JP2022508131A - 製造されたｔ細胞でがんを治療するための方法 - Google Patents

製造されたｔ細胞でがんを治療するための方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、がんを治療するための方法を提供する。がんを治療するための方法は、ペントスタチンおよびシクロホスファミドの投与後、製造されたＴ細胞の投与を含むことができる。本開示はさらに、かかる製造されたＴ細胞を産生するための方法、前記製造されたＴ細胞および前記製造されたＴ細胞を含む組成物を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７６８，１４５号、２０１９年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２７，０３４号、および２０１９年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２７，０７９号の優先権を主張し、そのそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｉ型サイトカインプロファイルのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれＴｈ１およびＴｃ１細胞）は、養子Ｔ細胞療法の取り組みのための候補Ｔ細胞集団である。このＴｈ１型Ｔ細胞は、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ４転写因子を刺激するＩＬ－１２およびＩＦＮ－αなどのサイトカインに極性化することによって促進され、次いで、Ｔｈ１型分化状態を一部規定するＴＢＥＴ転写因子を促進する。
養子Ｔ細胞療法の成功は、宿主におけるＴ細胞集団のインビボでの持続性に部分的に依存する。Ｔ細胞持続性は、Ｔ細胞メモリーを増殖および維持するＴ細胞の能力の増加、ならびにアポトーシス細胞死に対するＴ細胞の傾向の低下の両方によって決定されるバランスである。以前の研究では、薬理学的薬剤ラパマイシン（ラパマイシンの哺乳動物標的、ｍＴＯＲを阻害する）におけるＴ細胞のエクスビボ製造により、これらの特徴、すなわち、養子移入後にインビボで抗原駆動型のクローン性増殖を受ける能力の増加、Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）分化状態によって例示されるようなメモリー状態の改善、ならびにミトコンドリアオートファジーを含むオートファジーの誘導によって、およびアポトーシス促進メンバーと比較してｂｃｌ－２遺伝子ファミリーの抗アポトーシスメンバーの優先的な発現によって特徴付けられる多面的な抗アポトーシス表現型、を示したＴ細胞をもたらしたことが実証される。総合すると、エクスビボで製造されたラパマイシン耐性細胞のこれらの特性は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および移植片拒絶の予防、ならびにヒトからマウスへの異種間（ｈｕｍａｎ－ｉｎｔｏ－ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）ＧＶＨＤの媒介を含む移植応答のインビボ調節の増強と関連付けられ、注目すべきことに、これらの細胞は、多発性骨髄腫の治療のための自家および同種異系の設定において臨床試験に首尾良く移され、再発性の難治性多発性骨髄腫に対して安全かつ有効であることが示された。これらの臨床試験のために、製造プロセスには、以下の要素である、３ビーズ：１Ｔ細胞の比較的高い比率での抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ（３／２８ビーズ）による共刺激、Ｔ細胞および３／２８ビーズのエクスビボ培養への同時添加、経口投与されたｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの高用量の添加（１μＭ）、ならびにサイトカイン極性化中の培養へのＩＬ－２添加の使用（ＩＦＮ－α添加）、が含まれる。この方法によって産生される細胞は、本明細書において、本開示の後半でより具体的に定義されるＴ－ＲＡＰＡ細胞と称される。
がんの発生は、免疫機能の変化と関連し得る。かかる変化には、腫瘍の拒絶の失敗に関連する抑制細胞媒介免疫（ＣＭＩ）、ならびに腫瘍促進および進行を増強することができる体液性免疫の増強が含まれる。ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット、Ｔｈ１およびＴｈ２Ｔ細胞は、特異的な機能を有し、互いに調節する。Ｔｈ１細胞はインターロイキン（ＩＬ－２）およびインターフェロン（ＩＦＮ－γ）を産生し、ＣＭＩ応答を直接行うが、Ｔｈ２細胞はＩＬ－４およびＩＬ－１０を産生し、局所体液性免疫応答を促進する。
ある特定のがんにおいてＴｈ１／Ｔｈ２不均衡の証拠が存在し、Ｔｈ２細胞の割合は、Ｔｈ１細胞数を犠牲にして著しく上昇する。Ｔｈ２に有利な慢性Ｔｈ１／Ｔｈ２不均衡は、抑制細胞媒介免疫を引き起こす可能性があり、それによって、効果的な免疫監視の低下および悪性腫瘍の発症に好都合な環境を提供する。
イディオタイプ特異的Ｔ細胞応答は、初期多発性骨髄腫のほとんどの患者に見られる。これらには、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生によるＴｈ１応答が含まれる。例えば、Ｔｈ１型免疫は、緩徐進行性疾患の場合に優先的に見出され、Ｔｈ２型応答は、進行性多発性骨髄腫の場合に主に見られる。欠陥のあるＴｈ１免疫応答（ＩＬ－６によって媒介される）ならびに調節不全のサイトカインネットワークは、多発性骨髄腫患者に見出される。ＭＭ患者由来の骨髄腫イディオタイプ特異的Ｔヘルパー細胞は、一貫して非Ｔｈ１表現型である。
多発性骨髄腫の治療の進歩、および最近の新しい医薬品およびモノクローナル抗体のＦＤＡ承認にもかかわらず、多発性骨髄腫はほぼ普遍的に致命的である。したがって、再発性難治性多発性骨髄腫（ＲＲＭＭ）を有する患者であって、多発性骨髄腫に対する上位５つの薬剤に対して難治性である（「ペンタ難治性」）患者は、数ヶ月の生存期間に限られ、治療選択肢はほとんどない。多発性骨髄腫は免疫療法を受けやすい疾患であり、同種幹細胞移植の長期にわたって観察された治療的役割、ならびにモノクローナル抗体療法、ワクチン、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ－）およびＣＡＲ－修飾Ｔ細胞療法を含む他の多数のアプローチによって証明されている。したがって、このペンタ難治性患者集団は、新規のＴ細胞療法に好適である。加えて、難治性の低い疾患を有する患者も、新規の治療を大いに必要としており、すなわち、疾患の２回目または３回目の再発であっても、無増悪生存期間の中央値は、典型的には２年未満である。
ある特定のがんについて、新規かつ革新的な免疫療法アプローチの必要性が存在する。
本開示は、対象においてがんを治療するための方法を対象とする。
一実施形態では、方法は、製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で該対象に投与することを含む。
別の実施形態では、本方法は、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で該対象に投与する前に、該対象に免疫枯渇レジメンを施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、該免疫枯渇レジメンは、ペントスタチンを含む第１の組成物を該対象に投与することと、シクロホスファミドを含む第２の組成物を該対象に投与することとを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の治療サイクルおよび１つ以上の追加の治療サイクルを含み、該第１の治療サイクルは、該対象を第１の免疫枯渇レジメンに施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることを含み、該１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、該対象を第２の免疫枯渇レジメンに施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることと、製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で該対象に投与することと、を含む。
上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、ペントスタチンの１つ以上の追加用量を該対象に投与する前に、該対象のクレアチンクリアランス（ＣｒＣｌ）を測定することと、ＣｒＣｌに基づいて該対象に投与されるペントスタチンの用量を調整することとをさらに含み得、ペントスタチンは、ＣｒＣｌ≧６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合に４ｍｇ／ｍ２で投与され、ペントスタチンは、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２＞ＣｒＣｌ≧３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合に２ｍｇ／ｍ２で投与され、ペントスタチンは、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合に投与されない。いくつかの実施形態では、ペントスタチンの用量は、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２＞ＣｒＣｌ≧３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合にペントスタチンの用量が５０％減少するように、ＣｒＣｌに基づいて調整することができ、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合にペントスタチンは投与されない。
上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、１回以上の追加用量のシクロホスファミドを投与する前に、絶対リンパ球数（ＡＬＣ）および絶対好中球数（ＡＮＣ）を測定し、ＡＬＣおよびＡＮＣに基づいて該対象に投与されるシクロホスファミドの用量を調整することをさらに含み得、シクロホスファミドは、ＡＮＣ＞１マイクロリットル当たり１０００の場合に２００ｍｇの用量で投与され、シクロホスファミドは、ＡＮＣが１マイクロリットル当たり５００～９９９およびＡＬＣ≧１マイクロリットル当たり５０の場合に１００ｍｇの用量で投与され、シクロホスファミドは、ＡＬＣ＜１マイクロリットル当たり５０またはＡＮＣ＜１マイクロリットル当たり５００の場合に投与されない。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの用量はＡＬＣおよびＡＮＣに基づいて調整することができ、ＡＮＣが１マイクロリットル当たり５００～９９９およびＡＬＣ≧１マイクロリットル当たり５０の場合にシクロホスファミドの用量が５０％減少され、またはＡＬＣ＜１マイクロリットル当たり５０もしくはＡＮＣ＜１マイクロリットル当たり５００である場合に投与されないようにできる。
０日目および様々な培養条件の後にＦｏｘＰ３を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 ０日目および様々な培養条件の後にＴＢＥＴを発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後のＴ細胞収量を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後のＴ細胞収量を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後のＩＦＮ－ガンマ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後のＴＮＦ－アルファ分泌を示す。 Ｔ－Ｒａｐａ方法論および本開示の方法（Ｒａｐａ－Ｔ）を使用して培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのｐ－４ＥＢＰ１ならびにアクチンタンパク質のウェスタンブロットを示す（上部パネル）。Ｔ－Ｒａｐａ方法論および本開示の方法（Ｒａｐａ－Ｔ）を使用して培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるアクチン発現によってｐ－４ＥＢＰ１レベルを正規化した（下部パネル）。 Ｔ－Ｒａｐａ方法論および本開示の方法（Ｒａｐａ－Ｔ）を使用して培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＰ７０Ｓ６Ｋおよびアクチンタンパク質のウェスタンブロット（上部パネル）、ならびにＴ－Ｒａｐａ方法論および本開示の方法を使用して培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるアクチン発現によって正規化したＰ７０Ｓ６Ｋレベルを示す（下部パネル）。 Ｔ－Ｒａｐａ方法論および本開示の方法（Ｒａｐａ－Ｔ）を使用して培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＰ－ＳＴＡＴ５およびアクチンタンパク質のウェスタンブロット（上部パネル）、ならびにＴ－Ｒａｐａ方法論および本開示の方法を使用して培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるアクチン発現によって正規化したＰ－ＳＴＡＴ５レベル（下部パネル）を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後６日目のＩＦＮ－ガンマ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後１３日目のＩＦＮ－ガンマ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後６日目のＴＮＦ－アルファ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後１３日目のＴＮＦ－アルファ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後６日目のＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後１３日目のＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後６日目のＩＬ－２分泌を示す。 様々な条件下でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した後１３日目のＩＬ－２分泌を示す。 様々な条件下で培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＰ６２およびアクチンタンパク質のウェスタンブロット（上部パネル）、ならびに様々な条件下でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるアクチン発現によって正規化されたＰ６２タンパク質発現を示す（下部パネル）。 様々な条件下で培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのｐ－ラプター（ｐ－ＲＡＰＴＯＲ）およびアクチンタンパク質のウェスタンブロット（上部パネル）、ならびに様々な条件下で培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるアクチン発現によって正規化されたｐ－ラプターレベルを示す（下部パネル）。 様々な条件下で培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞からのＢＩＭおよびアクチンタンパク質のウェスタンブロット（上部パネル）、ならびに様々な条件下で培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるアクチン発現によって正規化されたＢＩＭタンパク質発現を示す（下部パネル）。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ４５ＲＡのフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ４５ＲＡのフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ４５ＲＡのフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ４５ＲＡのフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７のフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７のフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７のフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後のＣＤ４＋細胞サブセットでのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７のフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下で培養したＴ細胞の培養収量の倍増を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後６日目のＩＦＮ－ガンマ分泌を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後１３日目のＩＦＮ－ガンマ分泌を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後６日目のＴＮＦ－アルファ分泌を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後１３日目のＴＮＦ－アルファ分泌を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後６日目および１３日目のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットでのＣＤ２５のフローサイトメトリー発現分析を示す。 様々な条件下でＴ細胞を培養した後６日目および１３日目のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットでのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７のフローサイトメトリー発現分析を示す。 下記のナイーブおよびＴセントラルメモリーパネルについての、ビーズ共刺激を組み込まない新Ｒａｐａ－Ｔ方法、ビーズ共刺激を組み込む新Ｒａｐａ－Ｔ方法（ビーズ対Ｔ細胞比、１：３）、ならびに旧Ｔ－Ｒａｐａ方法（ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）を比較するフローサイトメトリー発現分析を示す：ＣＤ４５ＲＡ発現、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の共発現、ならびにＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７の共発現。 ＩＬ－２受容体ＣＤ２５の発現、ならびに免疫抑制分子ＣＴＬＡ４およびＴＩＭ３の発現についての、ビーズ共刺激を組み込まない新Ｒａｐａ－Ｔ方法、ビーズ共刺激を組み込む新Ｒａｐａ－Ｔ方法（ビーズ対Ｔ細胞比、１：３）、および旧Ｔ－Ｒａｐａ方法（ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）を比較するフローサイトメトリー発現分析を示す。 ＩＩ型サイトカインＩＬ－４の分泌、およびＩ型サイトカインＩＦＮ－γの分泌についての、ビーズ共刺激を組み込まない新Ｒａｐａ－Ｔ法、ビーズ共刺激を組み込む新Ｒａｐａ－Ｔ法（ビーズ対Ｔ細胞比、１：３）、および旧Ｔ－Ｒａｐａ法（ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）を比較する、製造終了時および阻害剤なしの培養で追加の６日後のサイトカイン分泌結果を示す。 新Ｒａｐａ－Ｔ細胞集団の製造におけるビーズ共刺激なしの役割をさらに特定するために、ｎ＝１１の様々な培養条件で阻害剤なしの培養で、製造終了時および追加の６日後のＩ型サイトカイン分泌（ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ）結果を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＣＤ２５＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＣＤ２８＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＩＣＯＳ＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＣＤ３９＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＣＤ７３＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＧＩＴＲ＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＬＡＧ３＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＰＤ１＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞の２Ｂ４＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＬＡＩＲ１＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＣＴＬＡ４＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＫＬＲＧ１＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＴＩＧＩＴ＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下でのＴ細胞のＴＩＭ３＋についてのフローサイトメトリデータ測定値を示す。 様々な培養条件下での細胞のｐ－ＳＴＡＴ５、ｐ－ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ｐ－ＳＧＫ１、ＳＧＫ１、ラプター（Ｒａｐｔｏｒ）、リクター（Ｒｉｃｔｏｒ）、シトクロムＣおよびアクチンについてのウェスタンブロット結果を示す。 抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激および異なるサイトカインへの曝露後２４時間の上清からのＲＡＰＡ－Ｔ細胞およびＴ－ＲＡＰＡ細胞のＩＬ－２分泌測定値を示す。 抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激および異なるサイトカインへの曝露後２４時間の上清からのＲＡＰＡ－Ｔ細胞およびＴ－ＲＡＰＡ細胞のＴＮＦ－α分泌測定値を示す。 抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズまたは溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微粒子による共刺激後のＲＡＰＡ－Ｔ細胞のＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１３分泌測定値を示す。 抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズまたは溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微粒子による共刺激後のＲＡＰＡ－Ｔ細胞についてフローサイトメトリーによって測定されたＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ４発現を示す。 製造されたＴ細胞療法スキーマを示す。 ペントスタチン／シクロホスファミドレジメンと、それに続く製造されたＴ細胞の注入を示す。 対照群の性質、すなわち、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法に無作為割り付けされていない対象は、２回目または３回目の再発におけるＭＭの対象に適した３つのＦＤＡ承認トリプレットレジメン、すなわち、ＤＰｄレジメン（Ａ）、ＤＲｄレジメン（Ｂ）、またはＫＲｄレジメン（Ｃ）のうちの１つを受けることを詳細に説明する。 対照群の性質、すなわち、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法に無作為割り付けされていない対象は、２回目または３回目の再発におけるＭＭの対象に適した３つのＦＤＡ承認トリプレットレジメン、すなわち、ＤＰｄレジメン（Ａ）、ＤＲｄレジメン（Ｂ）、またはＫＲｄレジメン（Ｃ）のうちの１つを受けることを詳細に説明する。 対照群の性質、すなわち、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法に無作為割り付けされていない対象は、２回目または３回目の再発におけるＭＭの対象に適した３つのＦＤＡ承認トリプレットレジメン、すなわち、ＤＰｄレジメン（Ａ）、ＤＲｄレジメン（Ｂ）、またはＫＲｄレジメン（Ｃ）のうちの１つを受けることを詳細に説明する。 本開示の製造されたＴ細胞を生成するための例示的なワークフローを示す。 膵臓がん細胞に曝露後のＲＡＰＡ－Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を示す。 肺がん細胞に曝露後のＲＡＰＡ－Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を示す。 膵臓がん細胞または肺がん細胞への曝露ありまたはなしでの、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を示す。 チェックポイント阻害剤療法応答とがんの腫瘍変異の数との間の相関関係を示す。
本開示は、製造されたＴ細胞の産生方法、本明細書に開示される方法によって産生された製造されたＴ細胞、製造されたＴ細胞集団を含む集団および組成物、ならびに該製造されたＴ細胞または製造されたＴ細胞集団を使用して対象においてがんを治療するための方法を提供する。
定義
以下の定義が提供される：
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別途指示されない限り、複数の指示対象を含む。特許請求の範囲および本開示における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すよう明示的に示されない限り、または代替物が互いに排他的である場合を除き、「および／または」を意味するように使用される。
「約」という用語の使用は、数値とともに使用される場合、＋／－１０％を含むことが意図される。限定されないが例として、いくつかのアミノ酸が約２００として特定される場合、これは、１８０～２２０（プラスまたはマイナス１０％）を含むであろう。
「対象」、「患者」、および「個体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、治療される哺乳動物対象を指し、ヒト患者が好ましい。場合によっては、本発明の方法は、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類、ならびに霊長類を含むがこれらに限定されない、疾患のための実験動物、獣医用途、ならびに動物モデルの開発において使用されることが見出される。
「試料」は、最も広義に本明細書で使用される。細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体などを含む試料は、体液、細胞調製物の可溶性画分、または細胞が増殖した培地、細胞から単離または抽出された染色体、細胞小器官、または膜、溶液中または基質に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチド、細胞、組織、組織プリント、指紋、皮膚、または毛髪などを含み得る。
「治療」は、障害の発症を予防するか、または病状もしくは症状を変更することを意図して実行される介入である。したがって、「治療」は、療法的治療および予防または予防措置の両方を指す。治療を必要としているものには、既に障害を患っているもの、および障害を予防するべきものが含まれる。例えば、腫瘍（例えば、がん）治療において、治療剤は、腫瘍細胞の病状を直接的に低減させるか、または腫瘍細胞を他の治療剤、例えば、放射線および／または化学療法による治療の感受性をより高めることができる。本明細書で使用される場合、「改善された」とは、正規化された値（例として、限定されないが、健康な患者または個体で得られる値）に近づく症状を指し、例えば、正規化された値との差異が５０％未満であり、好ましくは、正規化された値との差異が約２５％未満であり、より好ましくは、正規化された値との差異が１０％未満であり、さらにより好ましくは、日常的な統計検定を使用して決定される正規化された値と有意に異なるものではない。限定されないが例として、例えばＢ型肝炎ウイルスなどの感染症生物に罹患している患者の改善または治療は、例えばプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）の低下によって測定した場合、患者から採取された試料中のウイルス粒子の低下によって決定され得る。
本明細書で使用される場合、「治療サイクル」は、概して、一次治療サイクル、第１の治療サイクル、第２の治療サイクル、または１つ以上の追加の治療サイクルのいずれかを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「治療有効用量」または「治療有効量」という用語は、所望の治療応答をもたらすのに有効な本発明の化合物の量を意味する。限定されないが例として、がんの増殖を遅らせる、またはがんを縮小させる、または転移を予防するために有効な用量は、「治療有効用量」であり得る。特定の治療有効用量は、治療される特定の病態、患者の身体状態、治療される哺乳動物または動物の種類、治療期間、同時療法の性質（存在する場合）、ならびに使用される特定の製剤、および化合物またはその誘導体の構造などの要因によって変化する。
本明細書で使用される「免疫細胞」は、限定されないが、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫＴ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、肥満細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマを含む遺伝子修飾免疫細胞、薬物修飾免疫細胞、ならびに上記細胞型の誘導体、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）または前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を含む、アッセイされ得る免疫系の任意の細胞を含むことを意味する。
「Ｔ細胞」は、胸腺に由来し、ＣＤ３複合体のタンパク質（例えば、再配置されたＴ細胞受容体、細胞の抗原／ＭＨＣ特異性に関与するＴ細胞表面上のヘテロ二量体タンパク質）に関連するヘテロ二量体受容体を有するリンパ球のサブセットである。Ｔ細胞応答は、他の細胞（例えば、標的細胞殺傷、Ｂ細胞などの他の免疫細胞の活性化）またはそれらが産生するサイトカインに対するそれらの効果についてのアッセイによって検出され得る。
本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８」という用語は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を指すと理解されるべきである。例えば、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズ」は、それに関連する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体部分を有する磁気ビーズを指すと理解されるべきである。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズなどの特定の形態によっても提供されないことが開示される事例では、これはまた、他の形態の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による共刺激も除外できることを理解するべきである。
本明細書で使用されるとき、「Ｔ－Ｒａｐａ細胞（複数可）」という用語は、培養開始と共刺激との間で遅延なく３：１の比率（ビーズ：Ｔ細胞比）で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激によって産生されたＴ細胞（複数可）を指し、細胞は、Ｘ－ＶｉｖｏまたはＩＦＮ－α（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびラパマイシン（１μＭ）を含有し、５％ＡＢ血清を補充するがＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない、同等培地で増殖され、細胞は３７℃で６日間培養され、１．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で培養開始される。方法「Ｔ－Ｒａｐａ」に関して使用される場合、特に断りのない限り、上記で定義されるＴ－Ｒａｐａ細胞を産生する方法を指す。
本明細書で使用される場合、「製造されたＴ細胞」および「Ｒａｐａ－Ｔ細胞」という用語は、本開示の方法によって産生されたＴ細胞を指すように互換可能に使用される。「製造されたＴ細胞」は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方を含むことができる。「製造されたＴ細胞」は、患者から採取されたＴ細胞、すなわち、天然に存在するＴ細胞を含まない。
本明細書で使用される場合、フローサイトメトリーによって測定した結果を指すために使用される場合、「発現レベル（ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）」または同等の参照値は、集団における特定の種類の陽性細胞の頻度を指すことを理解されたい。「発現レベル」または同等物が、特定の細胞型の発現レベルまたは同等物を指す限り、言及される任意の減少または増加は、特に断りのない限り、対応する特定の細胞型と比較していることを理解されたい。
当業者には認識されるように、「自己」細胞という用語は、これらが宿主に移植されるときにそれらに対する著しい免疫応答が生じないように、細胞が投与される対象または「宿主」と同じまたは類似のハプロタイプの細胞を意味する。
「ＣＤ４」は、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原ペプチドのＴ細胞受容体による認識に重要な細胞表面タンパク質である。活性化されると、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞は、少なくとも２つの細胞型、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞のうちの１つに分化し、各型は、それが産生するサイトカインによって特徴付けられる。「Ｔｈ１細胞」は、主に細胞免疫および炎症応答に関してマクロファージを活性化することに関与するが、「Ｔｈ２細胞」または「ヘルパーＴ細胞」は、主にＢ細胞を刺激して抗体（体液性免疫）を産生することに関与する。ＣＤ４はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の受容体である。Ｔｈ１細胞のエフェクター分子には、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＩＬ－３、ＴＮＦ－β、およびＩＬ－２が含まれるが、これらに限定されない。Ｔｈ２細胞のエフェクター分子としては、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＣＤ４０リガンド、ＩＬ－３、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、およびエオタキシンが含まれるが、これらに限定されない。Ｔｈ１型サイトカイン応答の活性化は、Ｔｈ２型サイトカイン応答を抑制することができ、逆に、Ｔｈ２型サイトカイン応答の活性化は、Ｔｈ１型応答を抑制することができる。
「サイトカイン」は、サイトカインが効果を及ぼす細胞の表面上の「サイトカイン受容体」を介して他の細胞の挙動に影響を与える細胞によって作製されるタンパク質である。リンパ球によって製造されるサイトカインは、「リンホカイン」と称されることがある。サイトカインは、Ｉ型（例えば、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ）およびＩＩ型（例えば、ＩＬ－４およびＩＬ－１０）としても特徴付けられる。
「調節する」という用語は、言及される活性のうちのいずれかが、例えば、増加、増強、増加、アゴニスト化（アゴニストとして作用）、促進、低下、減少、抑制、ブロック、またはアンタゴニスト化（アゴニストとして作用）されることを意味する。調節は、ベースライン値よりも１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍などを超える活性を増加させることができる。調節は、その活性をベースライン値よりも低下させることもできる。
「基質」は、核酸分子またはタンパク質が結合する任意の固定または半固定支持体を指し、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェーハ、繊維、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管、またはウェル、トレンチ、ピン、シャミエル（ｃｈａｍｉｅｌ）、および細孔を含む様々な表面形態を有する他のチューブ、プレート、ポリマー、および微粒子を含む。
製造されたＴ細胞を産生するための方法、本明細書に開示される方法によって産生された製造されたＴ細胞、および製造されたＴ細胞集団を含む組成物
本開示の方法において、ＩＦＮ－αは、Ｔ細胞を含む培養物のＴｈ１型分化状態表現型に向けたエクスビボ極性化のために利用される。Ｔｈ１型分化は、制御性Ｔ（ＴＲＥＧ）細胞表現型に向かって極性化することによって侵食され得、これは部分的にＴＲＥＧ分化状態を規定するＦｏｘＰ３転写因子を促進するためにＳＴＡＴ５を介してシグナル伝達するＩＬ－２を含むサイトカインによって促進される本開示の方法において、ＴＲＥＧ混入は、細胞培養中にＩＬ－２の外来的使用を省略することによって、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤の培養添加によって自己分泌ＩＬ－２シグナル伝達を防止することによって、Ｔｈ１型極性化中に制限される。いくつかの態様では、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体である。
本開示では、他のＴ細胞の製造方法と比較して、以下の介入を組み込んだ、新しい製造方法が提供される：（１）抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（あるいは、ナノ粒子または微粒子などの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激の任意の代替源を提供することができる）の、Ｔ細胞収量の向上のための培養への添加（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズまたはナノ粒子が共刺激のために使用される）の遅延または添加のない、（２）耐性Ｔ細胞表現型の強化のためのより低い比の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの使用、または代替的に、ビーズ、ナノ粒子もしくは微小粒子人工抗体ベースの共刺激の添加のない、（３）製造実現可能性を高めるためのｍＴＯＲ阻害（テムシロリムス）の非経口製剤の使用、ならびに（４）Ｔ細胞培養中の外来的ＩＬ－２の典型的な使用を省略することによって、ならびに内因性自己分泌ＩＬ－２シグナル伝達を、例えば、Ｔ細胞培養中に抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブもしくはバシリキシマブまたはＩＬ－２受容体シグナル伝達受容体を阻害する他の試薬）の使用を介して、抑制することによって、ＩＬ－２シグナル伝達の回避およびその結果としてのＴｈ１型分化のＴＲＥＧ細胞混入の回避。並列培養実験では、「製造されたＴ細胞」と称されるこの新しい組み合わせ方法によって生成されたＴ細胞は、エクスビボ培養で産生された前述のＴ細胞と比較して、より最適な細胞表現型を示した。
