DE112012002430T5

DE112012002430T5 - Antigenspezifische zentrale Gedächtnis-T-Zellpräparationen mit hohem CD4+ Anteil

Info

Publication number: DE112012002430T5
Application number: DE112012002430.3T
Authority: DE
Inventors: Hans-Dieter Volk; Michael Schmück; Petra Reinke
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-06-11
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2014-03-06
Also published as: EP2718426A1; US20140154228A1; EP2532740A1; EP2718426B1; WO2012171882A1; ES2659756T3; DK2718426T3; US9763985B2; NO2718426T3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahrung zur Erzeugung von T-Zellpräparationen, die für mindestens ein Zielantigen spezifisch sind, umfassend die Schritte Expandieren von lymphoiden Zellen in vitro in der Gegenwart eines Zielantigens oder Peptidfragmenten davon in einem Expansionsschritt, Isolieren von Zellen, die Interferon gamma sekretieren und Kultivieren der Zellen in Gegenwart von Interleukin-2 und Interleukin-7 und enweder eines Inhibitors des mTor Komplexes 1 oder in Gegenwart eines Inhibitors der Interleukin-2(IL-2)-Interleukin-2-Rezeptor(IL-2R)-Interaktion. Die Erfindung betrifft weiterhin Präparationen, die durch das Verfahren der Erfindung erhalten werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft antigenspezifische CD4+ und CD8+ zentrale Gedächtnis-T-Zellen für die adoptive T-Zelltherapie sowie ein Verfahren zur Bereitstellung solcher Zellen.
Die Erzeugung von antigenspezifischen T-Zellen in vitro für die Behandlung von schweren viralen oder anderen Infektionen oder von malignen Erkrankungen („adoptive Therapie”) zielt auf die Induktion einer effektiven Immunantwort gegen ein Antigen ab, welche in einer effektiven Antwort bzw. idealerweise in der Eliminierung der Infektion oder der Krankheit resultiert.
Der adoptive Zelltransfer von autologen oder allogenen, ex vivo geprägten und expandierten menschlichen zytotoxischen Lymphozyten (CTLs) hat sich als vielversprechender Ansatz zur Behandlung sowohl von Infektionskrankheiten als auch von malignen Erkrankungen herausgestellt.
T-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Bekämpfung von pathogenen Infektionen und Tumoren. Eine unzureichende Reaktionsfähigkeit der T-Zellen wird von einer mangelhaften Bekämpfung insbesondere von Viren oder virusassozierten Tumoren, aber auch von anderen Pathogen und Tumoren begleitet. Die adoptive T-Zelltherapie ist ein neuer vielversprechender Ansatz zur Wiederherstellung der Immunokompetenz.
Infektionen durch das humane Cytomegalievirus (CMV) sind eine Hauptursache von Morbidität und Sterblichkeit von immungeschwächten Individuen, und können als Modell für die T-Zell vermittelte Immunität und Infektionsbekämpfung dienen. Eine latente CMV-Infektion kann im immunkompetenten Zustand klinisch unauffällig bleiben, in immungeschwächten Patienten, z. B. Transplantatempfängern, verursacht der Cytomegalievirus jedoch häufige und schwere Komplikationen. Durch die therapeutische Immunsuppression ist die Bildung antigenspezifischer T-Zellantworten in diesen Individuen sehr begrenzt. Ein Protokoll basierend auf Peptiden für die Erzeugung von CMV-spezifischen T-Zelllinien ex vivo wurde entwickelt (Hammer et al., Eur. J. Immunol. 2005, 35, 2250–2258). Dieses Protokoll basiert auf der kurzzeitigen Stimulation mit Peptidpoolbibliotheken, wobei die Peptide nahezu alle CD4+ und CD8+ T-Zellepitope eines gegebenen Proteins abdecken ( EP 1 257 290 B1 ).
He et al. (PLoS one 2011, Vol 6, e20107; WO2010/151517A2 ) zeigt murine T-Zellpräparationen, die von isolierten, naiven CD8+ T-Zellen abgeleitet sind, die in vitro, nach Isolierung, mit Antigenpeptiden in Gegenwart von dentritischen Zellen und hohen Konzentrationen an Rapamycin geprägt wurden. Die Machbarkeit dieses Ansatzes wurde kürzlich demonstriert (Brestrich et al., Am J Transplant, 2009). In vitro generierte, autologe CMV-spezifische T-Zellen wurden einem Patienten mit transplantierter Lunge verabreicht, der an einer schweren CMV-Krankheit litt, wobei der betreffende Patient CMV resistent gegen antivirale Medikamente war und langfristig künstlich beatmet werden musste. Die adoptiv transferierten T-Zellen beseitigten schnell die virale Infektion, und der Patient erholte sich innerhalb weniger Tage von der Beatmung, die über Monate hinweg notwendig gewesen war. 3 Wochen nach der T-Zellinfusion und vollständiger Genesung wurde der Patient aus der Klinik entlassen. Nach sieben Wochen erlitt der Patient einen unerwarteten Rückfall. Ähnliche Daten wurden bei zwei anderen Patienten beobachtet. Dies zeigt die Anwendbarkeit und das Potential dieses Ansatzes, da effiziente CMV-spezifische T-Zellen von schwerkranken Patienten erfolgreich gewonnen werden konnten. Gemäß den experimentellen Daten ist der Rückfall wahrscheinlich auf den spät differenzierten Phänotyp der verabreichten T-Zellen und damit ihrer unzureichenden Langlebigkeit in vivo zurückzuführen.
Die sogenannten Gedächtniszellen sind eine Population von Zellen, die wichtig für die Schaffung des Immungedächtnisses sind. Diese Population wurde weiter in Subpopulationen unterteilt, unter ihnen CD45RA-(negativ)CCR7-(negativ)Effektor-Gedächtnis-T Zellen (Tem)”, und CD45RA- CCR7+ zentrale Gedächtnis-T-Zellen (Tcm). Die Zellen, die zur Subpopulation der zentralen Gedächtnis-T-Zellen gehören, werden als kritisch für die Entstehung einer effektiven Immunantwort nach erneuter Konfrontation mit einem Antigen angesehen.
Spät differenzierte Effektor-Gedächtnis-T-Zellen haben eine starke Effektorfunktion, können aber aufgrund ihres eingeschränkten Proliferationspotential und ihres kurzen Überlebens nach erneuter Konfrontation kein langwirkendes Immungedächtnis etablieren. Im Gegensatz dazu haben früh differenzierte zentrale Gedächtnis-T-Zellen zwar eine geringe zytotoxische Effektorfunktion, aber dafür eine starke Proliferationsfähigkeit und eine lange Lebensspanne. Von zentralen Gedächtnis-T-Zellen wird erwartet, dass sie ein hervorragendes, nachhaltiges Anwachsen zeigen. Das Erreichen eines Gleichgewichts zwischen der Transplantationsfitness und einer starken antigenspezifischen Effektorfunktion könnte zu einem optimalen Therapieergebnis führen. Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, T-Zelllinien zur Verfügung zu stellen, die zu einem starken Anwachspotential nach adoptiven Transfer befähigt sind. Diese Aufgabe wird von den Verfahren und den Präparationen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Während der Experimente, die auf eine Verbesserung des Anwachsens und der Aktivität von adoptiv transferierten T-Zellen zielten, wurde überraschenderweise gefunden, dass partielles Blockieren des Interleukin-2(IL2)-Rezeptors oder Modifizieren des intrazellularen IL2-Signalweges durch partielle mTOR-Inhibition während der Expansionsphase von antigenspezifischen T-Zelllinien die antipathogen/tumorelle T-Zellantwort erheblich steigern, und vor allem einen früher Effektor-Gedächtnis-Zellphänotyp aufrecht erhalten, der als mit einer langlebigen, in vivo Wirksamkeit in Verbindung stehend beschrieben wurde.
Im vorliegenden Dokument bedeutet ”CD45RA” den Marker von humanen naiven T-Lymphozyten (PTPRC; Uniprot ID P07585; isoform A) und CCR7 bedeutet den humanen Chemokinrezeptor 7 (Uniprot ID P32248).
Wenn eine beliebige Zellpopulation als „positiv” in Bezug auf ein bestimmtes Markerprotein bezeichnet wird, bedeutet diese Bezeichnung, dass die besagte Zellpopulation mit einem gängigen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen das Markerprotein angefärbt werden kann und ein Fluoreszenzsignal mit einer Intensität ergibt, die verglichen mit unmarkierten Zellen oder Zellen, die mit dem gleichen Antikörper markiert wurden, aber üblicherweise nicht das besagte Markerprotein exprimieren, um mindestens eine Größenordnung höher ist.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung von T-Zellpräparationen zur Verfügung gestellt, die für mindestens ein Zielantigen spezifisch sind. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

– in einem Expansionsschritt werden lymphoide Zellen in vitro in Gegenwart eines oder mehrerer Zielantigene oder Peptidfragmente davon unter Erhalt einer ersten T-Zellpräparation expandiert; dann
– werden in einem Isolierungsschritt aus der ersten T-Zellpräparation ansprechende Zellen unter Erhalt einer zweiten T-Zellpräparation isoliert; dann
– werden in einem Kultivierungsschritt die Zellen, die als zweite T-Zellpräparation erhalten wurden, in Gegenwart eines Wachstum und Differenzierung von Immunzellen stimulierenden Zyotkins, insbesondere Interleukin 2 und/oder Interleukin 7, und entweder eines Inhibitors des mTor Komplexes 1, insbesondere Rapamycin oder ein Rapamycinanalogon, so wie etwa, als nicht beschränkendes Beispiel, SDZ-RAD (Everolimus), oder in Gegenwart eines Inhibitors der Interleukin-2(IL2)-Interleukin-2-Rezeptor(IL2R)-Interaktion (so wie etwa, als nicht beschränkendes Beispiel, ein Inhibitor der CD25-alpha-Kette wie etwa der monoklonale Antiköper, der als Basiliximab oder Daclizumab bezeichnet wird) kultiviert.

