KR20210093302A - 제조된 t 세포로 암을 치료하는 방법 - Google Patents

제조된 t 세포로 암을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 암을 치료하는 방법은 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드의 투여에 이어서 제조된 T 세포의 투여를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 또한, 이러한 제조된 T 세포를 생산하는 방법, 상기 제조된 T 세포 및 상기 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

제조된 T 세포로 암을 치료하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2018년 11월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/768,145호, 2019년 10월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/927,034호 및 2019년 10월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/927,079호를 우선권으로 주장하며, 이러한 기초 출원 각각의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
타입 I 사이토카인 프로파일의 CD4+ 및 CD8+ T 세포(각각 Th1 및 Tc1 세포)는 입양 T 세포 요법 활동을 위한 후보 T 세포 집단이다. 이러한 Th1-타입 T 세포는 STAT1 및 STAT4 전사 인자를 자극시키고 차례로 부분적으로 Th1-타입 분화 상태를 규정하는 TBET 전사 인자를 촉진시키는, IL-12 및 IFN-α와 같은 사이토카인을 분극화함으로써 촉진된다.
입양 T 세포 요법의 성공은 부분적으로, 숙주에서 T 세포 집단의 생체내 지속성에 달려 있다. T 세포 지속성은 T 세포 기억을 증식시키고 유지하는 T 세포 능력의 증가 및 아폽토시스성 세포 사멸에 대한 T 세포 성향의 감소 둘 다에 의해 결정된 균형이다. 종래 연구에서, 약리제인 라파마이신에서 T 세포의 생체외 제조(라파마이신의 포유류 표적을 저해함, mTOR)가 이러한 특징들, 즉, 입양 전달 후 생체 내에서 항원-유도 클론 확장을 겪는 능력 증가; T 중심 기억(TCM) 분화 상태에 의해 예시되는 기억 상태 개선; 및 미토콘드리아 자가포식을 포함하는 자가포식의 유도 및 프로-아폽토시스 구성원에 비해 bcl-2 유전자 패밀리의 항-아포토시스 구성원의 우선적 발현을 특징으로 하는 다면 항-아폽토시스 표현형을 나타내는 T 세포를 생성한다는 것이 입증되었다. 종합해 보면, 이러한 생체외 제조된 라파마이신-내성 세포의 특성은 이식편-대-숙주 질환(GVHD)의 예방 및 이식 거부 및 인간-마우스 이종 GVHD의 중재를 포함하는, 이식 반응의 향상된 생체내 조절과 관련이 있으며, 참고로, 이러한 세포는 다발성 골수종의 치료를 위한 자가 및 동종이계 환경에서 임상 시험으로 성공적으로 번역되었고, 재발된, 불응성 다발성 골수종에 대해 안전하고 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 임상 시험 활동을 위해, 제조 공정은 하기 요소들을 포함하였다: 3개의 입자(bead):1개의 T 세포의 비교적 높은 비로 항-CD3, 항-CD28 코팅된 자성 입자(3/28 입자)와 공동-자극; 생체외 배양물에 T 세포 및/또는 3/28 입자의 동시 첨가; 고용량의 경구 투여된 mTOR 저해제 라파마이신(1μM)의 첨가; 및 사이토카인 분극화 동안 배양물에 IL-2 첨가의 사용(IFN-γ 첨가). 이러한 방법에 의해 생산된 세포는 본 명세서에서 본 개시내용에서 하기에서 더욱 상세하게 정의되는 T-Rapa 세포로서 지칭된다.
암 발생은 면역 기능의 변경과 관련될 수 있다. 이러한 변경은 종양 거부 실패와 관련된 억제된 세포 매개 면역(CMI)뿐만 아니라, 종양 촉진 및 진행을 강화시킬 수 있는 향상된 체액성 면역을 포함한다. CD4+ T 세포 서브세트, 즉, Th1 및 Th2 T 세포는 독특한 기능을 가지고, 서로 조절한다. Th1 세포는 인터루킨(IL-2) 및 인터페론(IFN-γ)을 생성하고, CMI 반응을 유도하는 반면, Th2 세포는 IL-4 및 IL-10을 생성하고, 국소 체액성 면역 반응을 촉진한다.
특정 암에서 Th1/Th2 불균형의 증거가 존재하며, 여기서, Th1 세포 수를 희생시키면서 Th2 세포의 비율이 크게 상승한다. Th2에 유리한 만성 Th1/Th2 불균형은 잠재적으로, 억제된 세포 매개 면역으로 이어지며, 이에 의해, 감소된 면역-감시 및 종양 발생을 위한 적절한 환경을 제공한다.
유전형 특이적 T 세포 반응은 초기 다발성 골수종을 갖는 대부분의 환자에서 발견된다. 이러한 것은 IL-2 및 IFN-γ 생성과 함께 Th1 반응을 포함한다. 예를 들어, 무통성 질환의 경우에 Th1-타입 면역이 우선적으로 발견되며, 진행성 다발성 골수종의 경우에 Th2-타입 반응이 우세하다. 결함이 있는 Th1 면역 반응(IL-6에 의해 매개됨)뿐만 아니라 조절장애 사이토카인 네트워크가 다발성 골수종 환자에서 확인된다. MM 환자에서 유래된 골수종 유전형-특이적 T 헬퍼 세포는 일관되게 비-Th1 표현형이다.
다발성 골수종 치료의 발전 및 신규한 약제학적 작용제 및 단클론성 항체의 최근 FDA-승인에도 불구하고, 다발성 골수종은 거의 보편적으로 치명적이다. 이와 같이, 다발성 골수종에 대한 상위 5개 약물에 대해 불응성인("펜타-불응성") 재발된, 불응성 다발성 골수종(RRMM)을 갖는 환자는 수 개월의 생존이 제한되고, 치료 옵션이 거의 없다. 다발성 골수종은 동종이형 줄기 세포 이식의 오랫동안-관찰된 치료 역할에 의해 및 단클론성 항체 요법, 백신, 및 T 세포 수용체(TCR-) 및 CAR-매개 T 세포 요법을 포함하는 다수의 다른 접근에 의해 입증한 바와 같이, 면역 요법에 취약한 질환이다. 이와 같이, 이러한 펜타-불응성 환자 집단은 신규한 T 세포 요법에 적합하다. 또한, 덜 불응성 질환을 갖는 환자는 또한, 신규한 치료법이 더욱 필요하다. 즉, 질환의 제2 또는 제3 재발에서도, 무진행 생존 중간값은 통상적으로 2년 미만이다.
특정 암에 대하여, 신규하고 혁신적인 면역 요법 방법이 필요하다.
본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 방법은 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 방법은 또한, 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에, 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 면역 고갈 요법은 상기 대상체에게 펜토스타틴을 포함하는 제1 조성물을 투여하고, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 제1 치료 사이클 및 하나 이상의 추가 치료 사이클을 포함하며, 상기 제1 치료 사이클은 상기 대상체에게 제1 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 것을 포함하며, 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각은 상기 대상체에게 제2 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키고; 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 본 방법은 또한, 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 용량의 펜토스타틴을 투여하기 전에, 상기 대상체의 크레아티닌 청소율(CrCl)을 측정하고, CrCl을 기초로 하여 상기 대상체에게 투여되는 펜토스타틴의 용량을 조정하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, CrCl > 60 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴은 4 ㎎/㎡로 투여되며, 60 ㎖/분/1.73㎡ > CrCl > 30 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴은 2 ㎎/㎡로 투여되며, CrCl < 30 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴은 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서, 60 ㎖/분/1.73㎡ > CrCl > 30 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴의 용량은 50% 감소되며, CrCl < 30 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴은 투여되지 않도록, 펜토스타틴의 용량은 CrCl을 기초로 하여 조정될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 본 방법은 또한, 하나 이상의 추가 용량의 사이클로포스파마이드를 투여하기 전에, 절대 림프구 수(ALC) 및 절대 호중구 수(ANC)를 측정하고, ALC 및 ANC를 기초로 하여 상기 대상체에게 투여되는 사이클로포스파마이드의 용량을 조정하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, ANC > 1000/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드는 200㎎의 용량으로 투여되며, ANC가 500 내지 999/마이크로리터이고 ALC > 50/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드는 100㎎의 용량으로 투여되며, ALC < 50/마이크로리터 또는 ANC < 500/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드는 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서, ANC가 500 내지 999/마이크로리터이고 ALC > 50/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드의 용량이 50% 감소되거나 ALC < 50/마이크로리터 또는 ANC < 500/마이크로리터일 때 투여되지 않도록 사이클로포스파마이드의 용량은 ALC 및 ANC를 기초로 하여 조정될 수 있다.
도 1a는 0일에 및 다양한 배양 조건 후 FoxP3을 발현하는 CD4+ T 세포의 백분율을 도시한 것이다.
도 1b는 0일에 및 다양한 배양 조건 후 TBET를 발현하는 CD4+ T 세포의 백분율을 도시한 것이다.
도 2a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 T 세포 수율을 도시한 것이다.
도 2a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 T 세포 수율을 도시한 것이다.
도 3a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 IFN-감마 분비를 도시한 것이다.
도 3b는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 TNF-알파 분비를 도시한 것이다.
도 4는 T-Rapa 방법 및 본 개시내용의 방법(Rapa-T)을 이용하여 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 p-4EBP1 및 액틴 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다(상단 패널). p-4EBP1 수준은 T-Rapa 방법 및 본 개시내용의 방법(Rapa-T)을 이용하여 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 액틴 발현에 의해 표준화되었다(하단 패널).
도 5는 T-Rapa 방법 및 본 개시내용의 방법(Rapa-T)을 이용하여 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 P70S6K 및 액틴 단백질(상단 패널)의 웨스턴 블롯 및 T-Rapa 방법 및 본 개시내용의 방법(Rapa-T)을 이용하여 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 액틴 발현에 의해 표준화된 P70S6K 수준(하단 패널)을 도시한 것이다.
도 6은 T-Rapa 방법 및 본 개시내용의 방법(Rapa-T)을 이용하여 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 P-STAT5 및 액틴 단백질(상단 패널)의 웨스턴 블롯 및 T-Rapa 방법 및 본 개시내용의 방법(Rapa-T)을 이용하여 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 액틴 발현에 의해 표준화된 P-STAT5 수준(하단 패널)을 도시한 것이다.
도 7a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 6일 IFN-감마 분비를 도시한 것이다.
도 7b는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 13일 IFN-감마 분비를 도시한 것이다.
도 8a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 6일 TNF-알파 분비를 도시한 것이다.
도 8b는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 13일 TNF-알파 분비를 도시한 것이다.
도 9a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 6일 GM-CSF 분비를 도시한 것이다.
도 9b는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 13일 GM-CSF 분비를 도시한 것이다.
도 10a는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 6일 IL-2 분비를 도시한 것이다.
도 10b는 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 배양한 후 13일 IL-2 분비를 도시한 것이다.
도 11은 다양한 조건 하에서 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 P62 및 액틴 단백질의 웨스턴 블롯(상단 블록) 및 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 액틴 발현에 의해 표준화된 P62 단백질 발현(하단 패널)을 도시한 것이다.
도 12는 다양한 조건 하에서 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 p-RAPTOR 및 액틴 단백질의 웨스턴 블롯(상단 블록) 및 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 액틴 발현에 의해 표준화된 p-RAPTOR 수준(하단 패널)을 도시한 것이다.
도 13은 다양한 조건 하에서 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 BIM 및 액틴 단백질의 웨스턴 블롯(상단 블록) 및 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 액틴 발현에 의해 표준화된 BIM 단백질 발현(하단 패널)을 도시한 것이다.
도 14a는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD45RA의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 14b는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD45RA의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 14c는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD45RA의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 14d는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD45RA의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 15a는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD62L, CCR7, 및 CD127의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 15b는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD62L, CCR7, 및 CD127의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 15c는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD62L, CCR7, 및 CD127의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 15d는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 CD4+ 세포 서브세트에 대한 CD62L, CCR7, 및 CD127의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 16은 다양한 조건 하에서 배양된 T 세포의 배양 수율의 배수 증가를 도시한 것이다.
도 17a는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 6일에 IFN-감마 분비를 도시한 것이다.
도 17b는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 13일에 IFN-감마 분비를 도시한 것이다.
도 18a는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 6일에 TNF-알파 분비를 도시한 것이다.
도 18b는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 13일에 TNF-알파 분비를 도시한 것이다.
도 19는 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 6일 및 13일에 CD4+ T 세포 서브세트에 대한 CD25의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 20은 다양한 조건 하에서 T 세포를 배양한 후 6일 및 13일에 CD4+ T 세포 서브세트에 대한 CD62L, CCR7, 및 CD127의 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 21은 고유 및 T 중심 기억 패널: CD45RA 발현; CD62L 및 CCR7의 동시-발현; 및 CD62L, CCR7, 및 CD127의 동시-발현에 대한, 입자 공동-자극을 도입하지 않은 신규한 Rapa-T 방법, 입자 공동-자극(입자-대-T 세포 비, 1:3)을 도입한 신규한 Rapa-T 방법, 및 종래 T-Rapa 방법(입자-대-T 세포 비, 3:1)을 비교한 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 22는 IL-2 수용체, CD25의 발현; 및 면역 억제 분자 CTLA4 및 TIM3의 발현에 대한, 입자 공동-자극을 도입하지 않은 신규한 Rapa-T 방법, 입자 공동-자극(입자-대-T 세포 비, 1:3)을 도입한 신규한 Rapa-T 방법, 및 종래 T-Rapa 방법(입자-대-T 세포 비, 3:1)을 비교한 유세포 분석법 발현 분석을 도시한 것이다.
도 23은 타입 II 사이토카인 IL-4의 분비 및 타입 I 사이토카인 IFN-γ의 분비에 대한, 입자 공동-자극이 도입되지 않은 신규한 Rapa-T 방법, 입자 공동-자극(입자-대-T 세포 비, 1:3)을 도입한 신규한 Rapa-T 방법, 및 종래 T-Rapa 방법(입자-대-T 세포 비, 3:1)을 비교한, 제조의 종료 시에 및 저해제를 사용하지 않고 추가 배양 6일에서의 사이토카인 분비 결과를 도시한 것이다.
도 24는 새로운 Rapa-T 세포 집단의 제조에서 입자 공동-자극이 없는 역할을 추가로 식별하기 위해 n=11 다양한 배양 조건에서 제조의 종료 시에 및 저해제 없는 배양에서 추가 6일 후 타입 I 사이토카인 분비(IL-2 및 IFN-γ) 결과를 도시한 것이다.
도 25a는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 CD45RA+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25b는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 CD25+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25c는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 CD28+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25d는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 ICOS+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25e는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 CD39+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25f는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 CD73+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25g는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 GITR+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25h는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 LAG3+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25i는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 PD1+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25j는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 2B4+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25k는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 LAIR1+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25l은 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 CTLA4+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25m은 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 KLRG1+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25n은 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 TIGIT+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 25o는 다양한 배양 조건 하에서 T 세포에 대한 TIM3+에 대한 유세포 분석법 데이터 측정을 도시한 것이다.
도 26은 다양한 배양 조건 하에서 세포에 대한 p-STAT5, p-STAT1, STAT1, p70S6K, p-SGK1, SGK1, Raptor, Rictor, 사이토크롬 C 및 액틴에 대한 웨스턴 블롯 결과를 도시한 것이다.
도 27a는 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로 공동-자극 및 상이한 사이토카인에 대한 노출 후 24시간 상청액으로부터의 RAPA-T 세포 및 T-Rapa 세포에 대한 IL-2 분비 측정을 도시한 것이다.
도 27b는 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로 공동-자극 및 상이한 사이토카인에 대한 노출 후 24시간 상청액으로부터의 RAPA-T 세포 및 T-Rapa 세포에 대한 TNF-α 분비 측정을 도시한 것이다.
도 28은 항-CD3/항-CD28 코팅된 입자 또는 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자로의 공동-자극 후 RAPA-T 세포에 대한 IL-2, TNF-α 및 IL-13 분비 측정을 도시한 것이다.
도 29는 항-CD3/항-CD28 코팅된 입자 또는 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자로의 공동-자극 후 RAPA-T 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD4, CD8, CD25 및 CTLA4 발현을 도시한 것이다.
도 30은 제조된 T 세포 요법 도식을 도시한 것이다.
도 31은 펜토스타틴/사이클로포스파마이드 요법에 이어서 제조된 T 세포 주입을 도시한 것이다.
도 32a 내지 도 32c는 대조군의 특성, 즉, Rapa-T 세포 요법에 무작위화되지 않은 대상체가 2차 또는 3차 재발된 MM을 갖는 대상체에게 적합한 3가지 FDA-승인 삼중 요법 중 하나를 수용할 것임을 상세히 도시한 것이다: 즉, DPd 요법(A); DRd 요법(B); 또는 KRd 요법(C).
도 33은 본 개시내용의 제조된 T 세포를 생성하기 위한 예시적인 작업 흐름을 도시한 것이다.
도 34a는 췌장암 세포에 노출된 후 RAPA-T 세포에 의한 사이토카인 분비를 도시한 것이다.
도 34b는 폐암 세포에 노출된 후 RAPA-T 세포에 의한 사이토카인 분비를 도시한 것이다.
도 35는 췌장암 세포 또는 폐암 세포에 노출되거나 노출되지 않은 RAPA-T 세포에 의한 사이토카인 분비를 도시한 것이다.
도 36은 관문 저해제 요법 반응과 암에서의 종양 돌연변이의 수 간의 상관 관계를 도시한 것이다.
본 개시내용은 제조된 T 세포를 제조하는 방법, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 제조된 T 세포, 제조된 T 세포의 집단을 포함하는 집단 및 조성물, 및 상기 제조된 T 세포 또는 제조된 T 세포의 집단을 사용하여 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
정의
하기 정의들이 제공된다:
본 명세서에서 사용되는 단일 형태는 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 청구범위 및 본 개시내용에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 지칭하거나 대안이 상호 배타적임을 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용된다.
용어 "약"의 사용은, 수치와 함께 사용될 때, +/- 10%를 포함하는 것으로 의도된다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 아미노산의 수가 약 200으로서 식별되는 경우에, 이는 180 내지 220(플러스 또는 마이너스 10%)을 포함할 것이다.
용어 "대상체," "환자," 및 "개체"는 본 명세서에서 서로 교환 가능하게 사용되고, 치료할 포유류 대상체를 지칭하며, 인간 환자가 바람직하다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 실험 동물, 수의학 적용, 및 마우스, 래트, 및 햄스터를 포함하는 설치류, 및 영장류를 포함하지만 이로 제한되지 않는 질환에 대한 동물 모델의 개발에서 용도를 발견한다.
"샘플"은 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용된다. 세포, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 등을 포함하는 샘플은 체액; 세포 제조물의 가용성 부분, 또는 세포가 성장된 배지; 염색체, 세포 기관, 또는 세포로부터 단리되거나 추출된 막; 용액 중 또는 기질에 결합된 게놈 DNA, RNA, 또는 CDNA, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드; 세포; 조직; 조직 프린트; 지문, 피부 또는 모발; 등을 포함할 수 있다.
"치료"는 장애의 발병을 예방하거나 이의 병리 또는 증상을 변경하려는 의도로 수행되는 개입이다. 이에 따라, "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애를 갖는 대상체뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 대상을 포함한다. 예를 들어, 종양(예를 들어, 암) 치료에서, 치료제는 종양 세포의 병리를 직접적으로 감소시키거나, 종양 세포를 다른 치료제, 예를 들어, 방사선 및/또는 화학요법에 의해 치료에 더 민감하게 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "개선된"은 정상화된 값(일례로서, 그러나 비제한적으로, 건강한 환자 또는 개체에서 얻은 값)에 도달하는 증상을 지칭하고, 예를 들어, 정상화된 값과 50% 미만 차이가 나고, 바람직하게는, 정상화된 값과 약 25% 미만 차이가 나고, 더욱 바람직하게는, 정상화된 값과 10% 미만 차이가 나고, 더욱 더 바람직하게는, 일상적인 통계 시험을 이용하여 측정한 경우 정상화된 값과 크게 상이하지 않다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 예를 들어, B형 간염 바이러스와 같은 감염성 질환 유기체를 앓고 있는 환자의 개선 또는 치료는 예를 들어, 플라크 형성 단위(p.f.u.)의 감소에 의해 측정한 경우, 환자로부터 획득된 샘플에서 바이러스 입자의 감소에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "치료 사이클"은 일반적으로, 1차 치료 사이클, 제1 치료 사이클, 제2 치료 사이클 또는 하나 이상의 추가 치료 사이클 중 어느 하나를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료학적 유효 용량" 또는 "치료학적으로 유효량"은 원하는 치료 반응을 산출하는 데 효과적인 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 암의 성장을 지연시키거나 암을 축소시키거나 전이를 예방하는 데 효과적인 용량은 "치료학적 유효 용량"일 수 있다. 특정 치료학적 유효 용량은 치료될 특정 병태, 환자의 신체 상태, 치료될 포유동물 또는 동물의 타입, 치료 기간, 동시 요법의 특성(임의의 경우), 및 사용되는 특정 제형 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 인자에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "면역 세포"는 B 세포로도 불리워지는 B 림프구, T 세포로도 불리워지는 T 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 림포카인-활성화 살해(LAK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 과립구, 비만 세포, 혈소판, 랑게르한스 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, 말초혈 단핵 세포, 종양-침윤(TIL) 세포, 하이브리도마를 포함하는 유전자 변형된 면역 세포, 약물 변형 면역 세포, 및 상기 세포 타입의 유도체, 전구체 또는 전구 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 검정될 수 있는 면역계의 임의의 세포를 포함하는 것을 의미한다.
"T 세포"는 흉선에서 비롯되고, CD3 복합체의 단백질과 관련된 헤테로다이머 수용체(예를 들어, 재배열된 T 세포 수용체, 세포의 항원/MHC 특이성을 담당하는 T 세포 표면 상의 헤테로다이머 단백질)를 갖는 림프구의 서브세트이다. T 세포 반응은 다른 세포에 대한 이의 효과(예를 들어, 표적 세포 사멸, B-세포와 같은 다른 면역 세포의 활성화) 또는 이러한 것이 생산되는 사이토카인에 대한 검정에 의해 검출될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항-CD3/항-CD28"은 항-CD3/항-CD28 항체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "항-CD3/항-CD28 자성 입자"는 항-CD3/항-CD28 항체 모이어티가 결합된 자성 입자를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 항-CD3/항-CD28 공동-자극이 항-CD3/항-CD28 자성 입자와 같은 특정 형태에 의해서도 제공되지 않는 것으로 개시되는 경우에, 이러한 것이 또한 다른 형태의 항-CD3/항-CD28로의 공동-자극을 배제할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "T-Rapa 세포(들)"는 배양 개시와 공동-자극 사이에 지연 없이 3:1의 비(입자:T 세포 비)로 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극에 의해 생산된 T 세포(들)를 지칭하며, 여기서, 세포는 X-Vivo 또는 IL-2 신호전달 저해제 없이 5% AB 혈청이 보충된, IFN-α(10,000 IU/㎖), IL-2(20 IU/㎖) 및 라파마이신(1μM)을 함유한 균등한 배지에서 성장되며, 여기서, 세포는 37℃에서 6일 동안 배양되고, 배양물에서 1.5×106개의 세포/㎖의 농도로 개시된다. 방법과 관련하여 사용되는 "T-Rapa"는 달리 주지하지 않는 한 상기에 규정된 바와 같이 T-Rapa 세포를 생성하는 방법을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "제조된 T 세포" 및 "Rapa-T 세포"는 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 T 세포를 지칭하기 위해 서로 교환 가능하게 사용된다. "제조된 T 세포"는 CD4+, CD8+ T 세포 또는 둘 다를 포함할 수 있다. "제조된 T 세포"는 환자로부터 수집된 T 세포, 즉, 자연 발생 T 세포를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "발현의 수준," "발현 수준" 또는 동등한 참조가 유세포 분석법에 의해 측정된 결과를 지칭하기 위해 사용될 때, 집단에서 특정 집단의 양성 세포의 빈도를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. "발현 수준" 또는 등가물이 특정 세포 타입의 수준을 지칭하는 한, 언급된 임의의 감소 또는 증가가 달리 주지하지 않는 한 상응하는 특정 세포 타입에 상대적인 것으로 이해되어야 한다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 용어 "자가" 세포는 세포가 투여되는 대상체 또는 "숙주"와 동일하거나 유사한 일배체형의 세포이며, 이에 대해 숙주에 이식될 때 이러한 세포에 대한 유의미한 면역 반응이 없음을 의미한다.
"CD4"는 APC 표면의 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원성 펩티드의 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 중요한 세포 표면 단백질이다. 활성화 시에, 고유 CD4 T 세포는 적어도 2개의 세포 타입, 즉, Th1 세포 및 Th2 세포 중 하나로 분화하며, 각 타입은 이러한 것이 생산하는 사이토카인을 특징으로 한다. "Th1 세포"는 주로 세포 면역 및 염증 반응과 관련하여 대식세포의 활성화에 관련이 있으며, "Th2 세포" 또는 "헬퍼 T 세포"는 주로 항체(체액 면역)를 생성하기 위해 B 세포의 자극화에 관련이 있다. CD4는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 수용체이다. Th1 세포에 대한 이펙터 분자는 IFN-γ, GM-CSF, TNF-α, CD40 리간드, Fas 리간드, IL-3, TNF-β, 및 IL-2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Th2 세포에 대한 이펙터 분자는 IL-4, IL-5, IL-13, CD40 리간드, IL-3, G-CSF, IL-10, TGF-β 및 에오탁신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Th1 타입 사이토카인 반응의 활성화는 Th2 타입 사이토카인 반응을 억제할 수 있으며, 반대로, Th2 타입 사이토카인 반응의 활성화는 Th1 타입 반응을 억제할 수 있다.
"사이토카인"은 사이토카인이 달성하는 세포의 표면 상의 "사이토카인 수용체"를 통한 다른 세포의 거동에 영향을 미치는 세포에 의해 제조된 단백질이다. 림프구에 의해 제조된 사이토카인은 때때로, "림포카인"으로 지칭된다. 사이토카인은 또한, 타입 I(예를 들어, IL-2 및 IFN-감마) 및 타입 II(예를 들어, IL-4 및 IL-10)를 특징으로 한다.
용어 "조절하다"는 언급된 임의의 활동이 예를 들어, 증가, 향상, 증가, 작용화(작용제로서 작용함), 촉진, 감소, 저감, 억제, 차단, 또는 길항화(길항제로서 작용함)되는 것을 의미한다. 조절은 기준치에 비해 1배, 2배, 3배, 5배, 10배, 100배, 등 이상의 활성을 증가시킬 수 있다. 조절은 또한, 이의 활성을 기준치 미만으로 감소시킬 수 있다.
"기재"는 핵산 분자 또는 단백질이 결합된 임의의 강성 또는 반-강성 지지체를 지칭하고, 웰, 트렌치, 핀, 카미엘(chamiel) 및 기공을 포함하는 다양한 표면 형태를 갖는 멤브레인, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 섬유, 자성 또는 비자성 입자, 젤, 모세관 또는 다른 배관, 플레이트, 폴리머, 및 미세입자를 포함한다.
제조된 T 세포를 제조하는 방법, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 제조된 T 세포, 및 제조된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물
본 개시내용의 방법에서, IFN-α는 Th1-타입 분화 상태 표현형 쪽으로 T 세포를 포함하는 배양물의 생체외 분극화에 사용된다. Th1-타입 분화는 조절 T(TREG) 세포 표현형에 대한 분극화에 의해 침식될 수 있으며, 이는 IL-2를 포함하는 사이토카인에 의해 촉진되며, 이는 부분적으로 TREG 분화 상태를 규정하는 FoxP3 전사 인자를 촉진시키기 위해 STAT5를 통해 신호전달한다. 본 개시내용의 방법에서, TREG 오염은 세포 배양 동안 IL-2의 외인성 사용을 생략하고 IL-2 신호전달 저해제의 배양 첨가에 의한 자가분비 IL-2 신호전달을 방지함으로써 Th1-타입 분극화 동안 제한된다. 일부 양태에서, IL-2 신호전달 저해제는 항-IL-2 수용체 단클론성 항체이다.