図３３は、本開示の製造されたＴ細胞を生成するための例示的なワークフローを提供する。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞を産生するための方法は、テムシロリムスおよびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地中で、対象からのＴ細胞をある細胞密度で含む細胞の培養投入集団（ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｐｕｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を接種するステップを含む。特定の態様では、培養培地は、既にテムシロリムスおよび／またはＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まず、これらの成分は、接種と同時にまたはほぼ同時に添加され得る。細胞の培養投入集団を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によって共刺激（限定されないが例として、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ、ナノ粒子または微小粒子による共刺激を含む）することなく、第１の期間インキュベートする。第１の期間の後、細胞の培養投入集団は、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ、ナノ粒子または微小粒子を添加することによって、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体によって刺激され得る。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズが使用される場合、これらは１：１～１：１２のビーズ比で使用することができる。加えて、ＩＦＮ－αを培養培地に添加する。次いで、細胞の培養投入集団を第２の期間インキュベートして、製造されたＴ細胞を得た。いくつかの態様では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ、ナノ粒子または微小粒子による共刺激は存在しない。いくつかの実施形態では、共刺激は実施されない。
上記の実施形態のいずれかにおいて、製造されたＴ細胞の産生方法は、該製造されたＴ細胞を収集した後、該製造されたＴ細胞の少なくとも一部をパッケージに包装することと、該製造されたＴ細胞の該一部を含有する該パッケージを凍結することと、をさらに含むことができる。当該製造されたＴ細胞の凍結保存は、当該技術分野で既知の方法によって行うことができる。
上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、培養培地中のある細胞密度で該対象からのＴ細胞を接種する前に、該対象からの該細胞の培養投入集団を採取することをさらに含むことができる。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該培養培地はＩＬ－２を含有することはできず、該培養培地にＩＬ－２を添加することはできない。上記の実施形態のいずれかにおいて、培養物に血清を添加することはできず、例えば、培養物は無血清である。上記の実施形態のいずれかにおいて、培養培地は、実質的に血清を含まないことが可能である。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＩＦＮ－αは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズが添加されるのと同時に、またはほぼ同時に添加され得る。培養物の共刺激が実行されない場合、例えば、培養開始時または培養開始から４８時間以内にＩＦＮ－αを添加することができる。例として、限定されないが、ＩＦＮ－αは、培養開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、または４８時間後に添加され得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該細胞密度は、１ｍＬ当たり約１×１０６個のＴ細胞～１ｍＬ当たり５０×１０６個の細胞であり得る。限定されないが例として、該細胞密度は、１ｍＬ当たり約１×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり１０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり１５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１５×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり２２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１０×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり２２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１０×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり２２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり５×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり２２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり５０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１０×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり４０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり２０×１０６個の細胞～１ｍＬ当たり４０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり７．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり１７．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり２０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり２２．５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり２５×１０６個のＴ細胞、１ｍＬ当たり３０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり３５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり４０×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり４５×１０６個の細胞、または１ｍＬ当たり５０×１０６個の細胞であり得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該テムシロリムスは、０．１～５μＭの濃度で該培養培地中に存在することができる。いくつかの実施形態では、テムシロリムスは、０．１～１μＭの濃度で該培養培地中に存在し得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、テムシロリムスは、１μＭの濃度で上記培養培地中に存在することができる。例として、限定されないが、テムシロリムスは、少なくとも０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ以上の濃度で該培養培地に存在することができる。さらなる例として、限定されないが、テムシロリムスは、約１～５μＭ、２～５μＭ、３～５μＭ、４～５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ、またはそれを超える濃度で該培養培地に存在することができる。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該テムシロリムスは、所望の濃度を維持するために、第２の期間中に１回以上該培養培地に添加され得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、テムシロリムスは、培地に１回添加され得る。非限定的な例として、該テムシロリムスは、該第２の期間中、２日ごとに該培養培地に添加することができる。所望のテムシロリムス濃度は、０．１～５μＭであり得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、テムシロリムスの所望の濃度は、０．１～１μＭであり得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、所望の濃度のテムシロリムスは、１μＭであり得る。限定されないが例として、所望のテムシロリムス濃度は、少なくとも０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ以上であり得る。さらなる例として、限定されないが、所望のテムシロリムス濃度は、約１～５μＭ、２～５μＭ、３～５μＭ、４～５μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ、またはそれを超える濃度であり得る。
ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、ＩＬ－２シグナル伝達を阻害する任意の物質であり得、ＩＬ－２シグナル伝達を阻害するのに十分な量で添加することができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、抗ＩＬ－２受容体抗体またはその断片、例えば、バシリキシマブまたはダクリズマブであり得る。該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、５～５０μｇ／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在することができる。非限定的な例として、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、約５～５０μｇ／ｍＬ、５～４０μｇ／ｍＬ、５～３０μｇ／ｍＬ、５～２０μｇ／ｍＬ、５～１０μｇ／ｍＬ、４０～５０μｇ／ｍＬ、３０～５０μｇ／ｍＬ、２０～５０μｇ／ｍＬ、２０～４０μｇ／ｍＬ、２０～３０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該第１の期間は、約８時間～約２４時間であり得る。非限定的な例として、該第１の期間は、約８時間～約２０時間、８時間～約１６時間、８時間～約１２時間、２０時間～約２４時間、１６時間～約２４時間、１２時間～約２４時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間であり得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、上記のビーズ：Ｔ細胞比は、１：３であり得る。いくつかの実施形態では、ビーズ：Ｔ細胞比は、１：１２～１：１であり得るか、または最も極端な例では、ビーズの添加なしであり得る。限定されないが例として、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、またはそれらの間の任意の範囲の比率を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞の培養投入集団の共刺激は、推奨されるよりも低い濃度で使用され得る抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８含有ナノ粒子を使用して達成され得る。例として、限定されないが、このようなナノ粒子は、約０．０１倍～約０．１倍、約０．０２５倍～約０．１倍、約０．０５倍～約０．１倍、約０．０７５倍～約０．１倍、約０．０１倍～約０．０７５倍、約０．０１倍～約０．０５倍、約０．０１倍～約０．０２５倍、約０．０２５倍～約０．０７５倍、約０．０２５倍～約０．０５倍、約０．０５倍～約０．０７５倍、または約０．０１倍、約０．０２５倍、約０．０５倍、約０．０７５倍、または約０．０１倍の推奨用量で使用することができる。限定されないが例として、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）などの試薬は、１×１０６個のＴ細胞当たり１０μＬの推奨用量と比較して少ない用量で使用することができ、例えば、例として、１．１μＬ（９倍の低下）または約０．１１倍であるが、これに限定されない。あるいは、製造されたＴ細胞を産生するために抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を使用する場合、共刺激源は、溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微小粒子によって提供され得る。例として、限定されないが、溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微小粒子は、製造業者（例えば、Ｃｌｏｕｄｚ（登録商標）；Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）が推奨する強度の２０％で使用することができる。さらなる例として、溶解性抗ＣＤ３－抗ＣＤ２８微小粒子は、製造業者の推奨強度の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％で使用することができる。添加される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８試薬の特定量は、最終Ｒａｐａ－Ｔ細胞産生物の所望の機能特性に基づいて用量設定することができる。具体的には、十分な量の試薬を添加して、本開示に記載される阻害分子の存在下でインビトロでＴ細胞生存率を維持することができる。しかしながら、任意の特定の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８試薬は、不適切に高レベルのＴ細胞活性化（最適で最小量の共刺激を有するＴ細胞培養物と比較して、フローサイトメトリーによるＣＤ２５発現の増加）、フローサイトメトリーによる不適切に高レベルのＴ細胞チェックポイント阻害剤受容体発現、およびフローサイトメトリーによるＴ細胞エフェクターメモリー細胞に関連する分子の不適切に変化した発現（ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７のレベルの減少、例えば、ＣＤ４５ＲＯおよびＫＬＲＧのレベルの増加）によって規定されるように、過剰に添加されてはならない。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該のＩＦＮ－αは、約１，０００ＩＵ／ｍＬ～約１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度まで上記培養培地に添加され得る。限定されないが例として、２，５００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬ、５，０００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬ、７，５００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬ、１，０００ＩＵ／ｍＬ～７，５００ＩＵ／ｍＬ、１，０００ＩＵ／ｍＬ～５，０００ＩＵ／ｍＬ、１，０００ＩＵ／ｍＬ～２，５００ＩＵ／ｍＬ、２，５００ＩＵ／ｍＬ～７，５００ＩＵ／ｍＬ、２，５００ＩＵ／ｍＬ～５，０００ＩＵ／ｍＬ、５，０００ＩＵ／ｍＬ～７，５００ＩＵ／ｍＬ、５，０００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬ、７，５００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬ、２，５００ＩＵ／ｍＬ、５，０００ＩＵ／ｍＬ、７，５００ＩＵ／ｍＬ、または１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度を使用することができる。１０００ＩＵ／ｍＬなどの低濃度のＩＦＮ－αは、Ｔｈ１表現型へのシフトがあまり顕著でなくなり得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該第２の期間は、約４日～約８日、４日～約６日、または６日～約８日であり得る。非限定的な例として、該第２の期間は、約４日、５日、６日、７日、または８日間とすることができる。共刺激が実行されない場合、インキュベーションの期間は、約４日～約８日、４日～約６日、または６日～約８日であり得る。非限定的な例として、該第２の期間は、約４日、５日、６日、７日、または８日間とすることができる。
上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の培地は、５％のヒト血清をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、該培養培地は、１％～２０％のヒト血清をさらに含むことができる。限定されないが例として、該培養培地は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％のヒト血清を含み得る。いくつかの実施形態では、該培養培地は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％のヒト血清を含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、血清は、培養培地に添加されることも、培養培地に存在することもできない。
上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の培地は、Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０培地をさらに含むことができる。上記の実施形態のいずれにおいて、上記の培地は、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標））培地をさらに含むことができる。Ｔ細胞を培養するために任意の好適な培養培地を使用することができる。
上記の実施形態のいずれにおいて、追加の培養培地を培養に加えることができる。限定されないが例として、追加の培養培地は、培養物への細胞の培養投入集団の初期接種後、約１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、またはそれらの間の任意の範囲もしくは時間で添加され得る。例として、限定されないが、培養培地の初期量に対する添加培養培地の量は、約０．５、０．７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０以上、およびそれらの間の任意の範囲の比率であり得る。例として、限定されないが、培養物に細胞の培養投入集団を初回接種した後に添加される培養培地の量は、培養物中の細胞密度を標的細胞密度まで減少させるのに十分な量であり得る。限定されないが例として、この標的細胞密度は、初期細胞密度が標的細胞密度よりも大きい場合、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、または４×１０７個、およびそれらの間の任意の範囲であり得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該細胞の培養投入集団は、その細胞の培養投入集団の細胞総数のうちのＴ細胞に関し、約５％～約１００％、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約５％～約９０％、約５％～約８０％、約５％～約７０％、約５％～約６０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約５％～約２０％、または約５％～約１０％を含むことができる。非限定的な例として、該細胞の培養投入集団は、該細胞の培養投入集団の細胞の総数のうち、約５％、１０％、１５％、２０％、３３％、４０％、５０％、６６％、７０％、７５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上のＴ細胞を含むことができる。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該細胞の培養投入集団は、単球をさらに含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、細胞の培養投入集団は、Ｔ細胞について富化され得る。例として、限定されないが、細胞の培養投入集団は、自動化されたＦｉｃｏｌｌ手順を使用してＴ細胞富化を施し得る。Ｆｉｃｏｌｌ手順を実行する方法は当該技術分野で既知であり、試料から好中球および赤血球を除去することを伴う。細胞集団中のＴ細胞を富化するための任意の好適な方法が使用され得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、該対象からのＴ細胞を含む試料を採取することと、該試料からＴ細胞を単離して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含むことができる。かかる試料は、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を含有することができ、限定されないが例として、動員された採取（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、定常状態アフェレーシス、または単純な採血によって得ることができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、ＰＢＳＣおよび／または細胞の培養投入集団を含有する試料は、製造されたＴ細胞調製の前に凍結保存され得る。定常状態アフェレーシスは、対象が十分な数の免疫細胞を有する場合に実施することができ、これは、例として限定されないが、最小絶対リンパ球数（ＡＬＣ）によって特徴付けられ得る。最小ＡＬＣは、例えば、１マイクロリットル当たり３００リンパ球であってもよい。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該Ｔ細胞は、抗体ベースの精製によって単離され得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該Ｔ細胞の富化は、対向流遠心溶出法（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によって行うことができる。そのような技術は、当技術分野において周知である。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該ＩＦＮ－αは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８含有ナノ粒子が添加されるのと同時に、またはほぼ同時に添加され得る。
上記の実施形態のいずれかにおいて、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、培養後に任意の好適な方法によって除去され得る。例として、限定されないが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズは、磁気的捕捉によって除去され得、溶解可能な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微小粒子は、放出緩衝液を添加し、製造されたＴ細胞を洗浄することによって除去され得る。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞比で添加された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用したインキュベーションの１週間後に、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して増加したＩＦＮ－γ分泌を示す。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞比で添加された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用したインキュベーションの１週間後に、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して増加したＴＮＦ－α分泌を示す。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞比で添加された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用したインキュベーションの１週間後に、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して増加したＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞比で添加された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用したインキュベーションの１週間後に、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して増加したＩＬ－２分泌を示す。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、Ｔ細胞の該対照集団と比較しておよびＴ－Ｒａｐａ細胞と比較して、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７およびＣＤ１２７に対して陽性の細胞の増加したパーセンテージを含む。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、Ｔ細胞の該対照集団と比較して、４ＥＢＰ１リン酸化の増加を示す。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して増加した４ＥＢＰ１リン酸化を示す。例として、限定されないが、Ｔ細胞が産生されたＴ細胞、すなわち培養投入Ｔ細胞に特徴的なＴ細の対照胞集団、または対照Ｔ細胞と比較した、４ＥＢＰ１のリン酸化の増加は、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、または３０％以下である。さらなる例として、限定されないが、４ＥＢＰ１リン酸化の増加は、５～５０％、５～４５％、５～４０％、５～３０％、５～２０％、５～１０％、１０～５０％、１０～４５％、１０～４０％、１０～３０％、１０～２０％、２０～５０％、２０～４５％、２０～４０％、２０～３０％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、４０～５０％、またはこれらの間の任意の値もしくはこれらの範囲内の値であり得る。４ＥＢＰ１のリン酸化は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して減少（または鈍化）する。いくつかの実施形態では、４ＥＢＰ１リン酸化の増加は、培養開始から３２時間後に測定され得る。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＰ７０Ｓ６Ｋ発現の減少を示し、製造されたＴ細胞が産生された細胞形態に特徴的なＴ細胞の該対照集団と比較して増加を示す。例として、限定されないが、増加は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上であり得、減少は、５０％、６０％、７０％、８０％以上であり得る。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、フローサイトメトリーによるＩＬ－２受容体ＣＤ２５の発現の減少を示す。例として、限定されないが、減少は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上であり得る。
いくつかの実施形態では、培養投入Ｔ細胞と比較して、製造されたＴ細胞は、ＫＬＦ４、ＫＬＦ１０、Ｎａｎｏｇおよびこれらの組み合わせなどの脱分化分子のＲＮＡ含有量の５０％以上の増加、ならびにパーフォリン、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γ、およびこれらの組み合わせなどの分化分子のＲＮＡ含有量の５０％以上の低下を特徴とする、独自のＲＮＡ発現プロファイルを発現することができる。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、免疫抑制効果に関連する以下の分子のレベルの減少を示す：ＣＴＬＡ４、およびＴＩＭ３。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が１０％以下であることを特徴とすることができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＴＬＡ４を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、減少した頻度は、対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が１０％以下であることを特徴とすることができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＩＭ３を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団におけるＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と比較して、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、対照集団中のＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、対照集団におけるＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＤ１を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が２Ｂ４を発現することができる。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における少なくとも０．１％のＣＤ４＋Ｔ細胞が２Ｂ４を発現する。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％以上のＣＤ４＋Ｔ細胞が２Ｂ４を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における２Ｂ４を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と比較して、２Ｂ４を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。例として、限定されないが、２Ｂ４を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、対照のＴ細胞集団における２Ｂ４を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。例として、限定されないが、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％減少できる。いくつかの実施形態では、減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が１０％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＡＩＲ１を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団におけるＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と比較して、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。例として、限定されないが、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、Ｔ細胞の対照集団におけるＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによって測定した場合、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、ＬＡＩＲ１の発現レベルの減少を示し得る。例として、限定されないが、減少は、少なくとも３０％、４０％、５０％、またはそれ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が１０％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＩＧＩＴを発現することができる。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における少なくとも０．１％のＣＤ４＋Ｔ細胞が２Ｂ４を発現する。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％以上のＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＩＧＩＴを発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。例として、限定されないが、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が１０％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＡＧ３を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、保存されたレベル、すなわち実質的に同じレベルの陽性共刺激分子ＣＤ２８によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現の頻度は、それぞれ、対照集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現の頻度の約２０％以内であり得る。例として、限定されないが、製造されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現の頻度は、それぞれ、対照集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現の頻度の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内であり得る。いくつかの実施形態では、この保存は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、保存されたレベル、すなわち実質的に同じレベルの陽性共刺激分子ＩＣＯＳよって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＣＯＳ発現の頻度は、それぞれ、対照集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＣＯＳ発現の頻度の約２０％以内であり得る。例として、限定されないが、製造されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＣＯＳ発現の頻度は、それぞれ、対照集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＣＯＳ発現の頻度の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内であり得る。いくつかの実施形態では、この保存は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団と比較して、保存されたレベル、すなわち実質的に同じレベルのＣＤ４５ＲＡによって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現の頻度は、それぞれ、対照集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現の頻度の約２０％以内であり得る。例として、限定されないが、製造されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現の頻度は、それぞれ、対照集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ発現の頻度の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以内であり得る。いくつかの実施形態では、この保存は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ２５を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、減少したレベルのＫＬＲＧ１によって特徴付けられる静止および非老化表現型を示す。いくつかの実施形態では、ＫＬＲＧ１のレベルの減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞がＫＬＲＧ１を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、免疫抑制分子ＣＤ３９の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が２０％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ３９を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、免疫抑制分子ＣＤ７３の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が２０％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ７３を発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％減少できる。例として、限定されないが、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、免疫抑制分子ＧＩＴＲの発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋の製造されたＴ細胞が５％以下であることを特徴とすることができる。例として、限定されないが、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％、４％、３％、２％、１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＧＩＴＲを発現することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の減少を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して少なくとも２０％減少できる。例として、限定されないが、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度は、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、頻度の減少は、製造されたＴ細胞をもたらす細胞が培養物に接種されてから６日後である。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞は、前駆体サイトカインＩＬ－２の分泌の増加、ならびに恒常性サイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５への応答性の増加によって証明されるように、対照Ｔ細胞培養物と比較してサイトカイン生物学的な早期分化状態を示すことができる。このようにして、本開示の製造方法は、恒常的サイトカインに対する反応性の増加を有するヘルパー非依存性Ｔ細胞の製造方法を記載する。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、同じ条件下でインキュベートされたＴ－Ｒａｐａ培養物と比較して増加したＩＬ－２分泌を示す。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分泌のこの増加は、少なくとも１．１倍である。例として、限定されないが、増加は、少なくとも１．１倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍以上であり得る。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、３：１～１：３ビーズ：Ｔ細胞比のＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激後、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６個の細胞／日のＩＬ－２を分泌する。例として、製造されたＴ細胞集団は、これらの条件下で、約５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上のｐｇ／ｍＬ／１×１０６個の細胞／日のＩＬ－２を分泌することができる。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、ＩＬ－７またはＩＬ－１５に曝露されると、増加した量のＩＬ－２を分泌することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、ＩＬ－７またはＩＬ－１５の存在なしの条件と比較して、製造されたＴ細胞集団がＩＬ－７またはＩＬ－１５の存在下でインキュベートされた場合、少なくとも１．１倍のＩＬ－２分泌の増加を特徴とする。例として、限定されないが、増加は、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍以上であり得る。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、３；１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激、ならびに存在する場合、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５の濃度でＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の両方に曝露した後、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６個の細胞／日のＩＬ－２を分泌する。例として、製造されたＴ細胞集団は、これらの条件下で、約１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００以上のｐｇ／ｍＬ／１×１０６個の細胞／日のＩＬ－２を分泌することができる。ＩＬ－２分泌は、ヘルパー非依存性Ｔ細胞と関連付けられる。Ｒａｐａ－Ｔ細胞の高いＩＬ－２分泌は、Ｔ細胞養子療法後に外来性ＩＬ－２を投与する必要性を排除することによって有利であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－７またはＩＬ－１５は、存在する場合、１０ｎｇ／ｍＬで添加される。