Reagierende Zellen im Sinne der Erfindung sind Zellen, die zumindest eine der Verbindungen Interferon gamma, Interleukin-2 oder Tumornekrosefaktor alpha sekretieren, oder Zellen, die CD137 oder CD40L nach Antigenstimulation (challenge) exprimieren.
Die T-Zellpräparation wird in Gegenwart eines Zytokins, z. B. IL-2 oder IL-7, kultiviert. Andere Beispiele sind IL-15 oder IL-21. Eine Kombination aus IL-2 und IL-7 ist bevorzugt.
In einer Ausführungsform werden im Isolierungsschritt die reagierenden Zellen auf Basis ihrer Interferon-gamma-Sekretion selektiert. Zellen, die positiv im Hinblick auf die IFNγ-Sekretion sind, sind in der zweiten T-Zellpräparation beinhaltet.
In einer Ausführungsform ist das Zielantigen CMV, insbesondere das immunodominante Antigen pp65 oder IE1 als vollständiges Peptid oder als Peptidbibliothek, die alle oder ausgewählte Epitope davon darstellt.
In einer Ausführungsform wird der Isolierungsschritt mittels magnetischer Separation der Zellen oder Durchflusszytometrie durchgeführt, z. B. aufgrund ihrer Bindung an einen Antikörper, der direkt oder indirekt an ein magnetisches Kügelchen („bead”) oder einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist. Der in den Beispielen verwendete Antikörper ist bivalent und erkennt ein Zyktokin (z. B. IFNγ, Interleukin 2, Tumornekrosefaktor alpha) und ein Zelloberflächenantigen (Zytokinsekretionsassay) oder befestigt sich direkt an die Oberfläche über die Aktivierungsmarker CD137 oder CD40L. Ein bivalenter Antikörper, der IFNγ und ein leukozytenspezifisches Oberflächenantigen wie etwa CD45 erkennt, ist bevorzugt. Das kommerziell erhältliche Kit (IFNγ-Sekretionsassay, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland) trennt die Zellen durch selektive Retention in einem Magnetfeld mittels eines Antikörpers, der an einem magnetischen Kügelchen befestigt ist. Der Antikörper bindet an das IFNγ, welches an der Zelloberfläche durch den bivalenten Antikörper befestigt ist.
In einigen Ausführungsformen liegt die Konzentration des Inhibitors des mTOR-Komplexes 1 zwischen 2 und 20 nmol/l. In einigen Ausführungsformen liegt die Konzentration des mTOR-Komplexes 1 zwischen 10 und 20 nmol/l. In einigen Ausführungsformen liegt die Konzentration des Inhibitors des mTOR-Komplexes 1 zwischen 5 und 10 nmol/l. In einigen Ausführungsformen liegt die Konzentration des Inhibitors des mTOR-Komplexes 1 zwischen 2 und 8 nmol/l. In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration des Inhibitors des mTOR-Komplexes 1 etwa 2, 4, 6, 8 oder 10 nmol/l. Alternativ wird ein Antikörperinhibitor der IL2-IL2R-Interaktion in einer Konzentration zwischen 2 und 20 μg/ml verwendet, bevorzugt zwischen 10 und 20 μg/ml.
Die Verwendung einer niedrigen oder sehr niedrigen Konzentration des Inhibitors des mTOR-Komplexes 1 führt zu einer signifikant besseren CD4+ Funktionsfähigkeit in der resultierenden T-Zellpräparation. Die verbesserte CD4+ Funktionsfähigkeit führt zu einer verbesserten Proliferation der zentralen CD4+ Gedächtniszellen, welches in einer allgemein verstärkten langfristigen T-Zellantwort inklusive der CD8+ Antwort resultiert. Niedrige Rapamycinkonzentrationen verhindern auch das Überwachsen der T-Zellpräparation durch CD8+ T-Zellen. Die aus dem Stand der Technik bekannten Präparationen (vgl. He et al.) betonen den Effekt von hohen Rapamycinkonzentrationen auf die kurzfristige CD8+ Funktionsfähigkeit, ohne die Nachteile zu berücksichtigen, die aus einer Funktionslosigkeit der CD4+ (Zellen) resultieren, welche sich wiederum aus hohen Rapamycinkonzentrationen während der Kultivierung ergibt.
In einigen Ausführungsformen ist der Inhibitor der IL2-IL2R-Interaktion ein monoklonaler Antikörper, der gegen die alpha-Kette des IL2R-Komplexes, CD25, gerichtet ist, insbesondere Daclizumab oder Basiliximab.
In einigen Ausführungsformen sind die lymphoiden Zellen periphere, mononukleare Zellen des Vollbluts, welche von einem menschlichen Patienten erhalten wurden.
In einigen Ausführungsformen dauert der Kultivierungsschritt zwischen 10 und 25 Tage, insbesondere zwischen 15 und 21 Tage, insbesondere etwa 18 Tage.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine T-Zellpräparation durch ein Verfahren gemäß dem oben stehenden Aspekt der Erfindung in einer beliebigen seiner Ausführungsformen zur Verfügung gestellt. Diese T-Zellpräparation unterscheidet sich in ihrer Zusammensetzung von vorher beschriebenen Präparationen insbesondere dadurch, dass die Zellen, die die T-Zellpräparation bilden, auf die Sekretion von IFNγ, Interleukin 2 oder Tumornekrosefaktor alpha oder auf die Expression von CD137 oder CD40L nach Antigenstimulierung selektiert wurden und in Gegenwart eines Inhibitors des mTOR-Komplexes 1 oder des IL2-Signalweges kultiviert oder propagiert wurden, um das CD4/CD8- und das zentrale Gedächtnis-/Effektor-Gedächtnis-T-Zellrepertoire im Vergleich zu Präparationen signifikant zu verschieben, die entweder in vivo, ohne Inhibitorbehandlung oder ohne vorherige Stimulation oder Selektion erhalten werden.
In einigen Ausführungsformen ist das Verhältnis von Zellen, die CD 8 exprimieren, zu Zellen, die CD4 exprimieren, kleiner als (<) 6. In einigen Ausführungsformen ist es < 5. In einigen Ausführungsformen ist es < 4,5. In einigen Ausführungsformen ist innerhalb der Prärparation das Verhältnis von Zellen, die CD8 exprimieren, zu Zellen, die CD4 exprimieren, etwa 4.
In einigen Ausführungsformen ist die Präparation durch einen prozentualen Anteil an CD45RA- und CCR7+-Zellen (in Bezug auf alle CD4 oder CD8 positiven Zellen) von größer als (>) 10% charakterisiert. In einigen Ausführungsformen ist es > 15%. In einigen Ausführungsformen ist die Präparation durch einen prozentualen Anteil von CD45RA- und CCR7+-Zellen von > 20% charakterisiert.
In einigen Ausführungsformen ist das Verhältnis von CD4+, CCR7- und CD45RA-(CM)-Zellen zu CD4+, CCR7- und CD45RA-(EM)-Zellen > 3. In einigen Ausführungsformen ist das Verhältnis von CD8+, CCR7- und CD45RA-(CM)-Zellen zu CD8+, CCR7- und CD45RA-(EM)-Zellen > 1.
In einigen Ausführungsformen ist der prozentuale Anteil von Zellen, die CD4+, CCR7+ und CD45RA-(CM/zentrale Gedächtniszellen), berechnet in Bezug auf die Summe der CD4+ Zellen und CD8-Zellen innerhalb der Kultur, > 15%. In einigen Ausführungsformen ist dieser Anteil > 20%. In einigen Ausführungsformen ist dieser Anteil ≥ 25%.
In einigen Ausführungsformen ist das Verhältnis (prozentualer Anteil) der CD8+, CCR7+ und CD45RA-(CM)-Zellen, in Bezug auf die CD4+ Zellen und die CD8+ Zellen innerhalb der Kultur, > 5%. In einigen Ausführungsformen ist es > 7,5%. In einigen Ausführungsformen ist es > 9%.
Die Bereitstellung einer T-Zellpräparation mit einem relativ hohen Anteil von CD4 exprimierenden zentralen Gedächntniszellen ist von großem Wert für jedwede ihrer Anwendungen, insbesondere zur Behandlung der CMV-Krankheit durch adoptiven Transfer der T-Zellpräparation.
In einigen Ausführungsformen exprimiert eine Hauptfraktion von Zellen innerhalb der T-Zellpräparation CCR7 und CD62L und weist eine ausgedehnte CD127-Expression während der ersten 2, 3, 4, 5 oder 6 Tage des Kultivierungsschritts auf.
Der IFNγ-Fangassay (capture assay) lieferte CD4+ T-Zellen, die vorwiegend einen naiven T-Zell- und einen zentralen Gedächtnis-T-Zellphänotyp aufweisen, die isolierten CD8+ T-Zellen jedoch zeigten einen naiven T-Zell-, Effektorgedächtnis-T-Zell-(TEM) und terminal differenzierten Gedächtnis-T-Zell-(TEMRA)-Phänotyp. Sowohl TEMRA- als auch TEM-Zellen sekretierten das meiste IFNγ.
In einigen Ausführungsformen ist die Präparation dadurch charakterisiert, dass sie einen Anteil von Zellen, die sowohl IFNγ, als auch TNF-alpha und IL2 exprimieren, von größer als (>) 10 besitzt (bezogen auf alle CD4 oder CD8 positiven Zellen der Präparation). Daten sind in 11 gezeigt.
Wo immer hier Ausführungsformen in Bezug auf Details eines besonderen Merkmals oder einer Reihe von Merkmalen beschrieben werden, ohne alle Merkmale der Erfindung bis ins letzte Detail zu beschreiben, können diese Ausführungsformen kombiniert werden, um besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu schaffen. Dementsprechend ist eine Ausführungsform einer Präparation (präpariert durch ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung) durch die Merkmale charakterisiert, dass

