DE102012105193B4

DE102012105193B4 - Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV)

Info

Publication number: DE102012105193B4
Application number: DE102012105193.3A
Authority: DE
Inventors: Stefan Stevanovic; Christina Kyzirakos; Christoph Grabenbauer; Elina Barsaume; Stefan Audehm; Prof. Dr. Rammensee Hans-Georg; Thomas Feger
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-04-03
Anticipated expiration: 2032-06-16
Also published as: WO2013186178A1; DE102012105193A1

Abstract

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), die zumindest drei verschiedene Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 78.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein Verfahren zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung und in dieser enthaltende Peptide.
Das Epstein-Barr-Virus (EBV), auch Humanes-Herpes-Virus 4 (HHV 4) genannt, ist ein humanpathogenes, behülltes, doppelsträngiges DNA-Virus aus der Familie der Herpesviren. Hauptübertragungsweg des Virus ist eine Tröpfcheninfektion oder eine Kontakt- bzw. Schmierinfektion. Auch kann es im Rahmen von Transplantationen oder Bluttransfusionen zu Übertragungen kommen. Die Infektion mit dem Virus erfolgt zumeist im Kindesalter. Ab dem 40. Lebensjahr sind ca. 98% der Menschen mit EBV infiziert. In den meisten Fällen verlaufen die chronischen Infektionen asymptomatisch. In 30% bis 60% aller Fälle kann es jedoch zum Ausbruch des sog. Pfeiffer-Drüsenfiebers bzw. der infektiösen Mononukleose kommen. EBV steht ferner in ursächlichem Zusammenhang mit Lymphdrüsenkrebs, dem Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom sowie weiteren Lymphomen. Besonders bei immunkompromittierten Personen kommt es zum verstärkten Auftreten von EBV-assoziierten Erkrankungen.
Eine wichtige Rolle spielt EBV bei Patienten, die sich einer Organtransplantation unterziehen. Diese werden immunsupprimiert, um die Abstoßung des Fremdorgans zu verhindern. Dies fördert die Vermehrung von EBV und die Entstehung der sog. lymphoproliferative Erkrankung nach Transplantation (engl. ”post-transplant lymphoproliferative disorder”, PTLD).
Eine zielgerichtete Therapie gegen das Pfeiffer-Drüsenfieber gibt es bisher nicht. In den meisten Fällen erfolgt eine rein symptomatische Behandlung. Entsprechend bestehen die Behandlungsmethoden des Hodgkin- oder Burkitt-Lymphoms aus klassischen Chemo- und Strahlentherapien. Auch die Therapie von PTLD ist bislang nicht zufriedenstellend gelöst. Häufig kommt es auch hier zum Einsatz von Chemo- und Strahlentherapien sowie verschiedenen Verfahren der Immunstimulation.
Der adoptive Transfer von polyklonalen T-Zelllinien zur Behandlung und Prävention von PTLD bei hämatopoetischer Stammzelltransplantation wird bspw. beschrieben in Heslop et al. (2010), Long-term outcome of EBV-specific T-cell infusions to prevent or treat EBV-related lymphoproliferative disease in transplant recipients, Blood 115(5), Seiten 925–935. Die dort eingesetzten polyklonalen T-Zelllinien wurden durch die wiederholte Stimulation von mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMC) des Spenders mit autologen EBV-infizierten lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) generiert. Dies ist jedoch sehr zeitaufwändig. Die Generation der LCL allein kann bis zu 5 Wochen dauern; vgl. Rooney et al. (1995), Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation, Lancet 345(8941), Seiten 9–13, und Wilkie et al. (2004), Establishment and characterization of a bank of cytotoxic T lymphocytes for immunotherapy of Epstein-Barr virus-associated diseases, Journal of Immunotherapy 27(4), Seiten 309–316. Ein weiterer Nachteil dieser Behandlungsmethode resultiert aus der Polyklonalität der T-Zelllinien. Diese können eine immunologische Reaktion im Sinne einer Transplantat-Wirt-Reaktion (engl. ”graft-versus-host-disease”) auslösen.
Moosmann et al. (2010), Effective and long-term control of EBV PTLD after transfer of Peptide-selected T cells, Blood, Vol. 115, Nr. 14, beschreiben die ex vivo-Stimulation von T-Zellen mit EBV-spezifischen Peptiden und die anschließende Transfusion der T-Zellen in Patienten mit PTLD.
Die Firma Prolmmune Limited, Oxford, Vereinigtes Königreich, vertreibt ein Produkt ”ProMix^TM EBV Peptide Pool”, das 26 Peptide enthält, wovon jedes einem definierten HLA-Klasse-I-vestringierten T-Zell-Epitop von EBV entspricht.
Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, mit denen EBV-assoziierten Erkrankungen vorgebeugt bzw. diese behandelt werden können, wobei die im Stand der Technik beschriebenen Problemen weitgehend vermieden werden sollen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV) gelöst, die zumindest drei verschiedene Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Die Erfinder konnten überraschenderweise feststellen, dass die Verabreichung von zumindest drei verschiedenen Peptiden mit drei verschiedenen Aminosäuresequenzen aus der von den Erfindern aufgefundenen Gruppe bei nahezu allen mit EBV-infizierten Individuen zu einer Stimulation der zellulären Immunantwort gegen EBV führt.
Die von den Erfindern bereitgestellten Peptide erfassen sog. ”frequently recognized epitopes” (FREP) aus EBV, also Epitope von EBV, die vom zellulären Immunsystem häufig erkennt werden. Die von den Erfindern bereitgestellten Peptide erfassen sowohl MHC-Klasse-I- als auch MHC-Klasse-II-restringierte EBV-spezifische Epitope.
Vor diesem Hintergrund besteht der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung darin, dass die MHC- bzw. HLA-Restriktion praktisch überwunden wird. Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung löst bei EBV-infizierten Individuen, gleich welches MHC- bzw. HLA-Profil vorliegt, eine Stimulation der zellulären Immunantwort aus. Es ist folglich nicht erforderlich, vor der Verabreichung eine MHC- bzw. HLA-Typisierung des betroffenen Individuums durchzuführen. Die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist deshalb besonders kostengünstig.
Ferner ist es nicht zwingend erforderlich, dem EBV-infizierten Individuum zunächst Zellen des Immunsystems zu entnehmen, um diese dann ex vivo zu stimulieren und anschließend erneut dem Individuum zu verabreichen, wie dies in dem von Heslop et al. (2010, a. a. O.) beschriebenen Ansatz der Fall ist. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dem Individuum vielmehr direkt verabreicht werden und somit zeitnah eine Immunstimulation induzieren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann neben den Peptiden einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen. Derartige Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Sie umfassen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel sowie Puffer, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition, Pharmaceutical Press, oder Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH.
Die Erfinder haben erkannt, dass bereits drei Peptide ausreichend sind, um einen Großteil der mit EBV-infizierten Individuen zu erfassen. Dies gilt insbesondere im Fall von MHC-Klasse-II-Peptiden. Diese sind in ihrer Bindungsfähigkeit nicht sehr restriktiv und können zum Teil allelübergreifend binden. Die Erfinder konnten MHC-Klasse-II-Peptide generieren, die unter zufällig ausgewählten Blutspendern zu Erkennungsraten von über 75% führten. Bei der Verwendung von mindestens drei erfindungsgemäßen MHC-Klasse-II-Peptiden werden Erkennungsraten von ca. 100% erreicht.
Die pharmazeutische Zusammensetzung benötigt neben den erfindungsgemäßen Peptiden keine weiteren Wirkstoffe. Sie kann jedoch weitere Wirkstoffe oder Wirkverstärker enthalten. Im Falle eines Impfstoffes oder Vakzins sind bspw. sog. Adjuvantien bevorzugt, um die Immunantwort unspezifisch zu steigern. Derartige Adjuvantien umfassen Aluminiumhydrochlorid, MF59, AS03, Monophosphoryl-Lipid A etc.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung der Erfindung weist die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest fünf verschiedene erfindungsgemäße Peptide auf.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit noch größerer Zuverlässigkeit die gesamte Population von EBV-infizierten Individuen abgedeckt und in diesen eine gezielte Immunstimulation erreicht wird. Dies gilt auch und insbesondere für den Fall von fünf ausgewählten MHC-Klasse-I-Peptiden. So weist jeder Mensch ein individuelles Set aus zwei HLA-A-Allelen und HLA-B-Allelen auf, bspw. HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7 und HLA-644. Die verschiedenen Allele sind unterschiedlich häufig in der Bevölkerung vertreten. MHC-Klasse-I-Epitope sind sehr restriktiv in ihrer Bindungsfähigkeit, binden also z. B. nur auf HLA-A2. Berechnet man die theoretische Populationsabdeckung eines Impfstoffes innerhalb der deutschen Bevölkerung, der aus Peptiden besteht, die an die häufigsten HLA-Allele binden, dann ergibt sich, dass ab einer Menge von fünf Peptiden über 95% der Bevölkerung abgedeckt wären:

Anzahl Peptide	Populationsabdeckung (%)	Restriktionen der verwendeten Peptide
1	49,8736	A2
2	69,4191	A2 + A3
3	82,1916	A2 + A3 + B7
4	91,3564	A2 + A3 + B7 + B44
5	96,2364	A2 + A3 + B7 + B44 + B8
6	99,1164	A2 + A3 + B7 + B44 + B8 + B35

Tabelle 1: Theoretische Populationsabdeckung mit steigender Anzahl von Peptiden bei einer Erkennungsrate der Peptide von 100%; Berechnung nach Schipper et al. (1996), Minimal phenotype panels. A method for achieving maximum population coverage with a minimum of HLA antigens, human immunology 51(2), Seiten 95–98; Allelfrequenzen der deutschen Bevölkerung aus www.allelefrequencies.net

Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung weist die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest acht verschiedene Peptide auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit noch höherer Sicherheit bei jedem beliebigen EBV-infizierten Individuum eine zelluläre Immunantwort auslöst.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zumindest 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 verschiedene Peptide aufweisen kann, wobei die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 73.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung weist die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest drei verschiedene MHC-Klasse-II-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen und zumindest fünf verschiedene MHC-Klasse-I-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen auf, wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-II-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 38, und wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-I-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 39 bis 78.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit sehr hoher Zuverlässigkeit die MHC-Klasse-I-Ausstattung und gleichzeitig die MHC-Klasse-II-Ausstattung eines menschlichen Individuums erfasst werden, so dass eine optimale Stimulation der zellulären Immunantwort gewährleistet ist.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer EBV-assoziierten Erkrankung ausgebildet.
