法能够，例如，获自Sigma-Aldrich或Invitrogen。允许表达所述修饰EBV基因组的条件基本上对应于本文以上所述的一般性条件。增强来自所述宿主细胞内的EBV基因组的多肽表达的修饰在本领域内对于那些技术人员是已知的。

有待用于本发明方法中的细胞优选人类来源的细胞。优选使用，例如，能够获自German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ，Braunschweig)或获自American tissue culture collection(ATCC)的HEK293细胞系。

根据本发明术语“诱导EBV的复制期”是指启动最终导致病毒样颗粒(VLP)的胞内组装以及所述VLP作为本文中定义的颗粒排出的过程。诱导作用，可以例如通过用所述一种或多种EBV多肽补充所述细胞来实现(由于缺失编码诱导复制所需的EBV多肽的所述一种或多种序列和/或修饰编码EBV多肽的所述一种或多种序列，所述宿主细胞中缺乏所述一种或多种EBV多肽)，从而导致它们不能诱导EBV复制。所述补充能够通过以下实现：例如，通过为所述细胞提供所述缺失的一种或多种序列，例如，在质粒上(稳定转染的或瞬时转染的)，由此可以表达所述缺失的EBV多肽；或通过为所述细胞提供编码能够诱导所述复制期的功能性EBV多肽的一种或多种未修饰序列。提供所述一种或多种DNA序列，能够通过如本文以上所述和实施例部分中的方法来实现。可替代地，所述补充能够通过为所述细胞提供诱导EBV复制所需的所述一种或多种EBV多肽来实现。向所述细胞提供所述一种或多种多肽能够通过本领域众所周知的蛋白递送方法来实现并可以涉及使用多种试剂，像例如，ProteoJuice^TM(Merck)，TurboFect^TM(Fermentas)或Lipodin-Pro^TM(Abbiotec)。

由此当从所述宿主细胞中排出时生成的颗粒能够从细胞培养物上清液中收集或作为其一部分。例如，包含所述生成颗粒的上清液能够直接用于B-细胞的感染，或所述颗粒能够进一步通过超离心或超滤来浓缩。

根据本发明方法产生的所述颗粒适合用于本发明的疫苗。优选地，包含于本发明疫苗中的颗粒是根据本发明方法生产的，其可以涉及与野生型EBV基因组相比较进一步对所述EBV基因组进行修饰，基于其在生物技术领域内通常的一般性知识以及基于本文中描述和/或提及的方法熟练技术人员能够还不费事地将其实施。

在优选的实施方式中，在本发明的疫苗(a)中或在本发明的方法(ab)中其转化能力被失活的多肽是LMP-1多肽。

所述LMP-1EBV多肽是B-细胞转化所需的跨膜多肽。LMP-1模拟构成活性的CD40受体(Gires et al.，1997)。例如，通过仅缺失所述多肽的膜连接部分或其部件以及保留在病毒颗粒外部上的所述多肽的膜外部分通过截短所述多肽能够使所述B-细胞转化能力失活。相应方法公开于实施例部分中。简言之，通过仅缺失其疏水区，即，包含跨膜域的氨基酸26～210(SEQ ID NO.：4)同时在努力维持其免疫原性中保留所述膜外部分，来使LMP-1失活。因此，在优选的实施方式中，所述截短的LMP-1通过SEQ IDNO.：1的DNA序列进行编码并且由SEQ ID NO.：2的多肽序列构成。

在本发明的疫苗或方法的另一个优选实施方式中，根据本发明的所述疫苗(b)或本发明方法(ab)缺乏的B-细胞转化所需的所述一种或多种EBV多肽选自由EBNA-2，EBNA-3a，EBNA-3b和EBNA-3c组成的组中。

在本发明方法的进一步优选的实施方式中，诱导缺乏的EBV复制所需的所述一种或多种EBV多肽或根据本发明的方法在步骤(ac)中其诱导EBV复制的能力被失活的所述一种或多种EBV多肽选自由BZLFl、BRLF1、BMLF1及其任意组合组成的组，并且其中在本发明所述方法的步骤Cc)中所述复制期通过将所选择的多肽提供于所述细胞进行诱导。

在本发明方法更优选的实施方式中，所选择的多肽是BZLF1。

在本发明方法的甚至更优选的实施方式中，向所述细胞提供所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1通过从所述细胞中稳定转染的载体中表达所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1来实现。

尽管存在如上概述的为细胞提供所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1的数种方法，但是从稳定结合的质粒中表达出于几个原因是有利的。表达的多肽的表达水平是恒定的，所述宿主细胞的调节降低到最低而产生这种颗粒的技术复杂性同样被显著地降至最低，这在大规模生产系统的情况下是很有利的。

在本发明方法的最优选实施方式中，所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1的表达是诱导性调节的。

控制从质粒中表达多肽的技术在本领域内是众所周知的。一种技术涉及使用可诱导的启动子，如热，化学品，或光敏启动子。例如，本领域已知的四环素可诱导的启动子，Dox-可诱导的启动子，蜕皮激素可诱导的启动子或重金属可诱导的启动子能够根据本发明使用(参见，例如，图7)。其他合适的启动子对于本领域的技术人员而言是众所周知的。可替代地，当融合至雌激素受体时BZLF1也能够进行调节并且因此当加入雌激素时就被活化。

在本发明方法的另一个优选的实施方式中，所述方法包含在步骤(b)之后和在步骤(c)之前的另一步骤(b’)，其包括：向所述细胞提供一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或一种或多种疫苗佐剂，其中所述一种或多种病毒多肽或所述一种或多种病毒核酸序列分别不是EBV多肽或EBV核酸序列。