– das Verhältnis von Zellen, die CD8 exprimieren, zu Zellen, die CD4 exprimieren, (CD8:CD4) innerhalb der Präparation kleiner als (<) 6 ist, und
– das Verhältnis von CD4+, CCR7+ und CD45RA-Zellen (CM) zu CD4+, CCR7- und CD45RA-Zellen (EM) > 3 ist; und
– das Verhältnis von CD8+, CCR7+ und CD45RA-Zellen (CM) zu CD8+, CCR7- und CD45RA-Zellen (EM) > 1 ist; und
– der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen, in Bezug auf die Summe von CD4 und CD8 positiven Zellen der Präparation, größer als (>) 10% ist, und der prozentuale Anteil an Zellen, die sowohl IFNγ als auch TNFα und IL2 exprimieren, größer als (>) 10% ist.

In einer anderen Ausführungsform,

– ist das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation < 5, und
– ist das Verhältnis von CD4+CM-Zellen zu CD4+EM-Zellen > 3; und
– ist das Verhältnis von CD8+CM-Zellen zu CD8+EM-Zellen > 1; und
– ist der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen, in Bezug auf die Summe von CD4 und CD8 positiven Zellen der Präparation, > 20%, und der prozentuale Anteil an Zellen, die sowohl IFNγ als auch TNFα und IL2 exprimieren, größer als (>) 10%.

In einer anderen Ausführungsform,

– ist das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation < 4,5, und
– ist das Verhältnis von CD4+CM-Zellen zu CD4+EM-Zellen > 3; und
– ist das Verhältnis von CD8+CM-Zellen zu CD8+EM-Zellen > 1; und
– ist der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen, in Bezug auf die Summe von CD4 und CD8 positiven Zellen der Präparation, > 20%, und der prozentuale Anteil an Zellen, die sowohl IFNγ als auch TNFα und IL2 exprimieren, größer als (>) 10%.

In einer anderen Ausführungsform,

– ist das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation etwa 4, und
– ist das Verhältnis von CD4+CM-Zellen zu CD4+EM-Zellen > 3; und
– ist das Verhältnis von CD8+CM-Zellen zu CD8+EM-Zellen > 1; und
– ist der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen, in Bezug auf die Summe von CD4 und CD8 positiven Zellen der Präparation, > 20%, und der prozentuale Anteil an Zellen, die sowohl IFNγ als auch TNFα und IL2 exprimieren, größer als (>) 10%.

In einer anderen Ausführungsform ist die Zellpräparation der Erfindung durch die Merkmale charakterisiert, dass

– das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation < 6 ist, und
– der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen größer als (>) 10% ist, und
– der prozentuale Anteil an CD4+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 15% ist; und
– der prozentuale Anteil an CD8+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 7% ist, wobei jeder der prozentualen Anteile in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen innerhalb der Präparation berechnet wird.

– das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation < 5 ist, und
– der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen > 20%, und
– der prozentuale Anteil an CD4+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 15% ist; und
– der prozentuale Anteil an CD8+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 7% ist, wobei jeder der prozentualen Anteile in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen innerhalb der Präparation berechnet wird.

– das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation < 4,5 ist, und
– der prozentuale Anteil an CD45RA- und CCR7+ Zellen > 20% ist, und
– der prozentuale Anteil an CD4+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 15% ist; und
– der prozentuale Anteil an CD8+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 7% ist, wobei jeder der prozentualen Anteile in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen innrhalb der Präparation berechnet wird.

– das Verhältnis von CD8:CD4 innerhalb der Präparation etwa 4 ist, und
– der prozentuale Anteil der CD45RA- und CCR7+ Zellen > 15% ist, bevorzugter > 20%, und
– der prozentuale Anteil der CD4+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 15% ist; und
– der prozentuale Anteil der CD8+, CCR7+ und CD45RA-(CM)Zellen > 7% ist, wobei jeder der prozentualen Anteile in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen berechnet wird.