Bei der EBV-assoziierten Erkrankung kann es sich um Pfeiffer-Drüsenfieber (infektiöse Mononukleose), Lymphdrüsenkrebs (Morbus Hodgkin), Burkitt-Lymphom oder aber bevorzugt um die lymphoproliferative Erkrankung nach Transplantation (PTLD) handeln.
Erfindungsgemäß wird damit auf besonders vorteilhafte Art und Weise eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, mit der solche EBV-assoziierten Erkrankungen zielgerichtet behandelt bzw. diesen vorgebeugt werden kann, für die bislang keine zufriedenstellenden therapeutischen Möglichkeiten verfügbar sind.
Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von zumindest drei, vorzugsweise zumindest fünf, weiter bevorzugt zumindest acht verschiedenen Peptiden mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen, zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Die Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von zumindest drei, vorzugsweise zumindest fünf, weiter bevorzugt zumindest acht verschiedenen Peptiden, (2) Formulierung der Peptide in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die zumindest drei, vorzugsweise zumindest fünf, weiter bevorzugt zumindest acht verschiedenen Peptide jeweils unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, die jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Die Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren gleichermaßen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV) bzw. die Verwendung eines Peptides zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV) bzw. die Verwendung eines Peptides zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10 bis 14, 16, 18, bis 20, 22, 24 bis 38, 48, 49, 54, 56, 61, 62, 66, 68, 69.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, bei dem es sich um DNA oder RNA bzw. einen genetischen Vektor oder Plasmid handeln kann, der für das erfindungsgemäße Peptid codiert.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Wirt, bspw. einen Mikroorganismus wie ein Bakterium, das das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthält.
Die für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung genannten Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen gelten für das erfindungsgemäße Peptid sowie dessen Verwendung und für das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül entsprechend.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stimulation der zellulären Immunantwort eines Lebewesens gegen EBV, das die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder des erfindungsgemäßen Peptides bzw. der Peptide in das Lebewesen umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur diagnostischen Untersuchung eines Lebewesens auf eine Infektion mit EBV, das folgende Schritte aufweist: (1) Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder des erfindungsgemäßen Peptides und/oder der erfindungsgemäßen Peptide in das Lebewesen, (2) Messung der Immunreaktion des Lebwesens, (3) Korrelation einer Immunreaktion des Lebwesens mit einer positiven Diagnose einer EBV-Infektion.
Die Immunreaktion des Lebewesens lässt sich bspw. über die Cytokinausschüttung messen, wobei IFN-γ ein besonders geeigneter Marker darstellt, der sich bspw. im Rahmen des sog. ELISpot-Assays bestimmen lässt.
Die Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für das erfindungsgemäße Stimulationsverfahren und das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren entsprechend.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der vorliegenden Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug auf die beigefügten Figuren genommen.
Die Figuren zeigen Folgendes:
1A) Eine Amplifizierung von peptidspezifischen Reaktionen in vitro führt zu detektierbaren Reaktionen. Spotbildende Einheiten von PBMCs von acht gesunden Spendern, gemessen mittels IFN-γ-ELISpot nach Stimulation mit 10 μg/ml des Peptides BLLF1₁₆₇ ex vivo- und nach In-vitro-Amplifizierung. Der Hintergrund (Stimulation mit dem Kontrollpeptid FInA) wurde subtrahiert.
1B) Beispiel eines Ergebnisses eines IFN-γ-ELISpot-Screenings. Die PBMCs eines gesunden Blutspenders wurden auf spezifische Gedächtniszellen für zehn verschiedene Epitopkandidaten nach der Amplifizierung in vitro getestet. Spotwerte von ≧ 10, die zumindest dreifach über den Spotwerten der Kontrollpeptide lagen, wurden als positive Reaktionen definiert. Die positive Reaktionen sind mit einem Stern gekennzeichnet. FInA: Kontrollpeptid; ∅: Mediumkontrolle, PHA: positive Kontrolle Phytohämagglutinin.