본 개시내용에서, 다른 T 세포 제조 방법과 비교하여 하기 개입을 도입하는 신규한 제조 방법이 제공된다: (1) 개선된 T 세포 수율을 위해 배양하기 위한 항-CD3/CD28 입자의 지연 첨가 또는 첨가 없음(대안적으로, 나노입자 또는 미세입자와 같은 항-CD3/항-CD28 공동-자극의 임의의 대안적인 공급원을 제공할 수 있음), 여기서, 공동-자극을 위해 항-CD3/CD28 입자 또는 나노입자가 사용됨; (2) 내성 T 세포 표현형의 향상을 위한 더 낮은 비율의 항-CD3/CD28 입자의 사용 또는 대안적으로, 입자, 나노입자 또는 마이크로입자 인공 항체-기반 공동-자극을 첨가하지 않음; (3) 제조 타당성을 높이기 위해 mTOR 저해의 비경구 제형(템시롤리무스)의 사용; 및 (4) T 세포 배양 동안 외인성 IL-2의 통상적인 사용을 생략하고 T 세포 배양 동안 예를 들어, 항-IL-2 수용체 단클론성 항체(다클리주맙 또는 바실릭시맙 또는 IL-2 수용체 신호전달을 저해하는 다른 시약)의 사용을 통해 내인성 자가분비 IL-2 신호전달을 폐지함으로써 IL-2 신호전달 및 Th1-타입 분화의 TREG 세포 오염의 방지. 나란한 배양 실험에서, "제조된 T 세포"로 명명되는 이러한 새로운 조합 방법에 의해 생산된 T 세포는 생체외 배양에서 생성된 이전에 기술된 T 세포에 비해 더욱 최적의 세포 표현형을 나타내었다.
도 33은 본 개시내용의 제조된 T 세포를 생성하기 위한 예시적인 작업 흐름을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포를 생성하는 방법은 템시롤리무스 및 IL-2 신호전달 저해제를 포함하는 배양 배지에서 소정 세포 밀도로 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 세포의 배양 투입 집단을 접종하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 배양 배지는 아직 템시롤리무스 및/또는 IL-2 신호전달 저해제를 포함하지 않으며, 이러한 성분들은 접종과 동시에 또는 대략 동시에 첨가될 수 있다. 세포의 배양 투입 집단은 일례로서, 그러나 비제한적으로, 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자, 나노입자 또는 미세입자로의 공동-자극을 포함하는, 항-CD3/항-CD28 항체에 의한 공동-자극 없이 제1 기간 동안 인큐베이션된다. 제1 기간 후에, 세포의 배양 투입 집단은 예를 들어, 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자, 나노입자 또는 미세입자를 첨가함으로써, 항-CD3/항-CD28 항체에 의해 자극될 수 있다. 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자가 사용되는 경우에, 이러한 것은 1:1 내지 1:12의 입자 비로 사용될 수 있다. 또한, IFN-α는 배양 배지에 첨가된다. 세포의 배양 투입 집단은 이후에 제조된 T 세포를 산출하기 위해 제2 기간 동안 인큐베이션된다. 일부 양태에서, 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자, 나노입자 또는 미세입자로의 공동-자극이 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 공동-자극이 수행되지 않는다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 제조된 T 세포를 생성하는 방법은 상기 제조된 T 세포를 수확한 후, 패키지에 상기 제조된 T 세포의 적어도 일부분을 패키징하는 단계; 및 상기 제조된 T 세포의 일부분을 함유한 상기 패키지를 냉동시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제조된 T 세포의 냉동 보존은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 본 방법은 배양 배지 중에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 접종하기 전에 상기 대상체로부터 상기 세포의 배양물 투입 집단을 수확하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 배양 배지는 IL-2를 함유하지 않으며, 상기 배양 배지에 IL-2가 첨가되지 않을 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 배양물에 혈청이 첨가되지 않을 수 있으며, 예를 들어, 배양물은 무혈청이다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 배양 배지에는 혈청이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 IFN-α는 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자가 첨가됨과 동시에 또는 대략 동시에 첨가될 수 있다. 배양물의 공동 자극이 수행되는 경우에, IFN-α는 예를 들어, 배양 개시 시에 또는 배양 개시 48시간 내에 첨가될 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, IFN-α는 배양 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 48시간에 첨가될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 세포 밀도는 약 1×106개 T 세포/㎖ 내지 50×106개의 세포/㎖일 수 있다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 상기 세포 밀도는 약 1×106개의 세포/㎖ 내지 5×106개의 세포/㎖, 1×106개의 세포/㎖ 내지 10×106개의 세포/㎖, 1×106개의 세포/㎖ 내지 15×106개의 세포/㎖, 15×106개의 세포/㎖ 내지 22.5×106개의 세포/㎖, 10×106개의 세포/㎖ 내지 22.5×106개의 세포/㎖, 10×106개의 세포/㎖ 내지 22.5×106개의 세포/㎖, 5×106개의 세포/㎖ 내지 22.5×106개의 세포/㎖, 1×106개의 세포/㎖ 내지 50×106개의 세포/㎖, 10×106개의 세포/㎖ 내지 40×106개의 세포/㎖, 20×106개의 세포/㎖ 내지 40×106개의 세포/㎖, 1×106개의 세포/㎖, 2.5×106개의 세포/㎖, 5×106개의 세포/㎖, 7.5×106개의 세포/㎖, 10×106개의 세포/㎖, 12.5×106개의 세포/㎖, 15×106개의 세포/㎖, 17.5×106개의 세포/㎖, 20×106개의 세포/㎖, 22.5×106개의 세포/㎖, 25×106개의 T 세포/㎖, 30×106개의 세포/㎖, 35×106개의 세포/㎖, 40×106개의 세포/㎖, 45×106개의 세포/㎖, 또는 50×106개/㎖의 세포일 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 템시롤리무스는 상기 배양 배지에 0.1 내지 5μM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 템시롤리무스는 상기 배양 배지에 0.1 내지 1μM의 농도로 존재할 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 템시롤리무스는 상기 배양 배지에 1μM의 농도로 존재할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 템시롤리무스는 상기 배양 배지에 적어도 0.1μM, 0.2μM, 0.3μM, 0.4μM, 0.5μM, 0.6μM, 0.7μM, 0.8μM, 0.9μM, 1.0μM, 1.5μM, 2.0μM, 2.5μM, 3.0μM, 3.5μM, 4.0μM, 4.5μM, 5.0μM 이상의 농도로 존재할 수 있다. 추가 예로서, 그러나 비제한적으로, 템시롤리무스는 상기 배양 배지에 약 1 내지 5μM, 2 내지 5μM, 3 내지 5μM, 4 내지 5μM, 0.1μM, 0.2μM, 0.3μM, 0.4μM, 0.5μM, 0.6μM, 0.7μM, 0.8μM, 0.9μM, 1.0μM, 1.5μM, 2.0μM, 2.5μM, 3.0μM, 3.5μM, 4.0μM, 4.5μM, 5.0μM, 이상의 농도로 존재할 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 템시롤리무스는 원하는 농도를 유지시키기 위해 제2 기간 동안 1회 이상 상기 배양 배지에 첨가될 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 템시롤리무스는 배양 배지에 1회 첨가될 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 템시롤리무스는 상기 제2 기간 동안 상기 배양 배지에 2일 마다 첨가될 수 있다. 템시롤리무스의 원하는 농도는 0.1 내지 5μM일 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 템시롤리무스의 원하는 농도는 0.1 내지 1μM일 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 템시롤리무스의 원하는 농도는 1μM일 수 있다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 템시롤리무스의 원하는 농도는 적어도 0.1μM, 0.2μM, 0.3μM, 0.4μM, 0.5μM, 0.6μM, 0.7μM, 0.8μM, 0.9μM, 1.0μM, 1.5μM, 2.0μM, 2.5μM, 3.0μM, 3.5μM, 4.0μM, 4.5μM, 5.0μM 이상일 수 있다. 추가 예로서, 그러나 비제한적으로, 템시롤리무스의 원하는 농도는 약 1 내지 5μM, 2 내지 5μM, 3 내지 5μM, 4 내지 5μM, 0.1μM, 0.2μM, 0.3μM, 0.4μM, 0.5μM, 0.6μM, 0.7μM, 0.8μM, 0.9μM, 1.0μM, 1.5μM, 2.0μM, 2.5μM, 3.0μM, 3.5μM, 4.0μM, 4.5μM, 5.0μM, 이상의 농도일 수 있다.
IL-2 신호전달 저해제는 IL-2 신호전달을 저해하는 임의의 물질일 수 있고, IL-2 신호전달을 저해하기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 IL-2 신호전달 저해제는 항-IL-2 수용체 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 바실릭시맙 또는 다클리주맙일 수 있다. 상기 IL-2 신호전달 저해제는 상기 배양 배지에 5 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 존재할 수 있다. 비제한적인 예로서, IL-2 신호전달 저해제는 약 5 내지 50 ㎍/㎖, 5 내지 40 ㎍/㎖, 5 내지 30 ㎍/㎖, 5 내지 20 ㎍/㎖, 5 내지 10 ㎍/㎖, 40 내지 50 ㎍/㎖, 30 내지 50 ㎍/㎖, 20 내지 50 ㎍/㎖, 20 내지 40 ㎍/㎖, 20 내지 30 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 15 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 35 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 45 ㎍/㎖, 또는 50 ㎍/㎖의 농도로 존재할 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 제1 기간은 약 8시간 내지 약 24시간일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 제1 기간은 약 8시간 내지 약 20시간, 8시간 내지 약 16시간, 8시간 내지 약 12시간, 20시간 내지 약 24시간, 16시간 내지 약 24시간, 12시간 내지 약 24시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 또는 24시간일 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 입자:T 세포 비는 1:3일 수 있다. 일부 실시형태에서, 입자:T 세포 비는 1:12 내지 1:1일 수 있거나, 가장 극단적인 예에서, 입자는 첨가되지 않는다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1의 비 또는 이들 사이의 임의의 범위가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포의 배양물 투입 집단의 공동-자극은 권장 농도보다 감소된 농도로 사용될 수 있는 항-CD3/항-CD28 함유 나노입자를 사용하여 달성될 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 이러한 나노입자는 권장 용량의 약 0.01X 내지 약 0.1X, 약 0.025X 내지 약 0.1X, 약 0.05X 내지 약 0.1X, 약 0.075X 내지 약 0.1X, 약 0.01X 내지 약 0.075X, 약 0.01X 내지 약 0.05X, 약 0.01X 내지 약 0.025X, 약 0.025X 내지 약 0.075X, 약 0.025X 내지 약 0.05X, 약 0.05X 내지 약 0.075X, 또는 약 0.01X, 약 0.025X, 약 0.05X, 약 0.075X, 또는 약 0.01X로 사용될 수 있다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, Miltenyi® T 세포 TransActTM와 같은 시약은 일례로서, 그러나 비제한적으로, 1.1 ㎕(9배 감소) 또는 약 0.11X와 같은, 1×106개의 T 세포당 10㎕의 권장 용량에 비해 감소된 용량으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 항-CD3/항-CD28 공동-자극이 제조된 T 세포를 생성시키기 위해 사용되는 경우에, 공동-자극의 공급원은 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자에 의해 제공될 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자는 제조사에 의해 권장된 20%의 농도로 사용될 수 있다(예를 들어, Cloudz®; Bio-Techne). 추가 예로서, 용해 가능한 항-CD3-항-CD28 미세입자는 제조사에 의해 권장된 농도의 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30%로 사용될 수 있다. 첨가되는 항-CD3/항-CD28 시약의 특정 양은 최종 Rapa-T 세포 산물의 원하는 기능적 특징을 기초로 하여 적정될 수 있다. 상세하게는, 시험관내에서 본 개시내용에 기술된 저해 분자의 존재 하에서 T 세포 생존력을 유지시키기 위해 충분한 양의 시약이 첨가될 수 있다. 그러나, 임의의 특정 항-CD3/항-CD28 시약은 T 세포 활성화의 적절치 않게 높은 수준(최적의 최소 양의 공동-자극으로 T 세포 배양물에 비해 유세포 분석법에 의한 CD25 발현의 증가); 유세포 분석법에 의한 T 세포 관문 저해제 수용체 발현의 적절치 않게 높은 수준; 및 유세포 분석법에 의한 T 세포 이펙터 기억 세포와 관련된 분자의 적절치 않게 변경된 발현(예를 들어, CD62L 및 CCR7 수준의 감소; 예를 들어, CD45RO 및 KLRG 수준의 증가)에 의해 규정된 바와 같이, 과량으로 첨가되지 않아야 한다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 IFN-α는 상기 배양 배지에 약 1,000 IU/㎖ 내지 약 10,000 IU/㎖의 농도로 첨가될 수 있다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 2,500 IU/㎖ 내지 10,000 IU/㎖, 5,000 IU/㎖ 내지 10,000 IU/㎖, 7,500 IU/㎖ 내지 10,000 IU/㎖, 1,000 IU/㎖ 내지 7,500 IU/㎖, 1,000 IU/㎖ 내지 5,000 IU/㎖, 1,000 IU/㎖ 내지 2,500 IU/㎖, 2,500 IU/㎖ 내지 7,500 IU/㎖, 2,500 IU/㎖ 내지 5,000 IU/㎖, 5,000 IU/㎖ 내지 7,500 IU/㎖, 5,000 IU/㎖ 내지 10,000 IU/㎖, 7,500 IU/㎖ 내지 10,000 IU/㎖, 또는 1,000 IU/㎖, 2,500 IU/㎖, 5,000 IU/㎖, 7,500 IU/㎖, 또는 10,000 IU/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 1000 IU/㎖와 같은 낮은 IFN-α 농도는 Th1 표현형으로의 이동을 덜 두드러지게 할 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 제2 기간은 약 4일 내지 약 8일, 4일 내지 약 6일, 또는 6일 내지 약 8일일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 제2 기간은 약 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일일 수 있다. 공동-자극이 수행되지 않는 경우에, 인큐베이션을 위한 기간은 약 4일 내지 약 8일, 4일 내지 약 6일, 또는 6일 내지 약 8일일 수 있다. 비제한적인 예로서, 제2 기간은 약 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일일 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 배양 배지는 5% 인간 혈청을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 배양 배지는 1% 내지 20% 인간 혈청을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 상기 배양 배지는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 인간 혈청을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 배양 배지는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 인간 혈청을 포함할 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 배양 배지에 혈청이 첨가되거나 않거나 혈청이 존재하지 않을 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 배양 배지는 X-Vivo 20 배지를 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 배양 배지는 TexMACS(Miltenyi®) 배지를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 배양 배지는 T 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 추가 배양 배지는 배양물에 첨가될 수 있다. 일례로서 그러나 비제한적으로, 추가 배양 배지는 배양물에 세포의 배양물 투입 집단의 초기 접종 후 약 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 108시간, 120시간 또는 이들 사이의 임의의 범위 또는 시간에 첨가될 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 배양 배지의 초기 양에 대한 첨가된 배양 배지의 양은 약 0.5, 0.75, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0 이상, 및 이들 사이의 임의의 범위의 비율일 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 세포의 배양물 투입 집단의 초기 접종 후에 배양물에 첨가된 배양 배지의 양은 배양물 중의 세포 밀도를 표적 세포 밀도까지 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 일례로서 그러나 비제한적으로, 이러한 표적 세포 밀도는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 또는 4×107 및 이들 사이의 임의의 범위일 수 있으며, 단, 초기 세포 밀도는 표적 세포 밀도보다 더 크다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 세포의 배양물 투입 집단은 세포의 배양물 투입 집단에서의 총 세포 수 중 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 T 세포를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 세포의 배양물 투입 집단은 상기 세포의 배양물 투입 집단에서의 총 세포 수 중 약 5%, 10%, 15%, 20%, 33%, 40%, 50%, 66%, 70%, 75%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 이상의 T 세포를 포함할 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 세포의 배양물 투입 집단은 단핵구를 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 세포의 배양물 투입 집단은 T 세포가 풍부할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 세포의 배양물 투입 집단은 자동 Ficoll 절차를 이용하여 T 세포 농축으로 처리될 수 있다. Ficoll 절차를 수행하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 샘플로부터 호중구 및 적혈구를 제거하는 것을 포함한다. 세포의 집단에서 T 세포를 농축시키는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 본 방법은 상기 대상체로부터 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하는 단계; 및 상기 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 말초혈 줄기 세포(PBSC)를 함유할 수 있고, 일례로서, 그러나 비제한적으로, 동원 수집, 정상 상태 채집 또는 단순 채혈에 의해 수득될 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, PBSC 및/또는 세포의 배양물 투입 집단을 함유한 샘플은 제조된 T 세포 제조 전에 냉동 보존될 수 있다. 정상 상태 채집은 대상체가 일례로서 그러나 비제한적으로, 최소 절대 림프구 수(ALC)를 특징으로 할 수 있는 충분한 수의 면역 세포를 가질 때 수행될 수 있다. 최소 ALC는, 예를 들어, 300개의 림프구/마이크로리터일 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 T 세포는 항체-기반 정제에 의해 단리될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 T 세포 농축은 역류 원심분리 용출에 의해 수행될 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 IFN-α는 나노입자를 함유한 항-CD3/항-CD28이 첨가됨과 동시에 또는 대략 동시에 첨가될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 항-CD3/항-CD28 항체는 배양 후 임의의 적합한 방법에 의해 제거될 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 항-CD3/항-CD28 자성 입자는 자성 캡쳐에 의해 제거될 수 있으며, 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자는 방출 완충제를 첨가하고 제조된 T 세포를 세척함으로써 제거될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 3:1의 입자:T 세포 비로 첨가된 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용하여 1주 인큐베이션 후 T-Rapa 세포에 비해 증가된 IFN-γ 분비를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 3:1의 입자:T 세포 비로 첨가된 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용하여 1주 인큐베이션 후 T-Rapa 세포에 비해 증가된 IFN-α 분비를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 3:1의 입자:T 세포 비로 첨가된 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용하여 1주 인큐베이션 후 T-Rapa 세포에 비해 증가된 GM-CSF 분비를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 3:1의 입자:T 세포 비로 첨가된 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용하여 1주 인큐베이션 후 T-Rapa 세포에 비해 증가된 IL-2 분비를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 상기 T 세포의 대조 집단 및 T-Rapa 세포에 비해 CD4, CD62L, CCR7 및 CD127에 대해 양성인 증가된 백분율의 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 상기 T 세포의 대조 집단에 비해 4EBP1 포스포릴화의 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포는 대조 T 세포에 비해 증가된 4EBP1 포스포릴화를 나타낸다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, T 세포가 생성된 T 세포에 특징인 T 세포의 대조 집단, 즉, 배양 투입 T 세포, 또는 대조 T 세포에 비해 4EBP1의 포스포릴화의 증가는 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 또는 30% 이하이다. 추가 예로서, 그러나, 비제한적으로, 4EBP1 포스포릴화의 감소는 5 내지 50%, 5 내지 45%, 5 내지 40%, 5 내지 30%, 5 내지 20%, 5 내지 10%, 10 내지 50%, 10 내지 45%, 10 내지 40%, 10 내지 30%, 10 내지 20%, 20 내지 50%, 20 내지 45%, 20 내지 40%, 20 내지 30%, 30 내지 50%, 30 내지 45%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 이러한 범위 내의 범위일 수 있다. 4EBP1의 포스포릴화는 T-Rapa 세포와 비교하여 감소된다(또는 둔화된다). 일부 실시형태에서, 4EBP1 포스포릴화의 증가는 배양 개시 후 32시간에 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 T-Rapa 세포에 비해 감소된 P70S6K 발현을 나타내고, 제조된 T 세포가 생성된 세포에 특징적인 T 세포의 상기 대조 집단에 비해 증가하였다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 증가는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상일 수 있으며, 감소는 50%, 60%, 70%, 80% 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 T-Rapa 세포에 비해 유세포 분석법에 의해 IL-2 수용체 CD25의 발현 감소를 나타낸다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 감소는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포는 KLF4, KLF10, Nanog 및 이들의 조합과 같은 탈-분화 분자의 RNA 함량의 50% 이상의 증가, 및 페르포린, 그랜자임 B, IFN-γ, 및 이들의 조합과 같은 분화 분자의 RNA 함량의 50% 이상의 감소를 특징으로 하는, 배양물 투입 T 세포에 비해 독특한 RNA 발현 프로파일을 발현시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 T-Rapa 세포에 비해 감소된 면역 억제 효과와 관련된 하기 분자의 수준을 나타낸다: CTLA4; 및 TIM3.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 10% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 감소된 빈도는 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 10% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포가 생성된 T 세포가 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도에 비해 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 대조 집단에서 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 대조 집단에서 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정 경우 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 PD1을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 감소된 빈도는 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 감소된 빈도는 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단의 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시킨다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1% 이상은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 2B4를 발현시키는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도에 비해 2B4를 발현시키는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 2B4를 발현시키는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 T 세포의 대조 집단에서 2B4를 발현시키는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 또는 80% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 10% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAIR1을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 상응하는 빈도에 비해 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 감소된 빈도는 T 세포의 대조 집단에서 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 세포 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 T-Rapa 세포에 비해 감소된 LAIR1의 발현 수준을 나타낼 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 감소는 적어도 30%, 40%, 50% 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 10% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시킨다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ T 세포의 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1% 이상은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 10% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAG3을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 형성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 양성 공동-자극 분자 CD28의 보존된 수준, 즉, 실질적으로 동일한 수준을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 CD28 발현의 빈도는 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 각각에서의 CD28 발현의 빈도의 약 20% 이내일 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 CD28 발현의 빈도는 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 각각에서의 CD28 발현의 빈도의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 보존은 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우, 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 양성 공동-자극 분자 ICOS의 보존된 수준, 즉, 실질적으로 동일한 수준을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 ICOS 발현의 빈도는 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 각각에서의 ICOS 발현의 빈도의 약 20% 이내일 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 ICOS 발현의 빈도는 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 각각에서의 ICOS 발현의 빈도의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 보존은 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 CD45RA의 보존된 수준, 즉, 실질적으로 동일한 수준을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 CD45RA 발현의 빈도는 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 각각에서 CD45RA 발현의 빈도의 약 20% 이내일 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 CD45RA 발현의 빈도는 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 각각에서의 CD45RA 발현의 빈도의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 보존은 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD25를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 KLRG1의 감소된 수준을 특징으로 하는 정지 및 비-노화 표현형을 나타낸다. 일부 실시형태에서, KLRG1 수준의 감소는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정하여 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 KLRG1을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 제조된 T 세포가 생성된 T 세포의 T 세포의 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 면역 억제 분자 CD39의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 20% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD39를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 형성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 제조된 T 세포가 생성된 T 세포의 T 세포 특징의 대조 집단에 비해 감소된 면역 억제 분자 CD73의 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우, CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 20% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD73을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 빈도 감소를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 빈도 감소는 CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 적어도 50% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 빈도 감소는 CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 생성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 제조된 T 세포가 생성된 T 세포의 T 세포의 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 감소된 면역 억제 분자 GITR의 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ 제조된 T 세포의 5% 이하를 특징으로 할 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 GITR을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 적어도 20% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도는 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 빈도는 제조된 T 세포를 형성하는 세포가 배양물에 접종된 후 6일이다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포는 전구체 사이토카인 IL-2의 분비 증가 및 항상성 사이토카인 IL-7 및 IL-15에 대한 반응성 증가에 의해 입증된 바와 같이, 대조 T 세포 배양에 비해 사이토카인 생물학의 초기 분화 상태를 나타낼 수 있다. 이러한 방식으로, 본 개시내용의 제조 방법은 항상성 사이토카인에 대한 반응성이 증가된 헬퍼-독립 T 세포를 제공하는 공정을 기술한다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 동일한 조건 하에서 인큐베이션된 T-Rapa 배양에 비해 증가된 IL-2 분비를 나타낸다. 일부 실시형태에서, IL-2 분비의 이러한 증가는 적어도 1.1배이다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 증가는 적어도 1.1-, 1.5-, 2.0-, 2.5-, 3.0-, 3.5-, 4.0-, 4.5-, 5.0배 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 3:1 내지 1:3 입자:T 세포의 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후에 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일 IL-2를 분비한다. 일례로서, 제조된 T 세포의 집단은 이러한 조건 하에서 약 500, 600, 700, 800, 900, 1000 pg 이상/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2를 분비할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 IL-7 또는 IL-15에 노출될 때 증가된 양의 IL-2를 분비할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 IL-7 또는 IL-15의 부재 하의 조건에 비해 IL-7 또는 IL-15의 존재 하에서 제조된 T 세포의 집단이 인큐베이션될 때 적어도 1.1배의 IL-2 분비 증가를 특징으로 한다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 증가는 적어도 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2.0배 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 3:1 내지 1:3 입자:T 세포의 비로 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 및 존재할 때 10 ng/㎖의 IL-7 및 10 ng/㎖ IL-15의 농도로 IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15 둘 다에 대한 노출 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일 IL-2를 분비한다. 일례로서, 제조된 T 세포의 집단은 이러한 조건 하에서 약 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 pg 이상/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2를 분비할 수 있다. IL-2 분비는 헬퍼-독립 T 세포와 관련이 있다. Rapa-T 세포의 높은 IL-2 분비는 T 세포 입양 요법 후 외인성 IL-2를 투여할 필요성을 제거함으로써 유리할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-7 또는 IL-15는 존재하는 경우에 10 ng/㎖로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 상기 대조 집단 T 세포에 비해 증가된 생체내 기능을 나타내고, 상기 생체내 기능은 마우스내 인간 이종 이식편-대-숙주-질환의 모델에서 인간 T 세포 생착 증가를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 형광체-P70S6K에 의해 측정한 경우 mTORC1 활성화의 감소를 나타낸다. 상기 감소는 일례로서, 그러나 비제한적으로, 배양 개시 후 32시간에 T-Rapa 세포에 비해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 T-Rapa 세포에 비해 감소된 형광체-STAT5를 나타낸다. 상기 감소는 일례로서, 그러나 비제한적으로, 배양 개시 후 32시간에 T-Rapa 세포에 비해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 배양된 T-Rapa 세포의 대조 집단에 비해 감소된 형광체-STAT5를 나타낸다. 상기 감소는 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 배양된 T-Rapa 세포의 대조 집단에 비해 적어도 50%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 제조된 T 세포가 T 세포를 포함하는 세포의 투입 집단으로부터 배양물로 접종된 후 48시간에 일어난다. 일부 실시형태에서, p-STAT5 수준은 웨스턴 블롯에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 적어도 일부 검출 가능한 STAT1 및 형광체-STAT1 수준을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상기 수준은 제조된 T 세포가 T 세포를 포함하는 세포의 투입 집단으로부터 배양물로 접종된 후 48시간에 측정된다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 T 세포의 대조 집단 및 적어도 동일한 수준의 STAT1 및 형광체-STAT1에 비해 감소된 형광체-STAT5를 나타낸다. 일부 실시형태에서, STAT1 또는 p-STAT1의 수준은 웨스턴 블롯에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 제조된 T 세포의 집단이 수득된 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 p70S6K 또는 Raptor 발현에 의해 측정한 경우 mTORC1 활성화의 감소를 나타낸다. 상기 감소는 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 50%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 감소는 제조된 T 세포가 T 세포를 포함하는 세포의 투입 집단에서 배양물에 접종된 후 48시간에 일어난다. 일부 실시형태에서, 감소는 웨스턴 블롯에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 상기 제조된 T 세포의 집단은 T 세포의 대조 집단에 비해 대략 동일한 Rictor, SGK1 또는 포스포릴화된 SGK1 수준을 나타낸다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, Rictor, SGK1 또는 포스포릴화된 SGK1의 수준은 T-Rapa 세포에서 Rictor, SGK1 또는 포스포릴화된 SGK1의 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 또는 상응하는 수준 내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 수준은 제조된 T 세포가 T 세포를 포함하는 세포의 투입 집단으로부터 배양물에 접종된 후 48시간의 수준이다. 일부 실시형태에서, Rictor, SGK1 또는 pSGK1의 수준은 적어도, T 세포의 대조 집단에서 측정한 수준이다. 일부 실시형태에서, 수준은 웨스턴 블롯에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 저해제 없이 제조 후에 6일 동안 배양 배지에서 확장 후에 T-Rapa 세포에 비해 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF 및 IL-2 중 적어도 하나의 분비의 증가를 나타낸다. 상기 증가는 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조 종료 시에(배양물 중 6일) 제조된 T 세포의 집단은 T-Rapa 세포에 비해 T 세포 마커 CD45RA를 발현시키는 증가된 수의 CD4+ T 세포를 가질 수 있다. 상기 증가는 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, 및 TIM3으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 수용체의 발현을 감소시킬 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 감소된 발현은 T-Rapa 세포의 상응하는 발현 수준보다 적어도 25% 적을 수 있다. 추가 예로서, 그러나 비제한적으로, 감소된 발현은 T-Rapa 세포 집단의 상응하는 발현 수준보다 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 적을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 제조된 T 세포의 집단이 생성된 T 세포에 특징적인 대조 T 세포 집단의 상응하는 발현 수준의 약 25% 이내인 CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT 및 TIM3으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준을 가질 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT 및 TIM3으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준은 제조된 T 세포의 집단이 생성된 T 세포에 특징적인 대조 T 세포 집단의 상응하는 발현 수준의 약 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이내일 수 있다. 관문 저해제에 대한 발현 수준이 동일한 세포 타입 간에 비교되며, 예를 들어, CD4+ 제조된 T 세포가 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 CD4+ T-Rapa 세포 또는 CD4+ 대조 T 세포와 비교될 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포는 CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT 및 TIM3으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 수용체의 발현을 감소시킬 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 감소된 발현은 T-Rapa 세포의 상응하는 발현 수준보다 적어도 25% 더 낮을 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 감소된 발현은 T-Rapa 세포의 상응하는 발현 수준보다 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 더 낮을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포는 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 대조 T 세포의 상응하는 발현 수준의 약 25% 이내인 CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT 및 TIM3으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준을 가질 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT 및 TIM3으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준은 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 대조 T 세포에서의 상응하는 발현 수준의 약 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 내일 수 있다. 관문 저해제에 대한 발현 수준이 동일한 세포 타입들 간에 비교되며, 예를 들어, CD4+ 제조된 T 세포가 제조된 T 세포가 생성된 T 세포에 특징적인 D4+ T-Rapa 세포 또는 CD4+ 대조 T 세포와 비교되는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포는 제조된 T 세포를 생성하는 세포의 대조군 T 세포 특징에 비해 CD127의 발현을 증가시켰다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 이러한 증가는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD127을 발현시키는 CD4+ T 세포의 적어도 5%를 가질 수 있다. 일례로서, 제조된 T 세포의 집단은 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD127을 발현시키는 CD4+ 세포의 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 이상을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포의 집단은 제조된 T 세포의 집단이 생성된 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 증가된 CD127을 발현시키는 CD4+ T 세포의 빈도를 가질 수 있다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 증가는 적어도 50%, 100%, 150%, 200%, 300% 이상일 수 있다.