Die erfindungsgemäße T-Zellpräparation kann als Arzneimittel verwendet werden, insbesondere zur Verwendung in der Prophylaxe oder der Theraphie von Infektionskrankheiten oder Krebs. Die hier zur Verfügung gestellte T-Zellpräparation ist von besonderem Nutzen bei Patienten, die sich einer Transplantation eines soliden Organs unterziehen oder unterzogen haben, und insbesondere in der Prophylaxe oder Therapie von Infektionskrankheiten oder Krebs.
Einer Reihe von Tumorentitäten wurden charakteristische Antigenen zugeordnet, das maligne Melanom ist ein Beispiel. Das Verfahren und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung werden für Patienten von Nutzen sein, die an solchen Tumorentitäten leiden. Besondere Vorteile werden in virusassoziierten Tumorindikationen bereitgestellt. Epstein-Barr-Virus-(EBV)-assoziiertes Lymphom, wie etwa die Posttranplantations-lymphoproliferative Erkrankung (PTLD) in immungeschwächten Patienten, ist ein typisches Beispiel. Adoptiver Transfer von EBV-spezifischen Zellen bekämpft erfolgreich PTLD in therapeutischen oder präventiven Ansätzen. Jedoch wurde, ähnlich zur CMV-spezifischen adoptiven T-Zelltherapie, eine langfristige Wirksamkeit nur in etwa 50% der Transplantationspatienten beobachtet. Phänotypische Analysen ergaben eine Dominanz des späten Tem-Phänotyps innerhalb der T-Zellprodukte und legen einen Bedarf für die Anreicherung von langlebenden Tcm-Zellen nahe, um die langfristigen Wirkungen in allen Patienten zu verbessern.
Eine pharmazeutische Zubereitung wird ebenso für die Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Infektionskrankheiten oder Krebs zur Verfügung gestellt, wobei die Zubereitung eine T-Zellpräparation gemäß einem der oben beschriebenen Ausführungsformen und einen akzeptablen Arzneistoffträger, Hilfstoff, Medium oder Verdünnungsmittel umfasst.
Ebenso wird ein Verfahren zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder Krebs bereitgestellt, wobei das Verfahren die Präparation und die Gabe einer erfindungsgemäßen T-Zellpräparation an einen derer bedürftigen Patienten umfasst.
Die beeindruckenden Effekte, die in den Figuren und Beispielen beschrieben sind, demonstrieren den Nutzen der partiellen Blockade des IL2-Rezeptors durch einen Antagonisten der alpha-Kette des Rezeptors während der Expansionsphase der Kultur, welche die antivirale T-Zellantwort stark erhöht und einen frühen Effektor/Gedächtnis-Phänotyp aufrechterhält, ohne die klonale Expansion signifikant zu beeinträchtigen. Die Modifizierung des IL2-Signalweges durch intrazellulare mTOR-Inhibition („mammalian target of Rapamycin”, Gene ID: 2475) resultierte in einem vergleichbaren Ergebnis, wobei die partielle Modifikation des IL-2 Signalweges als verantwortlich für diesen Effekt identifiziert wurde. Daher führt entweder die intrazellulare IL2-Signalwegmodifizierung oder die partielle Inhibition der Ligandenbindung (Blockierung eines der drei Rezeptoreinheiten) zu diesem Effekt. Die Qualität und Lebensdauer der CD4+ vermittelten CD8+ T-Zellantworten wurden signifikant erhöht. Die Wirkstoffdosis von Sirolimus (Rapamycin) darf 20 nM nicht übersteigen, da sonst der Effekt gegenläufig ist. Die Konzentration von Daclizumab (Simulect), als Modellsubstanz für einen IL2-Rezeptorantagonisten, darf 20 μg/ml nicht übersteigen. Klinische Materialien sind verfügbar, daher ist die Erzeugung von autologen TCM ein erreichbarer klinischer Ansatz. Sowohl Sirolimus als auch der IL-2-Rezeptorantagonist sind zur klinischen Verwendung (Immunsuppression) zugelassen, welches ihre Verwendung möglich macht. Titrationsexperimente wurden mit der hohen/normalen Arzneimitteldosierung durchgeführt, die in der Klinik verwendet wird, und zeigten immunsuppressive Eigenschaften, bei der das T-Zellwachstum vollständig inhibiert wurde. Die behandelten T-Zelllinien wiesen eine statistisch signifkant verlängerte Expression der Zelloberflächenmarker CD127, CCR7 und CD62L auf, was einen spezifischen Phänotyp von zentralen Gedächtniszellen charakterisiert. Ein spezielles Merkmal der zentralen Gedächtnis-T-Zellen ist die Fähigkeit, große Mengen an IL-2 nach Antigenstimulation zu sekretieren. In vivo ist dies entscheidend für ihre autokrine Aktivierung, was in Proliferation resultiert. Verglichen mit unbehandelten Proben weisen die erzeugten T-Zelllinien bei der Effektorzytokinsekretion eine signifikant höhere IL-2-Sekretion nach Stimulation auf. In diesem experimentellen Rahmen steigerten sowohl Daclizumab als auch Sirolimus die Quantität und die Qualität von virusspezifischen T-Zellen in vitro. Die erzeugten T-Zelllinien zeigten eine dosisabhängige, spezifische Lyse von peptidbeladenenen Zielen und eine gesteigerte Zytokinsekretion. Die Inhibition glich vor allem das CD4/CD8 Verhältnis aus, was nachfolgend zu einer überragenden antiviralen CD8-Antwort in vitro führt. Sowohl die Behandlung mit Daclizumab als auch mit Sirolimus erhöhte den CD4+-T-Zellanteil in der Kultur, welches in einer starken antigenspezifischen CD8+-T-Zelleffektorantwort resultierte. Beachtenswert ist, dass die behandelten CMV-spezifischen T-Zellen keine Unterschiede in der spezifischen Zielzelllyse aufweisen, was einen negativen Einfluss der Arzneimittel auf deren Funktionsfähigkeit ausschließt. Diese Untersuchung zeigt eine neue, potente Strategie zur Erzeugung von antigenspezifischen T-Zellen mit einer hohen funktionalen Leistungsfähigkeit und einer eventuell widerstandsfähigen, langfristigen Persistenz in vitro.
Wie hier bestimmt, definiert der Begriff Rapamycin” eine Klasse von immunsuppressiven Verbindungen, die den grundlegenden Rapamycinkern, charakterisiert durch eine Formel I:
enthalten.
Die Rapamycine dieser Erfindung beinhalten Verbindungen, welche als Derivate des Rapamycinkerns unter Beibehaltung der immunsupressiven Eigenschaften chemisch oder biologisch modifziert sein können.
Dementsprechend beinhaltet der Begriff „Rapamycin” Ester, Ether, Oxime, Hydrazone und Hydroxylamine des Rapamycins, so wie Rapamycine, in welchen funktionelle Gruppen des Rapamycins modifiziert wurden, zum Beipiel durch Reduktion oder Oxidation. Der Begriff ”Rapamycin” beinhaltet auch pharmazeutisch zulässige Salze von Rapamycinen, die aufgrund eines enthaltenen sauren oder basischen Restes fähig sind, solche Salze zu bilden.
Es ist bevorzugt, dass die Ester und Ether von Rapamycin von den Hydroxylgruppen an Position 42 und/oder der Position 42 des Rapamycinkerns, Ester und Ether von der Hydroxylgruppe an Position 27 (nach chemischer Reduktion der 27-Ketons), und dass die Oxime, Hydrazone und Hydroxylamine von dem Keton an Position 42 (nach Oxidation der 42-Hydroxylgruppe) und von dem 27-Keton des Rapamycinkerns gebildet werden.
Bevorzugte 42- und/oder 31-Ester und Ether von Rapamycin sind in den folgenden Patenten offenbart, welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind: ( US 4,316,885 ); Aminoalkylester ( US 4,650,803 ); fluorierte Ester ( US 5,100,883 ); Aminoester ( US 5,130,307 ); Aminodiester ( US 5,162,333 ); Aminoalkanester ( US 5,389,639 ); Amidester ( US 5,118,677 ); Silylester ( US 5,120,842 ); Actetale ( US 5,51,413 ); Sulfonate und Sulfatester ( US 5,177,203 ); Ester ( US 5,221,670 ); Alkoxyester ( US 5,233,036 ), O-Aryl, -Alkyl, -Alkenyl and -Alkynylether ( US 5,258;3899 , Carbonatester ( US 5,260,300 ); Arylcarbonyl- und Alkoxycarbonylcarbamate ( US 5,262,423 ); Hydroxyester ( US 5,362,718 ); gehinderte Ester ( US 5,385,908 ); heterocyclische Ester ( US 5,385,909 ); GEM(Gaussian Electrostatic Model)-verteilte Ester ( US 5,385,910 ); Phosphorylcarbamatester ( US 5,391,730 ); Amidinocarbamatester ( US 5,463,048 ); Carbamate ( US 5,302,584 ); Carbamatester ( US 5,411,967 ; US 5,434,260 ; US 5,480,988 ; US 5,480,989 ; US 5,489,680 ; US 5,118,678 ); gehinderte N-Oxidester ( US 5,491,231 ), Biotinester ( US 5,504,091 ); O-alkylether ( US 5,665,772 ); und PEG-Ester von Rapamycin ( US 5,780,462 ). Die Herstellung dieser Verbindungen ist in den oben aufgelisteten Patenten offenbart.
Demfolgend beinhalten Beispiele von Rapamycin Verbindungen, die durch die allgemeine Formel II
wobei R^A und R^B jeweils aus Wasserstoff und Estern von etherbildenden Gruppen ausgewählt sind, die in einem der zuvorgenannten Patente offenbart sind.
Bevorzugte 27-Ester und Ether von Rapamycin sind in US 5,256,790 offenbart, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die Präparation dieser Ester und Ether ist im zuvorgenannten Patent offenbart.
Bevorzugte Oxime, Hydrazone und Hydroxylamine von Rapamycin sind in US 5,373,014 , US 5,378,836 , US 5,023,264 und US 5,563,145 offenbart, welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Präparation dieser Oxime, Hydrazone und Hydroxylamin ist in den oben aufgelisteten Patenten offenbart. Die Präparation des 42-Oxorapamycins ist in US 5,023,263 offenbart, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Insbesondere beinhalten bevorzugte Rapamycine Rapamycin ( US 3,929,992 ), Rapamycin-42-ester mit 3-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-2-methylpropionsäure ( US 5,362,718 ) und 42-O-(2-Hydroxyl)ethylrapamycin ( US 5,665,772 ).
Soweit anwendbar, können pharmazeutische annehmbare Salze aus organischen oder anorganischen Säuren gebildet werden, zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Äpfelsäure, Phtalsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Naphtalinsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Camphersulfonsäure und ähnliche bekannte annehmbare Säuren, sofern Rapamycin eine geeigneten basischen Rest enthält. Salze können auch von organischen oder anorganischen Basen gebildet werden, wie etwa Alkalimetallsalze (zum Beispiel Natrium, Lithium oder Kalium), Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze, Alkylammoniumsalze, welche 1 bis 6 C-Atome enthalten, oder Dialkylammoniumsalze, welche 1 bis 6 C-Atome in jeder Alkylgruppe enthalten und Trialkylammoniumsalze, welche 1 bis 6 C-Atome in jeder Alkylgruppe enthalten, wenn Rapamycin einen geeigneten sauren Rest enthält.
Bevorzugte Inhibitoren von mTOR sind:

– Sirolimus (CAS Nummer 53123-88-9), auch bekannt als Rapamycin,
– Everolimus (IIIa; CAS Nummer 159351-69-6), welches ein 40-O-(2-Hydroxylethyl)derivativ von Rapamycin ist,
– Temsirolimus (IIIb; CAS nummer 162635-04-3)

Bevorzugte Antikörper zur Inhibition der alpha-Kette des IL-2-Rezeptorkomplexes (Gene ID: 3559) sind:

– Daclizumab (CAS Nummer 152923-59-3), ein humanisierter, monoklonaler Antikörper,
– Basiliximab, (DrugBank Eintrag DB00074), ein monoklonaler, chimerer Maus-Mensch-Antikörper.