2A) PBMCs von 16 zufällig ausgewählten Blutspendern reagieren auf den Peptidmix 1 durch IFN-γ-Produktion nach einer Amplifizierung in vitro. Die Zellen wurden amplifiziert und mit 10 μg/ml des Peptidmixes (2 μg/ml pro Peptid) und 2 bzw. 10 μg/ml FInA (Kontrollpeptid) stimuliert. Spotwerte von ≧ 10, die zumindest dreifach über den Spotwerten der Kontrollpeptide lagen, wurden als positive Reaktionen definiert. FInA: Kontrollpeptid, ∅: Mediumkontrolle, PHA: positive Kontrolle Phytohämagglutinin.
2B) Die Stimulation mit dem Peptidmix 1 induziert eine multifunktionale CD4⁺-T-Zell-Reaktion in seropositiven nicht jedoch seronegativen Spendern. PBMCs von fünf seropositiven und zwei seronegativen Spendern wurden mit 10 μg/ml des Peptidmixes 1 nach Präamplifizierung stimuliert und intrazellulär auf IFN-γ, TNF, Granzym B, CD154 und IL2 gefärbt. Gating-Strategie: lebende Lymphozyten wurden selektiert und in CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen selektiert. Duplets wurden ausgeschlossen.
2C) Die reagierenden Zellen der seropositiven Individuen sind hochfunktionell im Vergleich zu den reagierenden Zellen der seronegativen Individuen. Die gezeigten Bogen visualisieren die verschiedenen Funktionen, die simultan von den CD4⁺-Zellen von fünf seropositiven und zwei seronegativen Individuen exprimiert werden. In allen seropositiven Individuen exprimieren ein Sechstel bis ca. ein Drittel der Zellen (weiß bis mittelgraue Anteile) zumindest drei Funktionen. In den seronegativen Individuen zeigen die reagierenden Zellen hauptsächlich eine Funktion (schwarze Anteile).
3 Reaktion von 16 Blutspendern auf den Peptidmix 2.
4 Reaktionen von 16 Blutspendern auf den Peptidmix 3.
5 Reaktionen von 4 Blutspendern auf die Peptidmixe 4 bis 13.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Auswahl der Kandidatenepitope
Die Kandidatenepitope wurden unter Verwendung der Datenbank SYFPEITHI, Universität Tübingen, Interfakultäres Institut für Zellbiologie, Deutschland (www.syfpeithi.de) ermittelt. Die Proteinsequenzen wurden der Datenbank SwissProt (www.uniprot.org) entnommen. Für jedes Antigen wurden 2% der möglichen Anzahl von Peptiden für das Screening selektiert.
1.2. Peptidsynthese
Die Peptide wurden synthetisiert, wie beschrieben in Meyer et al. (2009), Identification of natural MHC class II presented phosphopeptides and tumor-derived MHC class I phospholigands, J. Proteome Res. 8(7), Seiten 3666–3674.
1.3. Isolation von mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)
Buffy Coats- oder Leukapherese-Produkte wurde von dem Institut für Klinische und Experimentelle Transfusionsmedizin, Universität von Tübingen, Deutschland, bereitgestellt. Die PBMCs wurden durch eine Standardgradientenseparation mit Ficoll (PAA) isoliert und in fötalem Kälberserum (PAA) mit 10% DMSO (Merck) bei –80°C bis zur Verwendung kryokonserviert.
1.4. Präamplifizierung von spezifischen Reaktionen
Gefrorene PBMCs wurden am Tag 0 aufgetaut und bei hoher Dichte (0,5 – 1·10⁷ Zellen/ml) in Medium (Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium (Lonza), enthaltend 5% hitzeinaktiviertes Humanserum, 50 μM β-Mercaptoethanol (Roth), 1 × Penicillin/Streptomycin (PAA) und 25 μg/ml Gentamicinsulfat (Lonza)) kultiviert. Am Tag 1 wurden die Peptide zusammen mit Medium bei jeweils 2–10 μg/ml hinzugegeben. Für das Epitop-Screening wurden die PBMCs mit einem Pool von Peptiden einschließlich dem Kontrollpeptid (Gag_HIV 296–313 oder FLNA_HUMAN 1669–1683) prästimuliert. An den Tagen 2, 5 und 7 wurden zusammen mit Medium 20 U/ml IL-2 (Proleukin S, Novartis) hinzugegeben. Die PBMCs wurden am Tag 12 für ELISpot, intrazelluläre Cytokinfärbungen oder IFN-γ-Sekretions-Assays (Miltenyi Biotec) verwendet.