제조된 T 세포의 집단과 관련된 상기 특성들 중 어느 하나가 단일 세포와 관련될 수 있는 정도까지, 제조된 T 세포는 상기 특성들을 특징으로 할 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 제조된 T 세포 또는 제조된 T 세포의 집단은 인용된 특성들 중 하나 초과의 특성을 가질 수 있다.
대상체에서 암을 치료하는 방법
재발된 다발성 골수종(MM)을 갖는 환자는 생존이 제한되어 있으며, 치료적 치료법이 어려웠다. 이와 같이, 재발된 MM을 갖는 환자는 새로운 T 세포 요법에 적합하다.
면역 요법은 여러 중요한 카테고리에서 기존의 면역 요법 방법과는 상이하다. 첫째로, 제조된 T 세포 생성물은 포유동물의 라파마이신 표적(mTOR) 경로의 수준에서 저해되도록 제조되며, 이는 아폽토시스에 대한 내성 및 중심 기억 분화에 대한 강화로 해석된다. 둘째로, 제조된 T 세포 생성물은 고용량 IFN-알파에서 제조되며, 이는 CD4+Th1 및 CD8+Tc1 분화를 촉진시킨다. 셋째로, 제조된 T 세포 생성물은 단일 클론 항체와 최소로 공동-자극되거나, 공동-자극되지 않고 다양한 T 세포 수용체(TCR) 레퍼토리를 발현시킨다. 이와 같이, 제조된 T 세포에 의해 매개된 항-종양 효과는 종양 항원에 대한 생체내 클론 확장을 통해 주로 일어날 것으로 예상된다. 이러한 메커니즘은 다발성 골수종에서 바람직할 수 있으며, 여기서, 종양 항원은 알려져 있지 않거나 높은 종양 돌연변이율로 인해 시간에 따라 가변적이다. 생체내 출현 T 세포 반응의 특징은 제조된 T 세포 요법의 잠재적인 메커니즘의 이해를 개선시키는 데 중요할 것이고, 이러한 연구에서 2차 목적으로서 평가될 것이다. 그리고, 넷째로, 본 출원인은 저용량, 용량-조정된 사이클로포스파마이드와 조합된 펜토스타틴으로 이루어진 신규한 면역-고갈 및 면역-억제 요법(PC 요법)에 대해 제조된 T 세포 요법을 평가할 것이다. 이러한 PC 요법은 골수 세포에서 비교적 드문데, 이에 의해 실질적인 호중구 감소증 없이 반복 치료 사이클을 허용한다. 이러한 요법은 비용(외래환자 환경에서 투여될 수 있음) 및 안전성(골수 세포 보존으로 인해 감염률을 감소시킴)의 측면에서 유리하다. 다발성 골수종은 염증 신호전달에 의해 중요하게 촉진되는 질환이다. 이와 같이, PC 요법에 의해 매개된 염증 저해는 요법 효능에 기여하는 하나의 구성요소일 것이다. 이러한 인자들 각각은 임상 시험의 설계 동안 고려되며, 이러한 것은 PC 컨디셔닝 후 제조된 T 세포의 다수 주입에 초점을 맞춘다.
제조된 T 세포는 크게 감소된 수준의 관문 저해제를 발현시키고, 이에 따라, 관문 저해로부터 면역계를 방출하는 신규한 생체외 방법을 제공하며, 이는 단클론성 항체 요법을 통해 현재 달성되는 것이다. 이러한 라인을 따라, 제조된 T 세포 요법이 흑색종, 신장 세포 암종, 방광암, 폐암, 림프종, 다발성 골수종, 및 결장암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 관문 저해제 요법에 민감한 암에서 성공할 것으로 예상된다. 또한, 관문 저해제 단클론성 항체 요법이 다발성 골수종 환자에서 비교적 독성을 나타내고, 이에 의해 면역 관문을 피하기 위한 대안적인 방법, 예를 들어, 제조된 T 세포 요법이 필요하다는 것이 주지되어야 한다.
또한, 매우 다양한 종양 항원에 대한 광범위한 클론 확장을 격는 제조된 T 세포의 능력은 증가된 돌연변이율을 갖는 종양 세포 및 미세-위성 불안정성을 갖는 종양이 제조된 T 세포 요법에 대해 특히 민감할 것이라는 것을 예측한다.
본 개시내용은 치료학적 유효 용량의 본 개시내용의 제조된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 암을 치료하는 방법은 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제조된 T 세포를 포함하는 조성물의 투여는 치료학적 유효 용량으로 또는 누적적으로 치료학적 유효 용량을 달성하기 위해 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 상기 대상체가 상기 면역 고갈 요법에 적용되기 전에 상기 대상체로부터 자가 세포를 수확하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 제조된 T 세포를 포함하는 상기 조성물을 투여하기 전에 상기 대상체로부터 자가 세포를 수확하는 것을 추가로 포함한다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 면역 고갈 요법은 상기 대상체에게 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 펜토스타틴은 상기 대상체에게 투여되며, 여기서, 상기 펜토스타틴의 용량은 0.5 내지 4 ㎎/㎡, 0.5 내지 3 ㎎/㎡, 0.5 내지 2 ㎎/㎡, 0.5 내지 1 ㎎/㎡, 1 내지 4 ㎎/㎡, 2 내지 4 ㎎/㎡, 또는 3 내지 4 ㎎/㎡일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 펜토스타틴의 용량은 약 0.5 ㎎/㎡, 1 ㎎/㎡, 1.5 ㎎/㎡, 2 ㎎/㎡, 2.5 ㎎/㎡, 3 ㎎/㎡, 3.5 ㎎/㎡, 또는 4 ㎎/㎡이다. 일부 실시형태에서, 사이클로포스파마이드는 상기 대상체에게 투여되며, 여기서, 상기 사이클로포스파마이드의 용량은 50 내지 400㎎, 50 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 50 내지 100㎎, 100 내지 400㎎, 200 내지 400㎎, 300 내지 400㎎, 200 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 사이클로포스파마이드의 용량은 약 50㎎, 100㎎, 150㎎, 200㎎, 250㎎, 300㎎, 350㎎, 또는 400㎎이다. 일부 실시형태에서, 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드 둘 다는 상기 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드는 상기 대상체에게 단일 조성물로 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 단일 조성물은 상기 대상체에게 정맥 투여된다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 면역 고갈 요법은 상기 대상체에게 펜토스타틴을 포함하는 제1 조성물을 투여하는 단계; 및 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 조성물은 1 내지 4 ㎎/㎡의 펜토스타틴 용량으로 투여되며, 이는 0.5 내지 4 ㎎/㎡, 0.5 내지 3 ㎎/㎡, 0.5 내지 2 ㎎/㎡, 0.5 내지 1 ㎎/㎡, 1 내지 4 ㎎/㎡, 1 내지 3 ㎎/㎡, 1 내지 2 ㎎/㎡, 또는 3 내지 4 ㎎/㎡이다. 비제한적인 예로서, 상기 펜토스타틴의 용량은 약 1 ㎎/㎡, 1.5 ㎎/㎡, 2 ㎎/㎡, 2.5 ㎎/㎡, 3 ㎎/㎡, 3.5 ㎎/㎡, 또는 4 ㎎/㎡이다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 조성물은 사이클로포스파마이드를 포함하고, 50 내지 400㎎, 50 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 50 내지 100㎎, 100 내지 400㎎, 200 내지 400㎎, 300 내지 400㎎, 200 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 상기 클로포스파마이드의 용량으로 투여된다. 비제한적인 예로서, 상기 사이클로포스파마이드의 용량은 약 50㎎, 100㎎, 150㎎, 200㎎, 250㎎, 300㎎, 350㎎, 또는 400㎎이다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 치료학적 유효 용량은 대상체 체중 kg당 1×105 내지 5×106, 1×106 내지 2.5×106개의 세포/㎏, 2.5×106 내지 5×106개의 세포/㎏, 1×105 내지 2.5×106개의 세포/㎏, 2.5×105 내지 5×106개의 세포/㎏, 1×105 내지 2.5×105개의 세포/㎏, 2.5×105 내지 5×105개의 세포/㎏, 1×105개의 세포/㎏, 2×105개의 세포/㎏, 3×105개의 세포/㎏, 4×105개의 세포/㎏, 5×105개의 세포/㎏, 1×106개의 세포/㎏, 2×106개의 세포/㎏, 3×106개의 세포/㎏, 4×106개의 세포/㎏, 또는 5×106개의 세포/㎏ 제조된 T 세포일 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 제조된 T 세포를 포함하는 조성물은 주입에 의해 상기 대상체에게 투여된다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 암은 일례로서, 그러나 비제한적으로, 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 방광암, 폐암, 간암, 림프종, 위암 및 결장암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 실시형태에서, 다발성 골수종은 재발된 다발성 골수종이다. 추가 에로서, 그러나 비제한적으로, 암은 육종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 유방암 또는 대장암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 PDL1-음성 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 관문 저해제 요법에 민감하다. 일부 실시형태에서, 다발성 골수종은 재발된, 불응성 다발성 골수종이다. 일부 실시형태에서, 다발성 골수종은 쿼드- 또는 펜타-불응성 다발성 골수종이다. 일부 실시형태에서, 다발성 골수종은 무증상 다발성 골수종이다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체 재발된 다발성 골수종을 앓고 있다. 특정 양태에서, 대상체는 재발된, 일례로서, 그러나 비제한적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 재발된 다발성 골수종을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 무증상 다발성 골수종을 앓고 있고. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 쿼드- 또는 펜타-불응성 다발성 골수종을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체는 일례로서, 그러나 비제한적으로 1, 2, 3, 4, 5회 이상 치료에 대해 불응성인 다발성 골수종을 앓고 있다.
일부 실시형태에서, 상기 대상체는 이전에 치료받았으며, 현재 프로테아솜 저해제의 투여, 면역 조절 약물의 투여, 알킬레이터의 투여, CD38 단클론성 항체의 투여, 및 글루코코르티코이드의 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 치료 라인을 받은 후 2차 또는 3차 재발 시점에 있다. 이러한 환자 집단은 3상 무작위화 임상 시험의 평가에 적합한 것으로 간주되며, 여기서, 2차 또는 3차 재발에서 환자를 위한 표준 화학요법을 받기 위해 대조군 코호트에 대한 무작위화는 정당하다.
별개의 실시형태에서, 상기 대상체는 다수의 표준 약물에 대해 고도로 불응성이며, 이에 따라, 무작위화된 임상 시험은 정당화되지 않는다. 오히려, 이러한 고도의 불응성 환자는 단일군, 제II상 임상 시험에서 Rapa-T 치료법으로 치료될 것이다. 고도의 불응성 상태는 쿼드- 또는 펜타-불응성이라는 명명법에 의해 정량화될 수 있으며, 이에 의해 이러한 대상체는 다발성 골수종을 치료하는 데 사용되는 상위 약물 중 4 또는 5개, 즉, 보르테조밉, 카르필조밉, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 및 다라투무맙에 대해 불응성이다.
2차 또는 3차 재발 시간에 MM을 치료하는 3상 임상 연구와 관련된 실시형태의 경우에, 1차 연구 목적은 연구 종점으로서 무진행 생존에 관한 것일 것이며, 무진행 상태는 상기 대상체가 1개월 기준으로 모니터링할 때 M-단백질/유리 경쇄 차이의 25% 미만으로 증가하는 것으로서 정의된다.
일부 실시형태에서, 제1 치료 사이클의 기간은 최소 28일이다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각의 기간은 최소 35일이다.
일부 실시형태에서, 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계는 제1 cly 사이클 동안 반복된다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계는 상기 제1 치료 사이클의 1, 4, 8 및/또는 11일에 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계는 제1 치료 사이클 동안 반복된다. 일부 실시형태에서, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계는 제1 치료 사이클의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 및/또는 12일에 수행된다.
상기 실시형태 중 어느 하나에서, 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각은 0 내지 4주로 분리된다. 상기 실시형태 중 어느 하나에서, 상기 제1 치료 사이클 및 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 중 제1 사이클은 0 내지 4주로 분리된다. 상기 실시형태 중 어느 하나에서, 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계는 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각의 15, 16, 17 또는 18일에 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 대상체는 프로테아솜 저해제의 투여, 면역 조절 약물의 투여, 알킬레이터의 투여, CD38 단클론성 항체의 투여, 및 글루코코르티코이드의 투여로 이루어진 요법을 수용한 후 MM의 2차 또는 3차 재발된 상태이다.
일부 실시형태에서, 상기 대상체는 MM 재발 및 쿼드- 또는 펜타-불응성의 후기 단계에 있고, 이에 의해 표준 치료법이 존재하지 않는다.
3상 임상 시험과 관련된 일부 실시형태에서, 1차 연구 목적은 무진행 생존과 관련될 것이며, 무진행은 치료 간에 M-단백질/유리 경쇄 차이가 25% 미만으로 증가한 것으로서 정의된다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 수행하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계; 및 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 면역 고갈 요법은 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계; 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계; 상기 대상체의 크레아티닌 청소율이 30 ㎖/분/1.73㎡ 이상인 경우에 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 용량의 펜토스타틴을 투여하는 단계; 상기 대상체의 절대 림프구 수가 1 마이크로리터당 50 이상이고 상기 대상체의 절대 호중구 수가 1 마이크로리터당 500 이상인 경우에 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 용량의 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 대상체의 CrCl을 측정하는 단계 및 투여되는 펜토스타틴의 용량을 조정하는 단계는 상기 면역 고갈 요법의 1, 4, 8 및/또는 11일에수행된다.
일부 실시형태에서, ALC 및 ANC를 측정하는 단계 및 투여되는 사이클로포스파마이드의 용량을 조정하는 단계는 면역 고갈 요법의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 및/또는 12일에 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계는 면역 고갈 요법의 개시 후 15 내지 18일에 수행된다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 수행하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계 및 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계는 적어도 2회 반복된다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 수행하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계 및 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계는 최대 8회 이상 반복될 수 있다. 상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 각 단계는 0 내지 9주로 분리될 수 있다.
상기 실시형태들 중 어느 하나에서, 항-CD3/항-CD28 항체에 의한 공동-자극이 수행되는 경우에, 또한 이러한 공동-자극이 임의의 형태의 항-CD3/항-CD28 항체로 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일례로서, 그러나, 비제한적으로, 공동-자극이 항-CD3/항-CD28 입자를 사용함으로써 수행되는 것으로 지시되는 경우에, 항-CD3/항-CD28 나노입자 또는 미세입자가 사용될 수 있다.
실시예
본 개시내용의 방법 및 얻어진 제조된 T 세포를 더 잘 예시하기 위해 하기 실시예가 제공된다. 이러한 실시예는 본 개시내용에 개시된 방법, 세포 및 조성물의 범위를 제한하거나 달리 변경하지 않는 것으로 의도된다.
실시예 1
Th1 농축을 위한 항-IL-2 수용체 차단 및 mTOR 차단의 사용. 입양 T 세포 요법을 위해, 조절 T(TREG) 세포 표현형을 갖는 세포로부터 최소로 오염되는, Th1 표현형을 우선적으로 발현시키는 T 세포를 제조하는 것이 중요하다. Th1-타입 세포는 세포 운명 전사 인자 TBET의 발현을 부분적으로 특징으로 할 수 있는 반면, TREG 세포는 FoxP3 전사 인자를 발현시킨다.
FoxP3을 제한하면서 TBET를 촉진시키는 방법을 평가하였다. 본 출원인은 불응성 신장 세포 암종의 치료를 위해 정맥 투여되는 FDA-승인 약제인, mTOR 저해제 템시롤리무스를 평가하였다. mTOR의 저해가 일반적으로 TREG 표현형의 T 세포의 촉진과 관련이 있기 때문에, Th1 표현형에 대해 농축된 T 세포를 제조하기 위한 mTOR 저해제의 사용은 역설적으로 보일 수 있다. 현재 실험은 템시롤리무스가 정맥내 제형이기 때문에 종래 연구와 상이하며, 이에 의해, 라파마이신에 비해 유리하며, 이는 배지 중 제한된 용해도로 인해 세포 배양에 덜 적합하다.
현재 실험은 또한 본 출원인이 템시롤리무스와 항-IL-2 수용체 단클론성 항체, 다클리주맙의 조합물을 평가하였기 때문에 종래 연구와 상이하다. 다클리주맙 및 바실릭시맙 둘 다는 공통 작용 메커니즘을 가지고 이에 따라 본 출원인이 개발한 시스템에서 상호 교환적으로 사용될 수 있는 FDA-승인 단클론성 항체이다.
T 세포를 명시된 바와 같이, 항-CD3, 항-CD28 입자 대 T 세포의 다양한 비율(1:1 또는 1:12); mTOR 저해제 템시롤리무스(1μM); 항-IL-2 수용체 단클론성 항체 다클리주맙(5 또는 50 ㎍/㎖)과 함께 또는 이의 없이; 및 Th1 분극화 사이토카인(IFN-알파; 10,000 IU/㎖) 또는 대조 조절 T 세포 분극화(IL-2 플러스 TGF-β)를 사용하여 생체외에서 배양하였다. 배양 6일에, T 세포를 조절 T 세포 전사 인자 FoxP3 및 Th1 전사 인자 TBET의 세포내 발현에 대해 평가하였다(도 1a 및 도 1b).
타입 I 분극화 사이토카인 IFN-γ의 환경에서 템시롤리무스(1.0μM 농도)의 첨가가 0일 투입 T 세포 집단에 비해 FoxP3의 얻어진 T 세포 발현을 감소시키는 것으로 확인되었다(도 1a 참조). 또한, 본 출원인은 IL-2 수용체의 차단이 FoxP3 발현을 추가로 감소시켰으며, 50 ㎍/㎖의 항체의 사용이 5 ㎍/㎖의 항체의 사용에 비해 더욱 효과적이었고, 이에 의해 용량-반응 관계를 나타낸다는 것을 확인하였다. 템시롤리무스는 외인성 IL-2가 IFN-γ과 조합하여 첨가된 경우에 FoxP3 발현을 감소시키는 데 효과적이지 않았다(도 1a). 또한, 템시롤리무스 및 다클리주맙은 배양 조건이 TREG 세포 분화에 대해 허용되는 경우, 즉, 1:12의 입자 비율의 감소; 배양물로부터 IFN-α의 제거; 및 외인성 IL-2 플러스 TGF-β의 첨가의 경우에 FoxP3 발현을 제한하는 데 효과적이지 않았다(도 1a).
FoxP3 발현을 제한하는 것 이외에, 템시롤리무스와 항-IL-2 수용체 단클론성 항체의 조합물은 TBET의 발현 증가에 의해 명시된 바와 같이, Th1 표현형을 촉진시키는 데 효과적이었다(도 1b). 또한, 50 ㎍/㎖ 다클리주맙이 TBET 발현을 5 ㎍/㎖보다 더 높은 정도로 촉진시키는, 용량 반응 관계를 나타낸다(도 1b). IFN-γ 분극화에 IL-2의 첨가가 TBET를 증가시켰지만, 이는 또한 FoxP3의 증가와 관련이 있었고, 이에 의해, 외인성 IL-2 첨가를 통해 Th1-순도의 부족함을 나타내었다. 중요하게, 예상되는 바와 같은 TREG 대조 조건-IL-2 및 TGF-β는 TBET의 발현을 감소시켰다(도 1b).
이와 같이, mTOR 저해와 IL-2 수용체 차단의 조합은 Th1 세포를 생성하기 위한 새로운 방법을 나타낸다.
생체외 제조 동안 T 세포를 저해하기 위한 개입, 즉, mTOR 저해; IL-2 수용체 차단; 감소된 T 세포 공동-자극; 및 공동-자극 전 T 세포의 억제(밤새 사전-인큐베이션)의 조합의 개발. mTOR 저해와 IL-2 수용체 차단의 조합이 Th1-타입 세포의 제조를 개선시킬 수 있다는 이러한 결과(TBET-대-FoxP3 비율의 개선; TREG 세포 오염의 제한)를 고려하여, 본 출원인은 추가 개입이 또한 Th1 세포 제조를 개선시킬 수 있는 것을 고려하였다.
입양 T 세포 요법 노력을 위한 mTOR 저해의 사용에 대한 한가지 이점은 이러한 개입이 T 중심 기억 서브세트(TCM) 또는 T 줄기 세포 기억 서브세트(TSCM)와 같은 더욱 원시적인 분화 상태를 갖는 T 세포의 제조를 촉진시킬 수 있다는 것이다. 생체와 라파마이신을 사용한 종래 연구에서, 생체외 라파마이신이 TCM 표현형의 T 세포의 제조를 위해 효과적이었다는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 T 세포 기억 상태의 제어에서 mTOR의 알려진 역할과 일치한다. 더욱 원시적인 분화 상태의 T 세포가 입양 전달 후 장기 생착을 증가시키고 실험 모델에서 증가된 생체내 효과를 매개하기 때문에 제조 동안 TCM 및/또는 TSCM 상태를 촉진시키는 것이 중요하다. WNT 신호전달의 촉진을 위한 GSK3 저해제의 사용; AKT 신호전달의 저해; 및 PI3 키나제 신호전달의 저해를 포함하는, 제한된 분화 상태의 T 세포의 제조를 촉진시키기 위한 여러 다른 방법이 기술되어 있다.
본 출원인은 T 세포를, 외인성 사이토카인이 없고 mTOR 저해제 템시롤리무스를 함유한 5% 인간 AB 혈청이 보충된 X-Vivo 20 배지 중에 플레이팅하고 인큐베이션하고 단클론성 항체 첨가를 통해 IL-2 수용체를 차단하는 방법을 개발하였다. 이러한 방법은 항-CD3, 항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 전에 대략 16시간 "사전-인큐베이션"을 도입하였다. 본 출원인이 아는 바와 같이, 이러한 방법은 이전에 보고된 적이 없었다.
이러한 점점 엄격해지는 배양 조건을 평가하기 위한 제1 단계로서, 본 출원인은 다양한 조건 하에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 배양이 배양 간격(Th1 제조의 경우, 6일 배양 간격)의 종료 시에 생존 세포의 존재에 의해 규정된 바와 같이, 가능한 지의 여부를 평가하였다. 도 2a 및 도 2b에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 명시된 바와 같이, 다양한 조건 하에서 배양물에 배치시켰다. T 세포에 대한 3/28 입자의 비율은 3:1, 1:1, 또는 1:3이었다. T 세포를 배양물에 첨가와 동시에(밤새 "사잔-인큐베이션" 없음) 또는 밤새, 16시간 사전-인큐베이션 후에 공동-자극을 받았다. 일부 조건에서, 항-IL-2 수용체 단클론성 항체 다클리주맙을 50 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. mTOR 저해를 위해, 템시롤리무스를 1.0 또는 0.1μM로 첨가하였다. 대안적으로, 대조군 mTOR 저해제 라파마이신을 1.0μM 농도로 첨가하였다. 대부분의 배양물에 또한, 타입 I 사이토카인 촉진제, IFN-α(10,000 IU/㎖)를 보충하였다. 명시된 바와 같이, 대부분의 배양 조건은 외인성 IL-2의 첨가를 포함하지 않았다. 배양 6일 후에 T 세포 수율을 계산하였고, 배양 개시("0일 투입 배양")와 비교하였다.
도 2a 및 도 2b에 예시된 바와 같이, mTOR 저해(1.0μM 또는 0.1μM의 템시롤리무스의 사용; 1.0μM의 라파마이신의 대조 사용) 및 IL-2 수용체 차단(다클리주맙)뿐만 아니라 감소된 공동-자극(3:1의 입자-대-T 세포를 1:1 및 1:3의 비까지 감소시킴) 및 밤샘 사전-인큐베이션을 포함하는 배양 조건의 변형은 대조군 T 세포 배양물과 유사한 생존 T 세포의 수를 야기시켰다.
Th1/Tc1 제조에서 사전-인큐베이션 및 고용량 템시롤리무스의 중요성. Th1/Tc1 세포 생성물의 냉동 보존 시에(배양의 종료), T 세포가 TMC 표현형 이외에 비교적 정지 표현형을 갖는 것이 중요하다. 즉, 본 출원인은 이전에, 라파마이신-생성 T 세포가 입양 전달 시에 매우 소량의 사이토카인을 분비하였지만, 생체내에서 대량의 사이토카인을 생성하였다는 것을 확인하였다. 참고로, 다른 사람은 세포 생성물 이펙터 기능(최소)과 생체내 이펙터 기능(최대) 간의 유사한 역 상관 관계를 확인하였다. 입양 전달 시에 T 세포 정지는 전이 후 T 세포 생존을 개선시킬 수 있고, 또한, 사이토카인 방출 증후군의 위험을 감소시키는 데 중요할 수 있으며, 이는 다른 형태의 입양 T 세포 요법, 특히, 유전자-변형 키메라-항원-수용체(CAR) T 세포 요법 후에 이환율 및 사망률의 원인이다.
이를 평가하기 위해, 본 출원인은 세포 배양의 종료(6일) 시에 및 이후에 최대 공동-자극(3/28 입자-대-T 세포 비, 3:1) 후 생체외 팽창 및 어떠한 저해제도 없는 배지에서의 전파 후 1주일에 제조된 T 세포의 사이토카인 분비 가능성을 시험하였다.