所述一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列可以是任何来源或序列，只要它们不是根据本文以上提供的定义的EBV多肽或EBV核酸序列。优选地，所述一种或多种多肽或所述一种或多种核酸序列是免疫原性的多肽或序列，即，引发特异性免疫应答，并且更优选地，已经证明作为免疫剂是安全和有效的。

术语“佐剂”结合疫苗根据众所周知的含义使用。具体而言，佐剂是一种免疫试剂，其修饰，优选增强疫苗效果同时当本身提供时对免疫系统具有较小的(如果有的话)直接影响。根据本发明，其定义为当与特异性抗原结合使用时能够加速、延长或增强抗原特异性免疫应答的任何物质。合适的佐剂可以是无机佐剂，像例如，铝盐(例如，磷酸铝，氢氧化铝)，有机佐剂如鲨鱼烯或油基佐剂，以及病毒颗粒。

该实施方式归功于这样的事实，即，根据本发明产生的颗粒能够有效地包括除了EBV多肽以及核酸序列之外的其他多肽，并且因此除了作为疫苗之外，还作为递送工具将其他化合物递送给有待免疫的个体。结合所述一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或一种或多种疫苗佐剂，能够根据以上所述的技术(如蛋白转染或核酸转染)以适合所述结合的量通过将后者提供给所述细胞而方便地实现。实现所述细胞内水平所需的具体用量以及具体技术能够通过技术人员实验地确定而没有过多负担。

在本发明疫苗的优选实施方式中，其另外地包含一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或疫苗佐剂，其中所述一种或多种病毒多肽或所述一种或多种病毒核酸序列分别不是EBV多肽或EBV核酸序列。

以上给出的定义也适用于这个实施方式和方法用来生成同样地以上所述的颗粒。优选地，包含于所述疫苗中的所述颗粒包含作为所述颗粒一部分的一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或疫苗佐剂。然而，还设想所述疫苗包含一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或疫苗佐剂，它们共混至本文中定义的颗粒中而未结合到所述颗粒中。

本发明另一个实施方式涉及通过根据本发明方法的步骤(a)转染而获得的细胞。

如本领域内技术人员应该理解的和如上概述的，稳定地转染载体能够优选地可诱导地调节表达所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1尤其适用于大规模装置和/或在其质量方面要求产品标准化和一致性的装置。这对于预想用于医疗用途，尤其是用于向患者给予的产品(如根据本发明方法产生的颗粒，这优选地是本发明疫苗的一部分)可以想见是很重要的。优选地，所述细胞是培养的细胞，细胞系或体外细胞。

在另一实施方式中，本发明涉及包含根据本发明的疫苗或根据本发明方法产生的颗粒的试剂盒。

所述试剂盒可以包含仅一种物品，如本发明的疫苗或根据本方法生成的颗粒。其还可以包含构成根据本发明的疫苗的各种组分。

在优选的实施方式中，构成疫苗的所述颗粒和药用载体作为独立的组分包含于根据本发明的试剂盒中。

在另一个优选的实施方式，根据本发明方法获得的细胞和诱导所述复制期所需的化合物作为独立的组分包含于根据本发明的试剂盒中。因此，所述试剂盒的各组分可以封装于一个或多个容器如一个或多个小瓶内。这些小瓶可以，除了这些组分之外，包含用于储存的防腐剂或缓冲剂，用于维持和储存的培养基，例如，细胞培养基，DMEM，MEM，HBSS，PBS，HEPES，潮霉素，嘌呤霉素，青霉素-链霉素溶液，尤其是庆大霉素。有利的是，这种试剂盒进一步包含允许技术人员方便工作(例如，本发明多个实施方式)的使用组分的说明书。任何这些组分都可以用于实验设置中。例如，所述颗粒本身或所述疫苗可以用于研究动物以及人类研究中的免疫应答。

而且，本发明涉及根据本发明的疫苗或通过本发明的方法获得的颗粒用于产生EBV抗原特异性的CD8+T细胞的用途。

根据本发明的用途可以例如，根据以下描述的方法进行实施。

另外地，本发明涉及用于生产包含EBV抗原特异性的CD8+T细胞的制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用根据本发明的疫苗或通过本发明方法获得的颗粒培养B-细胞持续足以产生包含呈递EBV抗原的B-细胞的制剂的一段时间；(b)将在步骤(a)中获得的所述B-细胞与包含T细胞的制剂共混；和(c)培养步骤(b)中获得的所述共混物用来生成包含EBV抗原特异性的CD8+T细胞的制剂。

术语CD8+T细胞能够与术语细胞毒性T细胞互换使用，这也是本领域内众所周知的。

根据该实施方式，术语“培养”是指将不同实体进行接触的过程。在用本发明的疫苗或通过本发明方法获得的颗粒培养B-细胞方面，所述培养在保持B-细胞存活并与抗原反应(如所述疫苗或颗粒)的条件下实施一段特定的时间。通过所述B-细胞呈递抗原所需的时间能够通过实验进行确定并可以根据所选择的实验设置而变化。优选地，培养维持至少(对于每个值)2，4，6，8，16或至少24h。也可以设想培养时间为至少2，至少3或至少4天。