1.5. IFN-γ-ELISpot-Assays
2 – 5·10⁵ PBMCs/Vertiefung wurden in mit Antikörper (1D1k, MabTech) beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen (MSHAN4B, Millipore) mit 10 μg/ml Peptid oder 10 μg/ml PHA-P (Sigma) als Positivkontrolle stimuliert. Nach 24 bis 26 Stunden der Inkubation wurden die Vertiefungen wiederholend gewaschen und das gebundene IFN-γ wurde mit biotinyliertem Sekundär-Anti-IFN-γ-Antikörper (7-B6-1, Mab-Tech) detektiert. Der gebundene Antikörper wurde an ExtrAvidin alkalische Phosphatase (Sigma) gekoppelt und mit NBT/BCIP (Sigma) gefärbt. Die entwickelten Platten wurden unter Verwendung eines automatisierten ELISpot-Lesegerätes (CTL) ausgewertet.
Jedes Peptid wurde mittels Zwei- oder Dreifachmessungen analysiert. Die Reaktionen auf die individuellen Peptide wurden als positiv bewertet, wenn die mittlere Anzahl von Spots pro Vertiefung zumindest 10 betrug und die Werte über dem Dreifachen des mittleren Wertes der Spots der Negativkontrolle lagen.
1.6. Intrazelluläre Cytokinfärbungen
10⁵–10⁶ PBMCs wurden über Nacht mit 2–10 μg/ml des bzw. der spezifischen Peptide in TCM + 10 μg/ml Brefeldin A (Sigma) stimuliert. PMA (Sigma, 150 ng/ml) und Ionomycin (Sigma, 1 μM Endkonzentration) wurden als Positivkontrolle verwendet. Nach der Inkubation wurden die Zellen zuerst mit live/dead aqua (Invitrogen) gefärbt, um tote Zellen auszuschließen. Anschließend wurden die Zellen extrazellulär mit verschiedenen Antikörpern gefärbt: Anti-CD3-PacificBlue (Biolegend), Anti-CD3-FITC (Eigenherstellung), Anti-CD4-APC-Cy7 (BD Biosciences), Anti-CD4-FITC (Eigenherstellung), Anti-CD8-PerCP (Biolegend), Anti-CD8-FITC (Eigenherstellung) und Anti-CD8-PE-Cy7 (Beckman Coulter). Dem folgte eine Permeabilisierung mit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) und eine intrazelluläre Färbung mit Anti-TNF-PacificBlue (Biolegend); Anti-CD154-FITC, Anti-IFN-γ-PE-Cy7/PE/FITC (alle BD Biosciences), Anti-IL-2-PE (BD Biosciences), Anti-GranzymeB-AlexaFluor647 (BD Biosciences). Die Zellen wurden unter Verwendung eines FACSCanto II Cytometer (BD Biosciences) und FlowJo (TreeStar) analysiert.
2. Ergebnisse
2.1 Die Amplifizierung von spezifischen T-Zellen führt zu einer effizienteren Detektionsrate von Epitopen.
Die Erfinder ermittelten unter Verwendung der syfpeithi-Datenbank über hundert Epitopenkandidaten von Antigenen des EBV aus der latenten als auch lytischen Phase des Virus. Diese wurden auf in gesunden Blutspendern vorhandene T Gedächtniszellen gescreent, um häufig erkannte Epitope (engl. ”frequently recognized epitopes”, freps) aus EBV zu identifizieren.
Im Gegensatz zu CD4⁺-T-Zellen, die spezifisch sind für das Cytomegalievirus (CMV), ist die Häufigkeit von CD4⁺-T-Zellen, die spezifisch sind für Epitope von EBV, mit weniger als 1 von 10.000 PBMCs, die im ELISpot auf ein Epitop reagieren, üblicherweise sehr gering. Um diese Beschränkung zu überwinden und um keine Reaktion zu übersehen, wurden die präexistierenden spezifischen T-Zellen vor dem Auslesen in einer 12tägigen Kultur in vitro amplifiziert. Dies führte zu einer Amplifizierung der Reaktion auf ein detektierbares Niveau.
Wie in 1A dargestellt, wurden acht gesunde Spender gefunden, die nach einer Amplifizierung in vitro auf das Epitop BLLF1₁₆₇ (SEQ ID Nr. 17) reagierten. Keine dieser Reaktionen war direkt ex vivo in einem ELISpot mit 0,5·10⁶ Zellen pro Vertiefung detektierbar. Die Amplifizierung von spezifischen PBMCs, die IFN-γ produzierten, variierte von etwa 10- bis etwa 900-fach, mit einem Mittelwert von 325,7 (± Standardabweichung 285,4).
2.2 Identifizierung von neuen EBV-Epitopen und verifizierten CD4⁺-T-Zell-Epitopen
Jeder Epitopkandidat wurde in einer ersten Runde gegen PBMCs von gesunden Blutspendern durch einen IFN-γ-ELISpot gescreent. Spotwerte von ≧ 10, die zumindest dreifach über den Spotwerten der Kontrollpeptide lagen, wurden als positive Reaktionen definiert. Peptide, die positive IFN-γ-Reaktionen auslösten, wurden weiter getestet, was in zumindest 15 getesteten Spendern pro Peptid resultierte. Ein exemplarisches ELISpot-Ergebnis eines getesteten Spenders in Bezug auf eine Reaktion gegen 10 verschiedene Epitopkandidaten des Antigens BLLF1 ist in der 1B dargestellt.