Gene ID Nummern in diesem Dokument beziehen sich auf Einträge in der Gendatenbank des United States National Center for Biotechnology Information.
Beispiele
Versuchsaufbau
Die Protokolle für Expansion und Selektion folgen den Techniken, die in WO2009/053109 veröffentlicht wurden.
CMV-spezifische T-Zellen wurden unter Gebrauch einer zuvor beschriebenen Technik (Becker et al., Nat. Med. 2001, 7, 1159–62) angereichert und expandiert. Kurz gesagt wurden 4 × 10⁷ autologe PBMCs für 6 h mit 1 μg/ml überlappendem humanen Cytomegalovirusphosphoprotein 65 (pp65) und Peptidpoolen des immediately early 1 Proteins (IE1) (JPT Peptide Technologies) stimuliert. Die Poole bestanden aus 15-meren Peptiden, die eine Überlappung von 10 Aminosäuren aufwiesen, und wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. IFNγ produzierende Zellen wurden einer positiven Selektion durch das IFNγ capture-system (Miltenyi Biotech) gemäß Herstellerprotokoll unterzogen. Danach wurden IFNγ+ Zellen für 18 Tage in 24-Lochplatten zusammen mit 10⁷ bestrahlten autologen PBMCs unter Verwendung von RPMI 1640 inkubiert, welches mit 10% fetalem Kälberserum 1% Penicillin/Streptomycin (Biochrom) und 50 U/mL rIL2 (Chiron) und 10 ng/mL rIL7 (Cellgenix) oder einzeln, wenn anderswo angegeben, ergänzt war. Wo angegeben, wurden entweder der mTor-inhibitor (Sirolimus, Sigma-Aldrich) in sehr niedrigen Dosen (very low dose, VLD, 2 nM) und niedrigen Dosen (low dose, LD, 20 nM) oder der IL-2-Rezeptorantagonist (Basiliximab, Simulect, Novartis) mit 20 μg/ml von Tag 1 an alle zwei Tage zusammen mit nachfolgender Medienergänzung zugegeben.
Erfassung der zytotoxischen Aktivität
Differenzierte Monozyten, die mit dem CMV-verwandten Laborwildtypstamm NEWT infiziert waren, wurden als Zielzellen genutzt. Um eine CMV-Infektion zu imitieren, wurden autologe LCL mit 1 μg/ml des überlappenden CMVpp65/IE-1-Peptidpools gepulst, wohingegen ungepulste LCL nicht infizierte Zielzellen darstellten. Zielzellen wurden mit 10 μM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFDA-SE, Molecular Probes) markiert. Als Kontrolle wurden ungepulste LCL und nicht infizierte differenzierte Monozyten (Fibroblast inkubiert) mit 5 μM Dimethyldodecylamineoxidsuccinimidylester (Far Red; Invitrogen) markiert. Die Zellen wurden für 16 h in einem T-Zell/Ziel-Verhältnis von 10:1 co-kultiviert. Die Proben wurden dreifach unter Verwendung eines LSR-II Durchflusszytometers analysiert. Proben ohne T-Zellen, die nur APC (Gepulste/NEWT oder Ungepulste) enthielten, stellten die interne Kontrolle dar. Die Analyse war auf Zellen beschränkt, die negativ auf einen lebend/tot-Diskriminierungsfarbstoff (near-IR fluorescent reactive dye, Invitrogen) reagierten. Das durchschnittliche prozentuale Überleben der gepulsten oder NEWT-infizierten Ziele wurde relativ zu antigenungepulsten Kontrollen berechnet. Die prozentuale lytische Aktivität der Ziellyse wurde wie folgt berechnet: prozentuales durchschnittliches Überleben der Ziele in den Kulturen, welche eine definierte Anzahl an Effektor-T-Zellen enthielten, im Vergleich zur Kontrolle ohne T-Zellen, vgl. auch I. F. Hermans et al., Journal of immunological methods 285, 25 (Feb 1, 2004).
Intrazellulare Zytokinfärbung
Nach der antigenspezifischen Stimulation wurden die Zytokinsekretion (IFNγ, TNFα und IL-2) und die Expression von Aktivierungsmarkern (CD137 und CD154) durch intrazellulare Fluorezenzfärbung bestimmt. Alle Antikörper wurden von Becton Dickinson (BD) erworben, außer anders angegeben. Virusinfizierte Monozyten und peptidpoolbeladene LCL oder Monozytee (1 μg/mL IE-1/pp65) wurden zu T-Zellen im Verdünnungsverhältnis von 1:10 zugegeben. Ungepulste LCL oder Monozyten (DMSO inkubiert) stellten die unstimulierte Kontrolle dar. Für die Effektorzytokindetektion wurden kultivierte T-Zellen für 18 h in Gegenwart von 1 μg/mL Brefeldin A (Sigma-Aldrich) restimuliert. Für die CD107a(H4A3)-Detektion wurden 2 μmol/l Monensin (Golgi Stop, BD) zusätzlich zugegeben. Die Zellen wurden dann geerntet, und der Phänotyp wurde mit monoklonalen Antikörpern für die Oberflächenmarker CD3 (UCHT1, eBioscience), CD8 (3B5, Invitrogen) und CD4 (SK3) gefärbt. Um den Gedächtnisphänotypen zu bestimmen, wurden T-Zellen extrazellular für CCR7 (#150503, R&D), CD62L (DREG56, Beckman Coulter), CD45RA (2H4LDH11LDB9, Beckman Coulter) und CD127 (hIL-7R-M21) gefärbt. Um tote Zellen auszuschließen, wurde ein lebend/tot-Diskriminierungsfarbstoff (Invitrogen) zugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit einer Perm2-Lösung (BD Biosciences) permeabilisiert und für IFNγ (4S.B3, eBiosciences), TNFα (MAb11), IL-2 (MQ1-17H12), CD137 (4B4-1) und CD154 (TRAP1) angefärbt. Um regulatorische T-Zellen zu bestimmen, wurden die T-Zellen intrazellular für Foxp3 (259D/C7) und Helios (22F6, BioLegend) angefärbt. Für die intrazellulare Anfärbung von Foxp3 und Helios wurde das „Foxp3 staining kit” von eBioscience benutzt. Die Zellen wurden mit einem LSR-II Durchflusszytometer gemesssen und unter Verwendung der FlowJo Version 8 software (Tree Star) analysiert. Lymphozyten wurden aufgrund des Vorwärtstreuung (FSC) versus Seitenstreuung (SSC) Profiles abgegrenzt und anschließend aufgrund des FSC (Höhe) versus FSC abgegrenzt, um Dubletten auszuschließen.
Durchflusszytometrische Analyse
Nach der antigenspezifischen Stimulation wurden die Zytokinsekretion (IFNγ, TNFα und IL-2) und die Expression von Aktivierungsmarkern (CD137 und CD154) durch intrazellulare Fluorezenzfärbung bestimmt. Alle Antikörper wurden von Becton Dickinson (BD) erworben, außer anders angegeben. Virusinfizierte Monozyten und peptidpoolbeladene LCL oder Monozyten (1 μg/mL IE-1/pp65) wurden zu T-Zellen im Verdünnungsverhältnis von 1:10 zugegeben. Ungepulste LCL oder Monozyten (DMSO inkubiert) stellten die unstimulierte Kontrolle dar. Für die Effektorzytokindetektion wurden kultivierte T-Zellen für 18 h in Gegenwart von 1 μg/mL Brefeldin A (Sigma-Aldrich) restimuliert. Für die CD107a(H4A3)-Detektion wurden 2 μmol/l Monensin (Golgi Stop, BD) zusätzlich zugegeben. Die Zellen wurden dann geerntet, und der Phänotyp wurde mit monoklonalen Antikörpern für die Oberflächenmarker CD3 (UCHT1, eBioscience), CD8 (3B5, Invitrogen) und CD4 (SK3) gefärbt. Um den Gedächtnisphänotypen zu bestimmen, wurden T-Zellen extrazellular für CCR7 (#150503, R&D), CD62L (DREG56, Beckman Coulter), CD45RA (2H4LDH11LDB9, Beckman Coulter) und CD127 (hIL-7R-M21) gefärbt. Um tote Zellen auszuschließen, wurde ein lebend/tot-Diskriminierungsfarbstoff (Invitrogen) zugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit einer Perm2-Lösung (BD Biosciences) permeabilisiert und für IFNγ (4S.B3, eBiosciences), TNFα (MAb11), IL-2 (MQ1-17H12), CD137 (4B4-1) und CD154 (TRAP1) angefärbt. Um regulatorische T-Zellen zu bestimmen, wurden die T-Zellen intrazellular für Foxp3 (259D/C7) und Helios (22F6, BioLegend) angefärbt. Für die intrazellulare Anfärbung von Foxp3 und Helios wurde das „Foxp3 staining kit” von eBioscience benutzt. Die Zellen wurden mit einem LSR-II Durchflusszytometer gemesssen und unter Verwendung der FlowJo Version 8 software (Tree Star) analysiert. Lymphozyten wurden aufgrund des Vorwärtstreuung (FSC) versus Seitenstreuung (SSC) Profiles abgegrenzt und anschließend aufgrund des FSC (Höhe) versus FSC abgegrenzt, um Dubletten auszuschließen.
Andere Antigen oder Epitope, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, beinhalten, als nicht beschränkendes Beispiel, Antigene des Ebstein-Barr-Virus (EBV), des humanen Papillomavirus (HPV), des humanen Immunodefizienzvirus (HIV) oder tumorassozieerte Antigene wie etwa WT1, PAX2/8, Tyrosinase und/oder MAGE.
Daher beschränkt sich die vorliegende Erfindung nicht auf CMV-spezifische T-Zellen, sondern richtet sich auf ein allgemeines Verfahren zur Bereitstellung von pathogenspezifischen Zellpräparationen zur medizinischen Verwendung.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1 zeigt die CD4+ und CD8+ Expression (A) und den Anteil an zentralen Gedächtnis-T-Zellen innerhalb CD4+ (linke Tafel) und CD8+ (rechte Tafel) (B) von CMV-antigenspezifischen T-Zellen nach 18 Tagen Expansion in Gegenwart von Rapamycin (VLD = 2 nM, LD = 20 nM; Sirolimus (Rapamycin)).