在步骤(b)中与所述B-细胞共混的所述T细胞的制剂包含幼稚T细胞和/或EBV-特异性记忆细胞和/或EBV-特异性效应器T细胞。本发明方法的培养步骤(c)必须持续允许生成EBV-特异性的CD8+T细胞的一段时间。CD8+T细胞发育所需的所述时间段能够通过实验进行确定并且可以根据所选择的实验设置而变化。优选地，培养维持至少(对于每个值)2，4，6，8，16或至少24h。也可以设想培养时间为至少2，至少3或至少4天。

所述方法或用途可以是体内的，离体的或体外的方法或用途。

本发明的实施方式归因于令人惊讶的发现，即，与本领域中已经建立的规则相反(例如，Keller et al.，2009；WO2009/068615)，B-细胞能够交叉呈递和交叉引发。具体而言，交叉引发描述了这样的过程，由此在被免疫细胞摄取之后抗原被处理用于MHC I类和MHC II类相关的呈递。所述过程以前被认为限制于，例如，树突细胞和巨噬细胞。尽管MHC II类相关的抗原呈递导致生成CD4+T细胞，MHC I类相关的抗原呈递导致产生CD8+细胞，即，抗原特异性的T杀伤细胞。B-细胞被认为不能进行交叉引发，其主要功能是产生抗体。本发明的发明人能够令人惊讶地证明，当向小鼠给予如本文中所述的颗粒时，EBV特异性的T细胞就能够显示存在于脾细胞中(像例如，实施例4，图5；实施例8，图11C)。

附图说明

这些附图表明：

图1：293-VII+辅助细胞基因组包含数个缺失(通过三角表示)。所述潜伏基因EBNA-2，EBNA-3a，-3b和-3c被完全缺失。LMP-1，已经描述存在于病毒颗粒中，由于缺失跨膜域而功能失活。还移除了BZLF-1(其活化所述溶解循环)和包装信号(TR)。为了在大肠杆菌中的繁殖，所述基因组包含F-因子复制子。增强的GFP已经作为标记基因而插入并且潮霉素耐受基因允许在真核细胞中选择。克隆策略先前已经更详细地进行了描述(Hettich et al.，2006；Delecluse et al.，1998；Delecluse et al.，1999)。所述293-VII+辅助细胞基因组表示在本说明书中详细说明的修饰EBV基因组的一个实施方式。

图2：所产生的病毒颗粒，称为VII+VLP，(相应于在本说明书中说明的颗粒)没有可检测量的EBV-DNA。如所描述的，从上清液中分离通过诱导VII+包装细胞系释放的颗粒并且通过PCR分析病毒DNA的存在。平行地，从诱导的2089细胞中分离病毒颗粒，当繁殖阶段诱导时，这些细胞释放感染性病毒粒子。与2089-颗粒相对，在VII+VLP中没有可检测到的EBV-DNA。采用gfp-特异性引物检测病毒病毒DNA，所述病毒病毒DNA都携带增强GFP的基因。

图3A：VII+VLP唯一地结合至CD21+细胞。为了测试VII+VLP的B-细胞向性，将来自健康供体的PBMCS与VII+VLP一起培养过夜。如通过GFP转化揭示的，VII+VLP的结合唯一地可在CD21+细胞上检测。

图3B：VII+VLP唯一地结合至CD21+细胞。为了更加详细地研究VLP与B-细胞的相互作用，我们在VLP-培养的PBMC上进行共聚焦显微术，这清楚地显示了存在于VII+VLP中的gp350和细胞表面上的CD21的共同定位(co-localization)，表明这两种分子的明显相互作用。

图4：未幼稚小鼠中(naive mice)VII+VLP诱导了的中和抗体。BALB/c小鼠(n=4)用10μg VII+-VLP(暗灰色条)或用相同量的293外来体(exosome)(n=2)(浅灰色条)免疫两次。在第二次免疫之后4个星期分离血液并对EBV-特异性抗体进行分析。(左侧)用VII+-VLP免疫的小鼠而不是用293外来体免疫的小鼠对于各种EBV蛋白都具有特异性的高水平抗体。293细胞用感兴趣的病毒蛋白的表达质粒转染并在1天后溶解。随后用不同溶解产物涂覆96-孔板，以1：200稀释的小鼠血清冲洗和培养。用过氧化物酶结合的抗小鼠-IgG抗体检测结合抗体的存在。用CMV蛋白pp65的表达质粒转染的293细胞作对照物。(右图)诱导的EBV-特异性抗体进行中和并抑制初级B-细胞的感染。重组体感染的EBV-颗粒(EBV-2089)采用来自用VII+-VLP(n=2)或293外来体(n=1)免疫的小鼠的血清预培养30min，并随后以MOI0.1用于感染人类初级B-细胞。48h之后，如通过GFP表达揭示的，通过流式细胞仪测定感染细胞数。清楚的是单独的293细胞具有较小的抑制效应，这可能是由于293-特异性抗体和EBV-2089的诱导也是293衍生的。然而，通过VII+VLP-免疫小鼠的血清的抑制作用是显著地更强的并且几乎完全阻断感染。

图5：VII+VLP诱导了EBV-特异性T-细胞的生成。免疫活性的BALB/c小鼠用VII+-VLP(10μg，i.p.)免疫两次，并在第二次免疫之后4个星期分离脾脏并且进行分析。采用已经用来自293细胞的溶解产物加载，用所示EBV-蛋白中任何一种的表达质粒瞬间转染的照射的脾细胞在小鼠-特异性干扰素-γELISPOT中测定EBV-特异性T-细胞的存在。这种Elispot揭示了抗EBV多肽的特异性细胞免疫响应，所有这些都描述为包含于野生型EBV中(Johannsen et al，2004)。相比较而言，针对EBNA2和pp65，一种衍生于巨细胞病毒的多肽，未检测到免疫响应，证明了这种分析的特异性。