いくつかの実施形態では、該製造されたＴ細胞集団は、該対照集団Ｔ細胞と比較して増加したインビボ機能を示し、該インビボ機能は、ヒトからマウスへの異種間移植片対宿主疾患のモデルにおける増加したヒトＴ細胞生着を特徴とする。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞の該集団は、リン－Ｐ７０Ｓ６Ｋによって測定した場合、ｍＴＯＲＣ１活性化の減少を示す。該減少は、例として、限定されないが、培養開始後３２時間において、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり得る。
いくつかの実施形態では、該製造されたＴ細胞集団は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、リン－ＳＴＡＴ５の低下を示す。該減少は、例として、限定されないが、培養開始後３２時間において、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％であり得る。
いくつかの実施形態では、該製造されたＴ細胞集団は、対照の培養Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、リン－ＳＴＡＴ５の低下を示す。該減少は、例として、限定されないが、対照の培養Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して少なくとも５０％であり得る。いくつかの実施形態では、該減少は、製造されたＴ細胞が、Ｔ細胞を含む投入細胞集団から培養物に接種された４８時間後におけるものである。いくつかの実施形態では、ｐ－ＳＴＡＴ５レベルはウェスタンブロットによって測定したものである。
いくつかの実施形態では、該製造されたＴ細胞集団は、少なくともある検出可能なレベルのＳＴＡＴ１およびリン－ＳＴＡＴ１を示す。いくつかの実施形態では、該レベルは、製造されたＴ細胞が、Ｔ細胞を含む投入細胞集団から培養物に接種された４８時間後に測定される。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ならびに少なくともある程度のレベルのＳＴＡＴ１およびリンＳＴＡＴ１と比較して、リンＳＴＡＴ５の低下を示す。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ１またはｐ－ＳＴＡＴ１のレベルは、ウェスタンブロットによって測定したものである。
いくつかの実施形態では、該製造されたＴ細胞集団は、製造されたＴ細胞集団が得られたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋまたはラプター発現によって測定した場合、ｍＴＯＲＣ１活性化の減少を示す。該減少は、例として、限定されないが、５０％減少することができる。いくつかの実施形態では、該減少は、製造されたＴ細胞が、Ｔ細胞を含む投入細胞集団から培養物に接種された４８時間後におけるものである。いくつかの実施形態では、減少はウェスタンブロットによって測定したものである。
いくつかの実施形態では、該製造されたＴ細胞集団は、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ほぼ同じレベルのリクター、ＳＧＫ１、またはリン酸化ＳＧＫ１を示す。例として、限定されないが、リクター、ＳＧＫ１またはリン酸化ＳＧＫ１のレベルは、Ｔ－Ｒａｐａ細胞におけるリクター、ＳＧＫ１またはリン酸化ＳＧＫ１の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％以内、または対応するレベルであり得る。いくつかの実施形態では、該レベルは、製造されたＴ細胞が、Ｔ細胞を含む投入細胞集団から培養物に接種された４８時間後におけるものである。いくつかの実施形態では、リクター、ＳＧＫ１またはｐＳＧＫ１のレベルは、Ｔ細胞の対照集団で測定したレベルである。いくつかの実施形態では、レベルはウェスタンブロットによって測定したものである。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、阻害剤を含まない製造後６日間、培養培地中での増殖後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－２のうちの少なくとも１つの分泌の増加を示す。上記増加は、例として、限定されないが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上であり得る。
いくつかの実施形態では、製造終了時（培養６日目）の製造されたＴ細胞集団は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の数が増加し得る。該増加は、例として、限定されないが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上であり得る。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤受容体の減少した発現を有し得る。例として、限定されないが、発現の減少は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞における対応する発現レベルよりも少なくとも２５％減少できる。さらなる例として、限定されないが、発現の減少は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団における対応する発現レベルよりも少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団における対応する発現レベルの約２５％以内である、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルを有することができる。例として、限定されないが、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルは、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における対応する発現レベルの約２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以内であり得る。チェックポイント阻害剤の発現レベルは、同じ細胞型間で比較されること、例えば、ＣＤ４＋の製造されたＴ細胞は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＣＤ４＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞またはＣＤ４＋対照Ｔ細胞と比較されることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞は、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤受容体の減少した発現を有し得る。例として、限定されないが、減少した発現は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞における対応する発現レベルよりも少なくとも２５％減少できる。さらなる例として、限定されないが、減少した発現は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞における対応する発現レベルよりも少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％減少できる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞における対応する発現レベルの約２５％以内である、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルを有することができる。例として、限定されないが、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルは、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞における対応する発現レベルの約２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以内であり得る。チェックポイント阻害剤の発現レベルは、同じ細胞型間で比較されること、例えば、ＣＤ４＋の製造されたＴ細胞は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的なＣＤ４＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞またはＣＤ４＋対照Ｔ細胞と比較されることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞は、製造されたＴ細胞が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞と比較して、ＣＤ１２７の発現の増加を有する。例として、限定されないが、この増加は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上であり得る。
いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５％を有することができる。例として、製造されたＴ細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％以上を有することができる。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞集団は、製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団と比較して、ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の増加した頻度を有することができる。例として、限定されないが、この増加は、少なくとも５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％以上であり得る。
製造されたＴ細胞集団に関連する上記の特性のうちのいずれかが単一の細胞と関連付けられる限り、製造されたＴ細胞は、該特性によって特徴付けられ得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、製造されたＴ細胞または製造されたＴ細胞集団は、列挙される特性のうちの２つ以上を有することができる。
対象においてがんを治療するための方法
再発性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者は、限られた生存期間を有し、治癒的療法は困難であった。このような点で、再発性ＭＭの患者は、新規のＴ細胞療法に好適である。
免疫療法は、いくつかの重要なカテゴリで免疫療法の既存のアプローチとは異なる。第１に、製造されたＴ細胞産物は、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）の経路のレベルで阻害されるように製造され、これは、アポトーシスに対する耐性に変化し、セントラルメモリー分化のための富化に変化する。第２に、製造されたＴ細胞産物は、ＣＤ４＋Ｔｈ１およびＣＤ８＋Ｔｃ１分化を促進する高用量ＩＦＮ－αで製造される。第３に、製造されたＴ細胞産物は、モノクローナル抗体と最小限に共刺激されるか、または共刺激されず、多様なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーを発現し、したがって、製造されたＴ細胞によって媒介される抗腫瘍効果は、主に腫瘍抗原へのインビボクローン増殖を通じて生じることが予想される。このような機構は、腫瘍抗原が知られていないか、または高い腫瘍変異速度のために経時的に可変である多発性骨髄腫において好ましい場合がある。インビボで出現するＴ細胞応答の特性評価は、製造されたＴ細胞療法の潜在的な機構の理解を向上させるために重要であり、本研究の二次目的として評価されるであろう。第４に、ペントスタチンと、低用量の用量調整シクロホスファミドとを組み合わせた（ＰＣレジメン）新規免疫枯渇および免疫抑制レジメンで、製造されたＴ細胞療法を評価する。このＰＣレジメンは、骨髄系細胞を比較的温存し、それによって実質的な好中球減少症を伴わずに繰り返し治療サイクルを可能にし、このレジメンは、費用（外来で投与することができる）および安全性（骨髄系細胞保存による感染率の減少）の観点から有利である。多発性骨髄腫は、炎症性シグナル伝達によって非常に促進される疾患であり、したがって、ＰＣレジメンによって媒介される炎症抑制は、レジメンの有効性に寄与する１つの構成要素である。これらの因子のそれぞれは、ＰＣコンディショニング後に、製造されたＴ細胞の複数回の注入に焦点を当てた臨床試験の設計中に考慮された。
製造されたＴ細胞は、チェックポイント阻害剤のレベルが大幅に減少して発現しているため、現在モノクローナル抗体療法によって達成されているチェックポイント阻害から免疫系を解放するための新規のエクスビボ方法を提供する。この方針に沿って、製造されたＴ細胞療法は、黒色腫、腎細胞がん、膀胱がん、肺がん、リンパ腫、多発性骨髄腫、および結腸がんを含むが、これらに限定されない、チェックポイント阻害剤療法の影響を受けやすいがんにおいて成功を収めることが期待される。また、チェックポイント阻害剤モノクローナル抗体療法は、多発性骨髄腫患者において比較的毒性があり、それによって、製造されたＴ細胞療法などの免疫チェックポイントを回避するための代替アプローチの必要性を生じさせたことにも留意されたい。
加えて、多種多様な腫瘍抗原への広範なクローン増殖を受ける製造されたＴ細胞の能力は、突然変異速度が増加した腫瘍細胞およびマイクロサテライト不安定性を有する腫瘍が、製造されたＴ細胞療法に対して特に感受性を有することを予測する。
本開示は、本開示の製造されたＴ細胞を治療有効用量で投与することを含む、がんを治療するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、がんを治療するための方法は、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、製造されたＴ細胞を含む組成物の投与は、治療有効用量で、または治療有効用量を累積的に達成するため、のいずれかで繰り返され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、該免疫枯渇レジメンを該対象に施す前に、該対象から自己細胞を採取することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、製造されたＴ細胞を含む該組成物を該対象に投与する前に、該対象から自己細胞を採取することをさらに含む。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該の免疫枯渇レジメンは、該の対象にペントスタチンおよびシクロホスファミドのうちの少なくとも１つを投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ペントスタチンは該対象に投与され、該ペントスタチンの用量は、０．５～４ｍｇ／ｍ２、０．５～３ｍｇ／ｍ２、０．５～２ｍｇ／ｍ２、０．５～１ｍｇ／ｍ２、１～４ｍｇ／ｍ２、２～４ｍｇ／ｍ２、または３～４ｍｇ／ｍ２であり得る。非限定的な例として、該ペントスタチンの用量は、約０．５ｍｇ／ｍ２、１ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、２．５ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、３．５ｍｇ／ｍ２、または４ｍｇ／ｍ２である。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは該対象に投与され、該シクロホスファミドの用量は、５０～４００ｍｇ、５０～３００ｍｇ、５０～２００ｍｇ、５０～１００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、２００～４００ｍｇ、３００～４００ｍｇ、２００～３００ｍｇ、または１００～２００ｍｇであり得る。非限定的な例として、該シクロホスファミドの用量は、約５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、または４００ｍｇである。いくつかの実施形態では、ペントスタチンおよびシクロホスファミドの両方が、該対象に投与される。いくつかの実施形態では、該ペントスタチンおよびシクロホスファミドは、単一の組成物で該対象に投与される。いくつかの実施形態では、該単一組成物は、該対象に静脈内投与される。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該免疫枯渇レジメンは、ペントスタチンを含む第１の組成物を該対象に投与することと、シクロホスファミドを含む第２の組成物を該対象に投与することとを含むことができる。いくつかの実施形態では、該第１の組成物は、ペントスタチンの１～４ｍｇ／ｍ２の用量で投与され、０．５～４ｍｇ／ｍ２、０．５～３ｍｇ／ｍ２、０．５～２ｍｇ／ｍ２、０．５～１ｍｇ／ｍ２、１～４ｍｇ／ｍ２、１～３ｍｇ／ｍ２、１～２ｍｇ／ｍ２、または３～４ｍｇ／ｍ２である。非限定的な例として、該ペントスタチンの用量は、約１ｍｇ／ｍ２、１．５ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、２．５ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、３．５ｍｇ／ｍ２、または４ｍｇ／ｍ２である。いくつかの実施形態では、該第２の組成物はシクロホスファミドを含み、５０～４００ｍｇ、５０～３００ｍｇ、５０～２００ｍｇ、５０～１００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、２００～４００ｍｇ、３００～４００ｍｇ、２００～３００ｍｇ、または１００～２００ｍｇの該シクロホスファミドの用量で投与される。非限定的な例として、該シクロホスファミドの用量は、約５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、または４００ｍｇである。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該治療有効用量は、対象の体重の１ｋｇ当たりの製造されたＴ細胞で、１×１０５～５×１０６、１×１０６～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６～５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５～５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５～２．５×１０５個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５～５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ、２×１０５個の細胞／ｋｇ、３×１０５個の細胞／ｋｇ、４×１０５個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ、または５×１０６個の細胞／ｋｇであり得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、製造されたＴ細胞を含む組成物は、注入によって該対象に投与される。
上記の実施形態のいずれかにおいて、がんは、限定されないが例として、多発性骨髄腫、腎細胞がん、膀胱がん、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、胃がん、および結腸がんからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、がんは、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫は再発性多発性骨髄腫である。さらなる例として、限定されないが、がんは、肉腫、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、または結腸直腸がんであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、ＰＤＬ１陰性がんである。いくつかの実施形態では、がんは、チェックポイント阻害剤療法の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫は再発性難治性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫はクアッドまたはペンタ難治性多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫はくすぶり型多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、該対象は、再発した多発性骨髄腫に罹患している。特定の態様において、対象は、限定されないが例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上再発した多発性骨髄腫に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、くすぶり型多発性骨髄腫に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、クアッドまたはペンタ難治性多発性骨髄腫に罹患している。いくつかの実施形態では、該対象は、限定されないが例として、１、２、３、４、５つ以上の治療に抵抗性の多発性骨髄腫に罹患している。
いくつかの実施形態では、該対象は、以前に治療されており、プロテアソーム阻害剤の投与、免疫調節薬の投与、アルキル化剤の投与、ＣＤ３８モノクローナル抗体の投与、およびグルココルチコイドの投与からなる群から選択される異なる治療方針を受けた後、現在、２回目または３回目の再発の時点にある。この患者集団は、２回目または３回目の再発患者に対して標準化学療法を受けるための対照コホートへの無作為割り付けが正当化される、第３相無作為化臨床試験の評価に適していると考えられる。
別個の実施形態では、該対象は、複数の標準薬物に対して高難治性であるため、無作為化臨床試験は正当化されない。むしろ、かかる高難治性患者は、単一治療群の第ＩＩ相臨床試験でＲａｐａ－Ｔ療法により治療される。高難治性の状態は、クアッドまたはペンタ難治性の名称によって数量化することができ、それによって、かかる対象は、多発性骨髄腫の治療に使用される上位の薬物、すなわち、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、レナリドミド、ポマリドミド、およびダラツムマブのうちの４つまたは５つのいずれかに対して難治性である。
２回目または３回目の再発時にＭＭを治療する第３相臨床試験に関連する実施形態の場合、主要研究目的は、研究エンドポイントとして無増悪生存期間に関連し、無増悪状態を、該対象が月１回でモニタリングしたとき、Ｍタンパク質／遊離軽鎖の差が２５％未満の増加を有すると定義する。
いくつかの実施形態では、第１の治療サイクルは、最低２８日の持続期間である。いくつかの実施形態では、該１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、最低３５日の持続時間である。
いくつかの実施形態では、該対象にペントスタチンを投与する該ステップが、第１の治療サイクル中に繰り返される。いくつかの実施形態では、該対象にペントスタチンを投与する該ステップが、該第１の治療サイクルの１日目、４日目、８日目、および／または１１日目に実行される。いくつかの実施形態では、該対象にシクロホスファミドを投与する該ステップが、第１の治療サイクル中に繰り返される。いくつかの実施形態では、該対象にシクロホスファミドを投与する該ステップが、第１の治療サイクルの１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、および／または１２日目に実行される。
上記の実施形態のいずれかにおいて、該１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれが、０～４週間間隔である。上記の実施形態のいずれかにおいて、該第１の治療サイクルおよび該１つ以上の追加の治療サイクルのうちの第１のサイクルが、０～４週間間隔である。上記の実施形態のいずれかにおいて、製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で該対象に投与する該ステップが、該１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの１５日目、１６日目、１７日目または１８日目に実行される。
いくつかの実施形態では、該対象は、プロテアソーム阻害剤の投与、免疫調節薬の投与、アルキル化剤の投与、ＣＤ３８モノクローナル抗体の投与、およびグルココルチコイドの投与からなるレジメンを受けた後、ＭＭの２回目または３回目の再発にある。
いくつかの実施形態では、該対象は、ＭＭ再発の後期段階でクアッドまたはペンタ難治性にあり、それにより標準的な療法が存在しない。
第３相臨床試験に関連するいくつかの実施形態では、主要研究目的は、無増悪生存期間に関連し、無増悪は、治療間のＭ－タンパク質／遊離軽鎖の差の２５％未満の増加として定義される。
いくつかの実施形態では、本方法は、該対象に免疫枯渇レジメンを施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることと、該免疫枯渇レジメンの後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で該対象に投与することと、を含む。
いくつかの実施形態では、該免疫枯渇レジメンは、ペントスタチンを該対象に投与することと、シクロホスファミドを該対象に投与することと、該対象のクレアチンクリアランスが≧３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２である場合、１つ以上の追加用量のペントスタチンを該対象に投与することと、該対象の絶対リンパ球数が１マイクロリットル当たり５０以上であり、かつ該対象の絶対好中球数が１マイクロリットル当たり５００以上である場合、１つ以上の追加用量のシクロホスファミドを該対象に投与することと、を含む。
いくつかの実施形態では、該対象のＣｒＣｌを測定し、投与されるペントスタチンの用量を調整する該ステップが、該免疫枯渇レジメンの１日目、４日目、８日目、および／または１１日目に実行される。
いくつかの実施形態では、ＡＬＣおよびＡＮＣを測定し、投与されるシクロホスファミドの用量を調整する該ステップが、免疫枯渇レジメンの１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、および／または１２日目に実行される。
いくつかの実施形態では、該免疫枯渇レジメン後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で該対象に投与する該ステップが、該免疫枯渇レジメンの開始の１５～１８日後に実行される。
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫枯渇レジメンを該対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させるステップと、該免疫枯渇レジメン後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で該対象に投与するステップと、は少なくとも２回繰り返される。上記の実施形態のいずれかにおいて、該対象を免疫枯渇レジメンに施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させるステップと、該免疫枯渇レジメン後に製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で該対象に投与するステップと、は最大８回またはそれ以上繰り返すことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、該免疫枯渇レジメン後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で該対象に投与する各ステップは、０～９週間間隔とすることができる。
また、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による共刺激が実行される上記の実施形態のいずれかおいて、この共刺激は、任意の形態の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で提供され得ることも理解されるべきである。例として、限定されないが、共刺激が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用することによって実行されることが示される場合、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子または微小粒子を使用することができる。
以下の実施例は、本開示の方法および結果として生じる製造されたＴ細胞をよりよく例示するために提供される。これらの実施例は、本開示に開示される方法、細胞、および組成物の範囲を限定すること、そうでなければ変更することを意図するものではない。
実施例１
Ｔｈ１富化のための抗ＩＬ－２受容体遮断およびｍＴＯＲ遮断の使用。養子Ｔ細胞療法の場合、制御性Ｔ（ＴＲＥＧ）細胞表現型を有する細胞からの混入を最小限に抑えながら、Ｔｈ１表現型を優先的に発現するＴ細胞を製造することが重要である。Ｔｈ１型細胞は、細胞運命転写因子ＴＢＥＴの発現によって部分的に特徴付けることができ、一方、ＴＲＥＧ細胞はＦｏｘＰ３転写因子を発現する。
ＦｏｘＰ３を制限しながらＴＢＥＴを促進する方法を評価した。難治性腎細胞がんの治療のために静脈内投与されるＦＤＡ承認薬であるｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムスを評価した。一般に、ｍＴＯＲの阻害が、ＴＲＥＧ表現型のＴ細胞の促進と関連付けられているため、ｍＴＯＲ阻害剤を使用してＴｈ１表現型について富化したＴ細胞を製造することは、矛盾しているように思われ得る。現行の実験は、テムシロリムスが静脈内投与製剤であり、したがって培地への溶解度が限られているため細胞培養にあまり適さないラパマイシンと比較して有利であるため、以前の研究とは異なる。
現行の実験はまた、テムシロリムスと抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体であるダクリズマブの組み合わせを評価したため、過去の研究とは異なる。ダクリズマブおよびバシリキシマブはともに、ＦＤＡ承認モノクローナル抗体であり、共通の作用機序を有するため、開発したシステムにおいて相互交換可能に使用され得る。
示されるように、様々な比率の抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ビーズ対Ｔ細胞（１：１もしくは１：１２）、ｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムス（１μＭ）、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブ（５もしくは５０μｇ／ｍｌ）無しもしくは有りで、ならびにＴｈ１極性化サイトカイン（ＩＦＮ－α、１０，０００ＩＵ／ｍｌ）もしくは対照の制御性Ｔ細胞極性化（ＩＬ－２＋ＴＧＦ－β）のいずれか、を使用して、Ｔ細胞をエクスビボで培養した。培養の６日目に、制御性Ｔ細胞転写因子ＦｏｘＰ３およびＴｈ１転写因子ＴＢＥＴの細胞内発現について、Ｔ細胞を評価した。（図１Ａ～図１Ｂ）。
Ｉ型極性化サイトカインＩＦＮ－αの設定でテムシロリムス（１．０μＭ濃度）の添加は、０日目投入Ｔ細胞集団と比較して、ＦｏｘＰ３の結果として生じるＴ細胞発現を減少させることがわかった（図１Ａを参照されたい）。さらに、ＩＬ－２受容体の遮断は、ＦｏｘＰ３発現をさらに減少させること、５０μｇ／ｍｌでの抗体の使用は、５μｇ／ｍｌでの抗体の使用よりも効果的であり、それによって用量反応関係を示すことがわかった。外来性ＩＬ－２をＩＦＮ－αと組み合わせて添加した場合、テムシロリムスはＦｏｘＰ３発現を減少させるのに有効ではなく（図１Ａ）、さらに、培養条件がＴＲＥＧ細胞分化に対して許容的である場合、すなわち、ビーズ比の１：１２への減少、培養からのＩＦＮ－αの除去；ならびに外来性ＩＬ－２＋ＴＧＦ－βの添加（図１Ａ）の場合、テムシロリムスおよびダクリズマブはＦｏｘＰ３発現を制限するのに有効ではなかった。
ＦｏｘＰ３発現を制限することに加えて、テムシロリムスと抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体との組み合わせは、ＴＢＥＴの発現の増加によって示されるように、Ｔｈ１表現型を促進するのに有効であった（図１Ｂ）。この場合も、用量反応関係があり、５０μｇ／ｍｌのダクリズマブが５μｇ／ｍｌよりも高い程度でＴＢＥＴ発現を促進した（図１Ｂ）。ＩＦＮ－α極性化へのＩＬ－２の添加はＴＢＥＴを増加させたが、これはまた、ＦｏｘＰ３の増加と関連付けられ、それにより、外来性ＩＬ－２添加によるＴｈ１純度の欠如を示した。注目すべきことに、ＴＲＥＧ対照条件、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βは、予想どおり、ＴＢＥＴの発現を減少させた（図１Ｂ）。
したがって、ｍＴＯＲ阻害とＩＬ－２受容体遮断の組み合わせは、Ｔｈ１細胞生成のための新しい方法を表している。
エクスビボでの製造中にＴ細胞を阻害するための介入の組み合わせの開発：ｍＴＯＲ阻害；ＩＬ－２受容体遮断；Ｔ細胞共刺激の減少；および共刺激前のＴ細胞の阻害（一晩のプレインキュベーション）。ｍＴＯＲ阻害とＩＬ－２受容体遮断の組み合わせがＴｈ１型細胞の製造を改善することができることを実証するこれらの結果を考慮して（ＴＢＥＴ対ＦｏｘＰ３比の改善、ＴＲＥＧ細胞混入の制限）、追加の介入もＴｈ１細胞の製造を改善する可能性があると考えた。
養子Ｔ細胞療法の取り組みへのｍＴＯＲ阻害の使用の利点の１つは、この介入が、Ｔセントラルメモリーサブセット（ＴＣＭ）またはＴ幹細胞メモリーサブセット（ＴＳＣＭ）などの、より原始的な分化状態を有するＴ細胞の製造を促進することができることである。エクスビボでラパマイシンを使用した以前の研究では、エクスビボでのラパマイシンがＴＣＭ表現型のＴ細胞の製造に有効であることが見出され；この結果は、Ｔ細胞メモリー状態の制御におけるｍＴＯＲの既知の役割と一致する。製造中にＴＣＭおよび／またはＴＳＣＭ状態を促進することが重要であり、なぜなら、より原始的な分化状態のＴ細胞は、養子移入後に長期の生着が増加し、実験モデルにおいて増加したインビボ効果を媒介するからである。ＷＮＴシグナル伝達の促進のためのＧＳＫ３阻害剤の使用、ＡＫＴシグナル伝達の阻害、およびＰＩ３キナーゼシグナル伝達の阻害を含む、限られた分化状態のＴ細胞の製造を促進するためのいくつかの他の方法論が記載されている。
我々は、Ｔ細胞を播種し、外来性サイトカインを欠き、ｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムスおよびモノクローナル抗体添加を介するＩＬ－２受容体遮断を含有した５％ヒトＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中でインキュベートする方法を開発した。この方法は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激の前に、およそ１６時間の「プレインキュベーション」を組み込んだ。我々の知る限り、この方法はこれまで報告されていない。
これらのますます厳しい培養条件を評価するための最初のステップとして、培養区間（Ｔｈ１製造の場合、６日間の培養区間）の終わりに生存細胞が存在するかどうかで定義されるように、様々な条件下でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の培養が実行可能であるかどうかを評価した。図２Ａ～図２Ｂでは、示されるように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を様々な条件下で培養物中に入れた。Ｔ細胞に対する３／２８ビーズの比は、３：１、１：１、または１：３のいずれかであった。Ｔ細胞は、培養物への添加と同時に（「一晩のプレインキュベーションなし」）、または一晩の１６時間のプレインキュベーション後のいずれかで共刺激された。いくつかの条件では、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した）。ｍＴＯＲ阻害のために、テムシロリムスを１．０もしくは０．１μＭのいずれかで添加し、または、対照のｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンを１．０μＭの濃度で添加した。ほとんどの培養物には、Ｉ型サイトカイン促進剤である、ＩＦＮ－α（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）も補充した。示されるように、培養条件のほとんどは、外来性ＩＬ－２の付加を含まなかった。Ｔ細胞収量を、培養６日後に計算し、培養開始（「０日目投入培養物」）と比較した。
図２Ａ～図２Ｂが示すように、ｍＴＯＲ阻害（１．０μＭまたは０．１μＭのいずれかでのテムシロリムスの使用、１．０μＭでのラパマイシンの対照使用）およびＩＬ－２受容体遮断（ダクリズマブ）だけでなく、共刺激の減少（３：１のビーズ対Ｔ細胞から１：１および１：３の比への減少）および一晩のプレインキュベーションを含むように培養条件を変更すると、対照のＴ細胞培養と比較して同様の数の生存Ｔ細胞が得られた。
Ｔｈ１／Ｔｃ１製造におけるプレインキュベーションおよび高用量テムシロリムスの重要性。Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞産物の凍結保存の時点で（培養終了時）、Ｔ細胞がＴＣＭ表現型に加えて比較的静止した表現型を有することが重要である。すなわち、ラパマイシンで生成されたＴ細胞が、養子移入時に非常に少量のサイトカインを分泌したが、インビボで大量のサイトカインをもたらしたことを以前に発見した。注目すべきことに、他の細胞は、細胞産物エフェクター機能（最小）とインビボエフェクター機能（最大）との間に同様の逆相関を特定している。養子移入時のＴ細胞静止は、移入後のＴ細胞生存を改善することができ、他の形態の養子Ｔ細胞療法、特に遺伝子組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法後の罹患率および死亡率の原因であるサイトカイン放出症候群のリスクを減少させるためにも重要であり得る。
これを評価するために、我々は、細胞培養の終了時（６日目）に製造されたＴ細胞のサイトカイン分泌潜在能力を試験し、次いで、最大の共刺激（３／２８ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）および阻害剤を含まない培地での増殖後、エクスビボ増殖の１週間後に再び試験した。