Mit diesem Screeningansatz konnten die Epitope in der folgenden Tabelle 2 aufgefunden werden:

Tabelle 2: Häufig erkannte EBV-spezifische Peptide. Es wurden jeweils mindestens 16 gesunde Blutspender (Ausnahmen: mit Stern gekennzeichnete jeweils drei; mit zwei Sterne gekennzeichnete jeweils 12) mit passender HLA-Restriktion (MHC-Klasse-I-Epitope) oder zufällig ausgewählte Blutspender (MHC-Klasse-II-Epitope) für ihre Reaktivität auf das gegebene Peptid mit dem ELISpot-Assay getestet.
2.3 Ein Peptidmix wird von über 90% aller EBV-Infizierten erkannt.
Als nächstes sollte ein Mix enthaltend wenige, jedoch häufig erkannte Peptide geschaffen werden, die in Kombination ausreichend sind, um EBV-spezifische CD4⁺-T-Gedächtniszellen von möglichst jedem gesunden EBV-Träger, unabhängig von seinem HLA-Typ, zu aktivieren.
Um dies zu erreichen, wurde das individuelle Erkennungsprofil von 16 gesunden Blutspendern gegen 9 häufig erkannte Epitope verglichen, wobei vier von den lytischen und fünf von den latenten Antigenen nach der Prästimulierung abgeleitet wurden:
Tabelle 3: Reaktion von 16 Blutspendern auf 9 verschiedene Peptide; die hervorgehobenen Werte entsprechen positiven Immunreaktionen.
Dieser Vergleich beinhaltete zwei zuvor bekannte EBNA-1-abgeleitete Epitope EBNA1514 (SEQ ID Nr. 21) und EBNA1411. Die Epitope EBNA3A 381 (SEQ ID Nr. 13), EBNA1 514 (SEQ ID Nr. 21), BMRF1 261 (SEQ ID Nr. 19), BLLF1 268 (SEQ ID Nr. 1) und BLLF1 167 (SEQ ID Nr. 17) wurden ausgewählt, da sie zusammengenommen die IFN-γ-Produktion in allen reagierenden Spendern (12/16) induzierten:
Tabelle 4: Peptidmix 1
Mit dem Peptidmix 1 konnten erfolgreich IFN-γ-produzierende Zellen in 23 aus 24 zufällig ausgewählten weder HLA-typisierte noch EBV-Serumstatus bestimmten gesunden Blutspendern stimuliert werden, wie mittels ELISpot nachgewiesen. Daten von 16 Spendern sind in der 2A nach Amplifikation in vitro dargestellt.
Die stimulierten Zellen exprimierten TNF, CD154, IFNγ, IL2 und Granzym B, während dies bei den PBMCs der seronegativen Spender L13 und CG dies nicht festgestellt wurde; vgl. 2B.
Das Cytokinexpressionsmuster unter den reagierenden Zellen war in den seropositiven Spendern deutlich multifunktioneller als in den seronegativen Spendern; vgl. 2C. Während in den jeweils getesteten seropositiven Individuen ein wesentlicher Anteil von Zellen (0,3 bis 0,7% von CD4⁺) alle fünf Aktivierungsmarker exprimierte, konnten in den seronegativen Individuen solche Zellen nicht detektiert werden.
In einem weiteren Experiment wurden die Reaktionen von acht weiteren Blutspendern auf neun verschiedene erfindungsgemäße Peptide getestet:
Tabelle 5: Reaktionen von acht Blutspendern auf neun verschiedene Peptide; Hervorhebung: Immunreaktion/IFN-γ-Antwort
Ein zweiter Mix aus fünf Peptiden, nämlich EBNA3A 381 (SEQ ID Nr. 13), BMRF1 261 (SEQ ID Nr. 19), EBNA3A 190 (SEQ ID Nr. 35), BRLF1 119 (SEQ ID Nr. 25), EBNA3A 287 (SEQ ID Nr. 29) (Peptidmix 2) wurde von insgesamt 29/32 getesteten Individuen (90,6%) erkannt; vgl. 3: 14 von 16 in diesem Experiment getesteten Spendern).
Ein dritter Mix aus sieben Epitopen, nämlich EBNA3A 381 (SEQ ID Nr. 13), BMRF1 261 (SEQ ID Nr. 19), EBNA1 514 (SEQ ID Nr. 21), BLLF1 167 (SEQ ID Nr. 17), BRLF1 119 (SEQ ID Nr. 25), EBNA2 276 (SEQ ID Nr. 3) und BXLF2 126 (SEQ ID Nr. 7) (Peptidmix 3) wurde von 16/16 getesteten Individuen erkannt; vgl. 4.