图6：来自EBV-阳性供体的CD4+和CD8+T-细胞的再活化。在8天内用VII+VLP或并不含有任何EBV衍生蛋白的293-外来体将来自两个供体的PBMC刺激3次。在第一次刺激之后12天通过流式细胞仪计将细胞数和分析。

图7：在293-VII+细胞中EBV溶解阶段的条件活化。所述293-VII+细胞系的衍生物允许连续生产VLP。(A)所述质粒p3989的质粒谱图，所述质粒被引入到293-VII+细胞系中。在四环素可诱导的双向启动子连同调节基因(terR B/E-KRAB和rtTA2s-M2)，质粒的DNA复制起点，oriP，及其反式作用子EBNA1(Bomkamm et al.，2005)一起的控制之下，这种表达质粒包含EBV溶解循环的基因，BZLF1和BRLF1的即刻早期转化。p3989基于先前所述的原理(Urlinger et al.，2000；Forster et al.，1999)。EBV溶解阶段激活子蛋白BZLF1和BRLF1的四环素依赖性表达由四环素调节的双向启动子实现。这种条件表达系统依赖于编码四环素控制的反式作用子，rtTA2S-M2，和Tet抑制剂-KRAB融合蛋白(tTS-KRAB)的双顺反表达盒(bicistronic expression cassette)的组成型表达。驱动感兴趣的基因的双向启动子在缺少强力霉素的情况下通过tTS-KRAB抑制剂进行下调，但是当其(强力霉素)加入时则通过rtTA2S-M2活化剂进行诱导。(B)蛋白质印迹(Western blot)分析表明当加入强力霉素12小时，在具有p3989的293-VII+细胞中诱导表达BZLF1和BRLF1。(C)来自EBV-血清阳性供体的PBMC加载来自强力霉素诱导的293-VII+-p3989细胞的VLP并用作gp350特异性CD4+T细胞克隆的刺激物。IFN-g的释放表明，由293-VII+和293-VII+-p3989细胞产生的VLP是可比较的。空载PBMC(w/o)或加载来自HEK293细胞(exo)的外来体的PBMC用作阴性对照物，自体LCL为阳性对照物。

图8：加载VLP的B细胞有效地再活化EBV-特异性CD4+和CD8+T细胞克隆：(A)加载VLP的B细胞是BNRF1-特异性CD4+T细胞克隆的强效刺激物。小-LCL系(Moosmann et al.，2002)加载由溶解诱导的293-VII+细胞获得的系列稀释的VLP。加载的细胞用作自体CD4+T细胞克隆的刺激物，其识别BNRF1-特异性抗原决定基(Mautner et al.，2004)。用加载来自HEK293细胞的外来体(exo)的小-LCL系刺激T细胞克隆用作阴性对照物而自体LCL(其表达BNRF1)用作阳性对照物。(B)来自HLA-A2+/B35+供体的PBMC与来自293-VII+细胞的VLP一起培养过夜或保持不处理并且随后用作EBV蛋白BZLF1(EPL，(Green et al.，2004))和BRLF1(YVL，(Saulquin et al.，2000))特异性的HLA-匹配的CD8+T-细胞克隆的刺激物。IFN-γELISA结果显示用VLP-处理的PBMC培养的T细胞的微弱的，但明显的活化作用，而未处理的PBMC则没有。

图9：采用VLP再活化EBV-特异性T-淋巴细胞取决于CD19+B细胞。在14天的时间内用所示的自体致死性照射的刺激物细胞刺激来自健康供体的CD3+T-细胞3次，所述自体致死性照射的刺激物细胞用来自HEK293细胞或293-VII+细胞的外来体(exo)或VLP预培养过夜。刺激物细胞是未分级的PBMC MACS-分选的CD19+B细胞或者其中B细胞耗尽的PBMC(CD19-)。在三轮刺激之后，使用加载VLP或外来体的自体PBMC作为靶，在IFN-γ酶联免疫斑点法(Elispot assay)中评价EBV特异性T细胞的再活化。T细胞再活化严格依赖于作为刺激物存在的CD19+B细胞。

图10：来自293-VII+细胞的VPL选择性地扩展EBV-特异性的CD4+和CD8+T细胞。来自不同EBV阳性供体的PBMC被致死性照射，加载来自溶解性诱导的293-VII+细胞的VLP，来自HEK293细胞的外来体，或保持未处理，并用作自体PBMC的刺激物。在28天三轮刺激之后，通过FACS分析细胞。(A)VLP-但是未加载外来体(exo)或未处理(w/o)的照射的PBMC如最近所述(Adhikary et al.，2008)扩展CD4+细胞。(B)如通过用针对选择的EBV蛋白抗原决定基的HLA B03/B08-或A02-限制性四聚体/五聚体染色所揭示的，加载VLP的PMMC再活化并扩展EBV特异性CD8+T细胞。针对细胞蛋白Her2/neu的四聚体(KIF)用作阴性对照物。(C)在28天内加载VLP的照射的PBMC将来自四个不同供体的EBV特异性CD8+细胞可靠地扩展高达15倍，而与初始CD8+T细胞数相比，CD8+T细胞总数下降了约一半。