図３Ａ～図３Ｂにおいて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、共刺激（３／２８ビーズ対Ｔ細胞の１：１比）の前に１６時間のプレインキュベーション間隔あり、もしくは、なしのいずれかで６日間培養した。示されるように、テムシロリムスを１．０または０．１μＭのいずれかの濃度で添加し、全ての培養物にＩＦＮ－α（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）およびダクリズマブ（５０μｇ／ｍｌ）を補充した。培養の６日目に、得られたＴ細胞を、３／２８のビーズの３：１の比で使用して２４時間共刺激し、ルミネックスアッセイにより上清をサイトカイン含有量について試験した（結果は、２４時間当たりの１００万個の細胞当たりで分泌されるサイトカイン１ｍｌ当たりのｐｇとして記載される）。加えて、得られたＴ細胞を３／２８ビーズの３：１の比で共刺激し、外来性サイトカインまたは阻害剤を含まない培地を使用して培養で１週間維持し、このＴ細胞培養後、培養の１３日目にＴ細胞を収集し、３／２８ビーズで再刺激し（比３：１）、２４時間の上清を上記のようにサイトカイン含有量について評価した。Ｎ．Ａの略語は、該当なしを示す（アッセイを実行するにはＴ細胞の収量が不十分である）。
結果を図３Ａ～図３Ｂに示し、ＩＦＮ－γ分泌を図３Ａに、ＴＮＦ－α分泌を図３Ｂに図示する。いずれの場合も、６日目のＴ細胞サイトカイン潜在能力を左パネルに示し、１３日目のＴ細胞サイトカイン潜在能力を右パネルに示す。
これらのデータは、高用量テムシロリムス（１．０μＭ）が、一晩のプレインキュベーション条件およびプレインキュベーションなしの条件の両方において、最大共刺激の２４時間後に６日目のＴ細胞ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の望ましい非常に低いレベルをもたらしたことを示す。注目すべきことに、０．１μＭの濃度でのテムシロリムスの使用は、６日目のＴ細胞サイトカイン分泌潜在能力を部分的に減少させたのみである。したがって、我々の方法では、テムシロリムスをより高い濃度、すなわち、少なくとも１μＭで使用する必要がある。これらのデータはまた、一晩のプレインキュベーション介入が単独で使用された場合、静止Ｔ細胞表現型をもたらすのに十分ではないことを示す。したがって、完全な所望の結果を達成するためには、一晩のプレインキュベーションステップを高用量テムシロリムスと組み合わせて使用する必要がある。
さらに、この方法は、初期のＴ細胞静止と、その後の再刺激後の結果として生じるエフェクター機能の増加との間の所望の逆相関をもたらす。すなわち、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の１３日目のＴ細胞値の両方について、６日目のサイトカイン潜在能力の最低レベルの条件（プレインキュベーション＋高用量テムシロリムスの組み合わせ）が、１３日目のサイトカイン分泌値の最高値をもたらした。注目すべきことに、一晩のプレインキュベーションなしでの高用量テムシロリムスからなる条件は、培養の１３日目にサイトカイン分泌潜在能力を評価するのに十分な収量をもたらさなかったので、この結果は、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞生成のための高用量テムシロリムス＋プレインキュベーションステップの価値をさらに裏付けている。
新しい組み合わせ方法は、ｍＴＯＲ阻害の強化およびＳＴＡＴ５リン酸化の抑止をもたらす。所望の表現型のＴ細胞を製造するための新しい組み合わせ方法（ｍＴＯＲ阻害、ＩＬ－２受容体遮断、共刺激の遅延のためのプレインキュベーション、およびより低い強度の共刺激の使用）の能力は、ラパマイシン耐性Ｔ細胞表現型と以前関連していた分子および細胞事象を制御する能力の増加に部分的に依存している。
この表現型の１つの構成要素は、タンパク質翻訳を制御するのに役立つ、４ＥＢＰ１レベルで生じるようなｍＴＯＲ依存性シグナル伝達事象の制御である。これに対処するために、高レベルの共刺激（３／２８ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）、高用量ラパマイシン（１．０μＭ）、およびサイトカイン添加（ＩＬ－２＋ＩＦＮ－α）を加えた培養物へのＴ細胞の同時添加を組み込んだＴ－Ｒａｐａ法を使用して、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞を製造した。対照による比較で、我々は、本開示の新しい組み合わせ方法（１６時間のプレインキュベーションステップ、減少レベルでの共刺激（１：１の比）、テムシロリムス（１．０μＭ）およびダクリズマブ（５０μｇ／ｍｌ）、ならびにＩＬ－２なしでＩＦＮ－αのみの添加を使用してＴ細胞を製造した。
図４では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、我々の以前の方法論［「Ｔ－Ｒａｐａ」：高レベルの共刺激（３／２８ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）、高用量ラパマイシン（１．０μＭ）、およびサイトカイン添加（ＩＬ－２＋ＩＦＮ－α）の添加による培養への同時Ｔ細胞添加］、または製造されたＴ細胞のための新しい組み合わせ方法論［「Ｒａｐａ－Ｔ」：１６時間のプレインキュベーションステップ；減少したレベルでの共刺激（１：１の比）、テムシロリムス（１．０μＭ）およびダクリズマブ（５０μｇ／ｍｌ）の両方の使用、およびＩＬ－２なしでＩＦＮ－αのみの添加］を使用して培養した。Ｔ細胞培養の１６時間および３２時間で、Ｔ細胞の一部を収集し、タンパク質を単離し、ハウスキーピング遺伝子β－アクチンおよびｍＴＯＲ経路分子リン－４ＥＢＰ１のウェスタンブロット分析を定量化した。結果を、任意のＴ細胞活性化の前の０日目の投入Ｔ細胞から得られたタンパク質と比較した。
図４が示すように、製造されたＴ細胞を生成するための新しい組み合わせ方法（図４の「Ｒａｐａ－Ｔ」）は、１６時間および３２時間の両方の培養時点で、我々の前述の方法（「Ｔ－Ｒａｐａ」）を使用して製造されたＴ細胞と比較して、ｍＴＯＲ経路（４ＥＢＰ１のリン酸化によって測定される）の活性化の減少をもたらした。
Ｐ７０Ｓ６キナーゼは、ｍＴＯＲ経路における追加の重要分子である。図５および図６では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、我々の以前の方法論［「Ｔ－Ｒａｐａ」：高レベル共刺激（３／２８ビーズ対Ｔ細胞比、３：１）、高用量ラパマイシン（１．０μＭ）、およびサイトカイン添加（ＩＬ－２＋ＩＦＮ－α）の添加による培養への同時Ｔ細胞添加、または製造されたＴ細胞を生成するための新しい組み合わせ方法論［「Ｒａｐａ－Ｔ」：１６時間プレインキュベーションステップ；減少したレベルでの共刺激（１：１比）、テムシロリムス（１．０μＭ）およびダクリズマブ（５０μｇ／ｍｌ）の両方の使用、およびＩＬ－２なしでＩＦＮ－αのみの添加］を使用して培養した。Ｔ細胞培養の１６時間および３２時間で、Ｔ細胞の一部を収集し、タンパク質を単離し、ハウスキーピング遺伝子β－アクチンおよびｍＴＯＲ経路分子Ｐ７０Ｓ６Ｋ（図５）またはリン酸化ＳＴＡＴ５（図６）のウェスタンブロット分析を定量化した。結果を、任意のＴ細胞活性化の前の０日目の投入Ｔ細胞から得られたタンパク質と比較した。
好対照に、製造されたＴ細胞を生成するための新しい組み合わせ方法を使用した製造は、Ｐ７０Ｓ６Ｋのレベルを大幅に鈍化させた（図６、Ｒａｐａ－Ｔ条件）。これらのデータは、Ｔｈ１／Ｔｃ１製造の組み合わせ方法がｍＴＯＲ活性化に対する改善された制御を提供するというさらなる証拠を提供する。ラパマイシン耐性Ｔ細胞を製造する以前の製造方法を使用して、１６時間および３２時間のＴ細胞培養の両方でＰ７０Ｓ６Ｋの実質的なアップレギュレーションを見出した（図５、Ｔ－Ｒａｐａ条件）。
組み合わせ方法は、Ｔｈ１型細胞の純度の向上（ＦｏｘＰ３発現細胞による混入の減少）に関連していた。以前の製造方法では、実質的なＳＴＡＴ５リン酸化が生じ（図６、Ｔ－Ｒａｐａは、１６時間および３２時間の培養で得られる）、好対照に、組み合わせアプローチは、ＳＴＡＴ５リン酸化を無効にする（図６、Ｒａｐａ－Ｔは、１６時間および３２時間の培養で得られる）。
したがって、新しい組み合わせ方法は、Ｔ細胞製造中のｍＴＯＲシグナル伝達の制御の増加、およびＴＲＥＧ細胞による混入を促進するシグナル伝達事象の廃止（ＳＴＡＴ５リン酸化の制御）に関しても有利である。
Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞生成の組み合わせ方法の個々の構成要素のさらなる描写。さらなる培養を確立して、得られたＴｈ１／Ｔｃ１表現型に対する培養介入の個々の寄与に関する追加の情報を得た。図７～図１０では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、図７～図１０に示すように、様々な３／２８ビーズ比、ｍＴＯＲ阻害の様々な方法、抗ＩＬ－２受容体遮断の可変的添加、Ｉ型極性化サイトカインＩＦＮ－αの可変的添加、および最初の一晩のプレインキュベーションステップの可変的使用を使用して、培養した。繰り返し共刺激（３：１のビーズ比）によって生成された上清を培養の６日目および１３日目に収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって、ＩＦＮ－γ（図７Ａ～図７Ｂ）、ＴＮＦ－α（図８Ａ～８Ｂ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図９Ａ～図９Ｂ）、またはＩＬ－２（図１０Ａ～図１０Ｂ）含有量について試験した（結果は、２４時間当たりの１００万個の細胞当たりで１ｍｌ当たりのｐｇとして表される）。
図７Ａ～図７Ｂは、培養終了時（６日目）および阻害剤の非存在下でのさらなる培養の１週間後（１３日目）のＩＦＮ－γ分泌結果を示す。所望の表現型は、６日目の比較的低いサイトカイン分泌値と、１３日目の比較的高いサイトカイン値から構成される。図７Ａ～図７Ｂでは、組み合わせられた要素のそれぞれを含む培養条件（低レベルの共刺激［１：１比］、一晩のプレインキュベーション後の遅延された共刺激、極性化サイトカインＩＦＮ－αの添加、ｍＴＯＲ阻害剤の添加［この実験では、０．１μＭの準最適濃度の使用］、および抗ＩＬ－２受容体抗体ダクリズマブの含有）は、この条件が６日目のＩＦＮ－γ分泌では減少したが、１３日目のＩＦＮ－γ分泌では高いという点で望ましい表現型を有していたことを実証する。これらの要素のうちの１つ以上を省略したＴ細胞培養条件は、６日目で高いサイトカイン値、および／または１３日目に低い値を有する傾向にあった。加えて、ラパマイシン耐性Ｔ細胞（Ｔ－Ｒａｐａ；図７Ａ～図７Ｂ）を製造するための以前の方法は、サイトカイン分泌のあまり好ましくないパターンを発現した（６日目で高い値、１３日目で低い値）。
Ｔｈ１／Ｔｃ１製造の組み合わせ方法はまた、以下のサイトカインを評価した場合、好ましいサイトカイン表現型が得られた（６日目の値の減少と１３日目の値の増加と組み合わせた）：ＴＮＦ－α（図８Ａ～図８Ｂ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図９Ａ～図９Ｂ）、およびＩＬ－２（図１０Ａ～図１０Ｂ）。
総合すると、これらの結果は、製造されたＴ細胞製造の新しい方法が、以前のＴ－Ｒａｐａ法と比較して重要な利点を有するというさらなる証拠を提供する。
組み合わせ方法論を使用したＴｈ１／Ｔｃ１細胞製造に関連する分子変化。我々は、組み合わせ方法論を使用して、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞製造中に変更される分子を特徴付けるために追加の実験を行った。そのような情報は、Ｔ細胞表現型の理解の向上につながる可能性があるだけでなく、そのような情報が品質管理要素として製造中に利用できるため、貴重である。加えて、かかる情報は、将来の製造の取り組みで使用され得る追加の組み合わせステップのスクリーニング中に使用することができる。
以前の取り組みでは、ラパマイシン耐性Ｔ細胞がＴ細胞製造中にオートファジーを受けたことを見出した。オートファジーは、ｍＴＯＲ阻害の直接的な結果であることが昔から知られている：ｍＴＯＲが活性化されると、Ｔ細胞は成長および増殖状態を維持する（オートファジーシグナルがオフになる）、対照的に、ｍＴＯＲが阻害されると、オートファジーが促進され、それによって、ミトコンドリア体積の減少（マイトファジー）を含むＴ細胞体積の減少がもたらされる。実際、オートファジーはＴ細胞生物学において必要な恒常的プロセスであり、エネルギー要件を減らし、細胞内小器官および他の細胞破片を排除できるため、Ｔ細胞の健康に関連している。
図１１～図１３では、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、１６時間のプレインキュベーション間隔を使用して培養した後、３／２８ビーズを１：３のビーズ対Ｔ細胞の減少した比率で添加した。図１１～図１３に示されるように、種々のＴ細胞培養物は、ｍＴＯＲ阻害の様々な方法（１．０μＭのラパマイシン、１．０または０．１μＭのテムシロリムス）、外来性ＩＬ－２添加の様々な条件、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体であるダクリズマブの添加に関連する様々な条件を受けた。１６時間のプレインキュベーション間隔の後、Ｔ細胞培養物から細胞を収集し、タンパク質を単離し、ｐ６２（図１１）、ホスホ－ラプター（図１２）、またはＢＩＭ（図１３）およびハウスキーパー遺伝子β－アクチンをウェスタンブロットで定量した。
我々は、オートファジーマーカーｐ６２のＴ細胞発現によって測定するものとして、オートファジーを促進する組み合わせ方法の能力を評価した。図１１が示すように、プレインキュベーションステップ、低レベルの共刺激（１：３の３／２８ビーズ対Ｔ細胞比）、ＩＬ－２受容体のダクリズマブ遮断、およびｍＴＯＲ阻害剤を含む組み合わせ方法は、オートファジーマーカーｐ６２をアップレギュレートした。これらの要因のそれぞれが存在する場合、ラパマイシン（１μＭ）またはテムシロリムス（１．０または０．１μＭ）によるｍＴＯＲ阻害によってオートファジーを実現することができる。レジメンからのＩＬ－２受容体遮断の排除は、オートファジーの誘導を実質的に鈍化させた。
さらに、組み合わせ方法は、リン酸化型のラプターの発現の減少によって示されるように、ｍＴＯＲ経路の阻害の改善をもたらした（図１２）。注目すべきことに、高用量テムシロリムスを組み込んだ組み合わせ方法では、低用量テムシロリムスまたは高用量ラパマイシンを使用した場合と比較してより低いレベルのホスホ－ラプターが得られた。
また、アポトーシス促進性メンバーのｂｃｌ－２遺伝子ファミリーである、ＢＩＭの製造されたＴ細胞発現を評価した。ｂｃｌ－２ファミリーメンバーは、主にミトコンドリアのレベルで動作するため、ミトコンドリアオートファジー（マイトファジー）は、アポトーシス閾値を決定するのに役立つｂｃｌ－２ファミリーメンバー遺伝子のバランスに影響を与え得る。マイトファジーは、アポトーシス閾値を下げるという点で有益であることが示されており、潜在的に、ｂｃｌ－２ファミリーの分子の好ましくないバランスを有するミトコンドリアを選択的に排除する。我々は、組み合わせの製造方法により、ＢＩＭの発現の減少をもたらしたことを見出した（図１３）。
要約すると、これらの実験は、増強したオートファジー、減少したｍＴＯＲシグナル伝達、および減少したアポトーシス促進性分子発現が、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞製造の組み合わせ方法と関連していることを示す。これらの変化は、製造されたＴ細胞のインビボ機能の増加に寄与する可能性が高く、したがって、品質管理ステップとして、またはＴ細胞製造の将来の次世代方法をスクリーニングするために使用することができる。
組み合わせ方法は、Ｔ細胞の静止、Ｔ細胞の分化を促進する。我々は、プレインキュベーションステップ、低レベルの共刺激（１：３の３／２８ビーズ対Ｔ細胞比）、ＩＬ－２受容体のダクリズマブ遮断、およびｍＴＯＲ阻害剤の組み込みによって定義される組み合わせ方法によって製造されたＴｈ１／Ｔｃ１細胞の表面表現型を特徴付けるために追加の実験を実行した。まず、幹細胞メモリーサブセットのＴ細胞を含むＴ細胞ナイーブティ（ｎａｉｖｅｔｙ）のマーカーであるＣＤ４５アイソフォームＲＡのＴ細胞発現に対する培養変数（ｃｕｌｔｕｒｅ ｖａｒｉａｂｌｅ）の効果を評価した。したがって、ＣＤ４５ＲＡの発現を維持または増加させるＴ細胞製造方法の開発が望ましい。
図１４Ａ～図１５Ｄについては、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、図１４Ａ～図１５Ｄに示されるように、様々な３／２８ビーズ比、ｍＴＯＲ阻害の様々な方法、抗ＩＬ－２受容体遮断の可変的添加、Ｉ型極性化サイトカインＩＦＮ－αの可変的添加、および初期一晩のプレインキュベーションステップの可変的使用を使用して、培養した。培養６日目に、Ｔ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＣＤ４細胞サブセットにおけるＣＤ４５ＲＡ（図１４Ａ～図１４Ｄ）またはＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７（図１５Ａ～図１５Ｄ）の発現について評価し、結果を培養０日目の発現レベル（「０日目投入培養物」）と比較した。
図１４Ａ～図１４Ｄが示すように、組み合わせ方法の重要な要素なしでのＴ細胞の製造（３：１のビーズ対Ｔ細胞比での高共刺激の使用、ダクリズマブの使用なし、ｍＴＯＲ阻害剤の使用なし）は、ＣＤ４５ＲＡ発現の急速な悪化をもたらす（カラム＃２を参照されたい）。対照的に、これらの構成要素の全ての使用は、ＣＤ４５ＲＡ発現の完全な保存をもたらした（カラム＃４を参照）。注目すべきことに、我々が同定した以前の製造方法を使用して増殖したＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡの発現を最適に保存していなかった（Ｔ－Ｒａｐａ細胞、図１４Ｂ、カラム＃３）。
加えて、組み合わせ方法がＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７を含むＴ細胞分化の減少した他のマーカーをもたらしたかどうかを評価した。図１５Ａ（カラム＃４）は、プレインキュベーションステップ、低レベルの共刺激、ＩＬ－２受容体の抗体遮断、およびｍＴＯＲ阻害剤を使用して製造されたＴ細胞が、これらのＴ細胞マーカーの共発現を増加させたことを示す。注目すべきことに、我々が同定した以前の製造方法を使用して増殖したＴ細胞は、これら３つのメモリーマーカーの発現を最適に増加させなかった（Ｔ－Ｒａｐａ細胞、図１５Ａ、列＃３）。
したがって、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞製造の組み合わせ方法は、制限された分化状態のＴ細胞を製造する点で有利であり、インビボ効果の増加を媒介することを明確かつ再現可能に示している。
組み合わせ方法は、培養開始時にＴ細胞純度を下げることによって最適化される。Ｔ細胞製造の場合、培養投入集団がＴ細胞含有量について高度に精製されなければならないか、または単球などの付属細胞集団が許容され得るかどうかを決定することが重要である。経済的コストおよび労務の観点から、一般に、高度に精製されない集団で培養を開始することが望ましい。しかしながら、培養開始時に混入している細胞集団は、Ｔ細胞増殖または所望のＴ細胞表現型の生成に悪影響を与え得る。このパラメータを評価するために、Ｔ細胞含有量が１００％、６６％、３３％、または１０％純度のいずれかであった投入集団を使用した組み合わせ方法を使用して培養を開始した（残りの細胞集団は主に単球であった）。
図１６～図２０では、培養開始前に、投入細胞集団を、Ｔ細胞の純度が１００％、６６％、３３％、または１０％のいずれかであるように調整し、残りの細胞集団は、末梢血単核細胞（主に単球）に含まれる非Ｔ細胞集団から構成された。示されるように、Ｔ細胞を、テムシロリムスを可変的に含有するか、または含有しない培地（１．０または０．１μＭのいずれかの濃度）で増殖させ、加えて、培養物は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ビーズ共刺激（１：３比）の前に１６時間のプレインキュベーションまたはプレインキュベーションなしを可変的に含んだ。示される各培養物を、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブ（５０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ－α（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）を含有する培地中で増殖させた。６日間の製造区間の終わりに、Ｔ細胞は、高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を受けた。図１６では、高レベルの共刺激の後、次に、Ｔ細胞を、阻害剤を含まない培地中で１週間増殖（ｅｘｐａｎｄ）させた。この増殖区間の終わりに、Ｔ細胞を数え上げ、０日目の投入数と比較してグラフ化した。図１７～図１８では、高レベルの共刺激の後、Ｔ細胞を培養１３日目まで増殖させた。６日目および１３日目の両方で、Ｔ細胞を共刺激し、２４時間上清をＩＦＮ－γ（図１７Ａ～図１７Ｂ）またはＴＮＦ－α（図１８Ａ～図１８Ｂ）含有量について評価した（結果は、２４時間当たりの１００万個の細胞当たりで１ｍｌ当たりのｐｇで示される）。図１９～図２０では、高レベルの共刺激の後、Ｔ細胞を培養１３日目まで増殖させた。６日目および１３日目の両方で、Ｔ細胞を、ＣＤ２５発現（示される結果は、ＣＤ２５を共発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントである）について（図１９）、またはＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７の発現について（図２０）、フローサイトメトリーによって評価した。
図１６に詳述されるように、培養投入時に低下したＴ細胞純度で開始された培養物は、Ｔ細胞増殖のためのより大きな容量をもたらし、この関係は用量依存的様態で生じる。注目すべきことに、一晩のプレインキュベーションステップを使用して増殖させたＴ細胞は、培養開始時に共刺激されたＴ細胞と比較してより大きな増殖を有した。これらのデータは、組み合わせ方法にさらなる支持を提供し、そうでなければ混入物質と見なされ得る培養開始時の細胞集団が、実際にＴ細胞増殖の可能性を促進するように見えることを示す。したがって、組み合わせ方法の最適化された使用には、培養開始時に高度に富化されていないＴ細胞の使用も含まれるべきであり、品質保証のために、非限定的な例として、Ｔ細胞含有量に対して６６％または３３％の純度の接種菌液で各培養を開始することによって純度レベルを制御することが重要であり得る。図１７Ａ～図１７Ｂおよび１８Ａ～図１８Ｂに詳細に記載されるように、組み合わせ方法および高度に精製されていない投入Ｔ細胞を使用して製造されたＴ細胞は、所望のサイトカイン分泌パターンをもたらし、すなわち、（図１７Ａ～図１７Ｂ）製造終了時（６日目）のＩＦＮ－γ分泌を減少させ、阻害剤を含まない培地での１週間増殖させた後（１３日目）のＩＦＮ－γ分泌を増加させ、および（図１８Ａ～図１８Ｂ）製造終了時（６日目）のＴＮＦ－α分泌を減少させ、阻害剤を含まない培地での１週間増殖させた後（１３日目）のＴＮＦ－α分泌を増加させた。
加えて、Ｔ細胞の純度が減少した投入集団を使用して、組み合わせ方法で製造されたＴ細胞における細胞表面マーカー発現を評価した。図１９に示すように、かかるＴ細胞は、製造終了時（６日目）にＣＤ２５発現を減少させ、静止表現型と一致した。阻害剤なしでの培養の１週間後、Ｔ細胞はＣＤ２５を大幅にアップレギュレーションした。図２０に示すように、かかるＴ細胞はまた、メモリーマーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７の共発現を増加しており、その後、これらのマーカーは、１週間のＴ細胞増殖後に減少した。
要約すると、これらのデータにより、組み合わせ方法を使用したＴｈ１／Ｔｃ１細胞の製造が、非Ｔ細胞集団が実質的に混入している投入Ｔ細胞を使用して可能であることを示している。実際、そのような非Ｔ細胞集団の意図的な包含は、Ｔ細胞収量を改善し、結果として生じるＴ細胞メモリープロファイルを改善するために利用され得る。
凍結保存された細胞基質からの製造。以前に収集したＰＢＳＣ産生物の場合、そのような凍結保存された細胞は、細胞の解凍およびＲａｐａ－Ｔ細胞の製造まで液体窒素の気相に保管される。アフェレーシスによって、または将来的に単純な採血によって単離したばかりの細胞の場合、細胞は即座に処理され、その後、培養物に直接入れられ得るか、または制御された速度の凍結技術によって凍結保存され得、後で使用するために液体窒素の気相に保管され得る。
新たに単離された細胞集団からの培養に代わる凍結保存細胞基質からのＴ細胞培養は、例えば、モノクローナル抗体およびカラム技術（陽性または陰性選択）の使用による、ある種類のＴ細胞富化を必要とする。Ｒａｐａ－Ｔ製造で使用される原料細胞の富化は、Ｔ細胞が培養区間中に効率的に富化されるため、かかる抗体ベースの方法論を必要としない、したがって、我々の方法は、グローバルレベルでの効果的な細胞療法のための推奨事項と一致する。Ｒａｐａ－Ｔ細胞の製造のための初期処理ステップは、凍結保存ステップ（該当する場合）で使用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の除去、赤血球（ＲＢＣ）の溶解、および混入顆粒球およびある程度の単球の遠心除去に焦点を当てる。これらのステップは、主にクローズドシステム技術を使用して比較的自動化された方法で実行され、この手順は、ヒューマンエラーを減少させ、バッチレコードの詳細な製造データを提供し、製造実行全体の一貫性を向上させ、最終産物の感染性因子の汚染のリスクを減少させるため有利である。Ｒａｐａ－Ｔ産生物の処理には、以下のステップが組み込まれている：（１）感染性因子の汚染を減らすために、固体、非水系の方法を使用する凍結保存された産生物の解凍（該当する場合）、（２）ＬＯＶＯ透過性膜デバイスを使用した細胞産生物の自動洗浄、（３）ＬＯＶＯ洗浄ステップ中の塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）緩衝液を使用したＲＢＣの溶解物の統合、（４）ＬＯＶＯ法を使用した細胞内容物の体積減少、その後の細胞の閉鎖系の、対向流、遠心溶出（ＣＣＥ）デバイス（Ｅｌｕｔｒａ、Ｔｅｒｕｍｏ）への播種、ならびに（５）ＣＣＥによる顆粒球および単球の効率的な除去のためのＥｌｕｔｒａデバイスの事前にプログラムされた操作。
このリンパ球富化および培地精製後、細胞は、酸素交換のための豊富な容量を有する特殊チャンバー（Ｇ－Ｒｅｘ容器、Ｗｉｌｓｏｎ－Ｗｏｌｆ）に播種される。強化されたガス透過性特性に加えて、Ｇ－Ｒｅｘ容器は閉鎖系ユニットであり、自動化された閉鎖系培地体積減少という追加の利点を有する（ＧａｔｈｅＲｅｘ液体ハンドリングポンプ）。リンパ球富化細胞は、Ｇ－Ｒｅｘ容器内で６日間維持される。
いくつかの特定の培養条件を利用して、製造されたＴ細胞の機能的属性を有するＧ－Ｒｅｘ容器中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物の製造を促進することができる。これらの特定の条件は次のとおりである：（１）５％ヒト血清をさらに補充した富化培地（Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｌｏｎｚａを含むがこれらに限定されない）の使用、（２）共刺激の前に、Ｇ－Ｒｅｘ内に播種した細胞の１６時間の休止区間を組み込む（細胞は１ｍｌ当たり１．５×１０６個の細胞の比較的高密度で播種される）、（３）この初期休止区間中、細胞は、モノクローナル抗体バシリキシマブ（ＩＬ－２受容体を遮断し、それにより内因的に産生されるＩＬ－２による自律型Ｔ細胞活性化を防止する）およびテムシロリムス（ｍＴＯＲＣ１の薬理学的阻害剤である）の添加によって最適に休止される、（４）この１６時間休止区間の後、細胞は、共刺激されないか、または準最適条件下で１：３のビーズ対Ｔ細胞比によって定義されるような、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ（３／２８ビーズ）で共刺激されるかのいずれかである（通常、ほとんどのＴ細胞増殖条件は、９倍高いレベルの共刺激、３：１のビーズ対Ｔ細胞比を利用する）、（５）重要なことに、初期休止区間後にＴ細胞が洗浄されないことが不可欠であり、（６）休止区間後、３／２８ビーズの追加に加えて、ＣＤ４＋Ｔｈ１およびＣＤ８＋Ｔｃ１表現型への分化を促進するために、極性化サイトカインＩＦＮ－αを高用量（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）で添加することが不可欠であり、（７）重要なことに、Ｔ細胞培養物に一般的な添加剤であるＩＬ－２の添加を避けることが重要である、ならびに（８）ビーズおよびＩＦＮ－αの添加後、培養の６日目に収集するまで細胞を乱さないままにすること（細胞洗浄なし、さらなる培養添加物なし）が重要である。
製造されたＴ細胞の凍結保存。１）Ｇ－Ｒｅｘ容器内で６日間の細胞培養後、ＧａｔｈｅＲｅｘ機器により、培養物の体積を閉鎖系様式で減少させることができる。その後、細胞を収集し、３／２８ビーズを手持ち磁石によって除去し、細胞をＬＯＶＯデバイスに入れて細胞を連続洗浄し、＞９９％の培養添加物（テムシロリムス、バシリキシマブ、ＩＦＮ－α）を除去することができる。
洗浄された細胞は、５％のＤＭＳＯおよび５％のペンタスターチを含有する凍結保存培地に再構成することができる。凍結保存は、５０ｍｌのフリーザーバッグ中で複数の単回使用アリコートで実施される。Ｒａｐａ－Ｔ細胞は、ＧＭＰ準拠の制御速度凍結方法によって凍結保存され、Ｒａｐａ－Ｔ細胞が指定された放出基準試験に合格した後、認定されたクライオシッパー（ｃｒｙｏ－ｓｈｉｐｐｅｒ）による液体窒素の気相で出荷される。
Ｒａｐａ－Ｔ細胞の放出基準試験には、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞純度の含有量などの標準試験が含まれる（最終産物は、フローサイトメトリーによる＞７０％のＣＤ３＋Ｔ細胞含有量であり得、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットはそれぞれ、５％レベルで存在し得る）。細胞は、フローサイトメトリーのアネキシンおよび７－ＡＡＤアッセイによって決定される場合、＞７０％の生存率であり得る。さらに、細胞は、最低３日間の培養間隔（理想的には１４日間の培養間隔）で細菌および真菌の混入がないようにする必要があり、さらに、細胞産物は、細菌性ＬＰＳエンドトキシンの検出限界を下回る必要がある。
これらの標準試験に加えて、特殊機能試験は、Ｒａｐａ－Ｔ細胞産物の放出基準を構成する。産物および細胞療法の放出前に、Ｒａｐａ－Ｔ細胞は、培養投入Ｔ細胞と比較して以下の属性を有することができる：（１）ＣＤ６２リガンドおよびＣＣＲ７のフローサイトメトリー共発現の増加によって定義される、強化されたＴセントラルメモリー表現型；（２）プログラム死－１（ＰＤ１）などのチェックポイント阻害分子の低レベル発現；（３）最大共刺激時のＴｈ１／Ｔｃ１型サイトカイン分泌のレベルの減少によって定義される、休止状態；（４）フローサイトメトリーのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイによるミトコンドリア質量の減少によって証明される、オートファジーシグネチャ、（５）ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２下流標的の少なくとも５０％の阻害によって証明される、耐性表現型、ならびに（６）ｎ＝８０個の主要転写因子および分化分子の多面的な差次的遺伝子発現プロファイル。
図２１は、新しいＲａｐａ－Ｔ方法がビーズ共刺激を使用しないか、または低レベルのビーズ共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の１：３の比）を使用するかに関係なく、新しいＲａｐａ－Ｔ方法が、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してナイーブマーカーまたはＴセントラルメモリーマーカーの発現が増加したＴ細胞を生成することを示す。図２１において、Ｒａｐａ－Ｔ１細胞は、前述のように、ビーズ共刺激なし（各パネルの最初の２つのカラム）または１：３のビーズ対Ｔ細胞共刺激（各パネルの３番目および４番目のカラム）のいずれかで、ＩＦＮ－α、テムシロリムス、およびバシリキシマブにおける培養によって生成され、結果を、以前のＴ－Ｒａｐａ方法（ラパマイシンおよび３：１のビーズ対Ｔ細胞の使用；各パネルの５番目および６番目のカラム）を使用した培養と比較した。フローサイトメトリーを培養の最後に実施し、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット（黒色カラム）およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（灰色カラム）の両方について詳細な結果を得た。示される結果は、ＣＤ４５ＲＡ＋発現によって定義されるナイーブＴ細胞サブセット（左パネル）についての、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の共発現によって定義されるＴセントラルメモリーサブセットについての、ならびにＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７を共発現するより原始的なＴ細胞サブセットについてのものである。
図２１に詳述されるように、方法が、ビーズ共刺激を伴わないまたはＴ－Ｒａｐａ方法と比較して減少したレベルでの共刺激を伴う条件を含めて、本開示に記載の方法に従って製造されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、フローサイトメトリーによるナイーブおよびＴセントラルメモリーマーカーの発現レベルが増加している。
図２２は、新しいＲａｐａ－Ｔ方法がビーズ共刺激を使用しないか、または低レベルのビーズ共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の１：３の比）を使用するかに関係なく、新しいＲａｐａ－Ｔ方法が、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、およびＴＩＭ３の発現が減少したＴ細胞を生成することを示す。図２２において、Ｒａｐａ－Ｔ１細胞は、前述のように、ビーズ共刺激なし（各パネルの最初の２つのカラム）または１：３のビーズ対Ｔ細胞共刺激（各パネルの３番目および４番目のカラム）のいずれかで、ＩＦＮ－α、テムシロリムス、およびバシリキシマブにおける培養によって生成され、結果を、以前のＴ－Ｒａｐａ方法（ラパマイシンおよび３：１のビーズ対Ｔ細胞の使用；各パネルの５番目および６番目のカラム）を使用した培養と比較した。フローサイトメトリーを培養の最後に実施し、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット（黒色カラム）およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（灰色カラム）の両方について詳細な結果を得た。示される結果は、ＩＬ－２受容体ＣＤ２５の発現についての（左パネル）、免疫抑制性分子およびＴＲＥＧ関連分子ＣＴＬＡ４についての、ならびに免疫チェックポイント分子ＴＩＭ３についてのものである。
図２２に列挙されるように、方法が、ビーズ共刺激を伴わないまたはＴ－Ｒａｐａ方法と比較して減少したレベルでの共刺激を伴う条件を含めて、本開示に記載の方法に従って製造されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、フローサイトメトリーにより、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、Ｔ細胞活性化およびＴＲＥＧ細胞機能に関連するＩＬ－２受容体ＣＤ２５２の発現レベルが減少し、免疫抑制分子ＣＴＬＡ４３および免疫チェックポイント阻害分子ＴＩＭ３４のレベルが減少する。
図２３は、新しいＲａｐａ－Ｔ方法がビーズ共刺激を使用しないか、または低レベルのビーズ共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の１：３の比）を使用するかに関係なく、新しいＲａｐａ－Ｔ方法が、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴｈ２対Ｔｈ１極性化の類似のパターンを有するが、増加した静止を有するＴ細胞を生成することを示す。図２３において、Ｒａｐａ－Ｔ１細胞は、前述のように、ビーズ共刺激なし（各パネルの最初の２つのカラム）または１：３のビーズ対Ｔ細胞共刺激（各パネルの３番目および４番目のカラム）のいずれかで、ＩＦＮ－α、テムシロリムス、およびバシリキシマブにおける培養によって生成され、結果を、以前のＴ－Ｒａｐａ方法（ラパマイシンおよび３：１のビーズ対Ｔ細胞の使用；各パネルの５番目および６番目のカラム）を使用した培養と比較した。サイトカイン分泌分析（ＩＬ－４およびＩＦＮ－ｇ測定）は培養の最後に実行され、結果はＴ細胞製造の最後（６日目）および阻害剤なしでさらに６日間の培養後（１２日目）に列挙された。
図２３に列挙されるように、方法が、ビーズ共刺激を伴わないまたはＴ－Ｒａｐａ方法と比較して減少したレベルで共刺激を伴う条件を含めて、本開示に記載の方法に従って製造されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、同程度のＴｈ２対Ｔｈ１サイトカイン極性化を有する。具体的には、培養の１２日目には、Ｔｈ２型サイトカインＩＬ－４の分泌レベルが低く（製造終了時［６日目］および阻害剤を含まない追加の培養期間後［１２日目］の値は、６日目および１２日目の両方で１００～２００ｐｇ／ｍｌの範囲である）、Ｔｈ１型サイトカインＩＦＮ－γの分泌レベルが高くなっている（１０００～３０００ｐｇ／ｍｌの値）。この方法がビーズ共刺激を利用していないか、または低レベルのビーズ共刺激（１：３のビーズ対Ｔ細胞比）を利用しているかに関係なく、製造終了時（６日目）の新しいＲａｐａ－Ｔ条件でのＩＦＮ－γ分泌は、旧Ｔ－Ｒａｐａ条件と比較して大幅に減少し、それによって、新しいＲａｐａ－Ｔ製造方法におけるＴ細胞静止の好ましい特徴を示す。
図２４に列挙されるように、方法が、ビーズ共刺激を伴わないまたはＴ－Ｒａｐａ方法と比較して減少したレベルで共刺激を伴う条件を含めて、本開示に記載の方法に従って製造されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴｈ１サイトカイン極性化のパターンを有する。
図２４は、新しいＲａｐａ－Ｔ方法がビーズ共刺激を使用しないか、または低レベルのビーズ共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の１：３の比）を使用するかに関係なく、新しいＲａｐａ－Ｔ法が、Ｔ－Ｒａｐａ細胞にと比較して、Ｔｈ１極性化の好ましいパターンを有するＴ細胞を生成することを示す。図２４において、Ｒａｐａ－Ｔ１細胞は、前述のように、ビーズ共刺激なしでまたは１：３のビーズ対Ｔ細胞共刺激のいずれかで、ＩＦＮ－α、テムシロリムス、およびバシリキシマブ中の培養によって生成され、以前のＴ－Ｒａｐａ法（ラパマイシンおよび３：１のビーズ対Ｔ細胞の使用）を含む、様々な対照培養物も、評価された。全ての培養物は、９×１０６個の細胞／ｍｌの濃度であり、ビーズ共刺激を有さず、ＩＬ－２添加を有さず、ＩＦＮ－αの添加の遅延を有し、１μＭの濃度のテムシロリムスおよび１０μＭの濃度のバシリキシマブを含み、特に明記しない限り、５％ＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地を使用した。図中の凡例に従った具体的な培養条件は、以下のとおりである：条件１、上記のＲａｐａ－Ｔ方法；条件２、血清を含まないＲａｐａ－Ｔ方法；条件３、バシリキシマブを含まないＲａｐａ－Ｔ方法；条件４、バシリキシマブを含まず、かつ減少させたテムシロリムス（０．１μＭ）を有するＲａｐａ－Ｔ法；条件５、テムシロリムスまたはバシリキシマブを含まないＲａｐａ－Ｔ法；条件６、高頻度の単球が混入した投入Ｔ細胞を使用するＲａｐａ－Ｔ方法（投入細胞の７９％は単球であり、約１０％の単球混入を有した全ての他の培養物から増加した）；条件７、単球混入を含まないＲａｐａ－Ｔ方法（＜１％）；条件８、ＩＦＮ－αの同時添加を使用するＲａｐａ－Ｔ方法（一晩の遅延なし）；条件９、１：３ビーズ共刺激を含むＲａｐａ－Ｔ方法；条件１０、対照のＴ細胞条件（阻害剤なし、３：１ビーズ）；および条件１１、旧Ｔ－Ｒａｐａ条件、ラパマイシン（１μＭ）、２０ＩＵ／ｍｌでのＩＬ－２、３：１ビーズ、一晩のプレインキュベーションなし。サイトカイン分泌分析（ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ測定）は培養の最後に実行され、結果はＴ細胞製造の最後（６日目）および阻害剤なしでさらに６日間の培養後（１２日目）に列挙された。
図２４に列挙されるように、方法が、ビーズ共刺激を伴わないまたはＴ－Ｒａｐａ方法と比較して減少したレベルで共刺激を伴う条件を含めて、本開示に記載の方法に従って製造されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して、Ｔｈ１サイトカイン極性化のパターンを有する。
図２４に示すように、ビーズなしで製造されたＲａｐａ－Ｔ条件である条件＃１は、特に阻害剤の非存在下でのＴ細胞増殖後１２日目に、好ましい高レベルのＩＬ－２分泌能力を有した。同様のパターンが、血清を補充していない培地で実行された条件＃２で観察され、それによって、血清補充を伴うか伴わないＲａｐａ－Ｔ細胞を製造する能力を示す。特に培養＃１１（旧Ｔ－Ｒａｐａ条件）と比較して、増加したＩＬ－２分泌能力は、新しいＲａｐａ－Ｔ製造方法が、インビボでヘルパーに依存しない様式で機能することができる分化前駆体プロファイルが低下したＴ細胞を生成することを示す。条件＃１は、共刺激の１：３のビーズ対Ｔ細胞比で製造された新しいＲａｐａ－Ｔ条件である培養＃９と比較して、この点でも有利であった。