2 zeigt die CD4+ und CD8+ Expression (A) und den Anteil an zentralen Gedächtnis-T-Zellen innerhalb CD4+ (linke Tafel) und CD8+ (rechte Tafel) (B) der CMV-antigenspezifischen T-Zellen nach 18 Tagen Expansion in Gegenwart von aIL-2R (aIL-2R = IL-2-Rezeptorantagonist).
3 zeigt die spezifische Zielzelllyse der behandelten CMV-spezifischen T-Zellen.
4 zeigt eine zytometrische Erfassung der Expression von CD4+ und CD8+ in T-Zellen nach 18 Tagen Expansion unter der angegebenen Behandlung (A; VLD, LD = Sirolimus (Rapamycin); B; aIL-2R = IL-2-Rezeptorantagonist) und die Expansionsfaktoren der Gesamtkultur (C) und TCM (D) nach 18 Tagen Behandlung.
5 (A Sirolimus, B aIL-2R) zeigt die funktionale Charakterisierung von CMV-spezifischen expandierten T-Zellen an Tag 18 (A; VLD, LD = Sirolimus (rapamycin), B; aIL-2R = IL-2-Rezeptorantagonist; unstim: unstimulierte Kontrollen).
6 (A, B: Sirolimus; C, D: aIL-2R) zeigt die phänotypische Charakterisierung (A, C: linke Tafel; CD4+ CD62L+/ und rechte Tafel; CD8+ CD62L+ Expression und B, D: Aktivierungsmarkerexpression; linke Tafel; CD4+ CD137+ CD154+ und rechte Tafel; CD8+ CD137+) der CMV-spezifischen expandierten T-Zellen an Tag 18. Alle prozentualen Anteile beziehen sich auf die Gesamtsumme der CD4 und CD8 Zellen.
7 Gesamtkultur (zugleich CD4+ und CD8+), einzelne CD4+ und einzelne CD8+ T-Zellen wurden getrennt für 18 Tage kultiviert. (A) Histogramme kennzeichnen die Menge an CD4+ T-Zellen in der jeweiligen Probe. Die Analyse der CD8+ T-Zellen (obere Tafel) und CD8+ T-Zellen der Gesamtkultur (untere Tafel) wurde ohne weitere Zugabe von CD4+ T Zellen und Gradientenergänzung von CD4+ T-Zellen vor spezifischer Restimulation durchgeführt (aufsteigender Balken bedeutet wachsende CD4+ T-Zellmenge). (B) IFNγ- und TNFα-Zytokinsekretion und (C) Expressionen der CD137 und CD154 Aktivierungsmarker wurden durch intrazellulare Färbung bestimmt. Gezeigt ist die Funktionsfähigkeit der CD8+ T-Zellen (obere Tafel) und CD8+ T-Zellen innerhalb der Massenkultur (untere Tafel), welche durch Gradientenergänzung von CD4+ T Zellen modifiziert wurde.
8 Modifizieren des IL-2-Rezeptorsignalweges durch Beinflussung der IL-2-Rezeptorbindung oder den mTor-Weg ermöglicht eine bessere, schützende CD4-vermittelte CD8+ T-Zellimmunität. Die Figur zeigt die Fähigkeit von CMV-peptidpoolspezifischen T-Zellen, die entweder mit Sirolimus oder einem IL-2-Rezeptorantagonisten expandiert wurden, überragend auf NEWT-infizierte, autologe Monozyten zu reagieren. Nach spezifischer Stimulation wurden die IFNγ- und TNFα-Zytokinsekretion (obere Tafel) und die Expression der Aktivierungsmarker CD137 und CD154 (untere Tafel) durch intrazellulare Färbung bestimmt.
9 zeigt die zytometrische Messung zur Erfassung regulatorischer T-Zellen mit den spezifischen Markern FoxP3 und Helios.
10 zeigt eine Zusammenfassung von sechs unabhängigen Experimenten, die die polyfunktionalen (IFNγ+, TNFα+, IL-2+), antigenspezifischen T-Zellantworten gegen CMVpp65/IE1-Peptidpool-gepulste LCL zeigen. Die jeweilige Inhibitorbehandlung ist gekennzeichnet. Häufigkeiten wurden mit Durchflusszytometrie erfasst.
11 zeigt die IFNγ T-Zellantworten nach ex vivo CMV-Peptidstimulation und die Häufigkeiten und Reinheiten des IFNγ capture assay für jeweils CD4+ und CD8+ T-Zellen.
12 zeigt eine zytometrische Erfassung der CD62L Expression auf CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen. CD4+ T-Zellen helfen, die antivirale CD8+-T-Zellantwort zu verbessern. Das targeting auf den IL-2 Signalweg bewahrte die CD62L Expression auf expandierten CMV-spezifischen CD4+ T-Zellen. Isolierte CMV-spezifische CD4+/CD8+ T-Zellen wurden getrennt mit Rapamycin (LD) oder aIL-2Ra kultiviert. In allen Graphiken ist jeweils ein repräsentatives Experiment von drei Experimenten gezeigt.
13 zeigt die Abhängigkeit der in vitro erzeugten T_CM-Zellen von Wachstumsfaktoren. CMV-spezifische T-Zelllinien wurden wie beschrieben erzeugt. Die Zusammenfassung von vier unabhängigen Experimenten zeigt die Differenzierung, Proliferation und Effektorfunktion von allen möglichen Permutationen der Variablen: IL-2, IL-7, Rapamycin (LD) und IL-2R-Antagonist (aIL-2Rα).
14 zeigt die IFNγ-Sekretion von Kulturen, in denen der IL-2R zum Ziel genommen worden war, in Abhängigkeit der CMVpp65/IE1 Peptidkonzentration. Auf den IL-2R-Weg abgezielte Kulturen weisen eine gesteigerte T-Zellerkennung auf. Die T-Zellen wurde für 18 h mit peptidbeladenen, autologen LCLs bei fallenden Peptidkonzentrationen von 1, 0,1, oder 0,01 mg/ml pp65/IE-1 restimuliert (steigender Balken bedeutet steigende Peptidkonzentration). Die IFNγ-Zytokinsekretion wurde durch intrazellulare Färbung bestimmt. In allen Graphiken ist jeweils ein repräsentatives Experiment von drei Experimenten gezeigt.
15 zeigt die IFNγ-Sekretion von CD8+ T-Zellen innerhalb einer Gesamtkultur oder von CD8+ T-Zellen, die alleine kultiviert wurden. Die CD8+ T-Zellfunktion kann durch Ergänzung gleicher Anzahl an CD4+ T-Zellen kurz vor spezifischer Restimulation induziert werden. Gezeigt ist die IFNγ-Sekretion von CD8+ T-Zellen innerhalb einer Gesamtkultur oder IFNγ-Sekretion von CD8+ T-Zellen, die alleine kultiviert wurden. CD8+ T-Zellen wurden getrennt mit Rapamycin (LD) oder aIL-2Rα, wie angegeben, kultiviert.
Detaillierte Beschreibung der Figuren:
Wie in 1A gezeigt wird, führt das Verfahren der Erfindung zu einem ausgeglicheneren CD4+/CD8+ T-Zellverhältnis nach 18 Tagen Expansion, ohne die klonale Expansion zu beinträchtigen. Niedrige Dosen (LD; 20 nmol/l) oder sehr niedrige Dosen (VLD; 2 nmol/l) Sirolimus (Rapamycin) wurden alle 2 Tage der Kultivierung während 14 bis 18 Tage ergänzt. LD und VLD haben dieselbe Bedeutung wie oben.
Wie in 1B gezeigt wird, vermehrt der Differenzierungsphänotyp nach 18 Tagen Expansion mit Sirolimus signifikant die zentralen Gedächtnis-T-Zellen. Der langlebige, zentrale Gedächtnisphänotyp wurde durch die Färbung der Oberflächenproteine CCR7 und CD45RA bestimmt. Zentrale Gedächtnis-T-Zellen sind durch eine CCR7, aber nicht durch eine CD45RA Expression charakterisiert. LD und VLD haben dieselbe Bedeutung wie oben.
2A zeigt den langlebigen zentralen Gedächtnisphänotypen in allen aIL-2R-behandelten Proben. Ähnlich zur Behandlung mit dem mTOR-Inhibitor (Rapamycin) führt IL-2R-Interferenz zu einem ausgeglicheneren CD4+/CD8+-T-Zellverhältnis. aIL-2R (20 μg/mL) wurde alle 2 Tage der Kultivierung ergänzt. Wie in 2B gezeigt wird, vermehrt der Differenzierungsphänotyp nach 18 Tagen Expansion mit aIL-2R signifikant die zentralen Gedächtnis-T-Zellen. Der langlebige zentrale Gedächtnisphänotyp wurde durch die Färbung der Oberflächenproteine CCR7 und CD45RA bestimmt. Zentrale Gedächtnis-T-Zellen sind durch eine CCR7, aber nicht durch eine CD45RA Expression charakterisiert. LD und VLD haben dieselbe Bedeutung wie oben.
3 demonstriert, dass behandelte CMV-spezifische T-Zellen keine Unterschiede bei der spezifischen Ziellyse zeigen. Die Ziellyse wurde mittels eines durchflusszytometrischen Vitalitätsassays bestimmt.
4 zeigt, dass Modifizieren des IL-2-Signalweges durch partielle mTOR/IL-2Ra-Inhibition zu einem erhöhten CD4-Anteil in antigenstimulierten und IFNγ-selektierten T-Zellen nach 18 Tagen Expansion unter der angegebenen Behandlung führt (4A; B). Die Zellen wurden mit lebend/tot-Farbstoff und für CD3, CD4 und CD8 gefärbt. Fig. C zeigt die zusammengefasste Expansionrate nach angegebener Behandlung. Die Expansionrate war reduziert, die klonale Expansion der Gesamtkultur war nicht signifikant beinträchtigt. Fig. D zeigt, dass Rapamycin oder der aIL-2R-Antagonist zur einer sequenziellen Expansion von zugleich CD4 und CD8 zentralen Gedächtnis-T-Zellen führt.