도 3a 및 도 3b에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 공동-자극(3/28 입자-대-T 세포의 1:1 비) 전 16시간 사전 인큐베이션 간격으로 또는 이의 없이 6일 동안 정제 및 배양하였다. 명시된 바와 같이, 템시롤리무스를 1.0 또는 0.1μM의 농도로 첨가하였다. 모든 배양물에 IFN-γ(10,000 IU/㎖) 및 다클리주맙(50 ㎍/㎖)을 보충하였다. 6일 배양 시에, 얻어진 T 세포를 3:1 비의 3/28 입자를 사용하여 24시간 동안 공동-자극하였다. 상청액을 Luminex 검정에 의해 사이토카인 함량에 대해 시험하였다(결과는 24시간당 백만개의 세포당 분비된 사이토카인 ㎖당 pg으로서 기술됨). 또한, 얻어진 T 세포를 3:1 비의 3/28 입자와 공동-자극하고, 어떠한 외인성 사이토카인 또는 저해제도 함유하지 않은 배지를 사용하여 배양물 중에서 1주일 동안 유지시켰다. 이러한 T 세포 배양 후에, 배양 13일에, T 세포를 수확하고, 3/28 입자(3:1 비)로 다시-자극하고, 24시간 상청액을 사이토카인 함량에 대해 상기와 같이 평가하였다. N.A, 약어는 해당 없음을 명시한 것이다(검정을 수행하기에 불충분한 T 세포 수율).
결과는 도 3a 및 도 3b에 도시되어 있으며, 도 3a에는 IFN-γ 분비가 예시되어 있으며, 도 3b에는 TNF-α 분비가 예시되어 있다. 각 경우에, 6일 T 세포 사이토카인 잠재력은 좌측 패널에 도시되어 있으며, 13일 T 세포 사이토카인 잠재력은 우측 패널에 도시되어 있다.
이러한 데이터는 고용량 템시롤리무스(1.0μM)가 밤새 사전-인큐베이션 조건 및 사전-인큐베이션 없는 조건 둘 다에서 24시간 후 최대 공동-자극의 원하는 매우 낮은 수준의 6일 T 세포 IFN-γ 및 TNF-α 분비를 초래함을 나타낸다. 참고로, 0.1μM 농도의 템시롤리무스의 사용은 6일 T 세포 사이토카인 분비 잠재력을 단지 부분적으로 감소시켰다. 이와 같이, 본 발명의 방법에서 템시롤리무스는 더 높은 농도, 즉, 적어도 1μM에서 사용되어야 한다. 이러한 데이터는 또한, 밤샘 사전-인큐베이션 개입이 단독으로 사용될 때, 정지된 T 세포 표현형을 산출하기에 충분하지 않음을 나타낸다. 이와 같이, 밤샘 사전-인큐베이션 단계는 원하는 완전한 결과를 달성하기 위해 고용량 템시롤리무스와 조합하여 사용되어야 한다.
또한, 이러한 방법은 초기 T 세포 정지와 후속 재-자극 후에 얻어진 증가된 이펙터 기능 간에 원하는 역 관계를 형성한다. 즉, IFN-γ 및 TNF-α 분비의 13일 T 세포 값 둘 다에 대해, 가장 낮은 수준의 6일 사이토카인 잠재력(사전-인큐베이션과 고용량 템시롤리무스의 조합)이 최고의 13일 사이토카인 분비 값을 산출하였다. 참고로, 밤샘 사전-인큐베이션 없이 고용량 템시롤리무스로 이루어진 조건은 사이토카인 분비 잠재력을 평가하기 위해 13일의 배양 시에 충분한 수율을 초래하지 않았다. 이와 같이, 이러한 결과는 Th1/Tc1 세포 생성을 위한 고용량 템시롤리무스 플러스 사전-인큐베이션 단계의 값을 추가로 확인한다.
새로운 조합 방법은 향상된 mTOR 저해 및 STAT5 포스포릴화의 폐기를 초래한다. 원하는 표현형의 T 세포를 제조하는 새로운 조합 방법의 능력(mTOR 저해; IL-2 수용체 차단; 공동-자극 지연을 위한 사전-인큐베이션; 및 더 낮은 강도의 공동-자극의 사용)은 부분적으로, 이전에 라파마이신-내성 T 세포 표현형과 관련된 분자 및 세포 사건을 제어하는 능력을 향상시켰다.
이러한 표현형의 하나의 구성요소는 단백질 번역을 제어하는 데 도움이 되는, 4EBP1의 수준에서 일어나는 것과 같은 mTOR-의존 신호전달 사건의 제어이다. 이를 해결하기 위해, 본 출원인은 높은 수준의 공동-자극(3/28 입자-대-T 세포 비, 3:1), 고용량 라파마이신(1.0μM), 및 사이토카인 첨가(IL-2 플러스 IFN-γ)와 함께 배양하기 위한 동시 T 세포 첨가를 도입한, T-Rapa 방법을 이용하여 Th1/Tc1 세포를 제조하였다. 나란히 비교하면, 본 출원인은 본 개시내용의 새로운 조합 방법(16시간 사전-인큐베이션 단계; 감소된 수준(1:1 비)에서 공동-자극; 템시롤리무스(1.0μM) 및 다클리주맙(50 ㎍/㎖) 둘 다의 사용; 및 IL-2 없이 단지 IFN-γ의 사용)을 이용하여 T 세포를 제조하였다.
도 4에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 본 출원인의 이전 방법["T-Rapa": 높은 수준의 공동-자극(3/28 입자-대-T 세포 비, 3:1), 고용량 라파마이신(1.0μM), 및 사이토카인 첨가(IL-2 플러스 IFN-γ)] 또는 T 세포를 제조하기 위한 새로운 조합 방법["Rapa-T": 16시간 사전-인큐베이션 단계; 감소된 수준(1:1 비)의 공동-자극; 템시롤리무스(1.0μM) 및 다클리주맙(50 ㎍/㎖) 둘 다의 사용; 및 IL-2 없이 IFN-γ 만의 첨가]을 이용하여 배양하였다. 16시간 및 32시간의 T 세포 배양에서, T 세포의 일부분을 수확하였고, 단백질을 단리시키고, 하우스키핑 유전자 β-액틴 및 mTOR 경로 분자 형광체-4EBP1의 웨스턴 블롯 분석을 정량화하였다. 결과를 임의의 T 세포 활성화 전 0일 투입 T 세포로부터 얻어진 단백질과 비교하였다.
도 4가 예시하는 바와 같이, 제조된 T 세포(도 4에서 "Rapa-T")를 생성하기 위한 신규한 조합 방법은 16시간 및 32시간 배양 시점 둘 다에 전술된 방법("T-Rapa")을 이용하여 제조된 T 세포에 비해 감소된 mTOR 경로 활성화(4EBP1의 포스포릴화에 의해 측정한 경우)를 야기시켰다.
P70S6 키나제는 mTOR 경로에서 추가의 중요한 분자이다. 도 5 및 도 6에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 본 출원인의 이전 방법["T-Rapa": 높은 수준의 공동-자극(3/28 입자-대-T 세포 비, 3:1), 고용량 라파마이신(1.0μM), 및 사이토카인 첨가(IL-2 플러스 IFN-γ)의 첨가와 함께 배양물에 동시 T 세포 첨가] 또는 제조된 T 세포를 생성하는 새로운 조합 방법["Rapa-T": 16시간 사전-인큐베이션 단계; 감소된 수준(1:1 비)에서 공동-자극; 템시롤리무스(1.0μM) 및 다클리주맙(50 ㎍/㎖) 둘 다의 사용; 및 IL-2 없이 단지 IFN-γ의 첨가]을 이용하여 배양하였다. 16시간 및 32시간의 T 세포 배양시에, T 세포의 일부분을 수확하고, 단백질을 단리하고, 하우스키핑 유전자 β-액틴 및 mTOR 경로 분자 P70S6K(도 5) 또는 포스포릴화된 STAT5(도 6)의 웨스턴 블롯 분석을 정량화하였다. 결과를 어떠한 T 세포 활성화 전에 0일 투입 T 세포로부터의 단백질과 비교하였다.
크게 대조적으로, 제조된 T 세포를 생성하는 신규한 조합 방법을 사용한 제조는 P70S6K의 수준을 크게 둔화시켰다(도 6, Rapa-T 조건). 이러한 데이터는 Th1/Tc1 제조의 조합 방법이 mTOR 활성화에 비해 개선된 제어를 제공한다는 추가 증거를 제공한다. 라파마이신-내성 T 세포를 제조하는 본 출원인의 종래 방법을 이용하는 경우에, 본 출원인은 16시간 및 32시간의 T 세포 배양 둘 다에서 P70S6K의 실질적으로 상향-조절을 확인하였다(도 5, T-Rapa 조건).
조합 방법은 Th1-타입 세포의 순도의 개선과 관련이 있다(FoxP3-발현 세포로의 오염 감소). 종래 제조 방법은 실질적으로 STAT5 포스포릴화를 초래한다(도 6, 16시간 및 32시간 배양 시의 T-Rapa 결과). 대조적으로, 조합 방법은 STAT5 포스포릴화를 폐기한다(도 6; 16시간 및 32시간 배양 시의 Rapa-T 결과).
이와 같이, 새로운 조합 방법은 또한, T 세포 제조 동안 mTOR 신호전달의 제어 증가 및 TREG 세포(STAT5 포스포릴화의 제어)로의 오염을 촉진시키는 신호전달 사건의 폐기와 관련하여 유리하다.
Th1/Tc1 세포 생성의 조합 방법의 개개 성분들의 추가 설명. 얻어진 Th1/Tc1 표현형에 대한 배양 개입의 개별 기여와 관련한 추가 정보를 얻기 위해 추가 배양을 확립하였다. 도 7 내지 10에 대하여, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 도 7 내지 10에 지시된 바와 같이, 다양한 3/28 입자 비, 다양한 mTOR 저해 방법, 항-IL-2 수용체 차단의 가변적인 첨가, 타입 I 분극화 사이토카인 IFN-γ의 가변적인 첨가, 및 밤샘 사전-인큐베이션 단계의 가변적 사용을 이용하여 배양하였다. 반복 공동-자극(3:1 입자 비)에 의해 생성된 상청액을 배양 6일 및 13일에 수집하고, Luminex 검정에 의해 IFN-γ(도 7a 및 7b), TNF-α(도 8a 및 8b), GM-CSF(도 9a 및 9b), 또는 IL-2(도 10a 및 10b) 함량에 대해 시험하였다(결과는 24시간당 백만개 세포당 ㎖당 pg으로서 표현됨).
도 7a 및 7b는 배양 종료 시(6일) 및 저해제 부재 하에 추가 배양 1주 후(13일) IFN-γ 분비 결과를 도시한 것이다. 원하는 표현형은 6일에 상대적으로 낮은 사이토카인 분비 값 및 동시에 13일에 상대적으로 높은 사이토카인 값을 포함한다. 도 7a 및 7b는 조합된 구성요소들 각각을 포함하는 배양 조건(낮은 수준의 공동-자극 [1:1 비]; 밤샘 사전-인큐베이션 후 지연된 공동-자극; 분극화 사이토카인 IFN-γ의 첨가; mTOR 저해제의 첨가[본 실험에서, 0.1μM의 차선 농도 사용]; 및 항-IL-2 수용체 항체 다클리주맙의 포함)이 원하는 표현형을 갖짐을 나타낸다. 여기에서, 이러한 조건은 6일에 IFN-γ 분비에서 감소하였지만, 13일에 IFN-γ 분비에서 높았다. 하나 이상의 요소들 중 하나 이상을 생략한 T 세포 배양 조건은 6일에 더 높은 사이토카인 값 및/또는 13일에 낮은 값을 갖는 경향이 있다. 또한, 라파마이신-내성 T 세포를 제조하는 본 출원인의 종래 방법(T-Rapa; 도 7a 및 7b)은 덜 바람직한 사이토카인 분비 패턴을 나타내었다(6일에 더 높은 값; 13일에 더 낮은 값).
Th1/Tc1 제조의 조합 방법은 또한, 하기 사이토카인이 평가되었을 때 유리한 사이토카인 표현형(6일에 감소된 값은 13일의 증가된 값과 조합됨)을 생성하였다: TNF-α(도 8a 및 8b); GM-CSF(도 9a 및 9b); 및 IL-2(도 10a 및 10b).
종합하면, 이러한 결과는 신규한 제조된 T 세포 제조 방법이 종래 T-Rapa 방법에 비해 중요한 장점을 갖는다는 추가 증거를 제공한다.
조합 방법을 이용한 Th1/Tc1 제조와 관련된 분자 변화. 본 출원인은 조합 방법을 이용한 Th1/Tc1 세포 제조 동안 변형되는 분자를 특성규명하기 위한 추가 실험을 수행하였다. 이러한 정보는 T 세포 표현형에 대한 이해를 개선시킬 수 있고 이러한 정보가 품질 관리 요소로서 제조 동안 사용될 수 있기 때문에 가치가 있다. 또한, 이러한 정보는 향후 제조 연구에서 사용될 수 있는 추가 조합 단계의 스크리닝 동안 사용될 수 있다.
이전 연구에서, 본 출원인은 라파마이신-내성 T 세포가 T 세포 제조 동안 자가 포식을 겪는다는 것을 확인하였다. 자가 포식이 mTOR 저해의 직접적인 결과라는 것이 오랫 동안 알려져 왔다. mTOR이 활성화될 때, T 세포는 성장 및 증식 상태를 유지한다(자가 포식 신호는 꺼짐). 반대로, mTOR이 저해될 때, 자가 포식이 촉진되고, 이에 의해, 미토콘드리아 부피(미토파지)의 감소를 포함하는 T 세포 부피의 감소를 초래한다. 실제로, 자가 포식은 T 세포 생물학에서 필수적인 항상성 과정이고, 에너지 요건이 감소될 수 있고 세포내 소기관 및 다른 세포 파편이 제거될 수 있기 때문에 T 세포 건강과 관련이 있다.
도 11 내지 도 13에 대하여, 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 1:3 입자-대-T 세포의 감소된 비의 3/28 입자의 첨가 전에 16시간 사전-인큐베이션 간격을 이용하여 배양하였다. 도 11 내지 도 13에 지시된 바와 같이, 다양한 T 세포 배양물은 상이한 mTOR 저해 방법(1.0μM의 라파마이신; 1.0 또는 0.1μM의 템시롤리무스), 상이한 외인성 IL-2 첨가 조건, 및 항-IL-2 수용체 단클론성 항체, 다클리주맙의 첨가에 대해 상이한 조건을 수용하였다. 16시간 사전-인큐베이션 간격 후에, 세포를 T 세포 배양물에서 수확하고, 단백질을 단리하고, p62(도 11), 포스포-RAPTOR(도 12), 또는 BIM(도 13) 및 하우스키핑 유전자 β-액틴을 웨스턴 블롯으로 정량화하였다.
본 출원인은 자가 포식 마커, p62의 T 세포 발현에 의해 측정한 경우, 자가 포식을 촉진하는 조합 방법의 능력을 평가하였다. 도 11에서 명시된 바와 같이, 사전-인큐베이션 단계, 낮은 수준의 공동-자극(1:3의 3/28 입자 대 T 세포 비), IL-2 수용체의 다클리주맙 차단, 및 mTOR 저해제를 포함한 조합 방법은 자가 포식 마커 p62를 상향-조절하였다. 이러한 인자 각각이 존재하는 경우에, 자가 포식은 라파마이신(1μM) 또는 템시롤리무스(1.0 또는 0.1μM)로의 mTOR 저해에 의해 실현될 수 있다. 요법으로부터 IL-2 수용체 차단의 제거는 자가 포식의 유도를 질질적으로 둔화시켰다.
또한, 조합 방법은 또한, 포스포릴화된 형태의 RAPTOR의 감소된 발현에 의해 명시된 바와 같이, mTOR 경로의 저해를 개선시켰다(도 12). 참고로, 고용량 템시롤리무스가 도입된 조합 방법은 저용량 템시롤리무스 또는 고용량 라파마이신의 사용과 비교하여 더 낮은 수준의 포스포-RAPTOR을 생성하였다.
본 출원인은 또한, bcl-2 유전자 패밀리, BIM의 프로-아폽토시스 구성원의 제조된 T 세포 발현을 평가하였다. bcl-2 패밀리 구성원은 주로 미토콘드리아 수준에서 작동하며, 이와 같이. 미토콘드리아 자가 포식(미토파지)은 bcl-2 패밀리 구성원 유전자의 균형에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 아폽토시스 임계치를 결정하는 데 도움을 준다. 미토파지는 아폽토시스 임계치를 감소시킨다는 측면에서 유리한 것으로 나타났으며, 이는 잠재적으로 bcl-2 분자 패밀리의 불리한 균형으로 미토콘드리아를 선택적으로 제거한다. 본 출원인은 제조의 조합 방법이 BIM의 감소된 발현을 초래함을 확인하였다(도 13).
요약하면, 이러한 실험은 향상된 자가 포식, 감소된 mTOR 신호전달 및 감소된 프로-아폽토시스 분자 발현이 Th1/Tc1 세포 제조의 조합 방법과 관련이 있음을 나타낸다. 이러한 변화는 제조된 T 세포의 증가된 생체내 기능에 기여할 가능성이 있고, 이와 같이, 품질 관리 단계로서 사용되거나, 미래의 차세대 T 세포 제조 방법을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
조합 방법은 T 세포 정지, T 세포 탈분화를 촉진시킨다. 본 출원인은 사전-인큐베이션 단계, 낮은 수준의 공동-자극(1:3 비의 3/28 입자 대 T 세포), IL-2 수용체의 다클리주맙 차단, 및 mTOR 저해제의 도입에 의해 규정된 바와 같이, 조합 방법에 의해 제조된 Th1/Tc1 세포의 표면 표현형을 특징분석하기 위한 추가 실험을 수행하였다. 첫째로, 본 출원인은 줄기 세포 기억 서브세트의 T 세포를 포함하는, T 세포 고유성의 마커인, CD45 아이소형 RA의 T 세포 발현에 대한 배양 변수의 효과를 평가하였다. 이와 같이, CD45RA의 발현을 보존하거나 증가시키는 T 세포 제조 방법의 개발이 요망된다.
도 14a 내지 도 15d에 대하여, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 다양한 3/28 입자 비, 다양한 mTOR 저해 방법, 항-IL-2 수용체 차단의 가변적인 첨가, 타입 I 분극화 사이토카인 IFN-γ의 가변적인 첨가, 및 초기 밤샘 사전-인큐베이션 단계의 가변적인 사용을 이용하여 도 14a 내지 도 15d에 명시된 바와 같이 배양하였다. 배양 6일에, T 세포를 수확하고, 배양 0일("0일 투입 배양물")에 발현 수준에 대한 결과와 비교하여, CD4 세포 서브세트 상에서 CD45RA(도 14a 내지 도 14d) 또는 CD62L, CCR7, 및 CD127(도 15a 내지 도 15d)의 유세포측정 발현에 대해 평가하였다.
도 14a 내지 도 14d에 예시된 바와 같이, 조합 방법의 중요 요소가 없는 T 세포 제조(3:1 입자-대-T 세포 비에서 높은 공동-자극 사용; 다클리주맙의 사용 없음; mTOR 저해제의 사용 없음)는 CD45RA 발현의 빠른 저하를 초래한다(칼럼 #2 참조). 크게 상반되게, 이러한 성분들 모두의 사용은 CD45RA 발현의 완전한 보존을 초래하였다(칼럼 #4 참조). 참고로, T 세포는 CD45RA의 발현을 최적으로 보존하지 않는 것으로 본 출원인이 확인한 종래 제조 방법을 이용하여 증식하였다(T-Rapa 세포; 도 14b, 칼럼 #3).
또한, 본 출원인은 조합 방법이 CD62L, CCR7, 및 CD127을 포함하는 감소된 T 세포 분화의 다른 마커를 초래하는 지의 여부를 평가하였다. 도 15a(칼럼 #4)는 사전-인큐베이션 단계, 낮은 수준의 공동-자극, IL-2 수용체의 항체 차단, 및 mTOR 저해제를 사용하여 제조된 T 세포가 이러한 T 세포 마커의 동시-발현을 증가시킴을 나타낸다. 참고로, T 세포는 본 출원인이 이러한 3개의 기억 마커의 발현을 최적으로 증가시키지 못하는 것으로 확인된 종래 제조 방법을 이용하여 증식하였다(T-Rapa 세포; 도 15a, 칼럼 #3).
이와 같이, Th1/Tc1 세포 제조의 조합 방법은 제한된 분화 상태의 T 세포를 제조하는 측면에서 유리하며, 이는 증가된 생체내 효과를 매개한다는 것이 명확하고 재현 가능하게 나타난다.
조합 방법은 배양 개시 시에 T 세포 순도를 감소시킴으로써 최적화된다. T 세포 제조를 위해, 배양물 투입 집단이 T 세포 함량에 대해 높은 정도로 정제되어야 하는 지의 여부 또는 단핵구와 같은 보조 세포 집단이 내약성일 수 있는 지의 여부를 결정하는 것이 중요하다. 경제적 비용 및 노동 관점에서, 일반적으로, 고도로 정제되지 않은 집단으로 배양물을 개시하는 것이 바람직하다. 그러나, 배양 개시 시에 세포의 오염 집단은 T 세포 확장에 또는 원하는 T 세포 표현형의 생성에 해로울 수 있다. 이러한 파라미터를 평가하기 위해, 본 출원인은 T 세포 함량에 대해 100%, 66%, 33%, 또는 10% 순수한 투입 집단을 이용하는 조합 방법을 이용하여 배양물을 개시하였으며, 세포의 나머지 집단은 주로 단핵구이다.
도 16 내지 도 20에 대하여, 배양 개시 전에, T 세포의 순도가 100%, 66%, 33%, 또는 10%이도록 투입 세포 집단을 조정하였으며, 나머지 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포(주로, 단핵구)에 함유된 비-T 세포 집단을 포함하였다. 명시된 바와 같이, T 세포를 템시롤리무스를 가변적으로 함유하거나 함유하지 않은(1.0 또는 0.1μM의 농도) 배지에서 확장하였다. 또한, 배양은 항-CD3, 항-CD28 입자 공동-자극(1:3 비) 전에 16시간 사전-인큐베이션 또는 사전-인큐베이션 없음을 가변적으로 포함하였다. 도시된 각 배양물을 항-IL-2 수용체 단클론성 항체 다클리주맙(50 ㎍/㎖) 및 IFN-γ(10,000 IU/㎖)를 함유한 배지에서 증식하였다. 6일 제조 간격의 종료 시에, T 세포는 높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 받았다. 도 16에 대하여, 높은 수준의 공동-자극 후에, T 세포를 이후에 저해제를 함유하지 않은 배지에서 1주일 동안 확장하였다. 이러한 확장 간격의 종료 시에, T 세포를 열거하고, 0일 투입 수에 대해 그래프로 표시하였다. 도 17 및 도 18에 대하여, 높은 수준의 공동-자극 후에, T 세포를 배양 13일까지 확장하였다. 6일 및 13일 둘 다에, T 세포를 공동-자극시키고, 24시간 상청액을 IFN-γ(도 17a 및 도 17b) 또는 TNF-α(도 18a 및 도 18b) 함량(결과는 24시간당 백만개의 세포당 ㎖당 pg로 나타냄)에 대해 평가하였다. 도 19 및 도 20에 대하여, 높은 수준의 공동-자극 후에, T 세포를 배양 13일까지 확장하였다. 6일 및 13일 둘 다에, T 세포를 유세포 분석법에 의해 CD25 발현(도시된 결과는 CD25를 공동-발현시키는 CD4+ T 세포의 백분율임)(도 19) 또는 CD62L, CCR7 및 CD127의 발현(도 20)에 대해 평가하였다.
도 16에 상세히 기술된 바와 같이, 배양 투입 시에 감소된 T 세포 순도로 개시된 배양물은 T 세포 확장에 대한 더 큰 능력을 초래하며, 이러한 관계는 용량-의존 방식으로 발생한다. 참고로, 밤샘 사전-인큐베이션 단계를 사용하여 증식된 T 세포는 배양 개시 시에 공동-자극된 T 세포에 비해 더 큰 확장을 갖는다. 이러한 데이터는 조합 방법에 대한 추가 지원을 제공하고, 달리 오염으로 간주될 수 있는 배양 개시 시의 세포 집단이 T 세포 확장 잠재력을 실제로 촉진시키기 것으로 보임을 나타낸다. 이와 같이, 조합 방법의 최적화된 사용은 또한, 배양 개시 시에 고도로 농축되지 않은 T 세포의 사용을 포함한다. 품질 보증을 위해, 비제한적인 예로서, T 세포 함량에 대해 66% 또는 33% 순수한 접종체로 각 배양을 개시하여, 순도의 수준을 제어하는 것이 중요할 수 있다. 도 17a, 17b 및 도 18a 및 18b에 상세히 기술된 바와 같이, 조합 방법을 이용하여 제조된 T 세포 및 고도로 정제되지 않은 투입 T 세포는 원하는 사이토카인 분비 패턴을 초래하였다: 즉, (도 17a 및 17b) 제조의 종료(6일) 시에 IFN-γ 분비의 감소 및 저해제를 함유하지 않은 배지에서 1주일 확장 후(13일) IFN-γ 분비 증가; 및 (도 18a 및 18b) 제조의 종료(6일) 시에 TNF-α 분비의 감소 및 저해제를 함유하지 않은 배지에서 1주일 확장 후(13일) TNF-α 분비 증가.
또한, 본 출원인은 감소된 T 세포 순도의 투입 집단을 사용하는 조합 방법으로 제조된 T 세포에서의 세포 표면 마커 발현을 평가하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 이러한 T 세포는 제조 종료 시(6일)에 CD25 발현을 감소시켰으며, 이는 정지 표현형과 일치한다. 저해제 없이 1주 배양 후에, T 세포는 CD25를 크게 상향-조절하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 이러한 T 세포는 또한, 기억 마커 CD62L, CCR7, 및 CD127의 동시-발현을 증가시켰다. 이러한 마커는 이후에 1주 T 세포 확장 후에 감소되었다.
요약하면, 이러한 데이터는 조합 방법을 이용한 Th1/Tc1 세포의 제조가 비-T 세포 집단으로의 실질적인 오염을 갖는 투입 T 세포를 사용하여 가능함을 나타낸다. 실제로, 이러한 비-T 세포 집단의 의도적인 포함은 T 세포 수율을 개선시키고 얻어진 T 세포 기억 프로파일을 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
냉동 보존된 세포 기질로부터의 제조. 이전에 수집된 PBSC 산물의 경우에, 이러한 냉동 보존된 세포를 세포의 해동 및 Rapa-T 세포의 제조까지 액체 질소의 증기상에서 저장하였다. 성분 채집술에 의해 또는 향후에 간단한 혈구 계수집에 의해 새로이 단리된 세포의 경우에, 세포는 바로 처리될 것이고, 이후에, 배양물에 바로 배치될 수 있거나, 제어된 속도 냉동 기술에 의해 냉동 보존될 수 있고, 후속 사용을 위해 액체 질소의 증기상에서 저장될 수 있다.
새로이 단리된 세포 집단으로부터 냉동 보존된 세포 기질로부터의 T 세포 배양물은 예를 들어, 단클론성 항체 및 칼럼 기술(양성 또는 음성 선택)의 사용에 의한 일부 타입의 T 세포 농축을 필요로 한다. Rapa-T 제조에서 사용되는 미가공 세포 물질의 농축은 T 세포가 배양 간격 동안 효율적으로 농축되기 때문에 이러한 항체-기반 방법을 필요로 하지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 전반적인 수준에서 효율적인 세포 요법에 대한 권장 사항과 일치한다. Rapa-T 세포를 제조하는 초기 가공 단계는 냉동 보존 단계(적용 가능한 경우)에서 사용되는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)의 제거, 적혈구(RBC)의 용해, 및 오염된 과립구의 원심분리 제거 및 어느 정도 단핵구의 원심분리 제거에 초점을 맞춘다. 이러한 단계는 주로 폐쇄형 시스템 기술을 이용하여 비교적 자동화된 방법으로 수행된다. 이러한 절차는 인적 오류를 감소시키고, 배취 기록(batch record)에 대한 상세한 제조 데이터를 제공하고, 제조 실행 전반에 걸쳐 일관성을 개선시키고, 최종 산물의 감염성 작용제 오염에 대한 위험을 감소시키기 때문에 유리하다. Rapa-T 세포 산물의 가공은 하기 단계를 도입한다: (1) 감염성 작용제 오염을 감소시키기 위해 고체-상태, 비수계 방법을 이용하여 냉동 보존된 산물을 해동하는 단계(적용 가능한 경우); (2) LOVO 침투성 막 디바이스를 이용한 세포 산물의 자동화된 세척; (3) LOVO 세척 단계 동안, 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 완충제를 사용하여 RBC의 용해를 통합하는 단계; (4) 폐쇄형 시스템, 역류, 원심 용출(CCE) 디바이스(Elutra; Terumo)에 세포의 후속 플레이팅과 함께 LOVO 방법을 이용한 세포 함량의 부피 감소; 및 (5) CCE에 의한 과립구 및 단핵구의 효율적인 제거를 위한 Elutra 디바이스의 사전-프로그래밍된 작동.