图11：VLP在免疫的小鼠体内引起EBV特异性体液和细胞免疫应答。BALB/c小鼠用10μg来自293-VII+细胞(n=4)的VLP或用相同量的来自HEK293细胞(n=2)的外来体免疫两次。在最后免疫之后4个星期进行血清和脾细胞分析。(A)在ELISA中来自VLP-(黑条)免疫小鼠的血清(而不是来自外来体免疫小鼠的血清(灰条))含有对病毒颗粒中存在的EBV蛋白特异性的抗体。(B)在用来自293-VII+细胞的VLP免疫的小鼠体内产生的抗体中和了感染性EBV。GFP-阳性2098EBV原液与来自用VLP(VLP)或外来体(exo)免疫的小鼠的血清一起预培养30min，并随后以计算的0.1的感染复数(multiplicity ofinfection)用于感染人类初级B细胞。48小时后，通过流式细胞仪测定表达GFP的感染细胞数。在两种不同浓度下中和的抗-gp350抗体72A1用作阳性对照物。(C)来自293-VII+细胞的VLP活化EBV-特异性T细胞。在小鼠特异性IFN-γELISPOT中用作为加载来自HEK293细胞的溶胞产物的抗原呈递细胞的照射脾细胞来测定在用VLPs(黑条)或外来体(灰条)免疫的小鼠中EBV-特异性T细胞的发生，所述HEK293细胞已经用编码所示病毒蛋白的表达质粒进行瞬时转染。

具体实施方式

这些实施例说明本发明：

实施例1：当诱导缺乏病毒DNA但是包含各种EBV蛋白时293-VII+细胞释放VLP

本发明人最近描述了构建两种辅助细胞系用于将EBV-衍生的载体封装到重组病毒颗粒中(Delecluse et a1.，1999；Hettich et a1.，2006)。这些细胞系包含缺乏末端重复序列(TR)的EBV辅助细胞基因组，但是相反地包含gfp基因的这种病毒的包装信号。因此，这些辅助细胞基因组不能封装到病毒颗粒中，但是相反地(in trans)递送包装合适的病毒载体以及组装和释放重组体和感染性EBV颗粒所需的所有蛋白。第一代细胞系，TR-2，包含保留初级人类B-细胞完全转化能力的另外的完整EBV基因组(Delecluse et a1.，1999)。为了处理辅助细胞基因组罕见的不合理封装和病毒载体与辅助细胞基因组之间的意外重组导致释放具有转化能力的重组病毒颗粒，本发明人后来设计了具有缺乏对于B-细胞转化非常重要的大多数病毒基因的EVB辅助细胞基因组的第二代包装细胞系，293-VII+，(图1)(Hettich et al.，2006)。

令人惊讶的是，由这些辅助细胞系释放的重组病毒颗粒维持了野生型EBV的特性：它们显示B-细胞嗜性和对正常和恶性B-淋巴细胞的转导能力。可能由于其由辅助细胞基因组过表达，这些颗粒也包含GFP蛋白从而使得可以容易地监测它们与靶细胞的相互作用。有趣的是，本发明人观察到，当用BZLF1表达质粒，P509(Hammerschmidt and Sugden，1988)诱导溶解循环时，甚至当可包装病毒载体并未被共转染时，293-VII+细胞将大量GFP-阳性颗粒释放到上清液中。由于许多细胞类型和永久细胞系构成地释放称为外来体的微泡并且很多病毒利用这些外来体生物合成用于其自身组装和排出(Calistri et al.，2009；Mori et al.，2008；Pelchen-Matthews et al.，2004)，这提出的问题是当诱导生产循环时从293-VII+细胞释放的颗粒是否是含有病毒蛋白的外来体样颗粒。

因此，本发明人更详细地分析了这些颗粒的组成和特性。首先，通过PCR检查它们，来自VII+细胞的VLP是否含有病毒DNA。为此，它们在具有p509的VII+细胞中诱导EBV的溶解期，并作为阳性对照物，并且在含有TR+EBV基因组并释放感染性病毒颗粒的2089细胞中诱导EBV的溶解期(Delecluse et al.，1998)。三天后从这些细胞系中收获上清液并通过超离心沉淀释放的颗粒。这些颗粒的PCR分析表明，在2089颗粒中能够容易地检测EBV-DNA，但是在来自VII+细胞的VLP中则不能(图2)。

实施例2：293-VII+-VLP具有EBV样B-细胞向性

发现结合到VLP中的一种蛋白是gp350/220，主要的病毒包膜蛋白通过与CD21相互作用而介导病毒粒子结合人类B-淋巴细胞。因此，本发明人想要阐明，VLP是否具有类似于野生型EBV的B-细胞向性。为了完成此项工作，他们用浓缩的VII+VLP培养新分离的PBMC过夜并通过FACS分析VLP的结合。对于这些实验，他们利用了这个事实，即，从VII+辅助细胞基因组表达的增强的GFP也结合到VLP中。如在图3a中所示，如通过仅CD21+细胞成为GFP-阳性的事实进行判断的，VLP的结合限于CD21+细胞，最有可能是B-细胞。相反，未能观察到VLP结合CD21-阴性细胞。为了更详细地研究VLP与B-细胞的相互作用，本发明人在VLP-培养的PBMC上进行共聚焦显微术，清楚地显示了存在于VLP中的gp350和细胞表面上的CD21的共同定位，表明了这两种分子的明显相互作用(图3h)。