Die Erfinder haben im Folgenden 10 weitere Mixe (Peptidmixe 4 bis 13) mit MHC-Klasse I-Peptiden getestet:
Peptidmix 4: BMLF1 280 (SEQ ID Nr. 40), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), EBNA4 657 (SEQ ID Nr. 72): Häufigste HLAs, jeweils bestes Peptid. Erkennung: 10/14, 71,4%
Peptidmix 5: BRLF1 109 (SEQ ID Nr. 39), BMLF1 280 (SEQ ID Nr. 40), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), BRLF1 148 (SEQ ID Nr. 78), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), EBNA4 657 (SEQ ID Nr. 72), EBNA6 162 (SEQ ID Nr. 73): Häufigste HLAs, jeweils zwei beste Peptide. Erkennung 9/14, 64,3%
Peptidmix 6: BRLF1 109 (SEQ ID Nr. 39), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), LMP2 419 (SEQ ID Nr. 53), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), BZLF1 190 (SEQ ID Nr. 57), EBN2 430 (SEQ ID Nr. 66), EBNA6 162 (SEQ ID Nr. 73): 7 häufigste HLAs, jeweils bestes Peptid. Erkennung 10/14, 71,4%
Peptidmix 7: EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), EBNA4 399 (SEQ ID Nr. 51), LMP2 419 (SEQ ID Nr. 53), BALF2 573 (SEQ ID Nr. 54), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), BZLF1 190 (SEQ ID Nr. 57), BZLF1 173 (SEQ ID Nr. 64), EBNA6 258 (SEQ ID Nr. 65), EB2 430 (SEQ ID Nr. 66), LMP2 200 (SEQ ID Nr. 71), EBNA6 162 (SEQ ID Nr. 73), LMP1 256 (SEQ ID Nr. 77): alle außer A*02, jeweils bestes Peptid. Erkennung 13/14, 92,8%
Peptidmix 8: BRLF1 109 (SEQ ID Nr. 39), BMLF1 280 (SEQ ID Nr. 40), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), BRLF1 148 (SEQ ID Nr. 78), EBNA4 399 (SEQ ID Nr. 51), EBNA4 416 (SEQ ID Nr. 52), LMP2 419 (SEQ ID Nr. 53), BALF2 573 (SEQ ID Nr. 54). Alle HLA-A, bis zu zwei beste Peptide. Erkennung 11/14, 78,5%.
Peptidmix 9: EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), BZLF1 190 (SEQ ID Nr. 57), EBNA3 193 (SEQ ID Nr. 58), EBNA4 831 (SEQ ID Nr. 63), BZLF1 173 (SEQ ID Nr. 64), EBNA6 258 (SEQ ID Nr. 65), EB2 430 (SEQ ID Nr. 66), BZLF1 54 (SEQ ID Nr. 67), LMP2 200 (SEQ ID Nr. 71), EBNA4 657 (SEQ ID Nr. 72), EBNA6 162 (SEQ ID Nr. 73), LMP1 156 (SEQ ID Nr. 77). Alle HLA-B, bis zu zwei beste Peptide. Erkennung 13/14, 92,8%.
Peptidmix 10: BRLF1 109 (SEQ ID Nr. 39), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), BZLF1 190 (SEQ ID Nr. 57), BZLF1 173 (SEQ ID Nr. 64), EBN2 430 (SEQ ID Nr. 66), EBNA1 407 (SEQ ID Nr. 70). Zufallsmischung I. Erkennung 13/14, 92,8%.