5 zeigt die zytometrische Erfassung der Zytokinsekretion und der Expression der Aktivierungsmarker von CD4+ und CD8+-T-Zellen (A Sirolimus; B aIL-2R-Antagonist). Häufigkeiten wurden nach antigenspezifischer Stimulation erfasst. Spezifische T-Zellen wurden für 18 h (16 h Brefeldin A) mit peptidbeladenen APC in Verhältnis 1:10 stimuliert. Die APC wurden mit 1 μg/mL IE-1/pp65 Peptidpool gepulst. IFNγ, TNFα und IL-2-Zytokinsekretion und Expression der Aktivierungsmarker CD137 und CD154 wurden durch intrazellulare Färbung bestimmt. Die Zellen wurden permeabilisiert und mit lebend/tot-Farbstoff und für IFNγ, IL-2, TNFα, CD3, CD4, CD8, CD137 und CD154 gefärbt.
6 zeigt die zytometrische Erfassung des Differenzierungsphänotyps von CD4+ und CD8+ T-Zellen nach 18 Tagen Expansion und angegebener Behandlung (A, B Sirolimus; C, D aIL-2R-Antagonist). Die Zellen wurden mit einem lebend/tot Farbstoff und für CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD62L und CCR7 angefärbt. Sirolimus oder aIL-2R behandelte CMV-spezifische T-Zelllinien zeigten eine signifikant verlängerte Expression des Oberflächenmarkers CD62L. Sirolimus oder aIL-2R behandelte CMV-spezifische CD8+ T-Zellen zeigten eine dosisabhängig erhöhte Expression des Aktivierungsmarkers CD137. Die Expression der Aktiverungsmarker CD137 und CD154 auf CD4+ T-Zellen war jedoch nicht beinträchtigt nach Behandlung mit Sirolimus. Der Wilcoxon signed rank Test ergab einen two-tailed p-Wert von p < 0.05. Die Boxplots sind mit Median und interquartilen Bereichen dargestellt. Die Daten von sechs unabhängigen Experimenten wurden vereinigt.
7 zeigt die antivirale CD8-Antwort in Abhängigkeit der Gegenwart von CD4+-Zellen in der Präparation. Die Figur zeigt die zytometrische Erfassung der Expression des Aktivierungsmarkers CD137 und der intrazellularen Zytokinfärbung auf CD8+ T-Zellen. Die Häufigkeiten nach antigenspezifischer Stimulation wurden erfasst. Spezifische T-Zellen wurden für 18 h (16 h Brefeldin A) mit CMVpp65/IE1 peptide-pool gepulsten APCs im Verhältnis von 1:10 stimuliert. CD8+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen wurden in Cokultur für 18 h bei sinkendem CD8+-T-Zell/CD4+-T-Zell-Verhältnis stimuliert. Die Zellen wurden permeabilisiert und mitlebend/tot-Farbstoff und für CD137 and CD154 Aktivierungsmarkerexpression und Zytokine (TNFa, IFNγ) angefärbt. Die Zellen wurden CD3, CD4, CD8, CD137 und CD154 angefärbt.
8 zeigt die Fähigkeit von CMV-peptidpoolspezifischen T-Zellen, die entweder mit Sirolimus oder dem IL-2-Rezeptorantagonist expandiert wurden, auf NEWT-infizierte, autologe Monozyten besser zu reagieren. Die spezifischen T-Zelllinien wurden wie beschrieben erzeugt. Die Ziele (Monozyten), die mit dem CMV low-passage-number Klinikstamm NEWT inkubiert wurden, wurden als APC genutzt. Zielzellen und T-Zellen wurden für 18 h in einem T-Zell/Zielverhältnis von 10:1 cokultiviert. Die Expression der Aktivierungsmarker CD137 und CD154 und die Zytokinsekrektionsfähigkeit wurden durch intrazellulare Färbung bestimmt. Nach 2 h wurde Bref-A zur Zytokindetektion zugegeben. Die Zellen wurden permeabilisiert und mit lebend/tot Farbstoff und für CD3, CD4, CD8, IFNγ, TNFa, CD137 und CD154 angefärbt. Monozyten, die mit Fibroblasten inkubiert wurden, stellen die unstimulierte Kontrolle dar.
9 zeigt die zytometrische Erfassung der für regulatorischen T-Zellen spezifischen Marker FoxP3 und Helios. Natürliche regulatorische T-Zellen werden nicht in CD4+ und CD8+ T-Zellen nach 18d Expansion und angegebener Behandlung gefunden.
10 zeigt, dass mTor Inhibition oder aIL-2R-Blockierung während der T-Zellexpansionsphase die polyfunktionalen, antigenspezifischen T-Zellantworten erweitern. Die Zellen wurden für 18 h (16 h Brefeldin A) mit CMVpp65/IE1-peptidpool gepulsten LCL im Verhältnis 10:1 stimuliert. Die Zellen wurden permeabilisiert und mit lebend/tot-Farbstoff und für IFNγ, TNFα, IL-2, CD3, CD4, und CD8 angefärbt. Die Zusammenfasssung von sechs unabhängigen Experimenten zeigt polyfunktionale (IFNγ+, TNFα+, IL-2+) antigenspezifische T-Zellantworten gegen CMVpp65/IE1-peptidpool-gepulste LCL. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Wilcoxon matched pairs test berechnet. *p < 0.05.
11 zeigt die IFNγ T-Zellantwort nach ex vivo CMV-Peptidstimulation und die Häufigkeiten und Reinheiten des IFNγ capture assay für jeweils CD4+ und CD8+ T-Zellen. Verglichen mit CD4+ T-Zellen, produzieren CD8+ T-Zellen substantiell größere Mengen an IFNγ. Anhand der CCR7- und CD45RA-Expression können menschliche Gedächtnis-T-Zellen in naive T-Zellen, terminal differenzierte Effectorzellen (TEMRA), TCM und TEM unterteilt werden. Der IFNγ capture assay offenbarte CD4+ T-Zellen, die überwiegend einen naiven T und TCM Phänotyp zeigen, die isolierten CD8+ T-Zellen jedoch zeigten einen naiven T, TEM und TEMRA Phänotyp (11B). Der große Anteil an naiven T-Zellen in zugleich CD4+ und CD8+ T-Zellen muss als Assaykontamination betrachtet werden. Wie in 11B gezeigt wird, sekretieren TEMRA sowie TEM das meiste IFNγ.
Wie in 12 gezeigt wird, wurden isolierte CMV-spezifische CD4+ und CD8+-T-Zellen getrennt mit Rapamycin/IL-2Rα-Antagonist kultiviert. CD8+ T-Zellgesamtkulturen, die mit Rapamycin/IL-2Ra-Antagonist inkubiert wurden, sowie auf den IL-2R Weg abgezielte CD4+ T-Zellen zeigten eine erhöhte CD62L-Expression. Im Gegensatz dazu konnte die CD62L-Expression auf gereinigten CD8+ T-Zellen nicht gesteigert werden. Deshalb kann die CD8+ T-Zelleffektorfunktion und der Gedächntisphänotyp in antigenspezifischen T-Zellkulturen in Gegenwart von CD4+ T-Zellen verbessert werden.
Wie in 13 gezeigt wird, weisen T-Zellen, die mit IL-2 allein expandiert wurden, eine kräftige Proliferation und eine gute Zytokinsekretionsfähigkeit auf, wobei jedoch die Mehrheit der T-Zellen einen spät differenzierten TEM-Phänotyp darstellt. IL-7 allein zeigt eine bemerkenswert reduzierte T-Zellproliferation, bewahrt aber etwas die CCR7/CD62L-Expression, verglichen mit der Ergänzung mit IL-2 oder IL-2/IL-7. Die Zugabe von Rapamycin/IL-2Ra-Antagonist zusammen mit entweder IL-2 oder IL-7 fördert die TCM-Bildung unter Erhaltung der Zytotoxizität. In Gegenwart von Rapamycin/anti-CD25 mAb war IL-2 allein weniger effektiv bei der Erhaltung des TCM-Phänotyps, aber potenter bei der Expansion und der Induktion der Effektorfunktionsfähigkeit als IL-7 allein. Die besten Ergebnisse in Hinblick auf Expansionsrate und Erhalt des TCM-Phänotyps mit voller Funktionsfähigkeit wurden nach Kultivierung mit zugleich IL-2 und IL-7 in Gegenwart von Rapamycin/IL-2Ra-Antagonist beobachtet.
Wie in 14 gezeigt wird, wurden, um den Bereich der T-Zellerkennung zu bestimmen, die T-Zellen mit sinkenden Peptidkonzentrationen stimuliert. Die IFNγ T-Zellantwort sank proportional mit der sinkenden Peptidkonzentration. Verglichen zu T-Zellen, die von auf den IL-2R Weg abgezielte Kulturen abgeleitet wurden, zeigen unbehandelte T-Zellen eine stärkere Reduktion in der IFNγ-Zytokinsekretion bei sinkenden Peptidkonzentrationen. Das Lebendinfektionsmodell benötigt eine effektive T-Zellerkennung, da die Präsentation von Epitopen im Vergleich zu peptid-beladenen Zellen reduziert ist.
Wie in 15 gezeigt wird, wurden, um den Einfluss der CD4+-T-Zellenquantität auf die CD8+-Zellfunktion zu testen, CMV-spezifische T-Zellen von PMBC isoliert und parallel in Gesamtkultur-T-Zellen, sortierten CD4+ und CD8+-Zellen kultiviert. Nach spezifischer Restimulierung mit NEWT-infizierten iDC zeigten CD8+ T-Zellen, die in Gesamtkulur kultiviert wurden, eine geringfügige IFNγ-Effektorzytokinsekretion, wohingegen CD8+ T-Zellen, die in Gesamtkultur kultiviert wurden und sich von auf den IL2-Weg abzielenden Kulturen ableiteten, ein viel höheres Ansprechen offenbarten. CD8+ T-Zellen, die ohne CD4+ T-Zellen kultiviert wurden, wiesen eine fast abgebaute IFNγ-Zytokinsekretion auf. Zu bemerken ist, dass die CD8+ T-Zellfunktionsfähigkeit, die durch die IFNγ-Sekretion bestimmt wurde, durch eine Ergänzung mit einer gleichen Anzahlt von CD4+-T-Zellen genau vor der spezifischen Restimulierung gesteigert werden konnte.