最近已经说明，当被人类PBMC吞噬时源于293/TR-的VLP能够有效地再活化EBV-特异性CD4+T-细胞(Adhikary et al.，2008)，试图确定这对于VII+-VLP是否也是如此。为了解决这个问题，本发明人用VII+-VLP加载来自健康供体的照射的初级PBMC并随后用对于EBV结构蛋白BLLF1和BNRF1特异性的白体CD4+T-细胞克隆或用白体PBMC共培养它们。这些实验表明，如用IFN-γELISA测定法测量的，VII+-VL-加载的PBMC能够有效地再活化特异性的CD4+T-细胞克隆和自体本体T-细胞。

实施例3：在幼稚宿主中VII+-VLP诱导中和EBV-特异性抗体

前面章节的结果证明VLP刺激EBV-特异性唤醒免疫应答的潜力。在接下来的一系列的实验中，本发明人因此评价了VLP是否也能够在幼稚宿主中体内地诱导EBV-特异性免疫应答，这当然是预防性疫苗的先决条件。为了这个目的，本发明人采用10μg VLP(n=4)在14天的时间腹腔内疫苗接种BALB/C小鼠两次而用相同量的由293上清液中分离出来的外来体免疫对照小鼠(n=2)。在第二次免疫之后4个星期，收集血清并分析EBV-特异性抗体的存在，并且测试脾细胞的EBV特异性。为此，本发明人用已经采用各种EBV蛋白的表达质粒瞬时转染的HEK293细胞的系列溶解产物来涂覆96孔板集合。

如图4所示，来自VII+-VLP免疫小鼠的血清而不是来自293-外来体免疫小鼠的血清显示较强的免疫反应性，因此诱导对于各种EBV蛋白具有特异性的抗体，这最近已经鉴别为EBV颗粒的组分(Johannsen et al.，2004)。在1：200(图4)和1：1,000的稀释度下(图中未显示)在来自VLP-免疫小鼠的血清中可以清楚地检测到所有抗体。有趣的是，本发明人还检测到转录因子BZLF-1的抗体，如上文所述，它以高水平存在于释放VLP的VII+细胞中并结合到VII+VLP中。相比之下，用293外来体免疫的小鼠显示没有可检测水平的EBV-特异性抗体。作为对照物，本发明人测定了对抗用编码CMV的主要外被蛋白pp65和EBV反式作用子EBNA2的表达质粒转染的293细胞的溶解产物的血清的反应活性。这种蛋白是由已经从VII+辅助细胞基因组中缺失的开放阅读框BYRF1翻译的(参见图1)。本发明人未能检测到针对这两种蛋白的任何反应性，指示这些分析的特异性。令人感兴趣的是，在第一次免疫之后7天就已经可检测到VLP注射小鼠中的显著抗体滴度，这指示VII+-VLP的高免疫原性(数据未显示)。

为了测试EBV特异性抗体是否是中和性的，本发明人量化了它们抑制初级B-细胞被EBV感染的程度。为此，他们利用携带在感染细胞中表达的gfg基因的重组EBV(2089)(Delecluse et al.，1998)。用EBV-2089感染从新鲜腺样体中分离的初级B-细胞，以0.1的MOI用小鼠血清预培养30min，并在48h之后通过FACS分析来量化感染的细胞数。如图4所示，来自VLP感染小鼠的血清抑制用EBV感染初级人类B-细胞。如可以看到的，来自293-免疫小鼠的血清具有微弱的抑制作用，这可能是由于293-特异性抗体识别293-衍生的EBV-2089。

实施例4：VII+-VLP诱导EBV-特异件细胞免疫应答

本发明人接着询问用VLP免疫幼稚小鼠是否也诱导EBV特异性细胞免疫应答，这已知对于病毒和EBV-感染细胞的免疫监视是至关重要的(Hislop et al.，2007)。因此，他们分离出VLP-免疫小鼠的脾脏并产生单细胞悬浮液。我们采用这些EBV蛋白中任何一种的表达质粒瞬时转染的293细胞的溶解产物过夜培养2×105个脾细胞，这些EBV蛋白也用于检测EBV-特异性抗体以允许VLP-衍生蛋白的吞噬、蛋白溶解降解和呈递。24小时后通过干扰素-γ酶联免疫斑点法(Elispot)测定T-细胞的活化。

实施例5：引入第3代包装细胞系

TR-2和293-VII+2是两种包装细胞系，其中EBV的繁殖周期通过瞬时转染编码BZLF1的表达质粒进行诱导，这足以引发从潜伏周期向溶解周期转换。然而，大规模生产临床级VLP依赖于永久释放的细胞系。

为了克服这些限制以及推动第一步骤朝向标准化和更恒定地生产VLP，本发明人设计了新的包装细胞系，称为iVII+，其除了VII+辅助细胞基因组之外还稳定地携带编码可诱导的BZLF1和另外地BRLF1的第二质粒，BRLF1是另一种病毒即刻早期蛋白，其与BZLF1结合诱导上皮细胞中的溶解循环(Zalani et a1.，1996)。当在强力霉素存在下进行培养时，iVII细胞维持溶解循环并构成地释放VLP，而在细胞表型方面没有任何可检测的变化。

实施例6：EBV-特异性T细胞的再活化

为了定义获自293-VII+细胞的VLP是否被人类B细胞吞噬以及是否具有再活化EBV特异性T细胞的潜力，用小-EBV转化的类淋巴母细胞B细胞系(LCL)(Kempkes et a1.，1995)用来自293-VII+细胞的VLP培养。然后加载的LCL用在小-EBV中未编码的EBV外被蛋白BNRF1特异性的自体CD4+T细胞克隆共培养(Kempkes et al.，1995)。实验证明，如通过GM-CSF ELISA测定法测量的，VLP-加载的B-细胞有效地再活化CD4+T细胞克隆(图8A)。这组实验表明，来自293-VII+细胞的VLP特异性地与人类B-细胞相互作用，并且被其吞噬，所述人类B-细胞进而是较强的抗原呈递细胞和EBV-特异性CD4+T细胞的刺激物，这佐证了Adhikary eta1.，2008的发现。