図２４に示すように、ビーズなしで製造されたＲａｐａ－Ｔ条件である、条件＃１、は、レベルが検出の下限に近かったため、それによって、Ｒａｐａ－Ｔ細胞産物が静止状態にあることを示し、製造終了の６日目のＩＦＮ－γ分泌に関しても好ましいものであった。比較すると、阻害剤を含まない条件＃５は、６日目にほぼ４０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ－γの分泌を有しており、同様に、旧Ｔ－Ｒａｐａ条件では、６日目に約６０００ｐｇ／ｍｌの高レベルのＩＦＮ－γの分泌を有していた。注目すべきことは、製造終了時、６日目に約２００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ－γ分泌があったため、１：３のビーズ対Ｔ細胞共刺激を利用した新しいＲａｐａ－Ｔ条件は、ビーズなしの状態＃１よりも静止性が低かった。最後に、新しいＲａｐａ－Ｔ製造方法（ビーズをなしの条件＃１またはビーズありの条件＃９のいずれか）は、阻害剤の不在下で６日間の培養間隔後の培養１２日目におけるＩＦＮ－γ分泌能力の良好な増加を有した。
要約すると、新しいＲａｐａ－Ｔ法は、以下の表現型特性を有するＴ細胞の製造をもたらすことができる：（ａ）投入正常Ｔ細胞と比較して、転写因子ＦＯＸＰ３などの制御性Ｔ細胞マーカーの発現の減少、およびＴｈ１型転写因子ＴＢＥＴの増加、（ｂ）旧Ｔ－Ｒａｐａ方法と比較して、ＩＬ－２受容体ＣＤ２５の発現の減少によって、ならびに製造終了時の炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌の減少によって部分的に示される静止状態の増加；（ｃ）旧Ｔ－Ｒａｐａ方法と比較して、ｐ－ＳＴＡＴ５の発現の減少、ならびにｍＴＯＲ経路分子ｐ－ラプター、ｐ－４ＥＢＰ１およびｐ７０Ｓ６Ｋのレベルの減少、（ｄ）投入正常Ｔ細胞と比較して、分子ｐ６２の発現の変化を含むが、これらに限定されないオートファジーのマーカーの増加、（ｅ）投入正常Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ／ＣＣＲ７の共発現、ＣＤ６２Ｌ／ＣＣＲ７／ＣＤ１２７の同時発現を含む、ナイーブまたはＴセントラルメモリー集団のフローサイトメトリーマーカーの増加（ｆ）旧Ｔ－Ｒａｐａ方法と比較して、ＣＴＬＡ４を含むが、これに限定されない共阻害分子の発現の減少、（ｇ）旧Ｔ－Ｒａｐａ方法と比較して、ＴＩＭ３を含むが、これに限定されないチェックポイント阻害性受容体発現の減少、および（ｈ）投入正常Ｔ細胞と比較して、脱分化マーカー（ナノグ（Ｎａｎｏｇ）、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むが、これらに限定されない）の増加、ならびに分化マーカー（パーフォリン、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γを含むが、これらに限定されない）の減少を含むが、これらに限定されない変化したＲＮＡ発現パターン。
本開示に詳述されるＲａｐａ－Ｔ方法に従って製造されたＴ細胞産物の表現型特徴付けの大部分は、培養の最後に確認することができる。しかしながら、Ｔ細胞産物は凍結保存することができ、したがって、解凍後の状態におけるＴ細胞の表現型特徴付けは、対象に養子移入される実際の産物を反映していることに留意することが重要である。解凍後の状態のＲａｐａ－Ｔ細胞は、以下によって特徴付けられ得る：
（ａ）製造試料の６日目の終わりと解凍後の試料との間で同等であるＩＬ－２受容体ＣＤ２５の低レベル発現によって示されるような、静止状態の維持、（ｂ）製造試料の６日目の終わりと比較して、解凍後の試料は、炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの低レベル分泌を継続する（製造終了時に収集された試料と比較して増加しない）、（ｃ）投入正常Ｔ細胞と比較して、解凍後の試料は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ／ＣＣＲ７の共発現、ＣＤ６２Ｌ／ＣＣＲ７／ＣＤ１２７の同時発現を含むナイーブまたはＴセントラルメモリー集団のフローサイトメトリーマーカーの増加を維持する、（ｆ）解凍後の試料は、ＣＴＬＡ４（製造終了時に収集された試料と比較して解凍後の試料での増加なし）を含むが、これらに限定されない共阻害分子の減少した発現を継続する、（ｇ）解凍後の試料は、ＴＩＭ３（製造終了時に収集された試料と比較して解凍後の試料での増加なし）を含むが、これらに限定されないチェックポイント阻害性受容体発現の減少した発現を継続する、および（ｈ）投入正常Ｔ細胞と比較して、脱分化マーカー（ナノグ（Ｎａｎｏｇ）、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むが、これらに限定されない）の増加、ならびに分化マーカー（パーフォリン、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γを含むが、これらに限定されない）の減少を含むが、これらに限定されない変化したＲＮＡ発現パターン。
凍結保存された細胞基質からの製造。以前に収集したＰＢＳＣ産生物の場合、そのような凍結保存された細胞は、細胞の解凍およびＲａｐａ－Ｔ細胞の製造まで液体窒素の気相に保管される。アフェレーシスによって、または将来的に単純な採血によって単離したばかりの細胞の場合、細胞は即座に処理され、その後、培養物に直接入れられ得るか、または制御された速度の凍結技術によって凍結保存され得、後で使用するために液体窒素の気相に保管され得る。
新たに単離された細胞集団からの培養に代わる凍結保存細胞基質からのＴ細胞培養は、例えば、モノクローナル抗体およびカラム技術（陽性または陰性選択）の使用による、ある種類のＴ細胞富化を必要とする。Ｒａｐａ－Ｔ製造で使用される原料細胞の富化は、Ｔ細胞が培養区間中に効率的に富化されるため、かかる抗体ベースの方法論を必要としない、したがって、我々の方法は、グローバルレベルでの効果的な細胞療法のための推奨事項と一致する。Ｒａｐａ－Ｔ細胞の製造のための初期処理ステップは、凍結保存ステップ（該当する場合）で使用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の除去、赤血球（ＲＢＣ）の溶解、および混入顆粒球およびある程度の単球の遠心除去に焦点を当てる。これらのステップは、主にクローズドシステム技術を使用して比較的自動化された方法で実行され、この手順は、ヒューマンエラーを減少させ、バッチレコードの詳細な製造データを提供し、製造実行全体の一貫性を向上させ、最終産物の感染性因子汚染のリスクを減少させるため、有利である。Ｒａｐａ－Ｔ産物の処理は以下のステップを含むことができる：（１）感染性因子の汚染を減らすために、固体、非水系の方法を使用する凍結保存された産生物の解凍（該当する場合）、（２）ＬＯＶＯ透過性膜デバイスを使用した細胞産生物の自動洗浄、（３）ＬＯＶＯ洗浄ステップ中の塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）緩衝液を使用したＲＢＣの溶解物の統合、（４）ＬＯＶＯ法を使用した細胞内容物の体積減少、その後の細胞の閉鎖系の、対向流、遠心溶出（ＣＣＥ）デバイス（Ｅｌｕｔｒａ、Ｔｅｒｕｍｏ）への播種、ならびに（５）ＣＣＥによる顆粒球および単球の効率的な除去のためのＥｌｕｔｒａデバイスの事前にプログラムされた操作。
このリンパ球富化および培地精製後、細胞は、酸素交換のための豊富な容量を有する特殊チャンバー（Ｇ－Ｒｅｘ容器、Ｗｉｌｓｏｎ－Ｗｏｌｆ）に播種することができる。強化されたガス透過性特性に加えて、Ｇ－Ｒｅｘ容器は閉鎖系ユニットであり、自動化された閉鎖系培地体積減少という追加の利点を有する（ＧａｔｈｅＲｅｘ液体ハンドリングポンプ）。リンパ球－富化細胞は、Ｇ－Ｒｅｘ容器内で６日間維持することができる。
いくつかの特定の培養条件を利用して、製造されたＴ細胞の機能的属性を有するＧ－Ｒｅｘ容器中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物の製造を促進することができる。これらの特定の条件は次のとおりである：（１）５％ヒト血清をさらに補充した、またはいくつかの実施形態では、血清の添加のない、富化培地（Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｌｏｎｚａを含むがこれらに限定されない）の使用、（２）共刺激の前に、Ｇ－Ｒｅｘ内に播種した細胞の１６時間の休止区間を組み込む（細胞は１ｍｌ当たり１．５×１０６個のＴ細胞の比較的高密度で播種される）、（３）この初期休止区間中、細胞は、モノクローナル抗体バシリキシマブ（ＩＬ－２受容体を遮断し、それにより内因的に産生されるＩＬ－２による自律型Ｔ細胞活性化を防止する）およびテムシロリムス（ｍＴＯＲＣ１の薬理学的阻害剤である）の添加によって最適に休止される、（４）この１６時間休止区間の後、細胞は、準最適条件下で１：３のビーズ対Ｔ細胞比によって定義されるような、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ（３／２８ビーズ）で共刺激される（通常、ほとんどのＴ細胞増殖条件は、９倍高いレベルの共刺激、３：１のビーズ対Ｔ細胞比を利用し、場合によっては、いずれかの共刺激試薬の添加を避けることが有益である）、（５）重要なことに、初期休止区間後にＴ細胞が洗浄されないことが不可欠であり、（６）休止区間後、３／２８ビーズの追加に加えて、ＣＤ４＋Ｔｈ１およびＣＤ８＋Ｔｃ１表現型への分化を促進するために、極性化サイトカインＩＦＮ－αを高用量（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）で添加することが不可欠であり、（７）重要なことに、Ｔ細胞培養物に一般的な添加剤であるＩＬ－２の添加を避けることが重要である、ならびに（８）ビーズおよびＩＦＮ－αの添加後、培養の６日目に収集するまで細胞を乱さないままにすること（細胞洗浄なし、さらなる培養添加物なし）が重要である。
製造されたＴ細胞の凍結保存。１）Ｇ－Ｒｅｘ容器内で６日間の細胞培養後、ＧａｔｈｅＲｅｘ機器により、培養物の体積を閉鎖系様式で減少させることができる。その後、細胞を収集し、３／２８ビーズを手持ち磁石によって除去し、細胞をＬＯＶＯデバイスに入れて細胞を連続洗浄し、＞９９％の培養添加物（テムシロリムス、バシリキシマブ、ＩＦＮ－α）を除去することができる。
洗浄された細胞は、５％のＤＭＳＯおよび５％のペンタスターチを含有する凍結保存培地に再構成することができる。凍結保存は、５０ｍｌのフリーザーバッグ中で複数の単回使用アリコートで実施される。Ｒａｐａ－Ｔ細胞は、ＧＭＰ準拠の制御速度凍結方法によって凍結保存され、Ｒａｐａ－Ｔ細胞が指定された放出基準試験に合格した後、認定されたクライオシッパー（ｃｒｙｏ－ｓｈｉｐｐｅｒ）による液体窒素の気相で出荷される。
Ｒａｐａ－Ｔ細胞の放出基準試験には、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞純度の含有量などの標準試験が含まれる（最終産物は、フローサイトメトリーによる＞７０％のＣＤ３＋Ｔ細胞含有量であり得、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットはそれぞれ、５％レベルで存在し得る）。細胞は、フローサイトメトリーのアネキシンおよび７－ＡＡＤアッセイによって決定される場合、＞７０％の生存率であり得る。さらに、細胞は、最低７日間の培養間隔（理想的には１４日間の培養間隔）で細菌および真菌の混入がないようにする必要があり、さらに、細胞産物は、細菌ＬＰＳエンドトキシンおよびマイコプラズマの検出限界を下回る必要がある。
これらの標準試験に加えて、特殊機能試験は、Ｒａｐａ－Ｔ細胞産物の放出基準を構成することができる。産物および細胞療法の放出前に、Ｒａｐａ－Ｔ細胞は、培養投入Ｔ細胞と比較して以下の属性を有することができる：（１）ＣＤ６２リガンドおよびＣＣＲ７のフローサイトメトリー共発現の増加によって定義される、強化されたＴセントラルメモリー表現型；（２）プログラム死－１（ＰＤ１）などのチェックポイント阻害分子の低レベル発現；（３）最大共刺激時のＴｈ１／Ｔｃ１型サイトカイン分泌のレベルの減少によって定義される、休止状態；（４）フローサイトメトリーのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイによるミトコンドリア質量の減少によって証明される、オートファジーシグネチャ、（５）ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２下流標的の少なくとも５０％の阻害によって証明される、耐性表現型、ならびに（６）ｎ＝８０個の主要転写因子および分化分子の多面的な差次的遺伝子発現プロファイル。
実施例２
定常状態アフェレーシスを実行して、ＰＢＭＣを含有する患者試料を得た。試料中のリンパ球を、ＧＥによるＳｅｐａｘ（登録商標）機器上での自動Ｆｉｃｏｌｌ手順を使用して、望ましくない汚染好中球集団を＞９５％排除することによって濃縮した。次いで、リンパ球富化細胞集団を、以下の表１に示される培養培地および血清補充条件での初期細胞密度でＧ－ＲＥＸ培養容器に播種し、培養で６日間インキュベートした。条件１は、前培養対照（Ｓｅｐａｘ（登録商標）自動化Ｆｉｃｏｌｌ後の富化リンパ球）を表す。また、表１に示される用量でテムシロリムス、シロリムス、および／または抗ＩＬ２受容体モノクローナル抗体バシリキシマブを添加することによって、可変の阻害剤条件で培養を開始した。バシリキシマブを、条件２～５については１０μｇ／ｍＬ、条件６～８については２０μｇ／ｍＬで添加した。いくつかの培養条件では、０．８８：１（条件２～３および５～６）または３：１（条件８～９）のビーズ：Ｔ細胞比でＤｙｎａｌ（登録商標）３／２８ビーズを使用して抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８共刺激を受けた。ＩＦＮ－α単独（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）、またはＩＦＮ－α（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）とＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍＬ）と組み合わせのいずれかからなるサイトカインを、指示された時間に添加した。サイトカイン添加は培養開始時（条件８～９）または培養開始の１日後（条件２～７）のいずれかであった。培養物３～４および６～７は、培養開始の２日後に追加培地を受けて、示された最終細胞密度まで希釈した。
Figure 2022508131000002
条件９は、Ｔ－Ｒａｐａ産物を表す。条件７は、表１で試験したもののうちの最適なＲＡＰＡ－Ｔ条件を提供したことが見出された。この条件にはいくつかの重要な属性があった：（１）無血清培地、（２）非常に高い初期細胞密度（３０Ｍ／ｍＬ）、（３）非常に高いテムシロリムス濃度（４．５μＭ）、（４）抗ＩＬ２受容体モノクローナル抗体の存在、（５）共刺激の不在、（６）培養開始の１日後にＩＦＮ－αのみ（ＩＬ－２なし）を添加したサイトカインサポート、および（７）培養２日目の細胞希釈。
図２５Ａ～図２５Ｏに示すように、培養６日後、得られたＴ細胞を収集し、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋（黒色のカラムで示される）およびＣＤ８＋（灰色のカラムで示される）Ｔ細胞サブセット内の特定の分子発現について評価した。
図２５Ａ（ＣＤ４５ＲＡ＋）は、培養投入細胞と比較して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方でナイーブＴ細胞マーカー発現を維持することに関して、ＲＡＰＡ－Ｔ培養条件の重要性を実証しており、好対照には、以前のＴ－ＲＡＰＡ条件は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の顕著な減少をもたらした。
図２５Ｂ（ＣＤ２５＋）は、培養投入細胞と比較してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方においてＴ細胞静止を維持することに関して、ＲＡＰＡ－Ｔ培養条件の重要性を実証しており、好対照には、以前のＴ－ＲＡＰＡ条件は、ＣＤ２５発現の増加によって示されるように、顕著に活性化したＴ細胞状態をもたらした。
図２５Ｃ（ＣＤ２８＋）および図２５Ｄ（ＩＣＯＳ＋）は、ＲＡＰＡ－ＴおよびＴ－ＲＡＰＡ細胞産物がこれらの活性化共刺激分子の同様のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞発現を示したことを示す。
図２５Ｅ～図２５Ｆ（それぞれ、ＣＤ３９＋およびＣＤ７３＋）は、ＲＡＰＡ－Ｔ培養条件が、Ｔ－ＲＡＰＡ条件と比較して、これらのエクトヌクレオチダーゼ分子の発現の減少をもたらしたことを示す。これらの分子は、ＡＴＰをアデノシンに代謝することによって免疫抑制効果を発揮する。したがって、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物は、治療的使用に関してＴ－ＲＡＰＡ細胞産物と比較して有利であると予想される。
図２５Ｇ～図２５Ｏの残りのデータは、新しいＲＡＰＡ－Ｔ方法が、免疫老化（ＫＬＲＧ１）に関連する、免疫抑制性制御性Ｔ細胞表現型（ＧＩＴＲ）に関連する、またはチェックポイント阻害機能（ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３）に関連する分子の発現を大幅に減少させることを示す。ＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物に関連した可変の培養条件のそれぞれは、Ｔ－ＲＡＰＡ細胞産物と比較して、これらの分子のそれぞれにおいて大幅に減少した。条件７は、試験した条件のこれらの分子の中で最も深く一貫した減少を示した。
実施例３
実施例２の培養条件２～９に対応する培養条件１～８を用いて、実施例２のようにＴ細胞を調製した。培養区間の２日目に、得られたＴ細胞を収集し、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、およびＳＴＡＴ経路に関連する分子についてウェスタンブロット分析（製造業者の指示に従う方法；ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ Ｍｒ．Ｗｅｓ計装）によって評価した。
最適なＴｈ１／Ｔｃ１型製造のためには、制御性Ｔ細胞表現型を駆動することができるＳＴＡＴ５の活性化（リン酸化）を制限することが重要である。図２６に示すように、Ｒａｐａ－Ｔ細胞培養条件（条件１～６）のそれぞれは、リン酸化ＳＴＡＴ５を比較的欠いており、好対照には、Ｔ－Ｒａｐａ条件は、リン酸化ＳＴＡＴ５（条件７～８）の有意な存在を示した。Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較したＲａｐａ－Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化の減少は、７５％超であり得る。
最適なＴｈ１／Ｔｃ１型製造のためには、ＳＴＡＴ１を含むＩ型分化を促進する特定のＳＴＡＴ分子を介した活性シグナル伝達を有することが重要である。図２６に示すように、Ｒａｐａ－Ｔ培養条件のそれぞれは、レベルが、条件６（実施例２、条件７）においてある程度減少したにもかかわらず、検出可能なレベルのＳＴＡＴ１リン酸化を示した。ただし、条件６では、総ＳＴＡＴ１のレベルも減少した。
Ｒａｐａ－Ｔ細胞の最適な表現型はまた、ｍＴＯＲＣ１経路に関連する分子の減少によっても特徴付けることができる。Ｒａｐａ－Ｔ条件６（実施例２、条件７に対応する）は、ｍＴＯＲＣ１関連分子ｐ７０Ｓ６Ｋの発現において本質的に欠いていた。他のＲａｐａ－Ｔ培養条件（条件１、２、４、および５）での共刺激の提供は、ｐ７０Ｓ６Ｋ発現を増加させた。したがって、Ｒａｐａ－Ｔ製造プロセスの間、共刺激を回避することが有益であり得る。
Ｔｈ１／Ｔｃ１型ＲＡＰＡ－Ｔ細胞製造の最適表現型は、ｍＴＯＲＣ２シグナル伝達経路の保存にも左右され得る。この点で、最適なＲＡＰＡ－Ｔ細胞条件（実施例２、条件７に対応する条件６）が、ｍＴＯＲＣ２関連分子の総ＳＧＫ１およびリン酸化ＳＧＫ１の発現の保存を有することは有益である。ｍＴＯＲＣ２の相対的保存によるｍＴＯＲＣ１の著しい減少に関する最適なＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物のこの特徴は、条件６、すなわち、ｍＴＯＲＣ１関連サブユニット分子ラプターの著しい減少、およびｍＴＯＲＣ２関連サブユニット分子リクターの相対的保存によってさらに例示される。
実施例４
定常状態アフェレーシスを実行して、ＰＢＭＣを含有する患者試料を得た。試料中のリンパ球を、ＧＥのＳｅｐａｘ（登録商標）機器での自動化Ｆｉｃｏｌｌ手順を使用することによって富化した。次に、リンパ球富化細胞集団を、１つは表１の条件７に対応し、もう１つは表１の条件９に対応する（Ｔ－ＲＡＰＡ）、２つの条件下で、Ｇ－ＲＥＸ培養容器に播種し、実施例２のように培養で６日間インキュベートした。６日間の培養後、Ｔ細胞を収集し、２４時間上清の生成のために１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で再播種した。再播種の時点で、Ｔ細胞を、３：１、１：１、１：３、または１：９、のビーズ：Ｔ細胞比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズで共刺激した。これらの比のそれぞれにおいて、サイトカイン添加なし（「－」記号で示される）、ｒｈｕＩＬ－２の添加（１００ＩＵ／ｍＬ、「＋ＩＬ－２」で示される）、ｒｈｕＩＬ－７の添加（１０ｎｇ／ｍＬ、「＋ＩＬ－７」で示される）、ｒｈｕＩＬ－１５の添加（１０ｎｇ／ｍＬ、「＋ＩＬ－１５」で示される）、またはｒｈｕＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈｕＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）の両方の添加（「＋ＩＬ－７＋ＩＬ－１５」で示される）とともに２４時間上清生成を行った。ＩＬ－２およびＴＮＦ－α分泌を、製造業者の指示に従って（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、既知の方法によって細胞内で測定した。結果を図２７Ａ～図２７Ｂに示す。
分化の初期状態にあるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、ナイーブ、セントラルメモリー、または幹セントラルメモリーサブセットは、養子移入に有益であり得る。かかる早期分化Ｔ細胞は、主要な恒常性サイトカイン、すなわち、ＩＬ－７およびＩＬ－１５に対するそれらの応答差によって部分的に特徴付けられている。したがって、所与のＴ細胞産物がＩＬ－７およびＩＬ－１５に応答する能力は、望ましい特徴である。
図２７Ａは、最適なＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物のＩＬ－２分泌プロファイルを示し、一方、下のパネルは、Ｔ－ＲＡＰＡ細胞産物のＩＬ－２分泌プロファイルを示す。最大の共刺激チャレンジで、外来性サイトカインのサポートなしで、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物は、Ｔ－ＲＡＰＡ細胞産物と比較して約５倍高い量のＩＬ－２を分泌した。注目すべきことに、非常に低レベルの共刺激（１：９ビーズ：Ｔ細胞比）であっても、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物は実質的なＩＬ－２を秘密にし、好対照には、Ｔ－ＲＡＰＡ状態におけるこの刺激条件は、検出不可能なレベルのＩＬ－２をもたらした。ＩＬ－２分泌能力は、有益なヘルパー非依存性Ｔ細胞表現型と関連付けられており、これは、分化の初期状態でＴ細胞で観察されるサイトカイン分泌特性である。最後に、Ｔ－ＲＡＰＡ条件ではなく、ＲＡＰＡ－Ｔ条件では、ＩＬ－７またはＩＬ－１５のいずれかの添加で、ＩＬ－２分泌能力がさらに増強された。したがって、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞は、恒常的サイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５に一意に応答する。
図２７Ｂは、最適なＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物のＴＮＦ－α分泌プロファイルを示し、一方、下のパネルは、以前のＴ－ＲＡＰＡ細胞産物のＴＮＦ－α分泌プロファイルを示す。最大の共刺激チャレンジで、外来性サイトカインサポートなしで、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞産物は、Ｔ－ＲＡＰＡ細胞産物と比較してほぼ同等のＴＮＦ－αを分泌した。しかしながら、共刺激へのＩＬ－７またはＩＬ－１５の添加は、Ｔ－ＲＡＰＡ条件と比較して、ＲＡＰＡ－Ｔ条件でＴＮＦ－αを分泌するより高い能力をもたらした。したがって、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞は、Ｔｈ１／Ｔｃ１エフェクターサイトカインＴＮＦ－αの分泌を誘導する点で、恒常的サイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５に一意に応答する。
実施例５
ヒトＴ細胞を、いかなる阻害剤も含まずに共刺激した（「従来型」、抗ＣＤ２３／抗ＣＤ２８ビーズの添加；３：１ビーズ：Ｔ細胞比）。あるいは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」、１：３ビーズ：Ｔ細胞比）またはＣｌｏｕｄｚ（登録商標）溶解性共刺激微小粒子（Ｂｉｏｔ－Ｔｅｃｈｎｅ；製造業者の推奨用量の２０％でのＣｌｏｕｄｚ（登録商標）の使用、１×１０６細胞当たり５０μＬのＣｌｏｕｄｚ（登録商標）ストック）のいずれかによって提供される共刺激で、Ｔ細胞をＲＡＰＡ－Ｔ細胞条件に従って共刺激した（「ラパマイシン処理」）。６日間の培養後、Ｔ細胞を収集し、１×１０６細胞／ｍＬに調整し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（３：１ビーズ：Ｔ細胞比）を使用して共刺激した。次いで、２４時間上清を収集し、ルミネックスアッセイによってＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１３の含有量について試験した（結果は、２４時間当たりの１×１０６個の細胞当たりでのｐｇ／ｍＬとして示される）。同じプロトコルを使用して、６日間の培養後の細胞を収集し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ４を含む細胞表面マーカーの発現についてフローサイトメトリーで評価した。
図２８は、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１３分泌データを示す。図２８に示すように、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」）によって共刺激されたＲＡＰＡ－Ｔ細胞と、溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微粒子（Ｃｌｏｕｄｚ（登録商標）試薬、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）によって共刺激されたＲＡＰＡ－Ｔ細胞と、の間の結果は、類似している。これらの細胞は、前述のように、Ｔｈ２型サイトカインＩＬ－１３の分泌が最小限であるＩＬ－２およびＴＮＦ－αの実質的な分泌による証拠として、Ｔｈ１型サイトカインプロファイルを有する。
図２９は、フローサイトメトリーによって測定した、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＴＬＡ４を発現する細胞の頻度を示す。図２９に示すように、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」）によって共刺激されたＲＡＰＡ－Ｔ細胞と、溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微粒子（Ｃｌｏｕｄｚ（登録商標）試薬、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）によって共刺激されたＲＡＰＡ－Ｔ細胞と、の間の結果は、類似している。これらの細胞は、前述のように、静止しており（ＣＤ２５の発現の減少によって示される）、チェックポイント阻害性受容体の発現が減少している（ＣＴＬＡ４の発現の減少によって示される）
実施例６：Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法の第ＩＩＩ相無作為化臨床試験
図３０は、無作為化第３相プロトコルスキーマを示す。図３０の上部パネルでは、Ｒａｐａ－Ｔ療法に無作為割り付けされた患者に対し、Ｒａｐａ－Ｔ細胞製造のための自己細胞は、無作為割り付け後に収集された定常状態アフェレーシスに由来する。免疫枯渇レジメンは、ペントスタチンおよび低用量、用量調整シクロホスファミド（ＰＣレジメン）で構成される。最初のＰＣサイクルは、Ｔ１．Ｒａｐａ製造の間隔中、治験登録時に単独で投与され（Ｔ細胞療法なし）、２８日の持続期間であり、ＰＣサイクル２、３、４、および５は、４回のＴ１．Ｒａｐａ細胞注入のそれぞれの前に投与され、３５日の持続期間である。図３０の下のパネルは、安定している疾患（ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）のための延長Ｔ１．Ｒａｐａ細胞療法を示す。サイクル４後に安定している疾患のＴ１．Ｒａｐａ細胞レシピエントについては、追加のロットのＴ１．Ｒａｐａ細胞を製造し、最大４回の追加のサイクルのＴ１．Ｒａｐａ細胞療法（サイクル６～９）を可能にする。
図３０は、製造されたＴ細胞コホートに無作為割り付けされた全ての患者に投与される、製造されたＴ細胞療法を詳細に示す。この治療法には以下が含まれる。（１）以前に採取された末梢血幹細胞移植手順または新鮮な定常状態アフェレーシス手順のいずれかから得られる、製造されたＴ細胞製造の基質として使用される免疫細胞の収集、（２）単核細胞集団の富化およびその後の製造されたＴ細胞培養条件下での単核細胞のインキュベーション、（３）同一性および機能の検証ステップを経る、単回使用の製造されたＴ細胞治療薬の凍結保存、（４）ペントスタチン＋シクロホスファミド薬物レジメン（ＰＣレジメン）による患者の治療は、最初は単独で、その後、製造されたＴ細胞療法の両方と組み合わせて、製造されたＴ細胞療法の患者を準備して抗腫瘍効果を直接促進する、ならびに（５）治療中および治療後の専門的な免疫モニタリング。
免疫枯渇レジメンは、ペントスタチンおよび低用量、用量調整シクロホスファミド（ＰＣレジメン）で構成される。最初のＰＣサイクルは、製造されたＴ細胞製造の間隔中に試験登録時に単独で投与され（Ｔ細胞療法なし）、血球数回復を可能にするために最低２８日の持続期間であり、ＰＣサイクル２、３、４、および５は、４回の製造されたＴ細胞注入のそれぞれの前に投与され、血球数回復を可能にするために最低３５日の持続期間である。製造されたＴ細胞療法のサイクル５の完了後、維持療法は行われない。治療サイクルは、臨床状況に応じて、指示された間隔よりも長く、無期限の間隔まで延長することができる。限定されないが例として、患者が寛解にある場合、疾患の再発の証拠が出るまで、サイクルを遅らせることができる。さらに、ＰＣレジメンと養子製作Ｔ細胞療法の追加の維持サイクルは、おそらく１年に１～４回の療法サイクルを施すことによって患者を寛解状態に維持するか、または疾患の再発が発生した場合にそれを治療することが想定される。
図３０に示すように、４サイクルの療法後に安定している疾患の患者について、Ｒａｐａ－Ｔ細胞の追加の製造を実行できるため、合計９までのＲａｐａ－Ｔ細胞療法サイクルの追加のサイクルでの潜在的な療法を容易にすることができる。
図３１は、ＰＣ化学療法レジメンの詳細を列挙する。ＰＣ療法の各サイクルは、サイクルの１５日目のＴ１．Ｒａｐａ細胞注入直前の１４日間のコースから構成される（Ｔ１．Ｒａｐａ用量：０．１～５×１０６個の細胞／ｋｇ）。サイクル１について、ペントスタチン（Ｐ）は、１日目、４日目、８日目、および１１日目に１日４ｍｇ／ｍ２の用量で投与され（静注）、シクロホスファミド（Ｃｙ）は、１～５日目および８～１２日目に１日２００ｍｇの用量で投与される。その後のサイクルでは、ペントスタチンを２ｍｇ／ｍ２の用量に減少させる。
図３２Ａ～図３２Ｃは、対照群の性質、すなわち、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法に無作為割り付けされていない対象が、２回目または３回目の再発におけるＭＭの対象に適した３つのＦＤＡ承認トリプレットレジメン、すなわち、ＤＰｄレジメン（図３２Ａ）、ＤＲｄレジメン（図３２Ｂ）、またはＫＲｄレジメン（図３２Ｃ）のうちの１つを受けることを詳細に説明する。
図３２Ａ～図３２Ｃに示される対照コホートについては、患者を登録し、その後、多発性骨髄腫（ＭＭ）の２回目または３回目の再発時に無作為割り付けする。患者は、この患者集団を治療するための３つのＦＤＡ承認レジメンのうちの１つを受けるための候補者である必要がある。対照コホートに無作為割り付けされた患者は、公開されている標準レジメンを使用してＤＰｄ、ＤＲｄ、またはＫＲｄレジメンのいずれかを受ける。これらの標準レジメンの具体的な態様は、以下に示される：［図３２Ａ］ＤＰｄレジメン、［図３２Ｂ］ＤＲｄレジメン、および［図３２Ｃ］ＫＲｄレジメン。
製造されたＴ細胞有効性の統計的評価
主要目的は、標準治療に無作為割り付けされたレシピエントに対して、製造されたＴ細胞療法のレシピエントにおける無増悪生存期間を比較することである。比較する際に、副次目的が、記述的統計を使用して予備的な方法で評価される。２回目または３回目の再発の適格なＭＭ患者は、ＤＰｄ、ＤＲｄ、またはＫＲｄのいずれかからなるＦＤＡ承認トリプレットレジメンを用いた標準治療、またはエクスビボで製造された自己ラパマイシン耐性Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞（製造されたＴ細胞）を用いた養子Ｔ細胞療法のいずれかを受けるために、１：１の方法で無作為割り付けされる。Ｎ＝６５人の評価可能な患者が、各コホートに生じる主要な研究目的は、製造されたＴ細胞コホートで治療された患者が、標準治療コホートで治療された患者と比較して無増悪生存期間（ＰＦＳ）が増加しているかどうかを決定することである。
無増悪生存期間（ＰＦＳ）および患者の全生存期間は、両群でカプラン・マイヤー法を使用して推定され、時点ごとの９５％信頼区間で指摘される。生存期間中央値およびその９５％信頼区間のノンパラメトリック推定値は、カプラン・マイヤー推定値を逆数にすることによって得られる。主要有効性転帰（ＰＦＳ）は、片側ログランク検定によって検定される。最終解析は、研究で１３０のＰＦＳ事象が発生したとき、または募集目標（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｇｏａｌ）が達成され、全ての患者が少なくとも１２ヶ月フォローアップされたときに実行される。全生存期間（ＯＳ）は治療の開始から測定され、何らかの原因による死亡も事象となり、患者は最後の接触の日に検閲削除される。
副次エンドポイントは、平均、標準偏差、信頼区間、カプラン・マイヤー分析、または多発性骨髄腫寛解状態を特徴付ける他の方法などの記述的な方法で評価される。客観的奏効率（ＯＲＲ）および微小残存病変率（ｍｉｎｉｍｕｍ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｒａｔｅ）（ＭＲＤ）は、対応する転帰を有する患者の観察された割合として推定され、９５％信頼区間で提示される。
人口統計学的データおよびベースラインデータを記述的に要約する。カテゴリデータは頻度およびパーセンテージとして提示され、連続データは、平均、中央値、および標準偏差などの要約統計量を使用して提示される。特に注目すべきは、多発性骨髄腫の以前の治療法の決定と利用された個々の薬剤に対する不応性の程度である。
２８および５５のＰＦＳ事象が全体的（２群を組み合わせた）に発生したときに、無益のため中止する可能性のある２つの中間解析が実施される。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ－ＦｌｅｍｉｎｇとＰｏｃｏｃｋの境界間の妥協点である、二次誤差消費関数（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｅｒｒｏｒ－ｓｐｅｎｄｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を備えたベータ誤差消費アプローチ（ｂｅｔａ ｅｒｒｏｒ－ｓｐｅｎｄｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）が使用される。以下の表は、２つの中間解析および１つの最終解析の帰無仮説の受容境界（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｂｏｕｎｄａｒｙ）を示す。これらの値は、中間解析のタイミングが変更された場合、誤差消費関数を使用して変更される。
Figure 2022508131000003
真の効果量の関数としての無益のために試験を早期に中止する確率を次の表に示す。
Figure 2022508131000004
製造されたＴ細胞製造のための基質として使用される免疫細胞の収集
製造されたＴ細胞製造のための細胞の収集および出荷は、製造されたＴ細胞療法コホートに無作為割り付けされた患者に必要とされる。
さらに、対象が、絶対リンパ球数（ＡＬＣ、１マイクロリットル当たり少なくとも３００リンパ球の値）によって定義される血流中の免疫細胞に対して必要な値を有する場合、定常状態アフェレーシスが実行され、１０～１５リットルの収集で構成される。アフェレーシスは、治験登録から１０日以内に実施する必要がある。アフェレーシス産物は、Ｒａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに直ちに出荷される（凍結保存なし）。
ＰＣレジメンの最初のサイクルは、治験登録後１０日以内に開始する必要がある。
製造されたＴ細胞療法のその後の反復は、より効率的になり得、したがって、製造を開始するために、より少ない数の投入細胞を使用し得る。そのような改善された方法は、少なくとも部分的に、改善された宿主調製および改善された製造プロセスを含む。このような方法では、５００ｍＬ以下の単純採血から得られた出発物質を用いてＴ細胞を製造することが可能になる。
製造されたＴ細胞の製造
以前に収集した細胞産物の場合、そのような凍結保存された細胞は、細胞の解凍および製造されたＴ細胞の製造まで液体窒素の気相で保管される。アフェレーシスによって、または将来的に単純な採血によって単離したばかりの細胞の場合、細胞は即座に処理され、その後、培養物に直接入れられ得るか、または制御された速度の凍結技術によって凍結保存され得、後で使用するために液体窒素の気相に保管され得る。
新たに単離された細胞集団からの凍結保存された細胞基質からのＴ細胞培養は、ある種類のＴ細胞富化を必要とする。限定されないが例として、Ｔ細胞の濃縮は、モノクローナル抗体およびカラム技術（陽性または陰性選択）を使用することによって達成することができる。製造されたＴ細胞製造で使用される原料細胞の富化は、Ｔ細胞が培養区間中に効率的に富化されるため、かかる抗体ベースの方法論を必要としない、したがって、我々の方法は、グローバルレベルでの効果的な細胞療法の推奨事項と一致する。製造されたＴ細胞の製造のための初期処理ステップは、凍結保存ステップ（該当する場合）で使用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の除去、赤血球（ＲＢＣ）の溶解、および混入顆粒球およびある程度の単球の遠心除去に焦点を当てる。これらのステップは、主にクローズドシステム技術を使用して比較的自動化された方法で実行される。この手順は、ヒューマンエラーを減少させ、バッチレコードの詳細な製造データを提供し、製造工程全体の一貫性を向上させ、最終産物の感染性因子汚染のリスクを減少させるため、有利である。製造されたＴ細胞産生物の処理には、以下のステップが組み込まれている：（１）感染性因子汚染を減らすために、Ｔｒｉａｎａ Ｅ，Ｏｒｔｅｇａ Ｓ，Ａｚｑｕｅｔａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈａｗｉｎｇ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｗｉｔｈ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｄｒｙ－ｗａｒｍｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１３；５３（１）：８５－９０におけるような、固体、非水系の方法を使用する凍結保存された産生物の解凍（該当する場合）、（２）Ｍｆａｒｒｅｊ Ｂ，Ｂｏｕｃｈｅｔ Ｇ，Ｃｏｕｑｕｉａｕｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｖｏ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈａｗｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒａｆｔｓ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；１９（１２）：１５０１－１５０８におけるような、ＬＯＶＯ透過性膜デバイスを使用した細胞産生物の自動洗浄、（３）ＬＯＶＯ洗浄ステップ中の、Ｂｒｏｗｎ ＷＥ，Ｈｕ ＪＣ，Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ ＫＡ．Ａｍｍｏｎｉｕｍ－Ｃｈｌｏｒｉｄｅ－Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｕｌｌｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ Ｎｅｏｔｉｓｓｕｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６；２２（９）：８９５－９０３に記載される塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）緩衝液を使用したＲＢＣの溶解物の統合、（４）Ｓｔｒｏｎｃｅｋ ＤＦ，Ｆｅｌｌｏｗｅｓ Ｖ，Ｐｈａｍ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｕｎｔｅｒ－ｆｌｏｗ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４；１２：２４１．（ｄｏｉ）：１０．１１８６／ｓ１２９６７－１２０１４－１０２４１－ｙに従前に記載されるように、ＬＯＶＯ法を使用した細胞内容物の体積減少、その後の細胞の閉鎖系の、対向流、遠心溶出（ＣＣＥ）デバイス（Ｅｌｕｔｒａ、Ｔｅｒｕｍｏ）への播種、ならびに（５）ＣＣＥによる顆粒球および単球の効率的な除去のためのＥｌｕｔｒａデバイスの事前にプログラムされた操作。