이러한 림프구 농축 및 배지 정제 후에, 세포를 산소 교환에 대한 강화된 능력을 갖는 특수 챔버(G-Rex 용기; Wilson-Wolf)에 플레이팅하였다. 향상된 가스 침투성 특징을 갖는 것 이외에, G-Rex 용기는 폐쇄형 시스템 유닛이고, 자동화된, 폐쇄형 시스템 배지 부피 감소(GatheRex Liquid Handling Pump)의 추가 정점을 갖는다. 림프구-농축된 세포를 G-Rex 용기에서 6일 동안 유지하였다.
제조된 T 세포의 기능적 속성을 갖는 G-Rex 용기에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물의 제조를 촉진하기 위해 여러 특정 배양 조건을 사용하였다. 이러한 특정 조건은 (1) 5% 인간 혈청이 추가로 보충된, 농축된 배지의 사용(X-Vivo 20; Lonza를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음); (2) 공동-자극 전에 G-Rex에 세포 플레이팅의 16시간 휴지 간격의 도입(세포는 1.5×106개의 T 세포/㎖의 비교적 고밀도로 플레이팅됨); (3) 이러한 초기 휴지 간격 동안, 단클론성 항체 바실릭시맙(IL-2 수용체를 차단하고 이에 의해 내인성으로 생성된 IL-2에 의해 자율 T 세포 활성화를 방지함) 및 템시롤리무스(mTORC1의 약리학적 저해제임)의 첨가에 의해 세포를 최적으로 휴지시킴; (4) 이러한 16시간 휴지 간격 후에, 세포를 1:3의 입자-대-T 세포비에 의해 규정된 바와 같이(통상적으로, 대부분의 T 세포 확장 조건은 9배 더 높은 수준의 공동-자극, 3:1 입자-대-T 세포 비를 사용함), 차선 조건 하에서 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자(3/28 입자)로 공동-자극하거나 공동 자극하지 않음; (5) 중요하게, T 세포가 초기 휴지 간격 후에 세척되지 않는 것이 필요함; (6) 휴지 간격 후에, 3/28 입자의 첨가 이외에, CD4+ Th1 및 CD8+ Tc1 표현형으로의 분화를 촉진시키기 위해 고용량(10,000 IU/㎖)의 분극화 사이토카인 IFN-γ를 첨가하는 것이 필요함; (7) 중요하게, T 세포 배양에 대한 통상적인 첨가제인 IL-2의 첨가를 피하는 것이 중요함; 및 (8) 입자 및 IFN-α의 첨가 후에, 배양 6일에 수확할 때까지 세포를 그대로 두는 것이 중요함(세포 세척하지 않음, 추가 배양 첨가제 없음)을 포함한다.
제조된 T 세포의 냉동 보존. 1) G-Rex 용기에서 6일 세포 배양 후에, 배양물의 부피는 GatheRex 기기에 의해 폐쇄형 시스템 방식으로 감소될 수 있다. 후속하여, 세포를 수확할 수 있으며, 3/28 입자를 휴대용 자석에 의해 제거할 수 있으며, 세포를 배양 첨가제(템시롤리무스, 바실릭시맙, IFN-α)의 99% 초과를 제거하기 위해 세포의 연속 세척을 위해 LOVO 디바이스에 배치시킬 수 있다.
세척된 세포를 냉동 보존 배지에 재구성할 수 있으며, 이는 5% DMSO 및 5% 펜타전분을 함유한다. 냉동 보존을 50 ml 냉동 백에서 여러 번 일회용 분취량으로 수행되었다. Rapa-T 세포를 GMP-준수 제어 속도 냉동 방법에 의해 냉동 보존하고, Rapa-T 세포가 특정 방출 기준 시험을 통과한 후 인증된 냉동-이송기에 의해 액체 질소의 증기상에서 이송하였다.
Rapa-T 세포의 방출 기준 시험은 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 순도의 함량과 같은 표준 시험을 포함한다(최종 산물은 유세포 분석법에 의해 70% 초과의 CD3+ T 세포 함량일 수 있으며, CD4+ 및 CD8+ 서브세트는 각각 5% 수준으로 존재할 수 있음). 세포는 유세포 분석법 아넥신 및 7-AAD 검정에 의해 측정한 경우 70% 초과로 생존 가능할 수 있다. 또한, 세포는 최소 3-일 배양 간격(이상적으로, 14일 배양 간격)에 박테리아 및 진균 오염이 없어야 하며, 또한, 세포 산물은 박테리아 LPS 내독소에 대해 검출 한계 미만이어야 한다.
이러한 표준 시험 이외에, 특수 기능 시험은 Rapa-T 세포 산물에 대한 방출 기준을 구성할 것이다. 산물 방출 및 세포 요법 전에, Rapa-T 세포는 배양물 투입 T 세포와 관련하여 하기 속성을 지닐 수 있다: (1) CD62 리간드 및 CCR7의 유세포측정 동시-발현 증가에 의해 규정된 바와 같은 향상된 T 중심 기억 표현형; (2) 예정사-1(PD1)과 같은 관문 저해 분자의 낮은 수준 발현; (3) 최대 공동-자극 시에 감소된 Th1/Tc1-타입 사이토카인 분비 수준에 의해 규정된 바와 같은 휴지 상태; (4) 유세포 분석법 MitoTracker 검정에 의해 미토콘드리아 질량 감소에 의해 입증된 바와 같은 자가 포식 특징; (5) mTORC1 및 mTORC2 다운스트림 표적의 적어도 50% 저해에 의해 입증된 바와 같은, 내성 표현형; 및 (6) n=80 주요 전사 인자 및 분화 분자의 다면 차등 유전자 발현 프로파일.
도 21은 신규한 Rapa-T 방법이 입자 공동-자극이 없거나 낮은 수준의 입자 공동-자극(1:3의 입자-대-T 세포 비)을 사용하는 지의 여부와는 관계없이, 신규한 Rapa-T 방법이 T-Rapa 세포에 비해 증가된 천연 또는 T 중추-기억 마커 발현을 갖는 T 세포를 생성함을 예시한 것이다. 도 21에서, Rapa-T1 세포를 입자 공동-자극 없이(각 패널의 첫번째 2개의 칼럼) 또는 1:3 입자-대-T 세포 공동-자극과 함께(각 패널에서 제3 및 제4 칼럼), 전술된 바와 같은 IFN-γ, 템시롤리무스, 및 바실릭시맙에서 배양에 의해 생성하였다. 결과를 이전 T-Rapa 방법을 이용한 배양(라파마이신의 사용 및 3:1 입자-대-T 세포; 각 패널에서 제5 및 제6 패널)과 비교하였다. 유세포 분석법을 배양 종료 시에 수행하였으며, 결과는 CD4+ T 세포 서브세트(검정색 칼럼) 및 CD8+ T 세포 서브세트(회색 칼럼) 둘 다에 대해 상세히 기술된다. 도시된 결과는 CD45RA+ 발현에 의해 규정된 바와 같이 천연 T 세포 서브세트(좌측 패널); CD62L 및 CCR7의 동시-발현에 의해 규정된 바와 같이 T 중심 기억 서브세트; 및 CD62L, CCR7, 및 CD127을 공동-발현시키는 더욱 원시적인 T 세포에 대한 것이다.
도 21에 상세히 기술된 바와 같이, 본 개시내용에 기술된 방법에 따라 제조된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T-Rapa 방법과 비교하여, 방법이 입자 공동-자극이 없거나 감소된 수준의 공동-자극을 포함하는 조건을 포함하여, T-Rapa 세포와 관련하여 유세포 분석법에 의해 천연 및 T 중심 기억 마커의 증가된 발현 수준을 갖는다.
도 22는 신규한 Rapa-T 방법이 입자 공동-자극이 없거나 낮은 수준의 입자 공동-자극(1:3의 입자-대-T 세포 비)을 사용하는 지의 여부와는 관계없이, 신규한 Rapa-T 방법이 T-Rapa 세포에 비해 감소된 CD25, CTLA4, 및 TIM3 발현을 갖는 T 세포를 생성함을 예시한 것이다. 도 22에서, Rapa-T1 세포를 입자 공동-자극 없이(각 패널의 첫번째 2개의 칼럼) 또는 1:3 입자-대-T 세포 공동-자극과 함께(각 패널에서 제3 및 제4 칼럼), 전술된 바와 같은 IFN-γ, 템시롤리무스, 및 바실릭시맙에서 배양에 의해 생성하였다. 결과를 이전 T-Rapa 방법을 이용한 배양(라파마이신의 사용 및 3:1 입자-대-T 세포; 각 패널에서 제5 및 제6 패널)과 비교하였다. 사이토카인 분비 분석(IL-4 및 IFN-g 측정)을 배양 종료 시에 수행하였다. 유세포 분석법을 배양의 종료 시에 수행하였으며, 결과는 CD4+ T 세포 서브세트(검정색 칼럼) 및 CD8+ T 세포 서브세트(회색 칼럼) 둘 다에 대해 상세히 기술된다. 도시된 결과는 IL-2 수용체 CD25의 발현(좌측 패널); 면역 억제 및 TREG-관련 분자 CTLA4; 및 면역 관문 분자 TIM3에 대한 것이다.
도 22에 상세히 기술된 바와 같이, 본 개시내용에 기술된 방법에 따라 제조된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T-Rapa 방법과 비교하여, 방법이 입자 공동-자극이 없거나 감소된 수준의 공동-자극을 포함하는 조건을 포함하여, T-Rapa 세포와 관련하여 유세포 분석법에 의해 T 세포 활성화 및 TREG 세포 기능과 관련된 IL-2 수용체 CD252의 감소된 발현 수준, 및 감소된 면역 억제 분자 CTLA43 및 면역 관문 저해 분자 TIM34의 수준을 갖는다.
도 23은 신규한 Rapa-T 방법이 입자 공동-자극이 없거나 낮은 수준의 입자 공동-자극(1:3의 입자-대-T 세포 비)을 사용하는 지의 여부와는 관계없이, 신규한 Rapa-T 방법이 Th2 대 Th1 분극화의 유사한 패턴, 및 T-Rapa 세포에 비해 증가된 정지를 갖는 T 세포를 생성함을 예시한 것이다. 도 23에서, Rapa-T1 세포를 입자 공동-자극 없이(각 패널의 첫번째 2개의 칼럼) 또는 1:3 입자-대-T 세포 공동-자극과 함께(각 패널에서 제3 및 제4 칼럼), 전술된 바와 같은 IFN-γ, 템시롤리무스, 및 바실릭시맙에서 배양에 의해 생성하였다. 결과를 이전 T-Rapa 방법을 이용한 배양(라파마이신의 사용 및 3:1 입자-대-T 세포; 각 패널에서 제5 및 제6 패널)과 비교하였다. 사이토카인 분비 분석(IL-4 및 IFN-g 측정)을 배양 종료 시에 수행하였다. 결과는 T 세포 제조 종료 시에(6일) 및 저해제 없이 추가 6일 배양 후(12일)에 상세히 기술되었다.
도 23에 상세히 기술된 바와 같이, 본 개시내용에 기술된 방법에 따라 제조된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T-Rapa 방법과 비교하여, 방법이 입자 공동-자극이 없거나 감소된 수준의 공동-자극을 포함하는 조건을 포함하여, T-Rapa 세포에 비해 유사한 정도의 Th2 대 Th1 사이토카인 분극화를 갖는다. 상세하게는, 낮은 수준의 Th2-타입 사이토카인 IL-4의 분비(6일 및 12일 둘 다에 100 내지 200 g/㎖ 범위의 제조 종료 시[6일] 및 저해제 없이 추가 배양 기간[12일] 후의 값을 가짐) 또는 배양 12일에 높은 수준의 Th1-타입 사이토카인 IFN-γ 분비(1000 내지 3000 g/㎖의 값)가 존재한다. 제조 종료 시에(6일) 새로운 Rapa-T 조건에서의 IFN-γ 분비는 이전 T-Rapa 조건에 비해 크게 감소되었고, 이에 의해, 방법이 입자 공동-자극이 없거나 낮은 수준의 입자 공동-자극(1:3의 입자-대-T 세포 비)을 사용하는 지의 여부와는 관계없이, 신규한 Rapa-T 제조 방법에서 T 세포 정지의 유리한 특징을 나타낸다.
도 24에 상세히 기술된 바와 같이, 본 개시내용에 기술된 방법에 따라 제조된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T-Rapa 방법과 비교하여, 방법이 입자 공동-자극이 없거나 수준의 공동-자극이 감소된 것을 포함하는 조건에서, T-Rapa 세포에 비해 Th1 사이토카인 분극화의 패턴을 갖는다.
도 24는 신규한 Rapa-T 방법이 입자 공동-자극을 사용하지 않거나 낮은 수준의 입자 공동-자극(1:3의 입자-대-T 세포 비)을 사용하는 지의 여부와는 관계없이, 신규한 Rapa-T 방법이 T-Rapa 세포에 비해 Th1 분극화의 유리한 패턴을 갖는 T 세포를 생성함을 예시한다. 도 24에서, Rapa-T1 세포를 입자 공동-자극 없이 또는 1:3 입자-대-T 세포 공동 자극과 함께, 이전에 기술된 바와 같이 IFN-γ, 템시롤리무스, 및 바실릭시맙에서 배양함으로써 생성하였다. 종래 T-Rapa 방법(라파마이신 및 3:1 입자-대-T 세포)을 포함하는 다양한 대조 배양물을 또한 평가하였다. 모든 배양물은 달리 특정하지 않는 한, 9×106개의 세포/㎖ 농도이고, 입자 공동-자극을 가지지 않고, IL-2가 첨가되지 않고, IFN-γ에 추가로 지연이 있고, 1μM 농도의 템시롤리무스 및 10μM 농도의 바실릭시맙을 포함하였고, 5% AB 혈청이 보충된 X-Vivo 20 배지를 사용하였다. 도면에서 범례에 대한 특정 배양 조건은 하기와 같다: 조건 1, 상기와 같은 Rapa-T 방법; 조건 2, 혈청 없는 Rapa-T 방법; 조건 3, 바실릭시맙 없는 Rapa-T 방법; 조건 4, 바실릭시맙이 없고 감소된 템시롤리무스(0.1μM)를 사용한 Rapa-T 방법; 조건 5, 템시롤리무스 또는 바실릭시맙 없는 Rapa-T 방법; 조건 6, 높은 빈도의 단핵구로 오염된 투입 T 세포를 사용한 Rapa-T 방법(투입 세포의 79%는 단핵구이고, 다른 모든 배양물에서 증가하였고, 이는 약 10% 단핵구 오염을 가짐); 조건 7, 단핵구 오염을 사용하지 않은(< 1%) Rapa-T 방법; 조건 8, IFN-γ의 동시 첨가(밤샘 지연 없음)를 사용한 Rapa-T 방법; 조건 9, 1:3 입자 공동-자극을 갖는 Rapa-T 방법; 조건 10, 대조 T 세포 조건(저해제 없음; 3:1 입자); 및 조건 11, 이전 T-Rapa 조건, 라파마이신(1μM), 20 IU/㎖의 IL-2 첨가, 3:1 입자, 밤새 사전-인큐베이션 없음. 사이토카인 분비 분석(IL-2 및 IFN-γ 측정)을 배양의 종료 시에 수행하였으며, 결과는 T 세포 제조의 종료(6일)에 및 저해제 없이 추가 6일 배양 후(12일)에 상세히 기술되었다.
도 24에 상세히 기술된 바와 같이, 본 개시내용에 기술된 방법에 따라 제조된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 T-Rapa 방법과 비교하여, 본 방법이 입자 공동-자극이 없거나 감소된 수준의 공동-자극을 포함하는 조건을 포함하는, T-Rapa 세포에 대한 Th1 사이토카인 분극화의 패턴을 갖는다.
도 24에 도시된 바와 같이, 조건 #1, 입자 없이 제조되는 Rapa-T 조건은 특히 저해제의 부재 하에서 T 세포 확장 후 12일에 유리하게 높은 수준의 IL-2 분비 능력을 갖는다. 혈청이 보충되지 않은 배지에서 수행되는 조건 #2에서 유사한 패턴이 관찰되었으며, 이에 의해, 혈청 보충과 함께 또는 이의 없이 Rapa-T 세포를 제조하는 능력을 나타내는 것이다. 특히, 배양 #11(이전 T-Rapa 조건)condition)과 비교하여 증가된 IL-2 분비 능력은 신규한 Rapa-T 제조 방법이 헬퍼-독립적 방식으로 생체 내에서 기능할 수 있는 감소된 분화 전구체 프로파일의 T 세포를 생산한다는 것을 나타낸다. 조건 #1은 또한, 1:3 입자-대-T 세포 비의 공동-자극으로 제조된 새로운 Rapa-T 조건인, 배양 #9에 비해 이와 관련하여 유리하였다.
도 24에 도시된 바와 같이, 조건 #1, 입자 없이 제조되는 Rapa-T 조건은 또한, 수준이 검출 하한치와 가깝기 때문에 제조 종료 6일에 IFN-γ 분비의 측면에서 바람직하였으며, 이에 의해, Rapa-T 세포 산물이 정지 상태에 있음을 나타내는 것이다. 비교하면, 저해제를 함유하지 않은 조건 #5는 6일에 거의 4000 g/㎖의 IFN-γ 분비를 가졌다, 유사하게, 이전 T-Rapa 조건은 6일에 높은 수준, 대략 6000 g/㎖의 IFN-γ 분비를 가졌다. 참고로, 1:3 입자-대-T 세포 공동-자극을 사용한 새로운 Rapa-T 조건은 제조 종료 시에, 6일에, 대략 200 g/㎖의 IFN-γ 분비가 존재하였기 때문에 입자가 없는 조건 #1보다 덜 정지되었다. 마지막으로, 신규한 Rapa-T 제조 방법(입자가 없는 조건 #1 및 입자를 갖는 조건 #9)은 저해제의 부재 하에 6일 배양 간격 후에 배양 12일에 IFN-γ 분비 능력의 유리한 증가를 갖는다.
요약하면, 신규한 Rapa-T 방법은 하기 표현형 특징을 갖는 T 세포를 제조할 수 있다: (a) 투입 정상 T 세포에 비해, 전사 인자, FOXP3과 같은 조절 T 세포 마커의 발현 감소; 및 Th1-타입 전사 인자, TBET의 증가; (b) 종래 T-Rapa 방법에 비해, 부분적으로 제조의 종료 시에 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 분비 감소에 의해 감소된 IL-2 수용체 CD25 발현에 의해 명시된 바와 같이, 정지 상태 증가; (c) 종래 T-Rapa 방법에 비해, p-STAT5 발현 감소 및 mTOR 경로 분자 p-RAPTOR, p-4EBP1 및 p70S6K의 수준 감소; (d) 투입 정상 T 세포에 비해, 분자 p62 발현의 변경을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 자가 포식 마커의 증가; (e) 투입 정상 T 세포에 비해, CD45RA, CD62L/CCR7의 동시-발현, CD62L/CCR7/CD127의 동시 발현을 포함하는, 천연 또는 T 중심 기억 집단의 유세포 분석법 마커의 증가; (f) 이전 T-Papa 방법에 비해, CTLA4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공동-저해 분자 발현의 감소; (g) 종래 T-Rapa 방법에 비해, TIM3을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 관문 저해 수용체 발현의 감소된 발현; 및 (h) 투입 정상 T 세포에 비해, 탈분화 마커(Nanog, KLF4 및 KLF10을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)의 증가 및 분화 마커(페르포린, 그랜자임 B, IFN-γ를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)의 감소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변경된 RNA 발현 패턴.
본 개시내용에서 상세히 설명된 Rapa-T 방법에 따라 제조된 T 세포 산물의 대부분의 표현형 특징은 배양 종료 시에 확인될 수 있다. 그러나, T 세포 산물이 냉동 보존될 수 있으며, 이와 같이, 해동후 상태의 T 세포의 표현형 특징이 대상체로 입양적으로 전달되는 실제 산물을 반영한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 해동후 상태의 Rapa-T 세포는 하기를 특징으로 할 수 있다: (a) 제조의 종료 6일 샘플과 해동후 샘플 간에 유사한 낮은 수준의 IL-2 수용체 CD25 발현에 의해 나타내는 바와 같은, 정지 상태의 유지; (b) 제조 종료 6일 샘플에 비해, 해동후 샘플은 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 낮은 수준 분비를 계속 가질 것임(제조 종료 시에 수집된 샘플에 비해 증가하지 않음); (c) 투입 정상 T 세포에 비해, 해동후 샘플은 CD45RA, CD62L/CCR7의 동시-발현, CD62L/CCR7/CD127의 동시-발현을 포함하는 천연 또는 T 중심 기억 집단의 유세포 분석법 마커의 증가를 유지시킬 것임; (f) 해동후 샘플은 CTLA4를 포함하지만 이로 제한되지 않는 공동 저해 분자의 발현을 지속적으로 감소시킬 것임(제조 종료 시에 수집된 샘플에 비해 해동후 샘플이 증가되지 않음); (g) 해동후 샘플은 TIM3을 포함하지만 이로 제한되지 않는 공동 저해 분자의 발현을 지속적으로 감소시킬 것임(제조 종료 시에 수집된 샘플에 비해 해동후 샘플이 증가되지 않음); 및 (h) 투입 정상 T 세포에 비해, 탈분화 마커(Nanog, KLF4 및 KLF10을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)의 증가 및 분화 마커(페르포린, 그랜자임 B, IFN-γ를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)의 감소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변경된 RNA 발현 패턴.
냉동 보존된 세포 기질에서 제조. 이전에 수집된 PBSC 산물의 경우에, 이러한 냉동 보존된 세포를 세포의 해동 및 Rapa-T 세포의 제조까지 액체 질소의 증기상에서 저장하였다. 성분 채집술에 의해 또는 향후에 간단한 혈구 계수집에 의해 새로이 단리된 세포의 경우에, 세포는 바로 처리되고, 이후에, 배양물에 바로 배치될 수 있거나, 제어된 속도 냉동 기술에 의해 냉동 보존될 수 있고, 후속 사용을 위해 액체 질소의 증기상에서 저장될 수 있다.
새로이 단리된 세포 집단으로부터 냉동 보존된 세포 기질로부터의 T 세포 배양물은 예를 들어, 단클론성 항체 및 칼럼 기술(양성 또는 음성 선택)의 사용에 의한 일부 타입의 T 세포 농축을 필요로 한다. Rapa-T 제조에서 사용되는 미가공 세포 물질의 농축은 T 세포가 배양 간격 동안 효율적으로 농축되기 때문에 이러한 항체-기반 방법을 필요로 하지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 전반적인 수준에서 효율적인 세포 요법에 대한 권장 사항과 일치한다. Rapa-T 세포를 제조하는 초기 가공 단계는 냉동 보존 단계(적용 가능한 경우)에서 사용되는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)의 제거, 적혈구(RBC)의 용해, 및 오염된 과립구의 원심분리 제거 및 어느 정도 단핵구의 원심분리 제거에 초점을 맞춘다. 이러한 단계는 주로 폐쇄형 시스템 기술을 이용하여 비교적 자동화된 방법으로 수행된다. 이러한 절차는 인적 오류를 감소시키고, 배취 기록에 대한 상세한 제조 데이터를 제공하고, 제조 실행 전반에 걸쳐 일관성을 개선시키고, 최종 산물의 감염성 작용제 오염에 대한 위험을 감소시키기 때문에 유리하다. Rapa-T 세포 산물의 가공은 하기 단계를 도입한다: (1) 감염성 작용제 오염을 감소시키기 위해 고체-상태, 비수계 방법을 이용하여 냉동 보존된 산물을 해동하는 단계(적용 가능한 경우); (2) LOVO 침투성 막 디바이스를 이용한 세포 산물의 자동화된 세척; (3) LOVO 세척 단계 동안, 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 완충제를 사용하여 RBC의 용해를 통합하는 단계; (4) 폐쇄형 시스템, 역류, 원심 용출(CCE) 디바이스(Elutra; Terumo)에 세포의 후속 플레이팅과 함께 LOVO 방법을 이용한 세포 함량의 부피 감소; 및 (5) CCE에 의한 과립구 및 단핵구의 효율적인 제거를 위한 Elutra 디바이스의 사전-프로그래밍된 작동.
이러한 림프구 농축 및 배지 정제 후에, 세포를 산소 교환에 대한 풍부한 능력을 갖는 특수 챔버(G-Rex vessels; Wilson-Wolf)에 플레이팅할 수 있다. 향상된 가스 침투성 특징을 갖는 것 이외에, G-Rex 용기는 폐쇄형 시스템 유닛이고, 자동화된, 폐쇄형 시스템 배지 부피 감소(GatheRex Liquid Handling Pump)의 추가 장점을 갖는다. 림프구-농축 세포를 G-Rex 용기에서 6일 동안 유지시킬 수 있다.
제조된 T 세포의 기능적 속성을 갖는 G-Rex 용기에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물의 제조를 촉진하기 위해 여러 특정 배양 조건을 사용하였다. 이러한 특정 조건은 (1) 5% 인간 혈청이 추가로 보충된, 또는 일부 실시형태에서, 혈청이 첨가되지 않은, 농축된 배지의 사용(X-Vivo 20; Lonza를 포함하지만, 이로 제한되지 않음); (2) 공동-자극 전에 G-Rex에 세포 플레이팅의 16시간 휴지 간격의 도입(세포는 1.5×106개의 T 세포/㎖의 비교적 고밀도로 플레이팅됨); (3) 이러한 초기 휴지 간격 동안, 단클론성 항체 바실릭시맙(IL-2 수용체를 차단하고 이에 의해 내인성으로 생성된 IL-2에 의해 자율 T 세포 활성화를 방지함) 및 템시롤리무스(mTORC1의 약리학적 저해제임)의 첨가에 의해 세포를 최적으로 휴지시킴; (4) 이러한 16시간 휴지 간격 후에, 세포를 1:3의 입자-대-T 세포비에 의해 규정된 바와 같이(통상적으로, 대부분의 T 세포 확장 조건은 9배 더 높은 수준의 공동-자극, 3:1 입자-대-T 세포 비를 사용함), 차선 조건 하에서 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자(3/28 입자)로 공동-자극하거나 공동 자극하지 않음; (5) 중요하게, T 세포가 초기 휴지 간격 후에 세척되지 않는 것이 필요함; (6) 휴지 간격 후에, 3/28 입자의 첨가 이외에, CD4+ Th1 및 CD8+ Tc1 표현형으로의 분화를 촉진시키기 위해 고용량(10,000 IU/㎖)의 분극화 사이토카인 IFN-γ를 첨가하는 것이 필요함; (7) 중요하게, T 세포 배양에 대한 통상적인 첨가제인 IL-2의 첨가를 피하는 것이 중요함; 및 (8) 입자 및 IFN-α의 첨가 후에, 배양 6일에 수확할 때까지 세포를 그대로 두는 것이 중요함(세포 세척하지 않음, 추가 배양 첨가제 없음)을 포함한다.