实施例7：VLPS再活化来自血清阳性宿主的CD8+T细胞

疫苗效能取决于产生长期持久的免疫记忆，这依赖于CD4+和CD8+T细胞两者。这将确定293-VII+细胞的VLP是否能够活化EBV特异性CD8+T细胞，一种体内监测EBV-感染细胞必需的细胞群落。为了测试VLP再活化CD8+记忆T细胞的能力，PBMC首先用来自293-VII+细胞的VLP或来自293细胞的外来体培养过夜，并随后用作EBV特异性CD8+T-细胞克隆的靶。IFN-γELISA显示出用由VLP预培养的PBMC培养的T细胞的微弱但明显的活化作用(图8B)。在下个系列实验中，采用由来自293-VII+细胞的VLP预培养的自体照射的PBMC刺激来自EBV-血清阳性供体的PBMC。在28天和3轮刺激之后，详细的流式细胞仪分析显示与加载来自母体HEK293细胞的外来体的PBMC或未处理的PBMC相比较，加载来自293-VII+细胞的VLP的PBMC诱导了自体CD4+T细胞增殖(图10A)。为了确定VLP是否也能再活化EBV-特异性的CD8+T细胞，测定了在供体PBMC中它们的初始频率并与体外VLP-扩展的CD8+T细胞群落进行比较用于特异性地识别已知HLA I类限制性EBV抗原决定基，这在感染的宿主中引起较强的CD8+T细胞免疫应答。分别选择潜伏蛋白LMP2的肽表位CLG和早期溶解蛋白BZLF1、BMLF1和BRLF1的肽表位EPL/RAK、GLC和YVL，它们是HLAB03/B08或A02限制性的。采用HLA/肽五聚体染色显示出在初始供体PBMC中较少但是可检测分数的CD8+T细胞，主要识别早期溶解表位(图10B)。在三轮VLP刺激中表位特异性的CD8+T细胞的分数从约0.15％扩展到0.25％到1.1％到2.4％(图10B)，而表位特异性的

细胞的绝对数量增加约高达10倍(图10C)。这一发现与最近出版物冲突，因为相对于专门的抗原递呈细胞如树突细胞或巨噬细胞，B细胞并不能有效地处理HLA I类相关的交叉递呈的病毒颗粒或VLP(Keller et al.，2009)。因此，预期PBMC中的单核细胞或巨噬细胞可能将VLP-衍生肽递呈给CD8+T细胞用于它们的活化。为了解决这个冲突，将CD19+和CD19-细胞从PBMC中纯化出来并用来自293-VII+细胞的VLP或来自HEK293细胞的外来体培养分级的单核细胞，在用VLP-加载的PBMC进行第3轮刺激之后立即再活化T细胞在具有CD19+和CD19-PBMC的IFN-γ酶联免疫斑点法中量化。这些结果清楚地表明，仅CD19+B细胞是VLP-衍生的病毒抗原的强递呈物(图9)。采用CD19-PBMC作为抗原递呈细胞，很难鉴定出任何T细胞(图9)，这表明仅B细胞活化包括HLA I类限制性CD8+T细胞的病毒表位特异性T细胞。

实施例8：在幼稚Balb/c小鼠中VLP引发EBV-特异性高滴度中和抗体和细胞免疫应答

这是包括进一步的数据(参见图11)的实施例3(也参见图4)的重复。为了完整性的目的，该方法被再次描述因为其包括多种变化。本发明人在14天的时间内用10μg VLP免疫BALB/C小鼠(四只动物)2次，而对照小鼠(两只动物)用相同量的来自HEK293细胞的外来体进行免疫。在第二次免疫之后4个星期，用ELISA和来自HEK293细胞的蛋白溶解产物(作为抗原)(其已经用单个EBV蛋白的表达质粒瞬时转染)来分析血清存在EBV-特异性抗体(如图11A所示)。为了避免由对抗HEK293-衍生蛋白产生的抗体引起背景信号，将血清用涂覆于细胞培养孔板的HEK293溶解产物预培养2h。如所示，来自VLP免疫小鼠的血清而不是用来自HEK293细胞的外来体免疫的小鼠的血清显示对抗所选择的病毒蛋白(其是EBV病毒颗粒的组分)的较强的免疫反应。在1～200倍稀释下在来自VLP免疫小鼠的血清中能够清楚地检测所有抗体(图11A)。VLP免疫的小鼠还产生高水平抗BZLF1基因编码的转录因子Zta的抗体。作为对照物，测量了对抗用编码CMV外被蛋白pp65和EBV反式作用子EBNA2的表达质粒转染的HEK293细胞的溶解产物的血清的反应性。EBNA2由在293-VII+细胞中的EBV辅助细胞基因组中缺失的BYRF1基因进行翻译(图1)。如所预期的，没有检测到在VLP-免疫小鼠中对抗这2种蛋白的体液应答，这指示这些分析的特异性。