このリンパ球富化および培地精製後、細胞を、Ｂａｊｇａｉｎ Ｐ，ＭｕｃｈａｒｌａＲ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｇ－Ｒｅｘ “Ｍ” ｓｅｒｉｅｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１４；１：１４０１５に記載された、酸素交換のための豊富な容量を有する特殊チャンバー（Ｇ－Ｒｅｘ容器；Ｗｉｌｓｏｎ－Ｗｏｌｆ）に播種した。強化されたガス透過性特性に加えて、Ｇ－Ｒｅｘ容器は閉鎖系ユニットであり、自動化された閉鎖系培地体積減少という追加の利点を有する（ＧａｔｈｅＲｅｘ液体ハンドリングポンプ）。リンパ球－富化細胞は、Ｇ－Ｒｅｘ容器内で６日間維持される。
いくつかの特定の培養条件を利用して、製造されたＴ細胞の機能的属性を有するＧ－Ｒｅｘ容器中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物の製造を促進する。これらの特定の条件は次のとおりである：（１）５％ヒト血清をさらに補充した富化培地（Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｌｏｎｚａを含むが、これらに限定されない、培地はまた５％ＡＢ血清で補充されてもよい）、Ｚｈａｎｇ ＨＤ，Ｓｏｎｇ ＺＬ，Ｌｉ ＷＰ．［Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ ｓｈｉ ｙａｎ ｘｕｅ ｙｅ ｘｕｅ ｚａ ｚｈｉ．２００６；１４（５）：９８５－９８９；Ｌｏｎｚａ）の使用、（２）共刺激の前に、Ｇ－Ｒｅｘ内に播種した細胞の１６時間の休止区間を組み込む（細胞は１ｍｌ当たり１．５×１０６個の細胞の比較的高密度で播種される）、（３）この初期休止区間中、細胞は、モノクローナル抗体バシリキシマブ（ＩＬ－２受容体を遮断し、それにより内因的に産生されるＩＬ－２による自律型Ｔ細胞活性化を防止する）およびテムシロリムス（ｍＴＯＲＣ１の薬理学的阻害剤である）の添加によって最適に休止される、（４）この１６時間休止区間の後、細胞は、共刺激されないか、または準最適条件下で１：３のビーズ対Ｔ細胞比によって定義されるような、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ（３／２８ビーズ）で共刺激されるかのいずれかである（通常、ほとんどのＴ細胞増殖条件は、９倍高いレベルの共刺激、３：１のビーズ対Ｔ細胞比を利用する）、（５）重要なことに、初期休止区間後にＴ細胞が洗浄されないことが不可欠であり、（６）休止区間後、３／２８ビーズの追加に加えて、ＣＤ４＋Ｔｈ１およびＣＤ８＋Ｔｃ１表現型への分化を促進するために、極性化サイトカインＩＦＮ－αを高用量（１０，０００ＩＵ／ｍｌ）で添加することが不可欠であり、（７）重要なことに、Ｔ細胞培養物に一般的な添加剤であるＩＬ－２の添加を避けることが重要である、ならびに（８）ビーズおよびＩＦＮ－αの添加後、培養の６日目に収集するまで細胞を乱さないままにすること（細胞洗浄なし、さらなる培養添加物なし）が重要である。
製造されたＴ細胞産生物の冷凍保存および同一性および機能の検証
Ｇ－Ｒｅｘ容器内で６日間の細胞培養後、ＧａｔｈｅＲｅｘ機器により、培養物の体積を閉鎖系様式で減少させる。続いて、細胞を収集し、３／２８ビーズを手持ち磁石によって除去し、細胞をＬＯＶＯデバイスに入れて細胞を連続洗浄し、＞９９％の培養添加物（テムシロリムス、バシリキシマブ、ＩＦＮ－α）を除去する。
洗浄した細胞は、５％のＤＭＳＯおよび５％のペンタスターチを含有する凍結保存培地に再構成される。凍結保存は、５０ｍｌのフリーザーバッグ中で複数の単回使用アリコートで実施される。製造されたＴ細胞用量は、レシピエント体重１ｋｇ当たり０．１～５×１０６個のＴ細胞である。製造されたＴ細胞の４回の連続したおおよその月１回の注入を可能にするため、４つの単回使用アリコートを凍結保存する。製造されたＴ細胞は、Ｈｕｎｔ ＣＪ．Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ：ｏｆｆｉｚｉｅｌｌｅｓ Ｏｒｇａｎ ｄｅｒ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｒ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｍｅｄｉｚｉｎ ｕｎｄ Ｉｍｍｕｎｈａｍａｔｏｌｏｇｉｅ．２０１１；３８（２）：１０７－１２３で以前に説明されているように、ＧＭＰ準拠の制御速度凍結方法によって凍結保存され、および、細胞は、製造されたＴ細胞が指定された放出基準試験に合格した後、認定されたクライオシッパーよる液体窒素の気相で出荷される。
製造したＴ細胞の放出基準試験には、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞純度の含有量などの標準試験が含まれる（最終産物はフローサイトメトリーによる＞７０％のＣＤ３＋Ｔ細胞含有量でなければならず、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットはそれぞれ５％レベルで存在しなければならない）。細胞は、フローサイトメトリーのアネキシンおよび７－ＡＡＤアッセイによって決定される、＞７０％の生存率でなければならない。さらに、細胞は、最低３日間の培養間隔（理想的には１４日間の培養間隔）で細菌および真菌の混入がないようにしなければならず、さらに、細胞産物は、細菌ＬＰＳエンドトキシンおよびマイコプラズマの検出限界を下回らなければならない。
これらの標準試験に加えて、特殊機能試験は、製造されたＴ細胞産物の放出基準を構成する。産物および細胞療法の放出前に、製造されたＴ細胞は、培養投入Ｔ細胞と比較して、以下の属性を有することができる：（１）ＣＤ６２リガンドおよびＣＣＲ７のフローサイトメトリー共発現の増加によって定義される、強化されたＴセントラルメモリー表現型；（２）プログラム死－１（ＰＤ１）などのチェックポイント阻害分子の低レベル発現；（３）最大共刺激時のＴｈ１／Ｔｃ１型サイトカイン分泌のレベルの減少によって定義される、休止状態；（４）フローサイトメトリーのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイによるミトコンドリア質量の減少によって証明される、オートファジーシグネチャ、Ｘｉａｏ Ｂ，Ｄｅｎｇ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｗ，Ｔａｎ ＥＫ．Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ－Ｂａｓｅｄ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ Ｕｓｉｎｇ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６；１０：７６を参照されたい、（５）ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２下流標的の少なくとも５０％の阻害によって証明される、耐性表現型、ならびに（６）ｎ＝８０個の主要転写因子および分化分子の多面的な差次的遺伝子発現プロファイル。
ＰＣレジメンを使用した宿主の調製
製造されたＴ細胞治療にある患者は、ペントスタチンとシクロホスファミド（ＰＣ）レジメンを受ける。ＰＣレジメンのサイクル１は、製造されたＴ細胞製造の間隔中に投与され、したがって、付随するＴ細胞注入なしに投与される。サイクル１は、２つのレベルで有利である：第１に、それは、宿主の制御性Ｔ細胞および末期老化エフェクターＴ細胞の数および機能を減少させ、それによって製造されたＴ細胞療法の将来のサイクルを増強し、第２に、それは、多発性骨髄腫に対する抗腫瘍効果を直接媒介し、それによって製造間隔中の疾患を制御する。サイクル＃１の後、ＰＣレジメンのその後のサイクルに続いて、２週間のＰＣレジメン間隔の翌日（１５日目）に製造されたＴ細胞の養子移入が行われる。ＰＣレジメンのこれらのサイクルは、ＩＬ－７およびＩＬ－１５などのＴ細胞恒常性サイトカインの増加を含む宿主生物学をさらに調節し、これにより、養子移入後の製造されたＴ細胞の増殖の改善が可能になるため、さらに有利である。
ＰＣレジメンの後に、製造されたＴ細胞注入が続く。ＰＣ療法の各サイクルは、サイクルの１５日目の製造されたＴ細胞注入の直前の１４日間のコースで構成される。製造されたＴ細胞用量は、１×１０５～５×１０６個の細胞／ｋｇのＴ細胞用量を含む、１～５×１０６個の細胞／ｋｇである。ペントスタチン（Ｐ）を、１日目、４日目、８日目、および１１日目に４ｍｇ／ｍ２の用量で投与し（静注）、シクロホスファミド（Ｃｙ）を、１～５日目および８～１２日目に２００ｍｇ／日の用量で投与する。
ペントスタチン投与前に前投薬と前水分補給（ｐｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）が必要となる。ペントスタチンの６０分前に、１リットルの０．９％の塩化ナトリウムによる前水分補給を行う。制吐剤を使用した前投薬が必要となる。制吐レジメンの推奨事項は以下のとおりである：（１）デキサメタゾン、各ペントスタチン用量の６０分前（すなわち、サイクルの１日目、４日目、８日目、および１１日目）にＩＶ注入による１２ｍｇ；（２）さらに、経口デキサメタゾンは、必要に応じて他の日に１日当たり４ｍｇの用量で投与されてもよく、（３）オンダンセトロンは、ペントスタチンの各用量の６０分前にＩＶ注入による８ｍｇの用量で投与されてもよく、（４）残りの治療では、オンダンセトロンは、必要に応じて、１日目から１４日目の１２時間ごとに８ｍｇ（錠剤）の経口用量で投与されてもよく、ならびに（５）抑制できない悪心および嘔吐を有する患者において、必要に応じて制吐レジメンにアプレピタントが添加されてもよい。ペントスタチンの用量は４ｍｇ／ｍ２であり、ペントスタチンの各用量を３０～６０分間かけて静脈内投与する。
ペントスタチンは用量変更され、患者に投与されるペントスタチンの用量は１～４ｍｇ／ｍ２である。ペントスタチンは、クレアチンクリアランス（ＣｒＣｌ）に基づいて用量変更され、これは、２４時間尿によって得られるか、またはコッククロフト・ゴールト式によって計算される。ペントスタチンおよびシクロホスファミド療法中に対象がクレアチニンレベルの上昇を経験した場合、その後の投与量は以下のように変更される：ＣｒＣｌ≧６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合、ペントスタチン４ｍｇ／ｍ２（全用量）を投与し、ＣｒＣｌ＜６０ｍＬであるが≧３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合、ペントスタチンを５０％用量減少させて２ｍｇ／ｍ２で投与し、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬの場合、ペントスタチンを保持する。ペントスタチンは、神経毒性（発作、昏睡）または心臓毒性（駆出率の低下）などの臓器毒性と関連することはほとんどない。そのため、ＰＣ治療中に生じる臓器毒性の評価には特別な注意が必要である。ペントスタチンがグレード２以上の臓器毒性に関連している場合、施設のＰＩに連絡して、さらなるペントスタチン療法およびさらなるプロトコル療法が必要かどうかを話し合う必要がある。
経口シクロホスファミド（Ｃｙ）をＰＣレジメンの構成要素として使用し、シクロホスファミドの用量は５０～４００ｍｇになる。Ｃｙの用量は、ＰＣレジメンのサイクル番号１～５の間、１～５日目および８～１２日目に１日当たり２００ｍｇである。静脈内注入によるシクロホスファミド２００ｍｇは、忍容性の問題または経済的考慮のために許容される。シクロホスファミド膀胱毒性のため、ＰＣレジメン中に十分な水分補給を維持しなければならない。透明な尿の色を維持するために、患者は１日に少なくとも２～４リットルの液体を飲む必要がある。
シクロホスファミドの投与量は、必要に応じて、サイクルの１、４、８、および１１日目に得られた全血球数（ＣＢＣ）および細胞差分値（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｖａｌｕｅ）（絶対リンパ球数［ＡＬＣ］、および絶対好中球数［ＡＮＣ］）に基づいて、以下の表に従って調整される。ＰＣレジメンの表明された目標は、骨髄系細胞抑制を最小限に抑えながら、免疫枯渇および免疫抑制を達成することである。この目標を確実にするために、必要に応じて、ペントスタチン投与日（すなわち、サイクルの１、４、８、および１１日目）に得られたＡＬＣおよびＡＮＣ値に基づいて、シクロホスファミドの投与量を次の表に従って調整する。表中の表記は、以下のとおりである：１ペントスタチンは、ＡＬＣ／ＡＮＣ値に基づいて用量調整されない、２ＡＮＣ値＜５００の場合、シクロホスファミド投与量の低減に加えて、患者は、次のＡＮＣ測定までＧ－ＣＳＦ療法を受ける、３表示されるシクロホスファミド用量は、次のＡＬＣ／ＡＮＣ測定まで毎日継続される（サイクルの１、４、８、および１１日目に実行される）。
ＰＣレジメンの変形が想定されている。第１に、ペントスタチンとシクロホスファミドは、それらの免疫枯渇および免疫抑制作用の点で相乗的である。このような相乗効果は抗腫瘍効果の点でも存在する可能性が高いが、この可能性に関する情報はほとんどない。したがって、ＰＣレジメンが、固形腫瘍を含むがん療法のための単独療法として使用され得ることを想定している。１つの先行する例では、ＰＣレジメンによって部分的に構成される併用レジメンを受けた難治性中皮腫の患者は、前例のない抗腫瘍効果を有した。第２に、この相乗効果のために、静脈内注入によって、好ましくは、ペントスタチンとシクロホスファミドを同じ静脈内注入バッグに混合して投与を容易にし、薬局エラーを低減することによって、２つの薬物を同時に投与することが有利であることを提案する。かかる用途では、様々な臨床的に関連するペントスタチン対シクロホスファミドの比を包含するＰＣ混合物の選択肢を提供することが重要であろう。
Figure 2022508131000005
製造されたＴ細胞の注入
全ての製造されたＴ細胞投与の前に、前投薬が必要となる。ジフェンヒドラミン（２５～５０ｍｇＩＶまたはＰＯ）およびアセトアミノフェン（６５０ｍｇ、ＰＯ）は、製造されたＴ細胞注入の３０～６０分前に投与される。
製造されたＴ細胞注入は、サイクル２～５の１５日目に行われるが、ロジスティック上の理由により、製造されたＴ細胞注入の最大３日間の遅延が発生する場合がある。さらに、ロジスティクス上の理由および毒性の回復を可能にするため、サイクル間に最大４週間の遅延が許容される。製造されたＴ細胞用量は５×１０６個の細胞／ｋｇになるが、製造中に最適以下の細胞収量が発生した場合、０．１×１０６個の細胞／ｋｇの低用量が許容される。凍結保存された製造されたＴ細胞は解凍され、血液製剤投与のための適切な施設のＳＯＰに従って、重力によって直ちにかつ迅速に静脈内投与される（３０分以内）。このＴ細胞注入は、入院患者の投与を必要とする予期しない状況がない限り、外来患者の設定で実行される。毒性が生命を脅かすと見なされない限り、細胞注入直後に起こり得るＤＭＳＯ関連毒性（悪寒、筋肉痛）の管理においてステロイドは許容されない。
０．１×１０６個の細胞／ｋｇ未満の少量の製造されたＴ細胞注入もまた、臨床的に関連し得ることが想定される（限定されないが例として、１ログ低い、１×１０５個の細胞／ｋｇでのもの）。第１に、製造は、インビボ効果がさらに高まったことを媒介する製造されたＴ細胞をもたらすように最適化され、それによって必要とされるＴ細胞用量が減少される。これは、一部にはＴ細胞収集が単純な採血によって行われる可能性のため、一部には製造実現可能性が向上するため、有利であろう。第２に、上述のように、ＰＣレジメンのさらなる改善とともに、養子移入された製造されたＴ細胞は、宿主細胞と比較してさらなる改善されたインビボ選択的利点を有し、それによって必要な製造されたＴ細胞用量を効果的に低減するであろう。
治療中および治療後の特殊な免疫モニタリング
末梢血単核細胞および骨髄細胞は、免疫モニタリング試験を行うことができるように、Ｒａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに送られる；これらの試験の目的は、製造されたＴ細胞療法の作用機序を探索し、製造されたＴ細胞有効性を予測するバイオマーカーを開発することである。１つの取り組みでは、我々は、自己多発性骨髄腫腫瘍細胞または、がん－精巣－抗原（ＣＴＡ）ファミリー内の分子などの既知のまたは疑われる腫瘍抗原を含む、様々な刺激に応答して様々なＴｈ１型およびＴｈ２型サイトカインを産生する能力について製造されたＴ細胞レシピエントを評価する。遺伝子のＣＴＡファミリーは、数が豊富で、多発性骨髄腫に関連することが示されている。ＣＴＡ遺伝子の配列が既知であり、特異的ＣＴＡ遺伝子の関連性が多発性骨髄腫で特徴付けられているため、製造されたＴ細胞療法は、様々な範囲のＣＴＡ抗原に対するＴ細胞媒介性免疫を特異的に誘導することを実証することができる。かかるサイトカイン応答の測定は、ＲＮＡ発現分析、ＥＬＩＳＡもしくはルミネックスマルチアナライト法による分泌分析、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して行うことができる。抗原特異的免疫は、抗体産生アッセイまたは細胞溶解アッセイの使用によって定量化することもできる。
我々は、製造されたＴ細胞療法後に得られたＴ細胞が、製造されたＴ細胞療法前に得られたＴ細胞と比較して、自己多発性骨髄腫細胞に対する反応性の増加を有するかどうかを評価する。この取り組みの１つの障害は、患者特有の多発性骨髄腫細胞株の増殖が通常成功しないことである。この障害を克服するために、Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｇｕ Ｙ，Ｓｕｎ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ Ｎｉｃｈｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）にあるような特殊な容器と、ＩＬ－６、ＣＤ４０リガンド、およびカーフィルゾミブに対する耐性の獲得を含む、多発性骨髄腫の増殖および生存を増強することが知られている因子の組み合わせを補充した培地、を使用して骨髄腫細胞を増殖させる。患者特有の多発性骨髄腫細胞は、免疫Ｔ細胞の抗腫瘍反応性の評価において刺激物質として単独で使用され得、あるいは、そのような腫瘍細胞は、内容物を製造されたＴ細胞製造中に溶出手順から収集された患者特有の単球から製造され得る、プロフェッショナル抗原提示細胞にロードすることでアポトーシス状態にすることができる。
加えて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）免疫レパートリー分析は、製造されたＴ細胞療法のバイオマーカーとして有用であると考えられる。好ましくは、かかるレパートリー分析は、より一般的に用いられるＤＮＡ配列決定ではなくＲＮＡ配列決定によって実行されるであろう。標的とされるＴ細胞療法の大部分とは異なり、製造プロセスが任意の特定の腫瘍抗原に対してＴ細胞反応性を優先的にシフトさせないため、製造されたＴ細胞療法はポリクローナル法である。したがって、製造されたＴ細胞療法後の任意の有益な抗腫瘍効果は、腫瘍抗原の多様性へのインビボクローン増殖から誘導されると予想される。この生物学的性質を考慮すると、製造されたＴ細胞療法の成功は、患者の治療前レパートリーを治療後レパートリーと比較するときに、異なるＴＣＲレパートリーをもたらす。チェックポイント阻害を解消するためのモノクローナル抗体療法などの他のがん療法の設定では、成功した治療は、モリシト指数（Ｍｏｒｉｓｉｔｏ Ｉｎｄｅｘ）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｌ，Ｈａｒｖｉｅｗ Ｃ，Ｅｍｅｒｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＴＣＲ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３：Ｅ２９２４４の定量化によって確認することができるＴＣＲレパートリーの偏り（ｓｋｅｗｉｎｇ）として知られる、新しいＴＣＲクローン特異性の出現と関連する。同様に、製造されたＴ細胞療法が成功すると、ＴＣＲレパートリーの偏りが生じ、製造されたＴ細胞療法の間隔を超えたＴＣＲの偏りの持続は、悪性腫瘍に対する長期Ｔ細胞免疫と一致する。製造の進歩により、改良された形態の製造されたＴ細胞が生成され、そのような場合、ＴＣＲの偏りはより広範囲になり、治療サイクルの数が減少して発生し、治療後の間隔でより耐久性があるであろう。
多発性骨髄腫の治療のためのプロトコル選択基準
≧１８歳の男性または女性患者は、製造されたＴ細胞療法の対象となる可能性がある。正式な年齢上限はない。ただし、心臓血管病理または症状の既往がある６５歳以上の患者（以下に詳述する除外基準に明確に適合していない場合でも）については、多施設サイトで心臓専門医による評価が必要である。このような被験者は、ケースバイケースで検討される。ＥＣＯＧパフォーマンスステータス≦２で定量されるように、患者全体のパフォーマンスステータスは、少なくとも中程度の健康状態でなければならない。
患者は、組織学または細胞学研究による多発性骨髄腫の確定診断を有する必要がある。さらに、疾患は症候性でなければならず、患者は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬、アルキル化剤、ＣＤ３８モノクローナル抗体、およびグルココルチコイドの薬物を受けた後、疾患の２回目または３回目の再発にある必要がある。
疾患の２回目または３回目の再発の患者は、比較的進行した病期にある。しかしながら、製造されたＴ細胞療法の安全性および有効性の実証により、我々は、治療アルゴリズムの初期の多発性骨髄腫患者が、製造されたＴ細胞療法の恩恵を受けることを想定する。限定されないが例として、製造されたＴ細胞療法は、自己造血細胞移植と組み合わせた高用量化学療法の代替として使用され得るか、または移植が不適格であるかなりの数の患者に使用され得る。さらに、製造されたＴ細胞療法は、臨床症状の前の多発性骨髄腫進行の最も早い時点、すなわち、くすぶり型疾患の段階での早期発見の間に想定することができる。
他方では、本明細書に記載のＲａｐａ－Ｔ細胞療法は、より進行した段階の多発性骨髄腫の患者および高度難治性疾患を有する患者の治療に適用可能であることが想定される。具体的には、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法は、ペンタ難治性ＭＭの治療に利用することができ、これは、ＭＭを再発し、ＭＭを治療するために使用される上位薬物、すなわち、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、およびダラツムマブのうちの５つに対する耐性を有する患者として定義される。
ペンタ難治性ＭＭを有する患者は、治療のための標準的な治療オプションを有さないため、この設定におけるＲａｐａ－Ｔ細胞療法を評価するための臨床プロトコルは、新規抗がん剤を評価するための、Ｃｈｅｎ Ｃ，Ｓｉｅｇｅｌ Ｄ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｅｌｉｎｅｘｏｒ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３１（８）：８５５－８６３において以前に実施されたものと同様の単一群第ＩＩ相試験である。この第ＩＩ相試験については、図３０、図３１、および図３２Ａ～図３２Ｃに記載されるように、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法が施与される。この研究の統計的な目標は、Ｒａｐａ－Ｔ細胞療法が少なくとも３０％と一致する割合によって定義されるように、ペンタ難治性ＭＭの少なくとも部分的な寛解の有意な割合を誘導できるかどうかを決定することである。
製造されたＴ細胞を製造するのに潜在的に十分な自己Ｔ細胞の潜在的な供給源を有する必要がある。具体的には、患者は、製造のために利用可能な十分な数の以前に凍結保存されたＰＢＳＣユニット（＞２００万個の細胞／ｋｇの総ＣＤ３４＋含有量によって定義される）、または定常状態アフェレーシスによって収集され得る十分な数の循環Ｔ細胞（１マイクロリットル当たり３００個を超える細胞のＡＬＣによって定義される）のいずれかを有する必要がある。
患者は、骨髄腫治療、大手術、放射線療法、他の治験への参加から少なくとも２週間経過し、これらの以前の治療の臨床的に重大な毒性から回復していなければならない（２以下の値へのＣＴＣＡＥ毒性の解消）。ＭＵＧＡまたは２Ｄ心エコー図による心臓駆出分（ＥＦ）は、施設の正常範囲内であり、ＥＦレベルが少なくとも４０％でなければならない。血清クレアチニンによって測定した腎機能は、２．５ｍｇ／ｄｌ以下でなければならない。肝機能は、ＡＳＴおよびＡＬＴによって測定した場合、正常の上限の３倍以下、および総ビリルビンが１．５以下（ギルバート病に起因する場合を除く）で適切でなければならない。肺機能検査で予想される５０％以上の補正ＤＬＣＯによって定義されるように、肺機能は適切でなければならない。異常出血傾向の既往があってはならない。標準医療の一部ではない研究関連の手順を実行する前に、将来の医療を損なうことなくいつでも患者が同意を取り消すことができることを理解した上で、自発的な書面による同意を与える必要がある。
無作為化第ＩＩＩ相試験：標準治療療法
製造されたＴ細胞療法の利点を証明するために、無作為化試験が実行され、製造されたＴ細胞療法の結果を、ＤＰｄ、ＤＲｄ、またはＫＲｄレジメンのいずれかで構成される標準治療療法と正式に比較する、レジメンは、２回目または３回目の再発におけるＭＭ患者のＦＤＡ承認ステータスに従って、文献に規定されているとおりに投与される。
実施例７
定常状態アフェレーシスを実行して、ＰＢＭＣリンパ球を含有する患者試料を得た 試料中のリンパ球をＧＥによるＳｅｐａｘ（登録商標）機器上での自動Ｆｉｃｏｌｌ手順を使用することによって富化した 次いで、リンパ球富化細胞集団をＧ－ＲＥＸ培養容器に播種し、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（血清補充なし、ＩＬ－２補充なし）、ＩＦＮ－α、テムシロリムス、およびバシリキシマブを含有する、で６日間培養した。製造の最後に、得られたＴｈ１／Ｔｃ１細胞を、エトポシドへの曝露によってアポトーシスになった膵臓がん細胞（ＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞株）または肺がん細胞（Ｈ２３細胞株）のいずれかに曝露した。この腫瘍溶解物を用いたパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）後、ＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍＬ）中で７日間培養し、その時点で、腫瘍溶解物への二次曝露を行った。ＩＬ－２含有培地での追加の７日間の培養間隔の後、三次腫瘍溶解物への曝露を行い、得られた２４時間上清をルミネックスアッセイによってサイトカイン含有量について試験した（結果は、２４時間当たりの１×１０６個の細胞当たりのｐｇ／ｍＬで示される）。サイトカインアッセイの結果を図３４Ａ～図３４Ｂに示す。条件Ａは、腫瘍溶解物の準最適な製剤でのパルシングを示す；条件Ｂは、腫瘍溶解物の最適な製剤を表す。「＜」は、値が検出限界を下回っていたことを示す。
図３４Ａ～図３４Ｂに示されるように、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞は、膵臓がん細胞および肺がん細胞などの固形腫瘍を含む腫瘍細胞に応答するそれらの能力によってさらに特徴付けられ得る。図３４Ａ～図３４Ｂにさらに示されるように、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦの高レベル分泌、ならびにＴｈ２サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１０の分泌の減少によって証明されるように、特徴的なＴｈ１サイトカイン表現型を維持することができる。
別の実験では、製造の終わりに、得られたＴｈ１／Ｔｃ１細胞を、エトポシドへの曝露によってアポトーシスになった膵臓がん細胞（ＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞株）または肺がん細胞（Ｈ２３細胞株）のいずれかに曝露した。この腫瘍溶解物を用いたパルシングに続いて、ＩＬ－７（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）中で７日間培養し、その時点で、腫瘍溶解物への二次曝露を行った。ＩＬ－７およびＩＬ－１５含有培地での追加の７日間の培養間隔の後、三次腫瘍溶解物への曝露を行い、得られた２４時間上清をルミネックスアッセイによってサイトカイン含有量について試験した（結果は、２４時間当たりの１×１０６個の細胞当たりｐｇ／ｍＬで示される）。対照培養物（「ＲＡＰＡ－２０１、腫瘍なし」）は、ＩＬ－７およびＩＬ－１５含有培地中で増殖したが、腫瘍溶解物でのパルシングを受けなかった製造された耐性Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞から構成された。サイトカインアッセイの結果を図３５に示す。
図３５に示すように、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞は、膵臓がん細胞および肺がん細胞などの固形腫瘍を含む腫瘍細胞に応答するそれらの能力によってさらに特徴付けられ得る。固形腫瘍細胞株に対するこのインビトロ感作は、ＲＡＰＡ－Ｔ細胞のエフェクター機能を選択的に駆動することが示されている２つの恒常的サイトカインであるＩＬ－７およびＩＬ－１５を補充した培地中での培養増殖によって容易に実証することができる。腫瘍細胞へのＲＡＰＡ－Ｔ細胞サイトカインの分泌は、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－αの高レベル分泌によって証明されるように、特徴的なＴｈ１サイトカイン表現型を維持することができる。
図３６に示されるように、腎細胞がん、肝臓がん、肺がん、膀胱がん、および胃がんなどの多くのがんは、固形腫瘍における寛解を誘導することができるＰＤ－１およびＣＴＬＡ４などのチェックポイント阻害剤分子に対するモノクローナル療法などのチェックポイント阻害剤療法に応答することが示されている。さらなる実験では、サイモンの２段階デザインの下で、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、膀胱がん、および低変異ＰＤＬ１陰性または低変異率がんを有する患者（ｎ＝７）に、製造されたＴ細胞療法を施与する。任意のコホートが少なくとも１人の応答性患者を有する場合、コホートは２０人の患者コホートに拡大される。
理論に束縛されるものではないが、Ｒａｐａ－Ｔ細胞は、細胞がチェックポイント阻害剤受容体を減少させているか、またはまったく有していないため、がんにおいて治療的利益を提供することができると予想される。ある特定のがんが、ＰＤ１およびＣＴＬＡ４以外のチェックポイント阻害剤受容体のために、ある特定の治療に対して非応答性であり得ることが疑われる。したがって、理論に束縛されることなく、追加のチェックポイント阻害剤受容体がないために、Ｒａｐａ－Ｔ細胞は、他のがんの治療に有効である可能性があると予想される。
実施例８
テムシロリムス（２μＭ）および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体バシリキシマブ（３０μｇ／ｍＬ）を含有する培地中で培養したＦｉｃｏｌｌ後の細胞集団を用いて、Ｒａｐａ－Ｔ細胞を６日間培養によって製造した。２４時間後、培養物をＩＦＮ－α（２０，０００ＩＵ／ｍＬ）で補充し、培養物のＩＬ－２補充はなかった。培養物中に使用される抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激の形態はなかった。
対照的に、「対照」について：Ｆｉｃｏｌｌ後の細胞集団を、テムシロリムスを含まず、バシリキシマブを含まない培地で培養した。細胞を、培養開始の日に、３：１のビーズ対Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズで共刺激した。培地は、培養開始日にＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびＩＦＮ－α（２０，０００ＩＵ／ｍＬ）で補充した。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、およびＴＩＭ３についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、培養投入集団、Ｒａｐａ－Ｔ細胞、および対照細胞についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのフローサイトメトリーによって測定した。データを以下の表２に示す。チェックポイント阻害剤受容体発現の減少は、Ｒａｐａ－Ｔ細胞と対照細胞との間で見られ、各チェックポイントについてのＭＦＩは、Ｒａｐａ－Ｔ細胞と培養投入細胞についてほぼ同じであった。
Figure 2022508131000006
製造実施形態：
１．製造されたＴ細胞を産生するための方法であって、
テムシロリムスおよびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地に、ある細胞密度で対象からのＴ細胞を含む細胞の培養投入集団を接種することと、
ＩＦＮ－αを該培養培地に添加することと、
該Ｔ細胞および培養培地を一定期間インキュベートして、製造されたＴ細胞を得ることと、
該製造されたＴ細胞を収集することと、を含む、方法。
２．Ｔ細胞および培養培地に、追加の培養培地を添加することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．追加の培養培地が、培養培地中の細胞の培養投入集団を接種した後、約４８時間で添加される、実施形態２に記載の方法。
４．培養物に添加される追加の培養培地の量が、培養中の細胞の細胞密度を標的細胞密度まで減少させるのに十分であり、接種時の細胞の培養投入集団の細胞密度が、９ｘ１０６個の細胞／ｍＬを超え、標的細胞密度が、約９ｘ１０６個の細胞／ｍＬである、実施形態２～３のいずれか１つに記載の方法。
５．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激が実行されない、実施形態１に記載の方法。
６．培養物に添加される追加の培養培地の量が、細胞の培養物投入集団が培養培地に接種されるときの培養培地の量に対して１：１～３：１の比である、実施形態２に記載の方法。
７．該製造されたＴ細胞を収集した後、
該製造されたＴ細胞の少なくとも一部分をパッケージに包装することと、
該製造されたＴ細胞の該一部分を含有する該パッケージを冷凍することと、をさらに含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．該培養培地がＩＬ－２を含有せず、ＩＬ－２が該培養培地に添加されない、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．該ＩＦＮ－αが、該細胞の培養投入集団を接種するのとほぼ同時に、または該細胞の培養投入集団に接種してから２４時間以内に、該培養培地に添加される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．該細胞密度が、１ｍＬ当たり少なくとも１．５×１０６個の細胞である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．該細胞密度が、１ｍＬ当たり約７．５×１０６個の細胞である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１２．該細胞密度が、１ｍＬ当たり約３０×１０６個の細胞である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１３．該テムシロリムスが、約４．５μＭの濃度で該培養培地中に存在する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．該テムシロリムスが、所望の濃度を維持するために、期間中に１回以上該培養培地に添加される、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１５．該テムシロリムスが、該期間中に２日ごとに該培養培地に添加される、実施形態１４に記載の方法。
１６．該所望の濃度が、約４．５μＭである、実施形態１４～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、抗ＩＬ－２受容体抗体またはその断片である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、バシリキシマブまたはダクリズマブである、実施形態１７に記載の方法。
１９．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、５～５０μｇ／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．該ＩＦＮ－αが、１，０００～１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で該培養培地に添加される、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．該期間が、約４日間～約８日間である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．該期間が、６日間である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２３．該培養培地が、血清を実質的に含まない、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．血清が、該培養培地に添加されない、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．該培養培地が、５％のヒト血清をさらに含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２６．該培養培地が、ＴｅｘＭＡＣＳ培地を含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．該細胞の培養投入集団が、細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、６６％以下のＴ細胞を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．該細胞の培養投入集団が、細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約５０％～約９５％のＴ細胞を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２９．該細胞の培養投入集団が、単球をさらに含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．
該対象からＴ細胞を含む試料を採取することと、
該試料からＴ細胞を単離して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．該細胞の培養投入集団が、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約９９％以上のＴ細胞を含む、実施形態３０に記載の方法。