Peptidmix 11: BRLF1 109 (SEQ ID Nr. 39), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), EBNA4 399 (SEQ ID Nr. 51), LMP2 419 (SEQ ID Nr. 53), BALF2 573 (SEQ ID Nr. 54), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), BZLF1 190 (SEQ ID Nr. 57), BZLF1 173 (SEQ ID Nr. 64), EBNA6 258 (SEQ ID Nr. 65), EB2 430 (SEQ ID Nr. 66), LMP2 200 (SEQ ID Nr. 71), EBNA6 162 (SEQ ID Nr. 73), LMP1 165 (SEQ ID Nr. 77). Alle HLAs, jeweils bestes Peptid. Erkennung 12/14, 85,7%
Peptidmix 12: BRLF1 109 (SEQ ID Nr. 39), BMLF1 280 (SEQ ID Nr. 40), LMP2 356 (SEQ ID Nr. 41), LMP2 426 (SEQ ID Nr. 42), LMP1 125 (SEQ ID Nr. 45), EBNA6 284 (SEQ ID Nr. 46), EBNA3 471 (SEQ ID Nr. 47), BRLF1 148 (SEQ ID Nr.78), EBNA4 399 (SEQ ID Nr. 51), EBNA4 416 (SEQ ID Nr. 52), LMP2 419 (SEQ ID Nr. 53), BALF2 573 (SEQ ID Nr. 54), EBNA3 247 (SEQ ID Nr. 55), BZLF1 190 (SEQ ID Nr. 57), EBNA3 193 (SEQ ID Nr. 58), LMP2 163 (SEQ ID Nr. 62), EBNA4 831 (SEQ ID Nr. 63), BZLF1 173 (SEQ ID Nr. 64), EBNA6 258 (SEQ ID Nr. 65), EB2 430 (SEQ ID Nr. 66), BZLF1 54 (SEQ ID Nr. 67), BALF2 31 (SEQ ID Nr. 68), EBNA1 407 (SEQ ID Nr. 70), LMP2 200 (SEQ ID Nr. 71), EBNA4 657 (SEQ ID Nr. 72), EBNA6 162 (SEQ ID Nr. 73), LMP1 156 (SEQ ID Nr. 77). Alle Peptide. Erkennung: 14/14, 100%
Peptidmix 13: BMLF1 280 (SEQ ID Nr. 40), EBNA4 399 (SEQ ID Nr. 51), BZLF1 (190 (SEQ ID Nr. 57), EBNA4 831 (SEQ ID Nr. 63), BZLF1 54 (SEQ ID Nr. 67), LMP2 200 (SEQ ID Nr. 71). Zufallsmischung II. Erkennung: 8/14, 57,1%

Tabelle 6: Reaktionen von 14 Spendern (1530–1761) auf verschiedene MHC-Klasse-I-Mixe nach in vitro Amplifikation, gemessen durch IFN-γ ELISPOT. Angegeben ist der Stimulationsindex (xfaches der Spotzahl über Negativkontrolle). Positive Reaktionen (min. 3fach über Negativkontrolle, min. 10 Spots) sind hervorgehoben. PHA: Positivkontrolle.
Tabelle 7: HLA-Typisierungen der verwendeten Spender
In der 5 sind repräsentative ELISPOT-Ergebnisse der Spender 1755–1761 auf die verschiedenen Mixkombinationen 4 bis 13 nach in vitro Amplifikation dargestellt. Jede Doppelreihe entspricht einem Spender, jeder Mix wurde als Duplikat gemessen. 110056: HIV-spezifisches Peptid, Negativkontrolle. Reihe 12: pro Spender ein Well Positivkontrolle PHA und ein Well Medium.
3. Fazit
Die Erfinder stellen Peptide bereit, mit denen bei EBV-infizierten Individuen eine Stimulation der zellulären Immunantwort gegen EBV induziert werden kann. Die Peptide können in einer Peptidmischung eingesetzt werden, der ohne vorherige MHC- bzw. HLA-Typisierung bei praktisch jedem beliebigen Individuum eine zelluläre Immunantwort gegen EBV induziert. Dies wird von den Erfindern anhand verschiedener Peptidmischungen demonstriert.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), die zumindest drei verschiedene Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zumindest fünf verschiedene Peptide aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, die zumindest acht verschiedene Peptide aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, die zumindest drei verschiedene MHC-Klasse-II-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen und zumindest fünf verschiedene MHC-Klasse-I-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-II-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 38, und wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-I-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 39 bis 78.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer EBV-assoziierten Erkrankung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die EBV-assoziierte Erkrankung eine Lymphoproliferative Erkrankung nach Transplantation (”Post-Transplant Lymphoproliferative Disorder”, PTLD) ist.
Verwendung von zumindest drei verschiedenen Peptiden mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), wobei die Aminosäuresequenzen jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei zumindest fünf verschiedene Peptide verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei zumindest acht verschiedene Peptide verwendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei zumindest drei verschiedene MHC-Klasse-II-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen und zumindest fünf verschiedene MHC-Klasse-I-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen verwendet werden, wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-II-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 38, und wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-I-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 39 bis 78.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer EBV-assoziierten Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die EBV-assoziierte Erkrankung eine lymphoproliferative Erkrankung nach Transplantation (”post-transplant lymphoproliferative disorder”, PTLD) ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von zumindest drei, vorzugsweise zumindest fünf, weiter bevorzugt zumindest acht verschiedenen Peptiden, (2) Formulierung der Peptide in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die zumindest drei, vorzugsweise zumindest fünf, weiter bevorzugt zumindest acht verschiedenen Peptide jeweils unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, die jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei in Schritt (1) zumindest drei verschiedene MHC-Klasse-II-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen und zumindest fünf verschiedene MHC-Klasse-I-Peptide mit jeweils unterschiedlichen Aminosäuresequenzen bereitgestellt werden, wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-II-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 38, und wobei die Aminosäuresequenzen der MHC-Klasse-I-Peptide jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 39 bis 78.
Peptid zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis 78.
Peptid zur direkten Verabreichung in ein Individuum zur Stimulation der zellulären Immunantwort gegen das Epstein-Barr-Virus (EBV), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10 bis 14, 16, 18 bis 20, 22, 24 bis 38, 48, 49, 54, 56, 61, 62, 66, 68, 69.