Claims

Verfahren zur Erzeugung von T-Zellpräparationen, die für mindestens ein Zielantigen spezifisch sind, umfassend die Schritte von: • Expandieren von lymphoiden Zellen in vitro in der Gegenwart eines Zielantigens oder Peptidfragmenten davon in einem Expansionsschritt unter Erhalt einer ersten T-Zellpräparation; • Isolieren von reagierenden Zellen aus der ersten T-Zellpräparation in einem Isolierungsschritt unter Erhalt einer zweiten T-Zellpräparation; • Kultivieren, in einem Kultivierungsschritt, der Zellen, die als zweite T-Zellpräparation erhalten wurden, in Gegenwart eines Zyotkins, bevorzugt Interleukin 2 und/oder Interleukin 7, und i. eines Inhibitors des mTor Komplexes 1, bevorzugt Rapamycin oder ein Rapamycinanalogon, oder ii. eines Inhibitors der Interleukin-2(IL-2)-Interleukin-2-Rezeptor(IL-2R)-Interaktion.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration – des Inhibitors des mTor Komplexes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 nmol/l ist, oder – des Inhibitors der Interleukin-2(IL-2)-Interleukin-2-Rezeptor(IL-2R)-Interaktion 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 μg/ml ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Inhibitor der Interleukin-2(IL-2)-Interleukin-2-Rezeptor(IL-2R)-Interaktion ein monoklonaler Antikörper ist, der gegen CD25 gerichtet ist, insbesondere Daclizumab oder Basiliximab.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die lymphoiden Zellen aus peripheren mononuklearen Zellen des Vollbluts isoliert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Kultivierungsschritt zwischen 10 und 25 Tagen, zwischen 15 und 21 Tagen oder etwa 18 Tage dauert.
T-Zellpräparation, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der prozentuale Anteil der CD45RA- and CCR7+ Zellen größer als (>) 10%, > 15% oder > 20% in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen innerhalb der Präparation ist.
T-Zellpräparation, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verhältnis von Zellen, die CD8 exprimieren, zu Zellen, die CD4 exprimieren, kleiner als (<) 6, < 5, < 4,5 oder etwa 4 ist.
T-Zellpräparation nach Anspruch 6 und/oder 7, wobei der prozentuale Anteil der CD4+, CCR7+ und CD45RA-(CM)-Zellen, berechnet in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen innerhalb der Präparation, > 15% ist.
T-Zellpräparation nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der prozentuale Anteil der CD8+, CCR7+ und CD45RA-(CM)-Zellen, berechnet in Bezug auf die Summe aller CD4+ Zellen und CD8+ Zellen innerhalb der Präparation, > 7% ist.
T-Zellpräparation nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der prozentuale Anteil an Zellen, die sowohl IFNγ, TNFα als auch IL-2 exprimieren, größer als (>) 10% ist.
T-Zellpräparation nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei mehr als 50% aller Zellen, die positiv für CD4+ oder CD8+ sind, CCR7 und CD62L exprimieren und mehr als 50% der Zellen am Tag 2, 3, 4, 5, oder 6 des Kultivierungsschritts CD127 exprimieren.
T-Zellpräparation nach einem der vorstehenden Ansprüche, zur Verwendung als Arzneimittel.
T-Zellpräparation nach einem der vorstehenden Ansprüche, zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Therapie von Infektionskrankheiten oder Krebs.
T-Zellpräparation nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung bei Patienten, die sich einer Transplantation eines soliden Organs unterziehen oder unterzogen haben, insbesondere in der Prophylaxe oder Therapie von Infektionskrankheiten oder Krebs.
Eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine T-Zellpräparation nach einem der vorstehenden Ansprüche, und einen akzeptablen Arzneistoffträger, Hilfstoff, Medium oder Verdünnungsmittel.