３２．該Ｔ細胞が、抗体に基づく精製によって単離される、実施形態３０～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．該対象からＴ細胞を含む試料を採取することと、
Ｔ細胞について該試料を富化して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３４．該富化が、対向流遠心溶出法またはＦｉｃｏｌｌ手順によって実行される、実施形態３３に記載の方法。
３５．該細胞の培養投入集団は、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約７０％のＴ細胞を含む、実施形態３３～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象から該細胞の培養投入集団を収集すること、をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３７．実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法によって産生される製造されたＴ細胞。
３８．製造されたＴ細胞を産生するための方法であって、
テムシロリムスおよびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地に、対象からのＴ細胞をある細胞密度で含む細胞の培養投入集団を接種することと、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による該細胞の培養投入集団の共刺激なしに、該細胞の培養投入集団および培養培地を第１の期間インキュベートすることと、
該第１の期間のインキュベーション後に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズを、ビーズ：Ｔ細胞比１：１～１：１２で該Ｔ細胞および培養培地に添加して、該Ｔ細胞を刺激することと、
ＩＦＮ－αを該培養培地に添加することと、
該抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズおよびＩＦＮ－αを含有する該培養培地中で該細胞の培養投入集団を第２の期間インキュベートして、製造されたＴ細胞を得ることと、
該製造されたＴ細胞から該抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズを分離することと、
該製造されたＴ細胞を収集することと、を含む、方法。
３９．該製造されたＴ細胞を収集した後に、
該製造されたＴ細胞の少なくとも一部分をパッケージに包装することと、
該製造されたＴ細胞の該一部分を含有する該パッケージを冷凍することと、をさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．該培養培地がＩＬ－２を含有せず、ＩＬ－２が該培養培地に添加されない、実施形態３８～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．該ＩＦＮ－αが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズが添加されるのと同時に、またはほぼ同時に添加される、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．該細胞密度が、１ｍＬ当たり少なくとも１．５×１０６個の細胞である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．該細胞密度が、１ｍＬ当たり約７．５×１０６個の細胞である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法。
４４．該細胞密度が、１ｍＬ当たり約３０×１０６個の細胞である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の方法。
４５．該テムシロリムスが、１μＭの濃度で該培養培地中に存在する、実施形態３８～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．該テムシロリムスが、所望の濃度を維持するために、該第２の期間中に１回以上該培養培地に添加される、実施形態３８～４４のいずれか１つに記載の方法。
４７．該テムシロリムスが、該第２の期間中に２日ことに該培養培地に添加される、実施形態４６に記載の方法。
４８．該所望の濃度が１μＭである、実施形態４６～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、抗ＩＬ－２受容体抗体またはその断片である、実施形態３８～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、バシリキシマブまたはダクリズマブである、実施形態４９に記載の方法。
５１．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、５～５０μｇ／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在する、実施形態３８～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．該第１の期間が、約８時間～約２４時間である、実施形態３８～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．該第１の期間が、１６時間である、実施形態３８～５１のいずれか１つに記載の方法。
５４．該ビーズ：Ｔ細胞比が、１：３である、実施形態３８～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．該ＩＦＮ－αが、１，０００～１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で該培養培地に添加される、実施形態３８～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．該第２の期間が、約４日間～約８日間である、実施形態３８～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．該第２の期間が、６日間である、実施形態３８～５５のいずれか１つに記載の方法。
５８．該培養培地が、５％のヒト血清をさらに含む、実施形態３８～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．該培養培地が、ＴｅｘＭＡＣＳ培地を含む、実施形態３８～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．該細胞の培養投入集団が、細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、６６％以下のＴ細胞を含む、実施形態３８～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．該細胞の培養投入集団が、細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約５０％～約９５％のＴ細胞を含む、実施形態３８～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．該細胞の培養投入集団が、単球をさらに含む、実施形態３８～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．該対象からＴ細胞を含む試料を採取することと、
該試料からＴ細胞を単離して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含む、実施形態３８～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．該細胞の培養投入集団が、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約９９％以上のＴ細胞を含む、実施形態６３に記載の方法。
６５．該Ｔ細胞が、抗体に基づく精製によって単離される、実施形態６３～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．該対象からＴ細胞を含む試料を採取することと、
Ｔ細胞について該試料を富化して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含む、実施形態３８～６２のいずれか１つに記載の方法。
６７．該富化が、対向流遠心溶出法またはＦｉｃｏｌｌ手順によって実行される、実施形態６６に記載の方法。
６８．該細胞の培養投入集団は、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約７０％のＴ細胞を含む、実施形態６６～６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象から該細胞の培養投入集団を収集すること、をさらに含む、実施形態３８～６２のいずれか１つに記載の方法。
７０．実施形態３８～６９のいずれか１つに記載の方法によって産生される製造されたＴ細胞。
７１．製造されたＴ細胞を産生するための方法であって、
テムシロリムスおよびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地に、ある細胞密度で対象からのＴ細胞を含む細胞の培養投入集団を接種することと、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による該細胞の培養投入集団の共刺激なしに、該細胞の培養投入集団および培養培地を第１の期間インキュベートすることと、
第１の期間の該インキュベーション後に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８含有ナノ粒子を、約０．０１倍～約０．１倍の推奨用量で該Ｔ細胞および培養培地に添加して、該Ｔ細胞を刺激することと、
ＩＦＮ－αを該培養培地に添加することと、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８含有ナノ粒子およびＩＦＮ－αを含有する該培養培地中で該細胞の培養投入集団を第２の期間インキュベートして、製造されたＴ細胞を得ることと、
該製造されたＴ細胞を収集することと、を含む、方法。
７２．該製造されたＴ細胞を収集した後に、
該製造されたＴ細胞の少なくとも一部分をパッケージに包装することと、
該製造されたＴ細胞の該一部分を含有する該パッケージを冷凍することと、をさらに含む、実施形態７１に記載の方法。
７３．該培養培地がＩＬ－２を含有せず、ＩＬ－２が該培養培地に添加されない、実施形態７１～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．該ＩＦＮ－αが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８含有ナノ粒子が添加されるのと同時に、またはほぼ同時に添加される、実施形態７１～７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．該細胞密度が、１ｍＬ当たり少なくとも１．５×１０６個の細胞である、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．該細胞密度が、１ｍＬ当たり約７．５×１０６個の細胞である、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載の方法。
７７．該細胞密度が、１ｍＬ当たり約３０×１０６個の細胞である、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載の方法。
７８．該テムシロリムスが、１μＭの濃度で該培養培地中に存在する、実施形態７１～７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．該テムシロリムスが、所望の濃度を維持するために、第２の期間中に１回以上該培養培地に添加される、実施形態７１～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．該テムシロリムスが、該第２の期間中に２日ことに該培養培地に添加される、実施形態７９に記載の方法。
８１．該所望の濃度が、１μＭである、実施形態７１～８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、抗ＩＬ－２受容体抗体またはその断片である、実施形態７１～８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、バシリキシマブまたはダクリズマブである、実施形態８２に記載の方法。
８４．該ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、５～５０μｇ／ｍＬの濃度で該培養培地中に存在する、実施形態７１～８３のいずれか１つに記載の方法。
８５．該第１の期間が、約８時間～約２４時間である、実施形態７１～８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．該第１の期間が、１６時間である、実施形態７１～８４のいずれか１つに記載の方法。
８７．該ＩＦＮ－αが、１，０００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で該培養培地に添加される、実施形態７１～８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．該第２の期間が、約４日間～約８日間である、実施形態７１～８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．該第２の期間が、６日間である、実施形態７１～８７のいずれか１つに記載の方法。
９０．該培養培地が、５％のヒト血清をさらに含む、実施形態７１～８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．該培養培地が、ＴｅｘＭＡＣＳ培地を含む、実施形態７１～９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．該細胞の培養投入集団が、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、６６％以下のＴ細胞を含む、実施形態７１～９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．該細胞の培養投入集団は、細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約５０％～約９５％のＴ細胞を含む、実施形態７１～９１のいずれか１つに記載の方法。
９４．該細胞の培養投入集団が、単球をさらに含む、実施形態７１～９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．該対象からＴ細胞を含む試料を採取することと、
該試料からＴ細胞を単離して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含む、実施形態７１～９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．該細胞の培養投入集団が、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約９９％以上のＴ細胞を含む、実施形態９５に記載の方法。
９７．該Ｔ細胞が、抗体に基づく精製によって単離される、実施形態９５～９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．該対象からＴ細胞を含む試料を採取することと、
Ｔ細胞について該試料を富化して、該細胞の培養投入集団を得ることと、をさらに含む、実施形態７１～９４のいずれか１つに記載の方法。
９９．該富化が、対向流遠心溶出法またはＦｉｃｏｌｌ手順によって実行される、実施形態９８に記載の方法。
１００．該細胞の培養投入集団は、該細胞の培養投入集団における細胞の総数のうち、約７０％のＴ細胞を含む、実施形態９８～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を培養培地に接種する前に、
該対象から該細胞の培養投入集団を収集すること、をさらに含む、実施形態７１～９４のいずれか１つに記載の方法。
１０２．実施形態７１～１０１のいずれか１つに記載の方法によって産生される製造されたＴ細胞。
１０３．外来性ＩＬ－２の存在下で産生される製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、ＳＴＡＴ５のリン酸化形態の減少したレベルを示す製造されたＴ細胞集団であって、観察された減少は、少なくとも５０％少なく、より好ましくは９０％以上少ない、製造されたＴ細胞集団。
１０４．培養投入Ｔ細胞と比較して、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を共発現するＴ細胞の頻度が少なくとも２５％増加することで示される、エフェクターメモリー状態から離れてＴセントラルメモリー状態に向かう分化のシフトを示す、製造されたＴ細胞集団。
１０５．ＩＬ－２受容体ＣＤ２５を、５％未満の割合、より好ましくは１％未満の割合で共発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度によって示される、静止状態で存在する製造されたＴ細胞集団。
１０６．製造終了時に低レベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αを分泌するＴ細胞によって示される、静止状態に存在する、製造されたＴ細胞集団であって、高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を使用した刺激手順後に培養上清中に含有される２４時間当たり１×１０６細胞当たり＜１００ｐｇ／ｍｌによって定義される、製造されたＴ細胞集団。
１０７．静止状態から高レベルの炎症性サイトカイン分泌の状態に移行する製造されたＴ細胞であって、阻害剤の不在下での６日間の拡張期間後、６日目の分泌レベルと比較して少なくとも５倍、より好ましくは２０倍である、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の増加によって定義される、製造されたＴ細胞。
１０８．少なくとも１０％未満のＣＴＬＡ４＋、より最適には５％未満のＣＴＬＡ４＋のフローサイトメトリーによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞発現によって定義される、低レベルの免疫抑制分子ＣＴＬＡ４を発現する製造されたＴ細胞集団。
１０９．少なくとも１０％未満のＴＩＭ３＋、より最適には２％未満のＴＩＭ３＋のフローサイトメトリーによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞発現によって定義される、低レベルのチェックポイント阻害分子ＴＩＭ３を発現する製造されたＴ細胞集団。
１１０．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象から該細胞の培養投入集団を採取すること、をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象からのＴ細胞を含む試料からＴ細胞を単離して、細胞の培養投入集団を得ること、をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
１１２．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象からのＴ細胞を含む試料を富化して、細胞の培養投入集団を得ること、をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。
１１３．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象からのＴ細胞を含む試料からＴ細胞を単離して、細胞の培養投入集団を得ること、をさらに含む、実施形態３８～６２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象からのＴ細胞を含む試料を富化して、細胞の培養投入集団を得ること、をさらに含む、実施形態３８～６２のいずれか１つに記載の方法。
１１５．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象からのＴ細胞を含む試料からＴ細胞を単離して、細胞の培養投入集団を得ること、をさらに含む、実施形態７１～９４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．ある細胞密度で該対象からのＴ細胞を含む該細胞の培養投入集団を培養培地に接種する前に、
該対象からのＴ細胞を含む試料を富化して、細胞の培養投入集団を得ること、をさらに含む、実施形態７１～９４のいずれか１つに記載の方法。
１１７．ＩＦＮ－αが、細胞の培養投入集団が培養培地に接種された後２４時間で添加される、実施形態１～３６、３８～６９、および７１～１００のいずれか１つに記載の方法。
１１８．実施形態１１０～１１７のいずれか１つに記載の方法によって産生される製造されたＴ細胞。
１１９．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１２０．フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１２１．該減少した頻度が、該対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１２０に記載の製造されたＴ細胞集団。
１２２．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＴＩＭ３を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１２３．フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と比較して、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１２４．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１２３に記載の製造されたＴ細胞集団。
１２５．フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１２６．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１２５に記載の製造されたＴ細胞集団。
１２７．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＰＤ１を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１２８．フローサイトメトリーによって測定した場合、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１２９．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１２８に記載の製造されたＴ細胞集団。
１３０．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、２Ｂ４を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１３１．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％以下のまたはＣＤ８＋Ｔ細胞が、２Ｂ４を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１３２．フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と比較して、２Ｂ４を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１３３．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１３２に記載の製造されたＴ細胞集団。
１３４．フローサイトメトリーによって測定した場合、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１３５．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも２０％少ない、実施形態１３４に記載の製造されたＴ細胞集団。
１３６．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＬＡＩＲ１を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１３７．フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団におけるＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と比較して、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１３８．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１３７に記載の製造されたＴ細胞集団。
１３９．フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１４０．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１３９に記載の製造されたＴ細胞集団。
１４１．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＴＩＧＩＴを発現する、製造されたＴ細胞集団。
１４２．フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１４３．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも４０％少ない、実施形態１４２に記載の製造されたＴ細胞集団。
１４４．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＬＡＧ３を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１４５．フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ－Ｒａｐａ細胞の対応する頻度と比較して、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の減少した頻度を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１４６．減少した頻度が、対応する頻度よりも少なくとも５０％少ない、実施形態１４４に記載の製造されたＴ細胞集団。
１４７．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における１％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ２５を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１４８．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における５％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＫＬＲＧ１を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１４９．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における２０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ３９を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１５０．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における２０％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ７３を発現する、製造されたＴ細胞集団。
１５１．製造されたＴ細胞集団であって、フローサイトメトリーによって測定した場合、製造されたＴ細胞集団における４％以下のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＧＩＴＲを発現する、製造されたＴ細胞集団。
１５２．製造されたＴ細胞集団においてＣＤ２８またはＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団においてＣＤ２８またはＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度と実質的に同じである、実施形態１０８～１０９および１１９～１５０のいずれか１つに記載の製造されたＴ細胞集団。
１５３．ＣＤ２８またはＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が、製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団においてＣＤ２８またはＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の対応する頻度の１０％以内である、実施形態１０８～１０９および１１９～１５０のいずれか１つに記載の製造されたＴ細胞集団。
１５４．３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズで共刺激した後、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６個の細胞／日のＩＬ－２を分泌する、製造されたＴ細胞集団。
１５５．３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズ、ならびにＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせを、存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５の各々について１０ｎｇ／ｍＬの濃度で共刺激した後、ＩＬ－２を少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６個の細胞／日のＩＬ－２で分泌する、製造されたＴ細胞集団。
１５６．ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下で、存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５の各々について１０ｎｇ／ｍＬの濃度で共刺激した後、対照のＴ細胞集団またはＴ－Ｒａｐａ細胞と比較して増加した量のＩＬ－２を分泌する、製造されたＴ細胞集団。
１５６．培養Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して少なくとも７５％少ないリン酸化ＳＴＡＴ５、検出可能なレベルのＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１、少なくとも５０％減少したｐ７０Ｓ６Ｋおよびラプター、ならびに培養Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と５０％以下の差のリクター、ＳＧＫ１およびリン酸化ＳＧＫ１のレベル、を発現する製造されたＴ細胞集団。
１５７．製造されたＴ細胞集団であって、
（ａ）Ｔ細胞の対照集団と比較して減少したレベルのリン酸化Ｐ７０Ｓ６Ｋ、または
（ｂ）Ｔ細胞の対照集団と比較して減少したレベルのラプター、のうちの少なくとも１つを特徴とする、減少したｍＴＯＲＣ１活性化を示し、かつ
実質的に同じレベルのリクター、ＳＧＫ１またはリン酸化ＳＧＫ１を特徴とする、ｍＴＯＲＣ２分子の保存を示す、製造されたＴ細胞集団。
１５７．培養Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して少なくとも７５％少ないリン酸化ＳＴＡＴ５、検出可能なレベルのＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１、少なくとも５０％減少したｐ７０Ｓ６Ｋおよびラプター、ならびに培養Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と５０％以下の差のリクター、ＳＧＫ１およびリン酸化ＳＧＫ１のレベル、を発現する製造されたＴ細胞集団。
１５８．製造されたＴ細胞集団であって、
（ａ）Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して減少したレベルのリン酸化Ｐ７０Ｓ６Ｋ、または
（ｂ）Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較して減少したレベルのラプター、のうちの少なくとも１つを特徴とする、減少したｍＴＯＲＣ１活性化を示し、かつ
Ｔ－Ｒａｐａ細胞と実質的に同じレベルのリクター、ＳＧＫ１またはリン酸化ＳＧＫ１を特徴とするｍＴＯＲＣ２分子の保存を示す、製造されたＴ細胞集団。
１５９．対照のＴ細胞培養物と比較して減少したＳＴＡＴ５リン酸化、および検出可能なレベルのＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１をさらに特徴とする、実施形態１５８に記載の製造されたＴ細胞集団。
１６０．対照Ｔ細胞培養物と比較して減少したＳＴＡＴ５リン酸化、および検出可能なレベルのＳＴＡＴ１またはリン酸化ＳＴＡＴ１を特徴とする製造されたＴ細胞集団。
１６１．以下の特性のうちの１つ以上を有する製造されたＴ細胞集団であり、該特性が、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＦＮ－γの分泌の少なくとも５０％の増加、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴＮＦ－αの分泌の少なくとも５０％の増加、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＧＭ－ＣＳＦの分泌の少なくとも５０％の増加、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後のＴ－Ｒａｐａ細胞と比較したＩＬ－２の分泌の少なくとも５０％の増加；
該製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、少なくとも５０％のＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７に陽性の細胞の割合の増加、
該Ｔ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、５０％以下の４ＥＢＰ１リン酸化の増加、
同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋまたはラプターの発現の少なくとも５０％の減少、
同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ－ＳＴＡＴ５の発現の少なくとも５０％の減少、
検出可能なレベルのＳＴＡＴ１およびｐ－ＳＴＡＴ１発現、
該製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋの発現の少なくとも１０％の増加、
Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ＣＤ２５の発現の少なくとも５０％の減少、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が２０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が２０％以下、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の５％以下、
製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ２８の発現レベル、
製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＩＣＯＳの発現レベル、
製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ４５ＲＡの発現レベル、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ４５ＲＡに陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５０％の増加、
同じ条件下でインキュベートされたＴ－Ｒａｐａ培養物と比較して、ＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベートした場合にＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベーション後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団の対応する発現レベルと比較して、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現の少なくとも２５％の減少、
ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルであって、製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における対応する発現レベルの２５％以内である、発現レベル、
ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の少なくとも５０％の増加、
培養投入Ｔ細胞と比較してＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を共発現するＴ細胞の頻度の少なくとも２５％の増加、
ＩＬ－２受容体ＣＤ２５を５％未満、より好ましくは１％未満で共発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、
高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を使用した刺激手順後の培養上清中に含有される２４時間当たり１×１０６細胞当たり＜１００ｐｇ／ｍｌで定義される、製造終了時の低レベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌、
６日目の分泌レベルと比較して少なくとも５倍、より好ましくは２０倍である、阻害剤の非存在下での６日間の拡張期間後のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の増加、ならびに、
これらの組み合わせ、である、製造されたＴ細胞集団。
１６２．以下の特性のうちの１つ以上を有する製造されたＴ細胞であり、該特性が、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後のＴ－Ｒａｐａ細胞と比較したＩＦＮ－γの分泌の少なくとも５０％の増加；
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後のＴ－Ｒａｐａ細胞と比較したＴＮＦ－αの分泌の少なくとも５０％の増加；
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後のＴ－Ｒａｐａ細胞と比較したＧＭ－ＣＳＦの分泌の少なくとも５０％の増加；
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後のＴ－Ｒａｐａ細胞と比較したＩＬ－２の分泌の少なくとも５０％の増加；
該Ｔ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、５０％以下の４ＥＢＰ１リン酸化の増加、
同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋまたはラプターの発現の少なくとも５０％の減少、
同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ－ＳＴＡＴ５の発現の少なくとも５０％の減少、
検出可能なレベルのＳＴＡＴ１およびｐ－ＳＴＡＴ１発現、
製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋの発現の少なくとも１０％の増加、
Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ＣＤ２５の発現の少なくとも５０％の減少、
製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ２８の発現レベル、
製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＩＣＯＳの発現レベル、