为了了解来自VLP免疫动物的血清是否含有能够抑制用EBV进行细胞感染的EBV特异性中和抗体，使用编码2089EBV的重组gfp，其赋予B细胞GFP荧光，作为感染的定量测定(Delecluse et al.，1998)。2089EBV的病毒原液采用小鼠血清预培养30min，而随后以0.1的计算的多重感染(multiplicity ofinfection)用于感染初级人类B细胞。在48小时之后GFP阳性感染细胞通过流式细胞仪进行定量。如图11B所示，来自VLP-免疫小鼠的血清削弱EBV的感染，而来自用HEK293细胞的外来体免疫的小鼠的血清也具有抑制性的，但是较弱的作用，这可能是由于诱导了抗293-衍生蛋白的抗体。2089EBV的病毒原液获自HEK293生产者细胞(Delecluse et a1.，1998)，表明用来自HEK293细胞的外来体免疫的小鼠的血清还能够识别2089EBV颗粒，并削弱其传染性。

接着，询问小鼠的免疫作用是否导致诱导EBV特异性细胞免疫应答，这对于EBV的免疫监视是重要的。单个细胞由以上所述的VLP-免疫小鼠和对照小鼠的脾脏制备。来自单个小鼠的致死照射的脾细胞用获自用编码如图11C所示并存在于病毒颗粒中的所述病毒基因的单表达质粒瞬时转染的HEK293细胞的溶解产物进行培养。为了允许外加溶解产物的吸附，蛋白溶解降解和递呈，将脾细胞培养5个小时，随后洗涤从而除去游离的溶解产物。细胞递呈抗原的能力采用作为指示剂加入的5×10⁵个非照射脾细胞进行评价。在24h之后在IFN-γ酶联免疫斑点分析法中测定指示物细胞的活化。如图11C所示，来自VLP-免疫小鼠的脾细胞而不是用来自HEK293细胞的外来体免疫的对照小鼠的脾细胞清楚地被再活化。综上所述，本实验表明，在幼稚小鼠中来自293-VII+细胞的VLP能够诱导EBV特异性细胞免疫应答。

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Claims (14)

1.一种包含颗粒的疫苗，所述颗粒包含

（i）至少一种爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）结构多肽，

（ii）至少一种EBV溶解多肽，

（iii）膜脂类，

所述颗粒缺乏EBV DNA，其中

（a）如所述颗粒中包含的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽的B-细胞转化能力被失活而它们的免疫原性被保持；和/或

（b）所述颗粒缺乏B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述颗粒包含选自BZLF1和gp350的至少一种EBV多肽和/或进一步包含至少一种EBV潜伏多肽。

3.一种产生颗粒的方法，包括以下步骤：

（a）用修饰的EBV基因组转染细胞，其中与野生型EBV基因组相比较所述修饰的EBV基因组至少

（aa）缺乏包装所述野生型EBV基因组所需的一种或多种序列，缺乏编码所述包装所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其包装能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列；

（ab）缺乏编码B-细胞转化所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其B-细胞转化能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列；以及

（ac）缺乏编码诱导EBV复制所需的EBV多肽的一种或多种序列和/或包含编码其诱导EBV复制的能力被失活的EBV多肽的一种或多种序列；

（b）在允许表达所述修饰的EBV基因组的条件下培养在步骤（a）中获得的所述细胞；

（c）诱导EBV的复制期；以及

（d）分离出所述颗粒。

4.根据权利要求1或2所述的疫苗或根据权利要求3所述的方法，其中在权利要求1的（a）中或在权利要求3的（ab）中其转化能力被失活的多肽是LMP-1多肽。

5.根据权利要求1，2或4中任一项所述的疫苗或根据权利要求3或4所述的方法，其中根据权利要求1的（b）或权利要求3的（ab）缺乏的B-细胞转化所需的一种或多种EBV多肽选自由EBNA-2、EBNA-3a、EBNA-3b和EBNA-3c组成的组中。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的方法，其中根据权利要求3的（ac）所述缺乏的诱导EBV复制所需的一种或多种EBV多肽或其诱导EBV复制的能力被失活的所述一种或多种EBV多肽选自由BZLF1、BRLF1、BMLF1以及它们任意组合组成的组中，并且其中在权利要求3的步骤（c）中所述复制期通过将选择的一种或多种多肽提供给所述细胞进行诱导。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述选择的多肽是BZLF1。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述将所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1提供给所述细胞，通过从所述细胞中稳定转染的载体中表达所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1来实现。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种EBV多肽或所述BZLF1的所述表达是诱导调节的。

10.根据权利要求3～9中任一项所述的方法，包括在步骤（b）之后和在步骤（c）之前的另外步骤（b’），包括：向所述细胞提供一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或一种或多种疫苗佐剂，其中所述一种或多种病毒多肽或所述一种或多种病毒核酸序列分别不是EBV多肽或EBV核酸序列。

11.根据权利要求1，2，4和5中任一项所述的疫苗，另外包含一种或多种病毒或非病毒多肽，一种或多种病毒或非病毒核酸序列和/或疫苗佐剂，其中所述一种或多种病毒多肽或所述一种或多种病毒核酸序列分别不是EBV多肽或EBV核酸序列。

12.根据权利要求8～10中任一项所述的方法的步骤（a）通过转染获得的细胞。

13.一种包含根据权利要求1，2，4，5和11中任一项所述的疫苗或根据根据权利要求3～10中任一项所述的方法产生的颗粒的试剂盒。

14.根据权利要求1，2，4，5和11中任一项所述的疫苗或通过根据权利要求3～10中任一项所述方法获得的颗粒用于产生EBV抗原特异性的CD8+T细胞的用途。

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