제조된 T 세포의 냉동 보존. 1) G-Rex 용기에서 6일 세포 배양 후에, 배양물의 부피는 GatheRex 기기에 의해 폐쇄형 시스템 방식으로 감소될 수 있다. 후속하여, 세포를 수확할 수 있으며, 3/28 입자를 휴대용 자석에 의해 제거할 수 있으며, 세포를 배양 첨가제(템시롤리무스, 바실릭시맙, IFN-α)의 99% 초과를 제거하기 위해 세포의 연속 세척을 위해 LOVO 디바이스에 배치시킬 수 있다.
세척된 세포를 냉동 보존 배지에 재구성할 수 있으며, 이는 5% DMSO 및 5% 펜타전분을 함유한다. 냉동 보존을 50 ml 냉동 백에서 여러 번 일회용 분취량으로 수행되었다. Rapa-T 세포를 GMP-준수 제어 속도 냉동 방법에 의해 냉동 보존하고, Rapa-T 세포가 특정 방출 기준 시험을 통과한 후 인증된 냉동-이송기에 의해 액체 질소의 증기상에서 이송하였다.
Rapa-T 세포의 방출 기준 시험은 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 순도의 함량과 같은 표준 시험을 포함한다(최종 산물은 유세포 분석법에 의해 70% 초과의 CD3+ T 세포 함량일 수 있으며, CD4+ 및 CD8+ 서브세트는 각각 5% 수준으로 존재할 수 있음). 세포는 유세포 분석법 아넥신 및 7-AAD 검정에 의해 측정한 경우 70% 초과의 생존 가능할 수 있다. 또한, 세포는 최소 7-일 배양 간격(이상적으로, 14일 배양 간격)에 박테리아 및 진균 오염이 없어야 하며, 또한, 세포 산물은 박테리아 LPS 내독소에 대해 검출 한계 미만이어야 한다.
이러한 표준 시험 이외에, 특수 기능 시험은 Rapa-T 세포 산물에 대한 방출 기준을 구성할 것이다. 산물 방출 및 세포 요법 전에, Rapa-T 세포는 배양물 투입 T 세포와 관련하여 하기 속성을 지닐 수 있다: (1) CD62 리간드 및 CCR7의 유세포측정 동시-발현 증가에 의해 규정된 바와 같은 향상된 T 중심 기억 표현형; (2) 예정사-1(PD1)과 같은 관문 저해 분자의 낮은 수준 발현; (3) 최대 공동-자극 시에 감소된 Th1/Tc1-타입 사이토카인 분비 수준에 의해 규정된 바와 같은 휴지 상태; (4) 유세포 분석법 MitoTracker 검정에 의해 미토콘드리아 질량 감소에 의해 입증된 바와 같은 자가 포식 특징; (5) mTORC1 및 mTORC2 다운스트림 표적의 적어도 50% 저해에 의해 입증된 바와 같은, 내성 표현형; 및 (6) n=80 주요 전사 인자 및 분화 분자의 다면 차등 유전자 발현 프로파일.
실시예 2
정상 상태 성분 채집술을 수행하여 PBMC를 함유한 환자 샘플을 수득하였다. 샘플에서 림프구를 GE에 의한 Sepax® 기기에서 자동화된 Ficoll 절차를 이용하여 바람직하지 않은 오염 호중구 집단의 95% 초과의 제거까지 농축하였다. 이후에, 림프구-농축 세포 집단을 G-REX 배양 용기에서 하기 표 1에 명시된 배양 배지 중 초기 세포 밀도 및 혈청 보충 조건에서 플레이팅하고, 배양물 중에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 조건 1은 사전-배양 대조군(Sepax® 자동화 Ficoll 후 농축된 림프구)을 나타낸다. 배양을 또한, 표 1에 명시된 용량으로 템시롤리무스, 시롤리무스 및/또는 항-IL2 수용체 단클론성 항체 바실릭시맙을 첨가함으로써 가변적 저해제 조건으로 개시하였다. 바실릭시맙을 조건 2 내지 5에 대해 10 ㎍/㎖로 첨가하였고, 조건 6 내지 8에 대해 20 ㎍/㎖로 첨가하였다. 일부 배양 조건은 0.88:1(조건 2 내지 3 및 5 내지 6) 또는 3:1(조건 8 내지 9)의 입자:T 세포 비로 Dynal® 3/28 입자를 사용하여 항-CD3, 항-CD28 공동-자극을 수용하였다. 사이토카인을 명시된 시간에 첨가하였으며, 이는 IFN-α 단독(10,000 IU/㎖) 또는 IL-2(20 IU/㎖)와 조합한 IFN-α(10,000 IU/㎖)로 이루어졌다. 사이토카인 첨가는 배양 개시 시에(조건 8 내지 9) 또는 배양 개시 후 1일에(조건 2 내지 7) 수행하였다. 배양물 3 내지 4 및 6 내지 7은 명시된 최종 세포 밀도로 이를 희석하기 위해 배양 개시 2일 후에 추가 배지를 수용하였다.
Figure pct00001
조건 9는 T-Rapa 제품을 나타낸다. 조건 7은 표 1에서 시험된 것의 최적의 RAPA-T 조건을 제공하였다는 것이 확인되었다. 이러한 조건은 여러 주요 속성을 갖는다: (1) 무혈청 배지; (2) 매우 높은 초기 세포 밀도(30 M/㎖); (3) 매우 높은 템시롤리무스 농도(4.5μM); (4) 항-IL2 수용체 단클론성 항체의 존재; (5) 공동-자극의 부재; (6) 배양 개시 1일 후 IFN-α만이 첨가된(IL-2 첨가되지 않음) 사이토카인 지원; 및 (7) 배양 2일에 세포 희석.
배양 6일 후에, 얻어진 T 세포를 수확하고, 유세포 분석법에 의해 도 25a 내지 25o에 도시된 바와 같은 CD4+(검정색 칼럼으로 지시됨) 및 CD8+(회색 칼럼으로 지시됨) T 세포 서브세트 내의 특정 분자 발현에 대해 평가하였다.
도 25a(CD45RA+)는 배양물 투입 세포에 비해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다 상에서 천연 T 세포 마커 발현을 유지하는 것과 관련하여 RAPA-T 배양 조건의 중요성을 나타내며, 대조적으로, 종래 T-RAPA 조건은 CD45RA+ 세포의 현저한 감소를 초래하였다.
도 25b(CD25+)는 배양물 투입 세포에 비해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다 상에서 T 세포 정지를 유지하는 것과 관련하여 RAPA-T 배양 조건의 중요성을 나타내며, 대조적으로, 종래 T-RAPA 조건은 증가된 CD25 발현에 의해 지시되는 바와 같이, 현저하게 활성화된 T 세포 상태를 초래하였다.
도 25c(CD28+) 및 도 25d(ICOS+)는 RAPA-T 및 T-RaPA 세포 산물이 이러한 활성화 공동-자극 분자의 유사한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 발현을 가짐을 나타낸다.
도 25e 및 25f(각각 CD39+ 및 CD73+)는 RAPA-T 배양 조건이 T-RAPA 조건에 비해 이러한 엑토-뉴클레오티다아제 분자의 감소된 발현을 초래함을 나타낸다. 이러한 분자는 ATP를 아데노신으로 대사함으로써 면역 억제 효과를 발휘한다. 이에 따라, RAPA-T 세포 산물은 치료적 사용 측면에서 T-RAPA 세포 산물에 비해 유리할 것으로 예상된다.
도 25g 내지 도 25o에서 나머지 데이터는 신규한 Rapa-T 방법이 면역 노화(KLRG1)와 관련된, 면역 억제 조절 T 세포 표현형(GITR)과 관련된, 또는 관문 저해 기능(LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, TIGIT, 및 TIM3) 분자의 발현을 크게 감소시킴을 나타낸다. RAPA-T 세포 산물에 연결된 각 가변 배양 조건은 T-RAPA 세포 산물에 비해 이러한 분자 각각에서 크게 감소되었다. 조건 7은 시험된 조건의 이러한 분자에서 가장 크고 일관된 감소를 나타낸다.
실시예 3
T 세포를 실시예 2에서와 같이 제조하였으며, 배양 조건 1 내지 8은 실시예 2의 배양 조건 2 내지 9에 해당하는 것이다. 2일의 배양 간격에, 얻어진 T 세포를 수확하고, mTORC1, mTORC2, 및 STAT 경로와 관련된 분자에 대한 웨스턴 블롯 분석(제조사의 설명서에 따른 방법; BioTechne Mr. Wes 기기)에 의해 평가하였다.
최적의 Th1/Tc1-타입 제조를 위해, 조절 T 세포 표현형을 유도할 수 있는 STAT5의 활성화(포스포릴화)를 제한하는 것이 중요하다. 도 26에 도시된 바와 같이, Rapa-T 세포 배양 조건(조건 1 내지 6) 각각에는 상대적으로 포스포릴화된 STAT5가 없었다. 대조적으로, T-Rapa 조건은 포스포릴화된 STAT5의 유의미한 존재를 나타내었다(조건 7 및 8). T-Rapa 세포에 비해 Rapa-T 세포의 STAT5 포스포릴화의 감소는 75%를 초과할 수 있다.
최적의 Th1/Tc1-타입 제조를 위해, STAT1을 포함하는 타입 I 분화를 유도하는 특정 STAT 분자를 통해 신호전달을 활성화하는 것이 중요하다. 도 26에 도시된 바와 같이, Rapa-T 배양 조건 각각은, 조건 6(실시예 2, 조건 7)에서 다소 감소하였음에도 불구하고, STAT1 포스포릴화의 검출 가능한 수준을 나타내었다. 그러나, 총 STAT1의 수준은 또한 조건 6에서 감소되었다.
Rapa-T 세포의 최적 표현형은 또한, mTORC1 경로와 관련된 분자의 감소를 특징으로 할 수 있다. Rapa-T 조건 6(실시예 2, 조건 7에 해당함)에는 mTORC1-관련 분자, p70S6K의 발현이 본질적으로 없다. 다른 Rapa-T 배양 조건(조건 1, 2, 4 및 5)에서 공동-자극의 제공은 p70S6K 발현을 증가시켰다. 이에 따라, Rapa-T 제조 공정 동안에, 공동-자극을 피하는 것이 유익할 수 있다.
Th1/Tc1-타입 RAPA-T 세포 제조의 최적 표현형은 또한, mTORC2 신호전달 경로의 보존에 따라 달라질 수 있다. 이와 관련하여, 최적의 RAPA-T 세포 조건(조건 6, 실시예 2, 조건 7에 해당함)이 mTORC2-관련 분자 총 SGK1 및 포스포릴화된 SGK1의 발현을 보존한다는 것이 유익하다. mTORC2의 상대적 보존과 함께 mTORC1의 현저한 감소와 관련한 최적의 RAPA-T 세포 산물의 이러한 특징은 조건 6, 즉, mTORC1-관련 서브유닛 분자 Raptor의 현저한 감소 및 mTORC2-관련 서브유닛 분자 Raptor의 상대적 보존에 의해 추가로 예시된다.
실시예 4
PBMC를 함유한 환자 샘플을 얻기 위해 정상 상태 성분 채집술을 수행하였다. 샘플의 림프구를 GE에 의한 Sepax® 기기에서 자동화된 Ficoll 절차를 이용하여 농축하였다. 림프구-농축된 세포 집단을 이후에, 2가지 조건 하에서 G-REX 배양 용기에 배치시켰으며, 하나의 조건은 표 1의 조건 7에 해당하는 것이며, 하나는 표 1의 조건 9에 해당하는 것이며(T-RAPA), 이를 실시예 2에서와 같이 6일 동안 배양물 중에서 인큐베이션하였다. 6일의 배양 후에, T 세포를 수확하고, 24시간 상청액의 생성을 위해 1×106개의 세포/㎖의 농도로 재플레이팅하였다. 재플레이팅 시에, T 세포를 3:1, 1:1, 1:3 또는 1:9의 입자:T 세포 비로 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로 공동-자극하였다. 이러한 비율 각각에서, 24시간 상청액 생성을 사이토카인의 미첨가("-" 기호로 지시됨), rhuIL-2의 첨가(100 IU/㎖, "+IL-2"로 지시됨), rhuIL-7의 첨가(10 ng/㎖, "+IL-7"로 지시됨), rhuIL-15의 첨가(10 ng/㎖, "+IL-15"로 지시됨), 또는 rhuIL-7(10 ng/㎖)과 rhuIL-15(10 ng/㎖) 둘 다의 첨가("+IL-7+IL-15"로 지시됨)와 함께 수행하였다. IL-2 및 TNF-α 분비를 제조사 설명서(Luminex)에 따른 공지된 방법에 의해 세포에서 측정하였다. 결과는 도 27a 및 도 27b에 도시되어 있다.
고유, 중심-기억, 또는 줄기 중심 기억 서브세트와 같은 초기 분화 상태의 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 입양 전달에 유익할 수 있다. 이러한 초기 분화 T 세포는 주요 항상성 사이토카인, IL-7 및 IL-15에 대한 이의 차등 반응을 부분적으로 기능적으로 특징으로 하였다. 이와 같이, 제공된 T 세포 산물이 IL-7 및 IL-15에 반응하는 능력은 원하는 특징이다.
도 27a는 최적의 RAPA-T 세포 산물의 IL-2 분비 프로파일을 도시한 것이며, 하단 패널은 T-RAPA 세포 산물의 IL-2 분비 프로파일을 도시한 것이다. 최대 공동-자극 접종에서 및 외인성 사이토카인 지원 없이, RAPA-T 세포 산물은 T-RAPA 세포 산물에 비해 대략 5배 더 많은 양의 IL-2를 분비하였다. 놀랍게도, 매우 낮은 수준의 공동-자극(1:9 입자:T 세포 비)에서도, RAPA-T 세포 산물은 상당한 IL-2를 분비한다. 매우 대조적으로, T-RAPA 조건에서 이러한 자극 조건은 검출할 수 없는 수준의 IL-2를 생성하였다. IL-2 분비 능력은 유익한 헬퍼-독립 T 세포 표현형과 관련이 있으며, 이는 분화 초기 상태에서 T 세포에서 관찰되는 사이토카인 분비 특징이다. 최종적으로, T-RAPA 조건이 아니고 RAPA-T 조건에서, IL-7 또는 IL-15의 첨가는 IL-2 분비 능력을 더욱 증가시켰다. 이와 같이, RAPA-T 세포는 항상성 사이토카인 IL-7 및 IL-15에 고유하게 반응성이다.
도 27b는 최적의 RAPA-T 세포 산물의 TNF-α 분비 프로파일을 도시한 것이며, 하단 패널은 이전 T-RAPA 세포 산물의 TNF-α 분비 프로파일을 도시한 것이다. 최대 공동-자극 접종에서 및 외인성 사이토카인 지원 없이, RAPA-T 세포 산물은 T-RAPA 세포 산물에 비해 대략 균등한 TNF-α를 분비하였다. 그러나, 공동-자극을 위한 IL-7 또는 IL-15의 첨가는 T-RAPA 조건에 비해 RAPA-T 조건에서 TNF-α를 분리하는 더 높은 능력을 야기시켰다. 이와 같이, RAPA-T 세포는 Th1/Tc1 이펙터 사이토카인 TNF-α의 분비를 유도하는 측면에서 항상성 사이토카인 IL-7 및 IL-15에 고유하게 반응한다.
실시예 5
인간 T 세포를 어떠한 저해제 없이 공동-자극하였다('통상적인": 항-CD23/항-CD28 입자의 첨가; 3:1 입자:T 세포 비). 대안적으로, T 세포를 RAPA-T 세포 조건("라파마이신-처리")에 따라 공동-자극하였으며, 공동-자극은 항-CD3/항-CD28 입자("Dynabeads"; 1:3 입자:T 세포 비)에 의해 또는 Cloudz® 용해 가능한 공동-자극 마이크로-입자(Biot-Techne; 20%의 제조사의 권장 용량의 Cloudz®의 사용; 1×106개의 세포당 50㎕의 Cloudz® 스톡)에 의해 제공되었다. 6일 배양 후에, T 세포를 수확하고, 1×106개의 세포/㎖로 조정하고, 항-CD3/항-CD28 입자(3:1 입자:T 세포 비)를 사용하여 공동-자극하였다. 24-시간 상청액을 이후에 수집하고, Luminex 검정에 의해 IL-2, TNF-α 및 IL-13의 함량에 대해 시험하였다(결과는 24시간당 1×106개의 세포당 g/㎖로서 나타냄). 동일한 프로토콜을 사용하여, 6일 배양 후 세포를 수확하고, CD4, CD8, CD25 및 CTLA4를 포함하는 세포 표면 마커의 발현에 대해 유세포 분석법으로 평가하였다.
도 28은 IL-2, TNF-α 및 IL-13 분비 데이터를 도시한 것이다. 도 28에 도시된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28 나노입자("Dynabeads")와 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자(Cloudz® 시약; Bio-Techne)에 의해 공동-자극된 RAPA-T 세포 간의 결과는 유사하였다. 이러한 세포는, 이전에 기술된 바와 같이, Th2-타입 사이토카인 IL-13의 최소 분비와 함께 IL-2 및 TNF-α의 상당한 분비에 의해 입증된 바와 같이, Th1-타입 사이토카인 프로파일을 지닌다.
도 29는 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 세포 표면 마커, 즉, CD4, CD8, CD25 및 CTLA4를 발현시키는 세포의 빈도를 도시한 것이다. 도 29에 도시된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28 나노입자("Dynabeads")와 용해 가능한 항-CD3/항-CD28 미세입자(Cloudz® 시약; Bio-Techne)에 의해 공동-자극된 RAPA-T 세포 간의 결과는 유사하였다. 이러한 세포는 이전에 기술된 바와 같이, 정지 상태이고(CD25의 감소된 발현에 의해 명시된 바와 같음), 관문 저해 수용체의 감소된 발현(CTLA4의 감소된 발현에 의해 명시된 바와 같음)을 갖는다.
실시예 6: Rapa-T 세포 요법의 3상 무작위화 임상 시험 도 30은 무작위화 3상 프로토콜 도식을 도시한 것이다. 도 30의 상단 패널에서, Rapa-T 치료법에 대해 무작위화된 환자에 대해, Rapa-T 세포 제조를 위한 자가 세포를 무작위화 후 수집된 정상 상태 성분 채집술로부터 유도하였다. 면역 고갈 요법은 펜토스타틴 및 저용량, 용량-조정된 사이클로포스파마이드(PC 요법)를 포함하였다. 제1 PC 사이클을 T1.Rapa 제조 간격 동안 연구 시작 시에 단독으로(T 세포 요법 없이) 투여할 것이고, 기간은 28일일 것이다. 4회의 T1.Rapa 세포 주입 각각 이전에 PC 사이클 2, 3, 4 및 5를 투여할 것이며, 기간은 35일일 것이다. 도 30의 하단 패널은 안정한 질환에 대한 확장된 T1.Rapa 세포 요법을 도시한 것이다. 사이클 4 후 안정한 질환을 갖는 T1.Rapa 세포 수용자의 경우에, T1.Rapa 세포의 추가 로트를 제조하여 T1.Rapa 세포 요법의 최대 4회의 추가 사이클(사이클 6 내지 9)을 허용할 것이다.
도 30은 제조된 T 세포 코호트로 무작위화된 모든 환자에게 투여되는 제조된 T 세포 요법을 상세히 설명한 것이다. 이러한 요법은 (1) 이전에 수확된 말초 혈액 줄기 세포 이식 절차 또는 새로운, 정상 상태 성분 채집술 절차로부터 수득되는, 제조된 T 세포 제조를 위한 기질로서 사용되는 면역 세포의 수집; (2) 단핵 세포 집단의 농축 및 제조된 T 세포 배양 조건 하에서의 단핵 세포의 후속 인큐베이션; (3) 식별 및 기능에 대한 검증을 거치는, 일회용 제조된 T 세포 치료제의 냉동 보존; (4) 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드 약물 요법(PC 요법)으로의 환자 치료는 제조된 T 세포 요법을 위해 환자를 준비시키고 항-종양 효과를 바로 촉진시키기 위해 초기에 단독으로 및 후속하여 제조된 T 세포 요법과 조합하여 적용됨; 및 (5) 치료 동안 및 치료 후 특수 면역 모니터링을 포함할 것이다.
면역 고갈 요법은 펜토스타틴 및 저용량, 용량-조정된 사이클로포스파마이드(PC 요법)를 포함할 것이다. 제1 PC 사이클을 제조된 T 세포 제조의 간격 동안 연구 시작 시에 단독으로(T 세포 요법 없이) 투여할 것이고, 혈구 계수 회복을 허용하기 위해 기간은 최대 28일일 것이다. 4회의 T 세포 주입 각각 이전에 PC 사이클 2, 3, 4 및 5를 투여할 것이며, 혈구 계수 회복을 허용하기 위해 기간은 35일일 것이다. 제조된 T 세포 요법의 사이클 5의 완료 후 유지 요법이 유지되지 않을 것이다. 치료 사이클은 임상 상황에 따라, 명시된 간격보다 더 길 수 있고, 무한한 간격으로 확장할 수 있다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 환자가 관해 상태인 경우에, 질환이 재발할 때까지 사이클이 지연될 수 있다. 또한, PC 요법 및 입양 제조된 T 세포 요법의 추가 유지 사이클은 가능하게, 1년에 1 내지 4회 치료 사이클을 투여함으로써 관해 상태로 환자를 유지하기 위해 또는 재발된 경우에, 질환 재발을 치료하도록 구상된다.
도 30에 명시된 바와 같이, 4 사이클의 치료 후 안정한 질환을 갖는 환자에 대해, Rapa-T 세포의 추가 제조를 수행하여, 최대 총9회의 Rapa-T 세포 요법 사이클까지의 추가 사이클과 함께 잠재적인 치료를 용이하게 할 수 있다.
도 31은 PC 화학치료 요법의 특성을 상세히 설명한 것이다. PC 요법의 각 사이클은 15일 사이클에 T1.Rapa 세포 주입 직전에 14일 과정으로 이루어질 것이다(T1.Rapa 용량: 0.1 내지 5×106개의 세포/㎏). 사이클 1에 대하여, 펜토스타틴(P)을 1, 4, 8, 및 11일에 4 ㎎/㎡의 용량으로 투여할 것이다(i.v.). 사이클로포스파마이드(Cy)를 1일 내지 5일 및 8일 내지 12일에 하루에 200㎎의 용량으로 투여할 것이다. 후속 사이클에 대하여, 펜토스타틴을 2 ㎎/㎡의 용량까지 감소시킬 것이다.
도 32a 내지 32c는 대조군의 특성을 상세히 설명한 것이다. 즉, Rapa-T 세포 요법에 무작위화되지 않은 대상체는 2차 또는 3차 재발된 MM을 갖는 대상체에게 적합한 3개의 FDA-승인 삼중 요법 중 하나, 즉, DPd 요법(도 32a); DRd 요법(도 32b); 또는 KRd 요법(도 32c) 중 하나를 수용할 것이다.
도 32a 내지 32c에 도시된 대조 코호트에 대하여, 후속하여 다발성 골수종(MM)의 2차 또는 3차 재발 시에 환자를 등록하고, 후속하여 무작위화하였다. 환자는 이러한 환자 집단을 치료하기 위해 3가지의 FDA-승인 요법 중 하나를 수용하는 후보자어야 한다. 대조 코호트로 무작위화된 환자는 공개된 표준 요법을 이용하여 DPd, DRd, 또는 KRd 요법을 수용할 것이다. 이러한 표준 요법의 특정 양태는 [도 32a] DPd 요법; [도 32b] DRd 요법; 및 [도 32c] KRd 요법에서 상기에 명시되어 있다.
제조된 T 세포 효능의 통계적 평가. 1차 목표는 표준 치료 요법에 무작위화된 수용체와 비교하여 제조된 T 세포 요법의 수용자의 무진행 생존을 비교하는 것이다. 비교하면, 2차 목표는 기술 통계를 이용하여 예비 방식으로 평가될 것이다. 2차 또는 3차 재발된 MM을 갖는 적격 환자는 DPd, DRd, 또는 KRd으로 이루어진 FDA-승인 삼중 요법을 이용한 표준 치료 요법 또는 생체외 제조된 자가, 라파마이신-내성 Th1/Tc1 세포(제조된 T 세포)로의 입양 T 세포 요법을 수용하기 위해 1:1 방식으로 무작위화될 것이다. N=65 평가 가능한 환자를 각 코호트에 포함시킬 것이다. 1차 연구 목표는 제조된 T 세포 코호트에서 치료된 환자가 표준 치료 코호트에서 치료된 환자에 비해 증가된 무진행-생존(PFS)을 갖는 지의 여부를 결정하는 것이다.
환자의 무진행 생존(PFS) 및 전체 생존을 두 군 모두에서 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 이용하여 추정하고, 점적 95% 신뢰 구간으로 나타내었다. 카플란-마이어 추정치를 역전시킴으로써 평균 생존 및 이의 95% 신뢰 구간의 비-파라미터 추정치를 얻을 것이다. 1차 효능 결과(PFS)를 이방 로그-순위 시험에 의해 시험하였다. 연구에서 130개의 PFS 사건이 발생하거나 모집 목표에 도달하고 모든 환자가 적어도 12개월 동안 추적되었을 때 최종 분석을 수행하였다. 전체 생존(OS)을 치료 시작부터 측정하였다. 어떠한 원인으로의 사망도 사건일 것이며, 환자를 마지막 접촉일에 검열하였다.
2차 종점은 평균, 표준 편차, 신뢰 구간, 카플란-마이어 분석, 또는 다발성 골수종 관해 상태를 특징분석하는 다른 방법과 같은 설명 방식으로 평가하는 것이다. 객관적 반응률(objective response rate: ORR) 및 최소 잔존 질환율(minimum residual disease rate: MRD)을 상응하는 결과와 함께 관찰된 환자의 비율로서 추정하였고, 95% 신뢰 구간으로 나타내었다.
인구통계 및 기준 데이터를 설명 방식으로 요약하였다. 카테고리 데이터를 빈도 및 백분율로서 나타내었으며, 연속 데이터를 평균, 중간값, 및 표준 편차와 같은 요약 통계를 이용하여 나타내었다. 다발성 골수종에 대한 종래 치료법의 결정 및 사용되는 개별 작용제에 대한 불응도에 특히 초점을 맞출 것이다.
전체적으로 28 및 55개의 PFS 사건이 발생했을 때(두 군의 조합) 무익성에 대한 잠재적인 중지와 함께 2개의 중간 분석을 수행하였다. 2차 오류-분배 함수를 갖는 베타 오류-분배 방법을 사용하였으며, 이는 O'Brien-Fleming와 Pocock 경계 간에 절충안이다. 하기 표는 2개의 중간 및 1개의 최종 분석에 대한 귀무 가설 허용 경계를 나타낸 것이다. 이러한 값은 중간 분석의 타이밍이 변경되는 경우에, 오류-분배 함수를 이용하여 변형될 것이다.
Figure pct00002
실제 효과 크기의 함수로서 무익함으로 인해 시험을 조기에 중단할 확률은 하기 표에 나타나 있다:
Figure pct00003
제조된 T 세포 제조를 위한 기질로서 사용되는 면역 세포의 수집
제조된 T 세포 제조를 위한 세포의 수집 및 이송은 제조된 T 세포 요법 코호트에 무작위화된 환자에 대해 요구될 것이다.
또한, 대상체가 절대 림프구 수(ALC; 마이크로리터당 적어도 300개 림프구의 값)에 의해 규정된 바와 같이 혈류에서 면역 세포에 대한 필요한 값을 갖는 경우에, 정상 상태 성분 채집술을 수행하고, 10- 내지 15-리터 수집으로 이루어질 것이다. 성분 채집술은 연구 시작 10일 이내에 수행되어야 한다. 성분 채집술 산물을 Rapa Therapeutics로 바로 이송할 것이다(냉동 보존 없이).
PC 요법의 제1 사이클은 연구 개시 후 10일 이내에 개시되어야 한다.
제조된 T 세포 요법의 후속 반복은 더욱 효율적이 될 수 있으며, 이와 같이, 더 적은 수의 투입 세포는 제조를 개시하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 개선된 방법은 적어도 부분적으로 개선된 숙주 제조 및 개선된 제조 공정을 포함할 것이다. 이러한 방법에서, 500㎖ 이하의 간단한 채혈로 얻은 출발 물질로 T 세포를 제조하는 것이 가능할 것이다.