製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ４５ＲＡの発現レベル、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ４５ＲＡに陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５０％の増加、
同じ条件下でインキュベートされたＴ－Ｒａｐａ培養物と比較して、ＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベートした場合にＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベーション後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団の対応する発現レベルと比較して、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現の少なくとも２５％の減少、
ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルであって、製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における対応する発現レベルの２５％以内である、発現レベル、
ＣＤ１２７を発現させること、
高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を使用した刺激手順後の培養上清中に含有される２４時間当たり１×１０６細胞当たり＜１００ｐｇ／ｍｌで定義される、製造終了時の低レベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌、
６日目の分泌レベルと比較して少なくとも５倍、より好ましくは２０倍である、阻害剤の非存在下での６日間の拡張期間後のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の増加、ならびに、
これらの組み合わせ、である、製造されたＴ細胞。

Claims (68)

  1. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、
    製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で前記対象に投与することを含む、方法。
  2. 製造されたＴ細胞を含む前記組成物を、治療有効用量で前記対象に投与する前に、免疫枯渇レジメンを前記対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記免疫枯渇レジメンを前記対象に施す前に、前記対象から自己細胞を収集することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 製造されたＴ細胞を含む前記組成物を前記対象に投与する前に、前記対象から自己細胞を収集することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記免疫枯渇レジメンが、
    ペントスタチンおよびシクロホスファミドのうちの少なくとも１つを前記対象に投与することを含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記免疫枯渇レジメンが、
    ペントスタチンを含む第１の組成物を前記対象に投与することと、
    シクロホスファミドを含む第２の組成物を前記対象に投与することと、を含む、請求項２に記載の方法。
  7. ペントスタチンが前記対象に投与され、前記ペントスタチンの用量が０．５～４ｍｇ／ｍ２である、請求項５に記載の方法。
  8. シクロホスファミドが前記対象に投与され、前記シクロホスファミドの用量が５０～４００ｍｇである、請求項５に記載の方法。
  9. ペントスタチンおよびシクロホスファミドの両方が前記対象に投与される、請求項５に記載の方法。
  10. 前記ペントスタチンおよびシクロホスファミドが、単一組成物で前記対象に投与される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記単一組成物が、前記対象に静脈内投与される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第１の組成物が、０．５～４ｍｇ／ｍ２のペントスタチンの用量で投与される、請求項６に記載の方法。
  13. 前記第２の組成物が、シクロホスファミドを含み、前記組成物が、５０～４００ｍｇの前記シクロホスファミドの用量で投与される、請求項６に記載の方法。
  14. 前記治療有効用量が、前記対象の体重の１ｋｇ当たり１×１０５～５×１０６個の製造されたＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記組成物が、注入によって前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
  16. 前記対象が、くすぶり型多発性骨髄腫に罹患している、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
  17. 前記対象が、再発性難治性多発性骨髄腫に罹患している、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記対象が、クアッドまたはペンタ難治性多発性骨髄腫に罹患している、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記対象が、プロテアソーム阻害剤の投与、免疫調節薬の投与、アルキル化剤の投与、ＣＤ３８モノクローナル抗体の投与、およびグルココルチコイドの投与からなる群から選択される３つ以上の異なる治療ラインで以前に治療されており、前記対象が、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤および少なくとも１つの免疫調節薬に対して難治性である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、治療中または以前の治療の治療中止後６０日以内において、Ｍ－タンパク質／遊離軽鎖の差の減少、または疾患の進行が２５％未満である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  21. がんの治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であって、
    第１の治療サイクルおよび１つ以上の追加の治療サイクルを含み、
    前記第１の治療サイクルが、
    第１の免疫枯渇レジメンを前記対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることを含み、
    前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれが、
    第２の免疫枯渇レジメンを前記対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることと、
    製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で前記対象に投与することと、を含む、方法。
  22. 前記第１の治療サイクルが、最低２８日の持続期間である、請求項２２に記載の方法。
  23. 前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれが、最低３５日の持続期間である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１の免疫枯渇レジメンが、
    ペントスタチンを前記対象に投与することと、
    シクロホスファミドを前記対象に投与することと、を含む、請求項２２に記載の方法。
  25. ペントスタチンを前記対象に投与する前記ステップが、前記第１の治療サイクル中に繰り返される、請求項２５に記載の方法。
  26. ペントスタチンを前記対象に投与する前記ステップが、前記第１の治療サイクルの１日目、４日目、８日目、および／または１１日目に実行される、請求項２６に記載の方法。
  27. ペントスタチンが、０．５～４ｍｇ／ｍ２の用量で前記対象に投与される、請求項２７に記載の方法。
  28. シクロホスファミドを前記対象に投与する前記ステップが、前記第１の治療サイクル中に繰り返される、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  29. シクロホスファミドを前記対象に投与する前記ステップが、前記第１の治療サイクルの１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目および／または１２日目に実行される、請求項２８に記載の方法。
  30. シクロホスファミドが、５０～４００ｍｇの用量で前記対象に投与される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第２の免疫枯渇レジメンが、
    ペントスタチンを前記対象に投与することと、
    シクロホスファミドを前記対象に投与することと、を含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ペントスタチンを前記対象に投与する前記ステップが、前記１つ以上の追加の治療サイクルの前記それぞれの間に繰り返される、請求項３１に記載の方法。
  33. ペントスタチンを前記対象に投与する前記ステップが、前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの１日目、４日目、８日目、および／または１１日目に実行される、請求項３２に記載の方法。
  34. ペントスタチンが、１～４ｍｇ／ｍ２の用量で前記対象に投与される、請求項３３に記載の方法。
  35. シクロホスファミドを前記対象に投与する前記ステップが、前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に繰り返される、請求項３２～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. シクロホスファミドを前記対象に投与する前記ステップが、前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目および／または１２日目に実行される、請求項３５に記載の方法。
  37. シクロホスファミドが、５０～４００ｍｇの用量で前記対象に投与される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれが、０～４週間間隔である、請求項２２～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記第１の治療サイクルおよび前記１つ以上の追加の治療サイクルのうちの第１のサイクルが、０～４週間間隔である、請求項２２～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で前記対象に投与する前記ステップが、前記１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの１５日目、１６日目、１７日目、または１８日目に実行される、請求項２２～４０のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記治療有効用量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり１×１０５～５×１０６個の製造されたＴ細胞である、請求項４０に記載の方法。
  42. 製造されたＴ細胞を含む前記組成物が、注入によって投与される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記対象が、くすぶり型多発性骨髄腫に罹患している、請求項２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記対象が、再発性難治性多発性骨髄腫に罹患している、請求項２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記対象が、クアッドまたはペンタ難治性多発性骨髄腫に罹患している、請求項２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記対象が、プロテアソーム阻害剤の投与、免疫調節薬の投与、アルキル化剤の投与、ＣＤ３８モノクローナル抗体の投与、およびグルココルチコイドの投与からなる群から選択される３つ以上の異なる治療ラインで以前に治療されており、前記対象が、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤および少なくとも１つの免疫調節薬に対して難治性である、請求項２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記対象が、治療中または以前の治療の治療中止後６０日以内において、Ｍ－タンパク質／遊離軽鎖の差の減少、または疾患の進行が２５％未満である、請求項２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  48. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、
    免疫枯渇レジメンを前記対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させることと、
    前記免疫枯渇レジメンの後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を、治療有効用量で前記対象に投与することと、を含む、方法。
  49. 前記免疫枯渇レジメンが、
    ペントスタチンを前記対象に投与することと、
    シクロホスファミドを前記対象に投与することと、
    前記対象のクレアチンクリアランスが＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２である場合に、１つ以上の追加用量のペントスタチンを前記対象に投与することと、
    前記対象の絶対リンパ球数が５０以上であり、かつ前記対象の絶対好中球数が５００以上である場合に、１つ以上の追加用量のシクロホスファミドを前記対象に投与することと、を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. １つ以上の追加用量のペントスタチンを前記対象に投与する前に、前記対象のクレアチンクリアランス（ＣｒＣｌ）を測定し、前記ＣｒＣｌに基づいて前記対象に投与されるペントスタチンの用量を調整すること、をさらに含み、ＣｒＣｌ＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合にペントスタチンが４ｍｇ／ｍ２で投与され、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２＞ＣｒＣｌ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合にペントスタチンが２ｍｇ／ｍ２で投与され、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２の場合にペントスタチンが投与されない、請求項４９に記載の方法。
  51. １つ以上の追加用量のシクロホスファミドを投与する前に、絶対リンパ球数（ＡＬＣ）および絶対好中球数（ＡＮＣ）を測定し、前記ＡＬＣおよびＡＮＣに基づいて前記対象に投与されるシクロホスファミドの用量を調整すること、をさらに含み、ＡＮＣ＞１０００／マイクロリットルの場合にシクロホスファミドが２００ｍｇの用量で投与され、ＡＮＣが５００～９９９／マイクロリットルおよびＡＬＣ＞５０／マイクロリットルの場合にシクロホスファミドが１００ｍｇの用量で投与され、ＡＬＣ＜５０／マイクロリットルまたはＡＮＣ＜５００／マイクロリットルの場合にシクロホスファミドが投与されない、請求項４８～４９のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記対象の前記ＣｒＣｌを測定し、投与されるペントスタチンの用量を調整する前記ステップが、前記免疫枯渇レジメンの１日目、４日目、８日目、および／または１１日目に実行される、請求項５０に記載の方法。
  53. ＡＬＣおよびＡＮＣを測定し、投与されるシクロホスファミドの用量を調整する前記ステップが、前記免疫枯渇レジメンの１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、および／または１２日目に実行される、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記免疫枯渇レジメンの後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で前記対象に投与する前記ステップが、前記免疫枯渇レジメンの開始の１５～１８日後に実行される、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 免疫枯渇レジメンを前記対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させるステップと、前記免疫枯渇レジメン後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で前記対象に投与するステップとを、少なくとも２回繰り返す、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 免疫枯渇レジメンを前記対象に施して、制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の少なくとも一部を減少させるか、または制御性Ｔ細胞および／もしくは末期老化エフェクターＴ細胞の機能の少なくとも一部を減少させるステップと、前記免疫枯渇レジメン後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で前記対象に投与するステップとを、最大５回繰り返す、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記免疫枯渇レジメンの後に、製造されたＴ細胞を含む組成物を治療有効用量で前記対象に投与する各ステップが、０～９週間間隔である、請求項５５～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記治療有効用量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり１×１０５～５×１０６個の製造されたＴ細胞である、請求項４８～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 製造されたＴ細胞を含む前記組成物が、注入によって投与される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記対象が、くすぶり型多発性骨髄腫に罹患している、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記対象が、再発性難治性多発性骨髄腫に罹患している、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記対象が、クアッドまたはペンタ難治性多発性骨髄腫に罹患している、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記対象が、プロテアソーム阻害剤の投与、免疫調節薬の投与、アルキル化剤の投与、ＣＤ３８モノクローナル抗体の投与、およびグルココルチコイドの投与からなる群から選択される３つ以上の異なる治療ラインで以前に治療されており、前記対象が、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤および少なくとも１つの免疫調節薬に対して難治性である、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記対象が、治療中または以前の治療の治療中止後６０日以内において、Ｍ－タンパク質／遊離軽鎖の差の減少、または疾患の進行が２５％未満である、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記がんが、多発性骨髄腫、腎細胞がん、膀胱がん、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、胃がん、結腸がん、肉腫、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、および結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１～１６、２０～４２、４６～５９、および６３～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記製造されたＴ細胞が、以下の特性のうちの１つ以上を有する製造されたＴ細胞集団であり、前記特性が、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＦＮ－γの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴＮＦ－αの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＧＭ－ＣＳＦの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＬ－２の分泌の少なくとも５０％の増加、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、少なくとも５０％のＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７に陽性の細胞の割合の増加、
    前記Ｔ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、５０％以下の４ＥＢＰ１リン酸化の増加、
    同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋまたはラプターの発現の少なくとも５０％の減少、
    同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ－ＳＴＡＴ５の発現の少なくとも５０％の減少、
    検出可能なレベルのＳＴＡＴ１およびｐ－ＳＴＡＴ１発現、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋの発現の少なくとも１０％の増加、
    Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ＣＤ２５の発現の少なくとも５０％の減少、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＭ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＰＤ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、２Ｂ４を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＩＲ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＴＩＧＩＴを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＬＡＧ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が１０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ２５を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＫＬＲＧ１を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ３９を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が２０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が２０％以下、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞が５％以下、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ２８の発現レベル、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＩＣＯＳの発現レベル、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ４５ＲＡの発現レベル、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ４５ＲＡに陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５０％の増加、
    同じ条件下でインキュベートされたＴ－Ｒａｐａ培養物と比較して、ＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
    ３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
    存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベートした場合にＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
    存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベーション後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
    Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団の対応する発現レベルと比較して、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現の少なくとも２５％の減少、
    ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルであって、前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における対応する発現レベルの２５％以内である、発現レベル、
    ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的な対照のＴ細胞集団と比較して、ＣＤ１２７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の少なくとも５０％の増加、
    培養投入Ｔ細胞と比較してＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を共発現するＴ細胞の頻度の少なくとも２５％の増加、
    ＩＬ－２受容体ＣＤ２５を５％未満、より好ましくは１％未満で共発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、
    高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を使用した刺激手順後の培養上清中に含有される２４時間当たり１×１０６細胞当たり＜１００ｐｇ／ｍｌで定義される、製造終了時の低レベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌、
    ６日目の分泌レベルと比較して少なくとも５倍、より好ましくは２０倍である、阻害剤の非存在下での６日間の拡張期間後のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の増加、及び、
    これらの組み合わせ、である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 以下の特性のうちの１つ以上を有する製造されたＴ細胞であり、前記特性が、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＦＮ－γの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴＮＦ－αの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＧＭ－ＣＳＦの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＬ－２の分泌の少なくとも５０％の増加、
    前記Ｔ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、５０％以下の４ＥＢＰ１リン酸化の増加、
    同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋまたはラプターの発現の少なくとも５０％の減少、
    同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ－ＳＴＡＴ５の発現の少なくとも５０％の減少、
    検出可能なレベルのＳＴＡＴ１およびｐ－ＳＴＡＴ１発現、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋの発現の少なくとも１０％の増加、
    Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ＣＤ２５の発現の少なくとも５０％の減少、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ２８の発現レベル、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＩＣＯＳの発現レベル、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ４５ＲＡの発現レベル、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ４５ＲＡに陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５０％の増加、
    同じ条件下でインキュベートされたＴ－Ｒａｐａ培養物と比較して、ＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
    ３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
    存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベートした場合にＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
    存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベーション後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
    Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団の対応する発現レベルと比較して、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現の少なくとも２５％の減少、
    ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルであって、前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における対応する発現レベルの２５％以内である、発現レベル、
    ＣＤ１２７を発現させること、
    高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を使用した刺激手順後の培養上清中に含有される２４時間当たり１×１０６細胞当たり＜１００ｐｇ／ｍｌで定義される、製造終了時の低レベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌、
    ６日目の分泌レベルと比較して少なくとも５倍、より好ましくは２０倍である、阻害剤の非存在下での６日間の拡張期間後のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の増加、及び、
    これらの組み合わせ、である、製造されたＴ細胞。
  68. 前記製造されたＴ細胞は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有し、前記特性が、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＦＮ－γの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＴＮＦ－αの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＧＭ－ＣＳＦの分泌の少なくとも５０％の増加、
    ３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズによる刺激を使用した１週間のインキュベーション後、Ｔ－Ｒａｐａ細胞と比較してＩＬ－２の分泌の少なくとも５０％の増加、
    前記Ｔ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、５０％以下の４ＥＢＰ１リン酸化の増加、
    同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋまたはラプターの発現の少なくとも５０％の減少、
    同じ条件下で培養されたＴ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ｐ－ＳＴＡＴ５の発現の少なくとも５０％の減少、
    検出可能なレベルのＳＴＡＴ１およびｐ－ＳＴＡＴ１発現、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ７０Ｓ６Ｋの発現の少なくとも１０％の増加、
    Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団と比較して、ＣＤ２５の発現の少なくとも５０％の減少、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ２８の発現レベル、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＩＣＯＳの発現レベル、
    前記製造されたＴ細胞集団が産生されたＴ細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団の約２０％以内のＣＤ４５ＲＡの発現レベル、
    フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ４５ＲＡに陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも５０％の増加、
    同じ条件下でインキュベートされたＴ－Ｒａｐａ培養物と比較して、ＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
    ３：１～１：３のビーズ：Ｔ細胞比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁気ビーズによる共刺激後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
    存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベートした場合にＩＬ－２分泌が少なくとも１．１倍増加、
    存在する場合、ＩＬ－７およびＩＬ－１５がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬで添加される、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７およびＩＬ－１５の組み合わせの存在下でインキュベーション後、ＩＬ－２の分泌が少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日、
    Ｔ－Ｒａｐａ細胞集団の対応する発現レベルと比較して、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現の少なくとも２５％の減少、
    ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ１、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＬＲＧ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびこれらの組み合わせ、から選択される１つ以上のチェックポイント阻害剤の発現レベルであって、前記製造されたＴ細胞集団が産生された細胞に特徴的なＴ細胞の対照集団における対応する発現レベルの２５％以内である、発現レベル、
    ＣＤ１２７を発現させること、
    高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞比）を使用した刺激手順後の培養上清中に含有される２４時間当たり１×１０６細胞当たり＜１００ｐｇ／ｍｌで定義される、製造終了時の低レベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌、
    ６日目の分泌レベルと比較して少なくとも５倍、より好ましくは２０倍である、阻害剤の非存在下での６日間の拡張期間後のＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α分泌の増加、及び、
    これらの組み合わせ、である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140154228A1 (en) * 2011-06-11 2014-06-05 Hans-Dieter Volk Antigen-specific central-memory t cell preparations having high cd4+ fraction
US20170356917A1 (en) * 2014-11-04 2017-12-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating multiple myeloma
WO2018085690A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car t cell compositions
WO2018106958A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 Transtarget, Inc. Methods and compositions for vaccinating and boosting cancer patients

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2783700A1 (en) * 2006-09-07 2014-10-01 Stemline Therapeutics, Inc. Cancer stem cell-targeted cancer therapy
WO2010151517A2 (en) * 2009-06-25 2010-12-29 The Regents Of The University Of Michigan Antigen-specific long-term memory t-cells
US20180334490A1 (en) * 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
CA3020330A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140154228A1 (en) * 2011-06-11 2014-06-05 Hans-Dieter Volk Antigen-specific central-memory t cell preparations having high cd4+ fraction
US20170356917A1 (en) * 2014-11-04 2017-12-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating multiple myeloma
WO2018085690A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car t cell compositions
WO2018106958A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 Transtarget, Inc. Methods and compositions for vaccinating and boosting cancer patients

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