제조된 T 세포 제조
이전에 수집된 세포 산물의 경우에, 이러한 냉동 보존된 세포를 세포의 해동 및 제조된 T 세포의 제조까지 액체 질소의 기상에서 저장하였다. 성분 채집술에 의한 또는 향후에 간단한 혈구 계수집에 의한 새로이 단리된 세포의 경우에, 세포를 바로 처리하고, 이후에 배양물에 직접적으로 배치시킬 수 있거나, 제어된 속도 냉동 기술에 의해 냉동 보존하고 이후 후속 사용을 위해 액체 질소의 기상에서 저장할 수 있다.
새로이 단리된 세포 집단으로부터 냉동 보존된 세포 기질로부터의 T 세포 배양은 일부 타입의 T 세포 농축을 필요로 한다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, T 세포 농축은 단클론성 항체 및 칼럼 기술(양성 또는 음성 선택)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 제조된 T 세포 제조에서 사용되는 미가공 세포 물질의 농축은 T 세포가 배양 간격 동안 효율적으로 농축되기 때문에 이러한 항체-기반 방법을 필요로 하지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 전반적인 수준에서 효율적인 세포 요법에 대한 권장 사항과 일치한다. 제조된 T 세포를 제조하는 초기 가공 단계는 냉동 보존 단계(적용 가능한 경우)에서 사용되는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)의 제거, 적혈구(RBC)의 용해, 및 오염된 과립구의 원심분리 제거 및 어느 정도 단핵구의 원심분리 제거에 초점을 맞춘다. 이러한 단계는 주로 폐쇄형 시스템 기술을 이용하여 비교적 자동화된 방법으로 수행된다. 이러한 절차는 인적 오류를 감소시키고, 배취 기록에 대한 상세한 제조 데이터를 제공하고, 제조 실행 전반에 걸쳐 일관성을 개선시키고, 최종 산물의 감염성 작용제 오염에 대한 위험을 감소시키기 때문에 유리하다. 제조된 T 세포 산물의 가공은 하기 단계를 도입한다: (1) 문헌[Triana E, Ortega S, Azqueta C, et al. Thawing of cryopreserved hematopoietic progenitor cells from apheresis will be with using a new dry-warming device. Transfusion. 2013;53(1):85-90]에 기술된 바와 같이, 감염성 작용제 오염을 감소시키기 위해 고체-상태, 비수계 방법을 이용하여 냉동 보존된 산물을 해동하는 단계(적용 가능한 경우); (2) 문헌[Mfarrej B, Bouchet G, Couquiaud J, et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 2017;19(12):1501-1508]에 기술된 바와 같이 LOVO 투과성 막 디바이스를 이용하여 세포 산물을 자동적으로 세척하는 단계; (3) LOVO 세척 단계 동안, 문헌[Brown WE, Hu JC, Athanasiou KA. Ammonium-Chloride-Potassium Lysing Buffer Treatment of Fully Differentiated Cells Increases Cell Purity and Resulting Neotissue Functional Properties. Tissue engineering Part C, Methods. 2016;22(9):895-903]에 기술된 바와 같이, 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 완충제를 사용하여 RBC의 용해를 통합하는 단계; (4) 문헌[Stroncek DF, Fellowes V, Pham C, et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. J Transl Med. 2014;12:241.(doi):10.1186/s12967-12014-10241-y]에 기술된 바와 같이, 폐쇄형 시스템, 역류, 원심 용출(CCE) 디바이스(Elutra; Terumo)에 세포의 후속 플레이팅과 함께 LOVO 방법을 이용한 세포 함량의 부피 감소; 및 (5) CCE에 의한 과립구 및 단핵구의 효율적인 제거를 위한 Elutra 디바이스의 사전-프로그래밍된 작동.
이러한 림프구 농축 및 배지 정제 후에, 세포를 문헌[Bajgain P, Mucharla R, Wilson J, et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 2014;1:14015]에 기술된 산소 교환을 위한 강화된 용량을 갖는 특수 챔버(G-Rex 용기; Wilson-Wolf)에 플레이팅하였다. 향상된 가스 투과성 특징을 갖는 것 이외에, G-Rex 용기는 폐쇄형 시스템 유닛이고, 자동화된 폐쇄형 시스템 매질 부피 감소의 추가 장점을 갖는다(GatheRex Liquid Handling Pump). 림프구-농축 세포를 6일 동안 G-Rex 용기에서 유지시켰다.
제조된 T 세포의 기능적 속성을 갖는 G-Rex 용기에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물의 제조를 촉진하기 위해 여러 특정 배양 조건을 사용하였다. 이러한 특정 조건은 (1) 5% 인간 혈청이 추가로 보충된, 농축된 배지의 사용(X-Vivo 20; Lonza를 포함하지만, 이로 제한되지 않음, 매개물에는 또한 5% AB 혈청이 보충될 수 있음)(Zhang HD, Song ZL, Li WP. [무혈청 배지로 수지상 세포의 시험관내 배양]. Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi. 2006;14(5):985-989; Lonza); (2) 공동-자극 전에 G-Rex에 세포 플레이팅의 16시간 휴지 간격의 도입(세포는 1.5×106개의 T 세포/㎖의 비교적 고밀도로 플레이팅됨); (3) 이러한 초기 휴지 간격 동안, 단클론성 항체 바실릭시맙(IL-2 수용체를 차단하고 이에 의해 내인성으로 생성된 IL-2에 의해 자율 T 세포 활성화를 방지함) 및 템시롤리무스(mTORC1의 약리학적 저해제임)의 첨가에 의해 세포를 최적으로 휴지시킴; (4) 이러한 16시간 휴지 간격 후에, 세포를 1:3의 입자-대-T 세포비에 의해 규정된 바와 같이(통상적으로, 대부분의 T 세포 확장 조건은 9배 더 높은 수준의 공동-자극, 3:1 입자-대-T 세포 비를 사용함), 차선 조건 하에서 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자(3/28 입자)로 공동-자극하거나 공동 자극하지 않음; (5) 중요하게, T 세포가 초기 휴지 간격 후에 세척되지 않는 것이 필요함; (6) 휴지 간격 후에, 3/28 입자의 첨가 이외에, CD4+ Th1 및 CD8+ Tc1 표현형으로의 분화를 촉진시키기 위해 고용량(10,000 IU/㎖)의 분극화 사이토카인 IFN-γ를 첨가하는 것이 필요함; (7) 중요하게, T 세포 배양에 대한 통상적인 첨가제인 IL-2의 첨가를 피하는 것이 중요함; 및 (8) 입자 및 IFN-γ의 첨가 후에, 배양 6일에 수확할 때까지 세포를 그대로 두는 것이 중요함(세포 세척하지 않음, 추가 배양 첨가제 없음)을 포함한다.
제조된 T 세포 제품의 냉동 보존 및 식별 및 기능의 검증
G-Rex 용기에서 6일 세포 배양 후에, 배양물의 부피는 GatheRex 기기에 의해 폐쇄 시스템 방식으로 감소될 것이다. 후속하여, 세포를 수확하고, 3/28 입자를 휴대용 자석에 의해 제거하고, 세포를 세포의 연속 세척을 위해 LOVO 디바이스에 배치시켜 99% 초과의 배양 첨가제(템시롤리무스, 바실릭시맙, IFN-γ)를 제거하였다.
세척된 세포를 5% DMSO 및 5% 펜타전분을 함유한 냉동 보존 배지에 재구성하였다. 냉동 보존을 50㎖ 냉동 백에 여러 번의 일회용 분취량으로 수행하였다. 제조된 T 세포 용량은 수용자 체중 1kg당 0.1 내지 5×106개의 T 세포일 것이다. 4개의 일회용 분취량을 냉동 보존하여 제조된 T 세포의 대략 매달 4회 연속으로 주입하였다. 제조된 T 세포를 이전에 문헌[Hunt CJ. Cryopreservation of Human Stem Cells for Clinical Application: A Review. Transfusion medicine and hemotherapy: offizielles Organ der Deutschen Gesellschaft fur Transfusionsmedizin und Immunhamatologie. 2011;38(2):107-123]에 기술된 바와 같이, GMP-준수 제어 속도 냉동 방법에 의해 냉동 보존하였으며, 세포를, 제조된 T 세포가 특정된 방출 기준 시험을 통과한 후 인증된 냉동-이송기에 의해 액체 질소의 증기상에서 이송하였다.
제조된 T 세포의 방출 기준 시험은 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 순도의 함량과 같은 표준 시험을 포함한다(최종 생성물은 유세포 분석법에 의해 70% 초과의 CD3+ T 세포 함량이어야 하며, CD4+ 및 CD8+ 서브세트 각각은 5% 수준으로 존재해야 함). 세포는 유세포 분석법 아넥신 및 7-AAD 검정에 의해 측정한 경우 70% 초과 생존 가능해야 한다. 또한, 세포에는 최소 3일 배양 간격(이상적으로, 14일 배양 간격)에서 박테리아 및 진균 오염이 없어야 한다. 또한, 세포 산물은 박테리아 LPS 내독소 및 마이크플라스마에 대한 검출 한계 미만이어야 한다.
이러한 표준 시험 이외에, 특수 기능 시험은 제조된 T 세포 산물에 대한 방출 기준을 구성할 것이다. 산물의 세포 요법의 방출 이전에, 제조된 T 세포는 배양물 투입 T 세포와 관련하이 하기 속성을 지닐 수 있다: (1) CD62 리간드 및 CCR7의 증가된 유세포 측정 동시-발현에 의해 규정된 바와 같은, 향상된 T 중심 기억 표현형; (2) 예정사-1(PD1)과 같은 관문 저해 분자의 낮은 수준 발현; (3) 최대 공동-자극 시에 Th1/Tc1-타입 사이토카인 분비의 감소된 수준으로 규정된 바와 같은, 휴지 상태; (4) 유세포 분석법 MitoTracker 검정에 의해 감소된 미토콘드리아 질량에 의해 입증된 바와 같은 자가 포식 특징[Xiao B, Deng X, Zhou W, Tan EK. Flow Cytometry-Based Assessment of Mitophagy Using MitoTracker. Frontiers in cellular neuroscience. 2016;10:76]; (5) mTORC1 및 mTORC2 다운스트림 표적의 적어도 50% 저해에 의해 입증된 바와 같은, 내성 표현형; 및 (6) n=80 주요 전사 인자 및 분화 분자의 다면적 차등 유전자 발현 프로파일.
PC 요법을 사용한 숙주 제조
제조된 T 세포 치료를 받은 환자는 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드(PC) 요법을 받는다. PC 요법의 사이클 1을 제조된 T 세포 제조 간격 동안 투여하고, 이에 따라, T 세포 주입을 동반하지 않고 투여하였다. 사이클 1은 2가지 수준에서 유리하다: 첫째, 이는 숙주 조절 T 세포 및 말기 노화 이펙터 T 세포의 수 및 기능을 감소시켜, 제조된 T 세포 요법의 향후 사이클을 강화시킨다. 둘째, 이는 다발성 골수종에 대한 항-종양 효과를 직접적으로 매개하여, 제조 간격 동안 질환을 조절할 것이다. 사이클 #1 후에, PC 요법의 후속 사이클 이후에, 2주 PC 요법 간격(15일) 다음 날에 제조된 T 세포의 입양 전달이 이어질 것이다. PC 요법의 이러한 사이클은, 이러한 것이 입양 전달 후 개선된 제조된 T 세포 확장을 허용하는 IL-7 및 IL-15와 같은 T 세포 항상성 사이토카인을 증가시키는 것을 포함하여, 숙주 생물학을 추가로 조절하기 때문에, 추가적으로 유리하다.
PC 요법 이후에 제조된 T 세포 주입이 이어진다. PC 요법의 각 사이클은 사이클의 15일에 제조된 T 세포 주입 직전에 14일 과정으로 이루어질 것이다. 제조된 T 세포 용량은 1 내지 5×106개의 세포/㎏이며, 1×105 내지 5×106개의 세포/㎏의 T 세포 용량을 포함한다. 펜토스타틴(P)을 1, 4, 8 및 11일에 4 ㎎/㎡의 용량으로 투여하였으며; 사이클로포스파마이드(Cy)를 1일 내지 5일 및 8일 내지 12일에 하루에 200㎎의 용량으로 투여하였다.
펜토스타틴 투여 전에 사전 투약 및 사전 수화가 필요할 것이다. 1 리터의 0.9% 나트륨 클로라이드로의 사전 수화는 펜토스타틴 60분 전에 제공될 것이다. 항구토제를 사용한 사전 약제가 필요할 것이다. 항구토 요법 권장 사항은 하기와 같다: (1) 각 펜토스타틴 투여(사이클의 1, 4, 8 및 11일) 60분 전 IV 주입에 의한 덱사메타손, 12㎎; (2) 또한, 경구 덱사메타손은 하루에 4㎎의 용량으로 필요 시에 격일로 투여할 수 있음; (3) 온단세트론은 펜토스타틴의 각 투여하기 60분 전 IV 주입에 의해 8㎎의 용량으로 투여될 것임; (4) 나머지 치료를 위해, 온단세트론은 1 내지 14일에 12시간 마다 8㎎의 경구 용량(정제)으로 필요 시에 투여될 수 있음; 및 (5) 조절되지 않는 메스꺼움 및 구토가 있는 환자에서 항구토 요법에 필요 시에 아프레피탄트(Aprepitant)가 첨가될 수 있음. 펜토스타틴 용량은 4 ㎎/㎡일 것이며, 펜토스타틴의 각 용량은 30 내지 60분에 걸쳐 정맥 투여될 것이다.
펜토스타틴을 용량 변경하며, 환자에게 투여되는 펜토스타틴의 투여량은 1 내지 4 ㎎/㎡이다. 펜토스타틴을 크레아틴 청소율(CrCl)을 기준으로 하여 용량 변경할 것이며, 이는 24시간 소변에 의해 얻어지거나 Cockcroft-Gault 식에 의해 계산될 것이다. 대상체가 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드 치료법 동안 크레아티닌 수준의 증가를 경험하는 경우에, 후속 투여량은 하기와 같이 변형될 것이다: CrCl ≥ 60 ㎖/분/1.73㎡ → 4 ㎎/㎡의 펜토스타틴(전체 용량)을 투여함; CrCl < 60㎖ 그러나 ≥ 30 ㎖/분/1.73㎡ → 펜토스타틴을 50% 용량 감소로, 2 ㎎/㎡로 투여함; 및 CrCl < 30㎖ → 펜토스타틴을유지시킴. 펜토스타틴은 신경학적 독성(발작, 혼수 상태) 또는 심장 독성(박출률 감소)과 같은 장기 독성과 거의 관련이 없다. 이와 같이, PC 요법 동안 발생하는 임의의 장기 독성을 평가하기 위해 특별한 주의를 기울여야 한다. 펜토스타틴이 등급 2 이상의 중증도의 임의의 장기 독성과 관련이 있는 경우에, 기관 PI는 추가 펜토스타틴 요법 및 추가 프로토콜 요법이 필요한 지의 여부를 논의하기 위해 접촉되어야 한다.
경구 사이클로포스파마이드(Cy)는 PC 요법의 구성성분으로서 사용될 것이며, 여기서, 사이클로포스파마이드의 용량은 50 내지 400㎎일 것이다. Cy의 용량은 PC 요법의 사이클 1 내지 5 동안 1 내지 5일 및 8 내지 12일에 하루에 200㎎일 것이다. 정맥 주입에 의한 사이클로포스파마이드 200㎎은 또한, 내약성 문제 또는 경제적 고려사항에 대해서도 허용될 것이다. 사이클로포스파마이드 방광 독성으로 인해, PC 요법 동안 적절한 수화가 유지되어야 한다. 환자는 투명한 소변 칼라를 유지시키기 위해 하루에 적어도 2 내지 4 리터의 물을 마셔야 한다.
사이클로포스파마이드 투여량은 사이클의 1, 4, 8 및 11일에 얻어진 전체 혈구 계수(complete blood count: CBC) 및 차등 세포값(절대 림프구 수[ALC] 및 절대 호중구 수[ANC]를 기반으로 하기 표에 따라, 필요에 따라 조정될 것이다. PC 요법의 기술된 목표는 골수 세포 억제를 최소화하면서 면역 고갈 및 면역 억제를 달성하는 것이다. 이러한 목표를 보정하는 것을 돕기 위해, 사이클로포스파마이드 투여량은 펜토스타틴 투여일(사이클의 1, 4, 8 및 11일)에 ALC 및 ANC를 기반으로 하기 표에 따라, 필요에 따라 조정될 것이다. 표에서의 표기는 하기와 같다: 1, 펜토스타틴은 ALC/ANC 값을 기반으로 하여 용량-조정되지 않을 것임; 2, 500 미만의 ANC 값에 대하여, 사이클로포스파마이드 투여량의 감소 이외에, 환자는 다음 ANC 측정까지 G-CSF 치료법을 받을 것임; 3, 명시된 사이클로포스파마이드 용량은 다음 ALC/ANC 측정까지 매일 지속될 것임(사이클의 1, 4, 8 및 11일에 수행됨).
PC 요법의 변형이 예상된다. 먼저, 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드는 면역 결핍 및 면역 억제 작용의 측면에서 상승 효과가 있다. 이러한 상승효과는 또한, 항-종양 효과의 측면에서도 존재할 가능성이 있지만, 이러한 가능성에 대한 정보가 거의 없다. 이와 같이, 본 출원인은 PC 요법이 고형 종양을 포함하는 암 치료법에 대한 단독 요법으로서 사용될 수 있다는 것을 고려한다. 하나의 종래 예에서, 부분적으로 PC 요법에 의해 포함된 조합 요법을 받은 불응성 중피종을 갖는 환자는 전례없는 항-종양 이점을 갖는다. 둘째로, 이러한 상승 효과로 인해, 본 출원인은 정맥 주입에 의해, 바람직하게는, 용이한 투여를 위해 조제 오류를 감소시키기 위해 동일한 정맥 주입 백에 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드를 혼합함으로써 동시에 2개의 약물을 투여하는 것이 유리할 것이라는 것을 제안한다. 이러한 적용에서, 다양한 임상적으로 관련된 펜토스타틴-대-사이클로포스파마이드 비를 포함하는 PC 혼합물의 옵션을 제공하는 것이 중요할 것이다.
Figure pct00004
제조된 T 세포 주입
예비투약은 모든 제조된 T 세포 투여 이전에 필요할 것이다. 디페닐하이드라민(25 내지 50㎎ IV 또는 PO) 및 아세트아미노펜(650㎎, PO)은 제조된 T 세포 주입하기 30 내지 60분 전에 투여될 것이다.
제조된 T 세포 주입은 15일에 2 내지 5 사이클로 이루어질 것이다. 그러나, 제조된 T 세포 주입의 최대 3일 지연은 물류상의 이유로 일어날 수 있다. 또한, 사이클 사이에 최대 4주 지연은 물류상의 이유로 및 독성 회복을 위해 허용될 것이다. 제조된 T 세포는 5×106개의 세포/㎏일 것이다. 그러나, 제조 동안 차선 세포 수율이 일어나는 경우에, 0.1×106개의 세포/㎏ 정도의 낮은 용량이 허용될 것이다. 냉동보존된 제조된 T 세포는 해동되고, 혈액 제품 투여를 위한 적절한 기관 SOP 후 중력에 의해 즉시 그리고 신속하게 정맥 투여된다(30분 이내). 이러한 T 세포 주입은 입원 환자 투여를 필요로 하는 예기치 않는 상황이 없는 한 외래 환자 환경에서 수행될 것이다. 독성이 생명을 위협하는 것으로 간주되지 않는 한, 세포 주입 직후에 일어날 수 있는 DMSO-관련 독성(오한, 근육통)의 관리에 스테로이드가 허용되지 않을 것이다.
0.1×106개의 세포/㎏ 미만의 더 적은 양의 제조된 T 세포 주입이 또한 임상적으로 관련될 수 있다는 것이 예상된다(일례로서, 그러나 비제한적으로, 1×105개의 세포/㎏에서, 1-log 더 낮음). 먼저, 더욱 높아진 생체내 효과를 매개하여 원하는 T 세포 용량을 감소시키는 제조된 T 세포를 생성하기 위해 제조가 최적화될 것이다. 이는 부분적으로 T 세포 수집이 간단한 채혈에 의해 일어날 수 있고 부분적으로 개선된 제조 가능성으로 인해 유리할 것이다. 둘째로, 상기에 상세히 기술된 바와 같이, PC 요법의 추가 개선과 함께, 입양 전달된 제조된 T 세포는 숙주 세포에 비해 추가로 개선된 생체내 선택적 이점을 가질 것이며, 이에 의해 원하는 제조된 T 세포 용량을 효과적으로 감소시킬 것이다.
치료 동안 및 후 전문 면역 모니터링
말초 혈액 단핵 세포 및 골수 세포는 면역 모니터링 검사가 수행될 수 있도록 Rapa Therapeutics로 보내질 것이다. 이러한 검사 목적은 제조된 T 세포 요법의 작용 메커니즘을 탐구하고 제조된 T 세포 효능을 예측하는 바이오마커를 개발하는 것이다. 하나의 노력으로, 본 출원인은 자가 다발성 골수종 종양 세포 또는 공지되거나 의심되는 종양 항원, 예를 들어, 암-고환-항원(CTA) 패밀리의 분자를 포함하는 다양한 자극에 반응하여 다양한 Th1- 및 Th2-타입 사이토카인을 생성하는 이의 능력에 대해 제조된 T 세포 수용자를 평가할 것이다. 유전자의 CTA 패밀리는 수에 있어서 광범위하고, 다발성 골수종과 관련이 있는 것으로 나타났다. CTA 유전자의 서열이 알려져 있고 특정 CTA 유전자의 관련이 다발성 골수종에서 특성규명되었기 때문에, 제조된 T 세포 요법은 소정 범위의 CTA 항원에 대한 T 세포-매개 면역을 특이적으로 유도하는 것으로 입증될 수 있다. 이러한 사이토카인 반응의 측정은 RNA 발현 분석, ELISA 또는 Luminex 다중-분석물 방법에 의한 분비 분석, 유세포 분석법, 또는 ELISPOT 검정을 이용하여 수행될 수 있다. 항원-특이적 면역은 또한, 항체 생산 검정 또는 세포용해 검정의 사용에 의해 정량화될 수 있다.
본 출원인은 제조된 T 세포 요법 후 얻어진 T 세포가 제조된 T 세포 요법 전에 수득된 T 세포에 비해 자가 다발성 골수종 세포에 대한 반응성이 증가하였는 지를 평가할 것이다. 이러한 노력의 한 가지 장애물은 환자-특이적 다발성 골수종 세포주의 전파가 통상적으로 성공적이지 않다는 것이다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 본 출원인은 문헌[Zhang W, Gu Y, Sun Q, et al. Ex Vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 2015;10(5)]에서와 같이, 특수 용기, 및 IL-6, CD40 리간드, 및 카르필조밉에 대한 내성 획득을 포함하는, 다발성 골수종 증식 및 생존을 향상시키는 것으로 알려진 인자들의 조합이 보충된 배지를 사용하여 골수종 세포를 전파할 것이다. 환자-특이적 다발성 골수종 세포는 면역 T 세포 항-종양 반응성의 평가에서 자극제로서 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 종양 세포는 전문 항원-제시-세포에 내용물이 로딩되어 아폽토시스 상태로 만들어질 수 있으며, 이는 제조된 T 세포 제조 동안 용출 절차로부터 수집된 환자 특정 단핵구로부터 제조될 수 있다.
또한, 본 출원인은 T 세포 수용체(TCR) 면역 레퍼토리 분석이 제조된 T 세포 요법에 대한 바이오마커로서 유용할 것이라고 생각된다. 바람직하게는, 이러한 레퍼토리 분석은 더욱 일반적으로 사용되는 DNA 시퀀싱보다는 RNA 시퀀싱에 의해 수행될 것이다. 표적화된, 대부분의 T 세포 요법과는 달리, 제조된 T 세포 요법은 제조 공정이 임의의 특정 종양 항원에 대해 T 세포 반응성을 우선적으로 이동시키지 않기 때문에 다클론성 방법이다. 이와 같이, 제조된 T 세포 요법 후 임의의 유익한 항-종양 효과는 다양한 종양 항원으로의 생체내 클론 확장으로부터 유도될 것으로 예상된다. 이러한 생물학을 고려하여, 성공적인 제조된 T 세포 요법은 치료전 레퍼토리의 환자와 치료후 레퍼토리의 환자를 비교할 때 차등 TCR 레퍼토리를 초래할 것이다. 관문 저해를 해소하기 위한 단클론성 항체 요법과 같은 다른 암 치료 환경에서, 성공적인 치료는 문헌[Morisito Index, Robert L, Harview C, Emerson R, et al. Distinct immunological mechanisms of CTLA-4 and PD-1 blockade revealed by analyzing TCR usage in blood lymphocytes. Oncoimmunology. 2014;3:e29244]에 의해 정량화에 의해 확인될 수 있는 TCR 레퍼토리의 왜곡으로서 알려진, 신규한 TCR 클론 특이성의 출현과 관련이 있다. 유사한 방식으로, 성공적인 제조된 T 세포 요법으로, TCR 레퍼토리가 왜곡될 것이다. 제조된 T 세포 요법의 간격을 초과하는 TCR 왜곡의 지속성은 악성 종양에 대한 장기 T 세포 면역과 일치할 것이다. 제조가 발전함에 따라, 개선된 형태의 제조된 T 세포가 생성될 것이다. 이러한 경우에, TCR 왜곡은 더욱 광범위할 것이고, 감소된 수의 치료 사이클에서 일어날 것이고, 치료후 간격에서 더욱 오래 지속할 것이다.
다발성 골수종의 치료를 위한 프로토콜 포함 기준
18세 이상의 남성 또는 여성 환자는 제조된 T 세포 요법을 잠재적으로 받을 수 있다. 공식적인 상한 연령이 제한되지 않을 것이다. 그러나, 심혈관 병리 또는 증상의 병력을 갖는 65세 이상의 환자(하기에 상세히 설명된 배제 기준에 명확하게 맞지 않더라도)에 대해, 다기관 사이트에서 심장 전문의에 의해 평가되어야 한다. 이러한 대상체는 이후에 사례별로 고려될 것이다. 전체 환자 수행 상태는 2 이하의 ECOG 성능 상태로 정량화되는 바와 같이, 적어도 적당히 건강해야 한다.
환자는 조직학 또는 세포학 연구에 의해 다발성 골수종의 진단을 받아야 한다. 또한, 질환은 증상이 있어야 하며, 환자는 하기 부류의 작용제로부터 약물을 받은 후 질환이 2차 또는 3차 재발되어야 한다: 프로테아솜 저해제, 면역 조절 약물, 알킬레이터, CD38 단클론성 항체 및 글루코코르티코이드.
2차 또는 3차 재발된 질환을 앓는 환자는 상대적으로 진행된 질환 단계에 있다. 그러나, 제조된 T 세포 요법의 안정성 및 효능이 입증됨에 따라, 본 출원인은 치료 알고리즘에서 초기의 다발성 골수종 환자가 제조된 T 세포 요법의 혜택을 받을 것으로 예상한다. 일례로서, 그러나 비제한적으로, 제조된 T 세포 요법은 자가 조혈 세포 이식과 결합된 고용량 화학요법에 대한 대안으로서 사용될 수 있거나, 이식 부적격인 상당 수의 환자에게 사용될 수 있다. 또한, 제조된 T 세포 요법은 임상 증상 이전의 다발성 골수종 진행의 가장 초기 시점에, 즉, 무증상 질환의 단계에서 조기 검출 동안 구상될 수 있다.
한편, 본 명세서에 기술된 Rapa-T 세포 요법이 다발성 골수종의 더욱 발전된 단계의 환자 및 고도의 불응성 질환을 갖는 환자의 치료에 적용 가능할 것으로 예상된다. 상세하게는, Rapa-T 세포 요법은 MM이 재발되고 MM을 치료하기 위해 사용되는 상위 약물 중 하기 5개의 약물, 즉, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 보르테조밉, 카르필조밉, 및 다라투무맙에 대해 내성인 환자로서 규정되는, 펜타-불응성 MM을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
펜타-불응성 MM을 갖는 환자가 치료법에 대한 표준 치료 옵션을 가지지 않기 때문에, 이러한 환경에서 Rapa-T 세포 요법을 평가하기 위한 임상 프로토콜은 신규한 항암 약물을 평가하기 위해 문헌[Chen C, Siegel D, Gutierrez M, et al. Safety and efficacy of selinexor in relapsed or refractory multiple myeloma and Waldenstrom macroglobulinemia. Blood. 2018;131(8):855-863]에서 이전에 수행된 연구와 유사한 단일군 제II상 연구일 것이다. 이러한 제II상 연구를 위해, Rapa-T 세포 요법은 도 30, 도 31, 및 도 32a 내지 도 32c에 기술된 바와 같이 투여될 것이다. 본 연구의 통계적 목표는 Rapa-T 세포 요법이 30%와 적어도 일치하는 비율에 의해 규정된 바와 같이, 펜타-불응성 MM의 유의미한 적어도 부분 완화율을 유도할 수 있는 지의 여부를 결정하는 것이다.
제조된 T 세포를 제조하기에 잠재적으로 충분한 자가 T 세포의 잠재적인 공급원이 있어야 한다. 상세하게는, 환자는 제조에 이용 가능한 충분한 수의 이전에 동결보존된 PBSC 단위(2백만개 세포/㎏ 초과의 총 CD34+ 함량에 의해 정의됨) 또는 정상 상태 성분 채집술에 의해 수확될 수 있는 충분한 수의 순환 T 세포(마이크로리터당 300개 초과의 세포의 ALC에 의해 정의됨)를 가져야 한다.
환자는 골수종 치료법, 대수술, 방사선 요법, 다른 임상 시험에 참여 후 적어도 2주이어야 하고, 이러한 종래 치료의 임상적으로 유의미한 독성에서 회복된 상태여야 한다(CTCAE 독성을 2 이하의 값까지 분해). MUGA 또는 2-D 심초음파에 의한 심장 박출률(EF)은 기관 정상 한계 내에 있어야 하며, EF 수준은 적어도 40%이다. 혈청 크레아티닌에 의해 측정된 신장 기능은 2.5 ㎎/㎗ 이하이어야 한다. 간 기능은 AST 및 ALT에 의해 측정한 경우 정상 상한의 3배 이하 및 1.5 이하(길버트병으로 인한 경우를 제외함)의 총 빌리루빈으로 적절해야 한다. 폐 기능은 폐 기능 시험에서 예상되는 것의 50% 이상의 보정된 DLCO에 의해 정의된 바와 같이 적절해야 한다. 비정상적인 출혈 경향의 병력이 없어야 한다. 표준 의료의 일부가 아닌 임의의 연구 관련 절차의 수행 전에 자발적인 서면 동의가 제공되어야 하며, 환자는 향후 의료를 침해하지 않고 임의의 시간에 동의를 철회할 수 있는 것으로 이해된다.
무작위화 3상 시험: 표준 치료 요법
제조된 T 세포 요법의 이점을 입증하기 위해, 무작위 연구를 수행하여 DPd, DRd, 또는 KRd 요법으로 이루어지는 표준 치료 요법과 제조된 T 세포 요법의 결과를 공식적으로 비교할 것이다. 이러한 요법들은 2차 또는 3차 재발에서 MM 환자에 대한 FDA 승인 상태에 따라, 문헌에 명시된 바와 같이 투여될 것이다.
실시예 7
PBMC를 함유한 환자 샘플을 얻기 위해 정상 상태 성분 채집술을 수행하였다. GE에 의한 Sepax® 기기에서 자동화된 Ficoll 절차를 이용함으로써 샘플에서 림프구를 농축하였다. 림프구-농축된 세포 집단을 이후에 G-REX 배양 용기에 플레이팅하고, TexMACS 배지(혈청이 보충되지 않고, IL-2가 보충되지 않음) 및 IFN-α, 템시롤리무스 및 바실릭시맙을 함유한 배지에서 6일 동안 배양하였다. 제조의 종료 시에, 얻어진 Th1/Tc1 세포를, 에토포사이드에 대한 노출에 의해 아폽토시스를 제공한 췌장암 세포(MIA-Paca2 세포주) 또는 폐암 세포(H23 세포주)에 노출시켰다. 이러한 종양 용해물로 펄싱한 후에 IL-2(200 IU/㎖)에서 7일 동안 배양하였으며, 이때에 종양 용해물에 대한 2차 노출이 수행되었다. IL-2 함유 배지에서 추가 7일 배양 간격 후에, 3차 종양 용해물 노출을 수행하였으며, 얻어진 24시간 상청액을 Luminex 검정에 의해 사이토카인 함량에 대해 시험하였다(결과는 24시간당 1×106개의 세포당 g/㎖로 나타냄). 사이토카인 검정에 대한 결과는 도 34a 및 도 34b에 도시되어 있다. 조건 A는 종양 용해물의 차선 제형으로의 펄싱을 나타내며, 조건 B는 종양 용해물의 최적 제형을 나타낸다. "<"는 값이 검출 한계 미만임을 나타낸다.
도 34a 및 도 34b에 도시된 바와 같이, RAPA-T 세포는 췌장암 세포 및 폐암 세포와 같은 고형 종양을 포함하는 종양 세포에 반응하는 이의 능력을 추가로 특징으로 할 수 있다. 도 34a 및 도 34b에 추가로 도시되어 있는 바와 같이, RAPA-T 세포는 IFN-γ 및 GM-CSF의 높은 수준의 분비, 및 Th2 사이토카인 IL-4 및 IL-10의 감소된 분비에 의해 입증된 바와 같이 특징적인 Th1 사이토카인 표현형을 유지할 수 있다.
다른 실험에서, 제조의 종료 시에, 얻어진 Th1/Tc1 세포를, 에토포시드에 대한 노출에 의해 아폽토시스를 제공한 췌장암 세포(MIA-Paca2 세포주) 또는 폐암 세포(H23 세포주)에 노출시켰다. 이러한 종양 용해물로 펄싱한 후에 IL-7(20 ng/㎖) 및 IL-15(10 ng/㎖)에서 7일 동안 배양하였으며, 이때에 종양 용해물에 대한 2차 노출이 수행되었다. IL-7 및 IL-15 함유 배지에서 추가 7일 배양 간격 후에, 3차 종양 용해물 노출을 수행하였으며, 얻어진 24시간 상청액을 Luminex 검정에 의해 사이토카인 함량에 대해 시험하였다(결과는 24시간당 1×106개의 세포당 g/㎖로 나타냄). 대조군 배양물("RAPA-201, 종양 없음")은 종양 용해물로의 펄싱을 받지 않을 것을 제외하고 IL-7 및 IL-15 함유 배지에서 전파된 제조된 내성 Th1/Tc1 세포로 이루어졌다. 사이토카인에 대한 결과는 도 35에 도시되어 있다.
도 35에 도시된 바와 같이, RAPA-T 세포는 췌장암 세포 및 폐암 세포와 같은 고형 종양을 포함하는 종양 세포에 반응하는 이의 용량을 추가로 특징으로 할 수 있다. 고형 종양 세포주에 대한 이러한 시험관내 민감화는 IL-7 및 IL-15가 보충된 배지에서 배양물 확장에 의해 용이하게 확인될 수 있으며, 이는 RAPA-T 세포의 이펙터 기능을 선택적으로 유도하는 것으로 나타내는 2개의 항상성 사이토카인이다. 종양 세포로의 RAPA-T 세포 사이토카인 분비는 IFN-γ, GM-CSF 및 TNF-α의 높은 수준의 분비에 의해 입증되는 바와 같이, 특징적인 Th1 사이토카인 표현형을 유지할 수 있다.
도 36에 도시된 바와 같이, 여러 암, 예를 들어, 신장 세포 암종, 간암, 폐암, 방광암 및 위암은 고형 종양에서 관해를 유도할 수 있는 PD-1 및 CTLA4와 같은 관문 저해제 분자에 대한 단클론성 치료법과 같은 관문 저해제 치료법에 반응성인 것으로 나타났다. 추가 실험에서, 시몬 2-단계 설계 하에서, 신장암, 폐암, 간암, 위암, 방광암 및 저 돌연변이 PDL1-음성 또는 저 돌연변이율 암을 갖는 환자(n = 7)에는 제조된 T 세포 요법이 투여될 것이다. 임의의 코호트가 적어도 하나의 반응성 환자를 갖는 경우에, 코호트는 20명 환자 코호트로 확장될 것이다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, Rapa-T 세포가 감소된 관문 저해제 수용체를 갖거나 관문 저해제 수용체를 갖지 않기 때문에 암에서 치료 이점을 제공할 수 있을 것으로 예상된다. 특정 암이 PD1 및 CTLA4 이외의 관문 저해제 수용체로 인해 특정 치료에 반응적이지 않을 수 있다고 의심된다. 이에 따라, 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, Rapa-T 세포가 추가 관문 저해제 수용체의 결여로 인해 다른 암을 치료하는 데 효과적일 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 8
Rapa-T 세포를 6일 배양에 의해 제조하였으며, Ficoll후 세포 집단은 템시롤리무스(2μM) 및 항-IL-2 수용체 단클론성 항체, 바실릭시맙(30 ㎍/㎖)을 함유한 배지에서 배양하였다. 24시간 후에, 배양물에 IFN-α(20,000 IU/㎖)를 보충하였으며, 배양물에는 IL-2를 보충하지 않았다. 배양물에서 사용되는 어떠한 형태의 항-CD3/항-CD28 공동-자극도 존재하지 않았다.
대조적으로, "대조군"의 경우, Ficoll후 세포 집단을 템시롤리무스 및 바실릭시맙을 함유하지 않은 배지에서 배양하였다. 세포를 3:1의 입자-대-T 세포 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 입자로 배양 개시일에 공동-자극하였다. 배양 개시일에 배지에 IL-2(20 IU/㎖) 및 IFN-α(20,000 IU/㎖)를 보충하였다. BTLA, CTLA4, PD1 및 TIM3에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 배양물 투입 집단에 대한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트, Rapa-T 세포 및 대조군 세포에 대해 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 데이터는 하기 표 2에 나타나 있다. 관문 저해제 수용체 발현의 감소는 Rapa-T 세포와 대조군 세포 사이에서 나타났으며, 각 관문에 대한 MFI는 Rapa-T 세포 및 배양물 투입 세포에 대해 대략 동일하였다.
Figure pct00005
제조 실시형태:
1. 제조된 T 세포(manufactured T cell)를 제조하는 방법으로서,
템시롤리무스 및 IL-2 신호전달 저해제를 포함하는 배양 배지에 소정 세포 밀도로 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 세포의 배양물 투입 집단을 접종하는 단계;
상기 배양 배지에 IFN-α를 첨가하는 단계;
상기 T 세포 및 배양 배지를 소정 기간 동안 인큐베이션하여 제조된 T 세포를 생산하는 단계;
상기 제조된 T 세포를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 실시형태 1에 있어서,
T 세포 및 배양 배지에 추가 배양 배지를 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
3. 실시형태 2에 있어서, 추가 배양 배지가, 배양 배지에 세포의 배양물 투입 집단을 접종한 후 약 48시간에 첨가되는, 방법.
4. 실시형태 2 또는 3에 있어서, 배양물에 첨가되는 추가 배양 배지의 양이 배양물에서 세포의 세포 밀도를 표적 세포 밀도까지 감소시키기에 충분하며, 접종 시에 세포의 배양물 투입 집단의 세포 밀도가 9×106개의 세포/㎖보다 크며, 표적 세포 밀도가 약 9×106개의 세포/㎖인, 방법.
5. 실시형태 1에 있어서, 항-CD3/항-CD28 공동-자극이 수행되지 않는, 방법.
6. 실시형태 2에 있어서, 세포의 배양물 투입 집단이 배양 배지에 접종될 때, 배양물에 첨가된 추가 배양 배지의 양이 배양 배지의 양에 대해 1:1 내지 3:1의 비인, 방법.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제조된 T 세포를 수확한 후에,
패키지에 상기 제조된 T 세포의 적어도 일부분을 패키징하고;
상기 제조된 T 세포의 일부분을 함유한 상기 패키지를 냉동시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 IL-2를 함유하지 않으며, 상기 배양 배지에 IL-2가 첨가되지 않은, 방법.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFN-α가 상기 배양 배지에, 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하는 것과 대략 동시에, 또는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하고 24시간 이내에 첨가되는, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 적어도 1.5×106개/㎖의 세포인, 방법.
11. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 약 7.5×106개/㎖의 세포인, 방법.
12. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 약 30×106개/㎖의 세포인, 방법.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 약 4.5μM의 농도로 존재하는, 방법.
14. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 원하는 농도를 유지하는 기간 동안 1회 이상 첨가되는, 방법.
15. 실시형태 14에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 상기 기간 동안 2일 마다 첨가되는, 방법.
16. 실시형태 14 또는 15에 있어서, 상기 원하는 농도가 약 4.5μM인, 방법.
17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 항-IL-2 수용체 항체 또는 이의 단편인, 방법.
18. 실시형태 17에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 바실릭시맙 또는 다클리주맙인, 방법.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 상기 배양 배지에 5 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 방법.
20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFN-α가 상기 배양 배지에 1,000 내지 10,000 IU/㎖의 농도로 첨가되는, 방법.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 기간이 약 4일 내지 약 8일인, 방법.
22. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 기간이 6일인, 방법.
23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 혈청이 실질적으로 존재하지 않는, 방법.
24. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 혈청이 배양 배지에 첨가되지 않은, 방법.
25. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 5% 인간 혈청을 추가로 포함하는, 방법.
26. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 TexMACS 배지를 포함하는, 방법.
27. 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 66% 이하의 T 세포를 포함하는, 방법.
28. 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 50% 내지 약 95%의 T 세포를 포함하는, 방법.
29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 단핵구를 추가로 포함하는, 방법.
30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하고;
상기 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
31. 실시형태 30에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 상기 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 99% 이상의 T 세포를 포함하는, 방법.
32. 실시형태 30 또는 31에 있어서, 상기 T 세포가 항체-기반 정제에 의해 단리되는, 방법.
33. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하고;
상기 샘플을 T 세포에 대해 농축시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
34. 실시형태 33에 있어서, 상기 농축이 역류 원심 용출에 의해 또는 Ficoll 절차에 의해 수행되는, 방법.
35. 실시형태 33 또는 34에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 상기 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 70% T 세포를 포함하는, 방법.
36. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 상기 세포의 배양물 투입 집단을 수확하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
37. 실시형태 1 내지 36 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 제조된 T 세포.
38. 제조된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
템시롤리무스 및 IL-2 신호전달 저해제를 포함하는 배양 배지에 소정 세포 밀도로 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 세포의 배양물 투입 집단을 접종하는 단계;
상기 세포의 배양물 투입 집단 및 배양 배지를, 항-CD3/항-CD28에 의한 상기 세포의 배양물 투입 집단의 공동-자극 없이 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
제1 기간 동안 상기 인큐베이션 후 1:1 내지 1:12의 입자:T 세포 비로 상기 T 세포 및 배양 배지에 항-C3/항-CD28 코팅된 자성 입자를 첨가하여 상기 T 세포를 자극시키는 단계;
상기 배양 배지에 IFN-α를 첨가하는 단계;
항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자 및 IFN-α를 함유한 상기 배양 배지에서 상기 세포의 배양물 투입 집단을 제조된 T 세포를 제2 기간 동안 인큐베이션하여 제조된 T 세포를 산출하는 단계;
상기 제조된 T 세포로부터 상기 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자를 분리하는 단계; 및
상기 제조된 T 세포를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
39. 실시형태 38에 있어서, 상기 제조된 T 세포를 수확한 후에,
패키지에 상기 제조된 T 세포의 적어도 일부분을 패키징하고;
상기 제조된 T 세포의 일부분을 함유한 상기 패키지를 냉동하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
40. 실시형태 38 또는 39에 있어서, 상기 배양 배지가 IL-2를 함유하지 않으며, 상기 배양 배지에 IL-2가 첨가되지 않는, 방법.
41. 실시형태 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFN-α가 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자가 첨가됨과 동시에 또는 대략 동시에 첨가되는, 방법.
42. 실시형태 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 적어도 1.5×106개/㎖의 세포인, 방법.
43. 실시형태 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 약 7.5×106개/㎖의 세포인, 방법.
44. 실시형태 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 약 30×106개/㎖의 세포인, 방법.
45. 실시형태 38 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 1μM의 농도로 존재하는, 방법.
46. 실시형태 38 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에, 원하는 농도를 유지하는 제2 기간 동안 1회 이상 첨가되는, 방법.
47. 실시형태 46에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 상기 제2 기간 동안 2일마다 첨가되는, 방법.
48. 실시형태 46 또는 47에 있어서, 상기 원하는 농도가 1μM인, 방법.
49. 실시형태 38 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 항-IL-2 수용체 항체 또는 이의 단편인, 방법.
50. 실시형태 49에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 바실릭시맙 또는 다클리주맙인, 방법.
51. 실시형태 38 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 상기 배양 배지에 5 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 방법.
52. 실시형태 38 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 기간이 약 8시간 내지 약 24시간인, 방법.
53. 실시형태 38 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 기간이 16시간인, 방법.
54. 실시형태 38 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자:T 세포 비가 1:3인, 방법.
55. 실시형태 38 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFN-α가 상기 배양 배지에 1,000 내지 10,000 IU/㎖의 농도로 첨가되는, 방법.
56. 실시형태 38 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 기간이 약 4일 내지 약 8일인, 방법.
57. 실시형태 38 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 기간이 6일인, 방법.
58. 실시형태 38 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 5% 인간 혈청을 추가로 포함하는, 방법.
59. 실시형태 38 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 TexMACS 배지를 포함하는, 방법.
60. 실시형태 38 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 66% 이하의 T 세포를 포함하는, 방법.
61. 실시형태 38 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 50% 내지 약 95% T 세포를 포함하는, 방법.
62. 실시형태 38 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 단핵구를 추가로 포함하는, 방법.
63. 실시형태 38 내지 62 중 어느 하나에 있어서,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하고;
상기 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
64. 실시형태 63에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 상기 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 99% 이상의 T 세포를 포함하는, 방법.
65. 실시형태 63 또는 64에 있어서, 상기 T 세포가 항체-기반 정제에 의해 단리되는, 방법.
66. 실시형태 38 내지 62 중 어느 하나에 있어서,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하고;
상기 샘플을 T 세포에 대해 농축시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
67. 실시형태 66에 있어서, 상기 농축이 역류 원심 용출에 의해 또는 Ficoll 절차에 의해 수행되는, 방법.
68. 실시형태 66 또는 67에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 상기 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 70% T 세포를 포함하는, 방법.
69. 실시형태 38 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 상기 세포의 배양물 투입 집단을 수확하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
70. 실시형태 38 내지 69 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 제조된 T 세포.
71. 제조된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
템시롤리무스 및 IL-2 신호전달 저해제를 포함하는 배양 배지에 소정 세포 밀도로 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 세포의 배양물 투입 집단을 접종하는 단계;
상기 세포의 배양물 투입 집단 및 배양 배지를, 항-CD3/항-CD28에 의한 상기 세포의 배양물 투입 집단의 공동-자극 없이 제1 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
제1 기간 동안 상기 인큐베이션 후 권장 용량의 약 0.01X 내지 약 0.1X로 상기 T 세포 및 배양 배지에 항-C3/항-CD28 함유 나노입자를 첨가하여 상기 T 세포를 자극시키는 단계;
상기 배양 배지에 IFN-α를 첨가하는 단계;
항-CD3/항-CD28 함유 나노입자 및 IFN-α를 함유한 상기 배양 배지에서 상기 세포의 배양물 투입 집단을 제조된 T 세포를 제2 기간 동안 인큐베이션하여 제조된 T 세포를 산출하는 단계;
상기 제조된 T 세포를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
72. 실시형태 71에 있어서, 상기 제조된 T 세포를 수확한 후에,
패키지에 상기 제조된 T 세포의 적어도 일부분을 패키징하고;
상기 제조된 T 세포의 일부분을 함유한 상기 패키지를 냉동하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
73. 실시형태 71 또는 72에 있어서, 상기 배양 배지가 IL-2를 함유하지 않으며, 상기 배양 배지에 IL-2가 첨가되지 않는, 방법.
74. 실시형태 71 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFN-α가 항-CD3/항-CD28 함유 나노입자가 첨가됨과 동시에 또는 대략 동시에 첨가되는, 방법.
75. 실시형태 71 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 적어도 1.5×106개/㎖의 세포인, 방법.
76. 실시형태 71 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 약 7.5×106개/㎖의 세포인, 방법.
77. 실시형태 71 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 밀도가 약 30×106개/㎖의 세포인, 방법.
78. 실시형태 71 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 1μM의 농도로 존재하는, 방법.
79. 실시형태 71 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에, 원하는 농도를 유지하는 제2 기간 동안 1회 이상 첨가되는, 방법.
80. 실시형태 79에 있어서, 상기 템시롤리무스가 상기 배양 배지에 상기 제2 기간 동안 2일마다 첨가되는, 방법.
81. 실시형태 71 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 원하는 농도가 1μM인, 방법.
82. 실시형태 71 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 항-IL-2 수용체 항체 또는 이의 단편인, 방법.
83. 실시형태 82에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 바실릭시맙 또는 다클리주맙인, 방법.
84. 실시형태 71 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 IL-2 신호전달 저해제가 상기 배양 배지에 5 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 방법.
85. 실시형태 71 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 기간이 약 8시간 내지 약 24시간인, 방법.
86. 실시형태 71 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 기간이 16시간인, 방법.
87. 실시형태 71 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 IFN-α가 상기 배양 배지에 1,000 내지 10,000 IU/㎖의 농도로 첨가되는, 방법.
88. 실시형태 71 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 기간이 약 4일 내지 약 8일인, 방법.
89. 실시형태 71 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 기간이 6일인, 방법.
90. 실시형태 71 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 5% 인간 혈청을 추가로 포함하는, 방법.
91. 실시형태 71 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 TexMACS 배지를 포함하는, 방법.
92. 실시형태 71 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 66% 이하의 T 세포를 포함하는, 방법.
93. 실시형태 71 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 50% 내지 약 95% T 세포를 포함하는, 방법.
94. 실시형태 71 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 단핵구를 추가로 포함하는, 방법.
95. 실시형태 71 내지 94 중 어느 하나에 있어서,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하고;
상기 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
96. 실시형태 95에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 상기 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 99% 이상의 T 세포를 포함하는, 방법.
97. 실시형태 95 또는 96에 있어서, 상기 T 세포가 항체-기반 정제에 의해 단리되는, 방법.
98. 실시형태 71 내지 94 중 어느 하나에 있어서,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 수확하고;
상기 샘플을 T 세포에 대해 농축시켜 상기 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
99. 실시형태 98에 있어서, 상기 농축이 역류 원심 용출에 의해 또는 Ficoll 절차에 의해 수행되는, 방법.
100. 실시형태 98 또는 99에 있어서, 상기 세포의 배양물 투입 집단이 상기 세포의 배양물 투입 집단에서 세포의 총 수 중 약 70% T 세포를 포함하는, 방법.
101. 실시형태 71 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 상기 세포의 배양물 투입 집단을 수확하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
102. 실시형태 71 내지 101 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 제조된 T 세포.
103. 외인성 IL-2의 존재 하에서 생산된 제조된 T 세포의 대조 집단에 비해 감소된 수준의 포스포릴화된 형태의 STAT5를 나타내는 제조된 T 세포의 집단으로서, 관찰된 감소는 적어도 50% 미만, 및 더욱 바람직하게는, 90% 이상 미만인, 제조된 T 세포의 집단.
104. 배양물 투입 T 세포에 대해 CD62L 및 CCR7을 공동-발현시키는 T 세포의 빈도의 적어도 25% 증가에 의해 지시되는 바와 같이, 이펙터 기억 상태에서 T 중축 기억 상태로 분화의 이동을 나타내는, 제조된 T 세포의 집단.
105. 5% 미만의 비율 및 더욱 바람직하게는, 1% 미만의 비율에서 IL-2 수용체 CD25를 공동-발현시키는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도에 의해 지시되는 바와 같이, 정지 상태로 존재하는, 제조된 T 세포의 집단.
106. 높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 사용한 자극 절차 후에 배양물 상청액에 함유된 24시간당 1×106개의 세포당 100 g/㎖ 미만으로 규정된 바와 같이, 제조 종료 시에 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 T 세포에 의해 지시된 바와 같은, 정지 상태로 존재하는, 제조된 T 세포의 집단.
107. 6일 분비 수준에 비해 적어도 5배, 및 더욱 바람직하게는, 20배 증가된 저해제의 부재 하에서 6일 확장 기간 후에 IFN-γ 및 TNF-α 분비의 증가에 의해 규정된 바와 같은, 정지 상태에서 높은 수준의 염증성 사이토카인 분비의 상태로의 전이하는 제조된 T 세포.
108. 적어도 10% 미만의 CTLA4+ 및 더욱 최적으로 5% 미만의 CTLA4+의 유세포 분석법에 의한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 발현에 의해 규정되는 바와 같은, 낮은 수준의 면역 억제 분자 CTLA4를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
109. 적어도 10% 미만의 TIM3+ 및 더욱 최적으로 2% 미만의 TIM3+의 유세포 분석법에 의한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 발현에 의해 규정되는 바와 같은, 낮은 수준의 관문 저해 분자 TIM3을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
110. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 상기 세포의 배양물 투입 집단을 수확하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
111. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
112. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 농축하여 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
113. 실시형태 38 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
114. 실시형태 38 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 농축하여 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
115. 실시형태 71 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플로부터 T 세포를 단리시켜 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
116. 실시형태 71 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지에 세포 밀도로 상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 상기 세포의 배양물 투입 집단을 접종하기 전에,
상기 대상체로부터의 T 세포를 포함하는 샘플을 농축시켜 세포의 배양물 투입 집단을 생산하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
117. 실시형태 1 내지 36, 38 내지 69 및 71 내지 100 중 어느 하나에 있어서, IFN-α가 세포의 배양물 투입 집단이 배양 배지에 접종된 후 24시간에 첨가되는, 방법.
118. 실시형태 110 내지 117 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 제조된 T 세포.
119. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하가 CTLA4를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
120. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
121. 실시형태 120에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
122. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하가 TIM3을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
123. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포의 T 세포 특징의 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도에 비해 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
124. 실시형태 123에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
125. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
126. 실시형태 125에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
127. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하가 PD1을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
128. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
129. 실시형태 128에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
130. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하가 2B4를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
131. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD8+ T 세포의 5% 이하가 2B4를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
132. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포의 T 세포 특징의 대조 집단에서 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도에 비해 2B4를 발현시키는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
133. 실시형태 132에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
134. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
135. 실시형태 134에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 20% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
136. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하가 LAIR1를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
137. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도에 비해 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
138. 실시형태 137에서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
139. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도에 비해 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
140. 실시형태 139에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
141. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하가 TIGIT를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
142. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
143. 실시형태 142에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 40% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
144. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하가 LAG3을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
145. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T-Rapa 세포의 상응하는 빈도에 비해 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 감소된 빈도를 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
146. 실시형태 144에 있어서, 감소된 빈도가 상응하는 빈도보다 적어도 50% 더 낮은, 제조된 T 세포의 집단.
147. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 1% 이하가 CD25를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
148. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하가 KLRG1을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
149. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20% 이하가 CD39를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
150. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20% 이하가 CD73를 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
151. 유세포 분석법에 의해 측정한 경우 제조된 T 세포의 집단에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 4% 이하가 GITR을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
152. 실시형태 108, 109 및 119 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD28 또는 ICOS를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 빈도가 제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징인 T 세포의 대조 집단에서 CD28 또는 ICOS를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도와 실질적으로 동일한, 제조된 T 세포의 집단.
153. 실시형태 108, 109 및 119 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 제조된 T 세포의 집단에서 CD28 또는 ICOS를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 빈도가 제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징인 T 세포의 대조 집단에서 CD28 또는 ICOS를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 상응하는 빈도의 10% 이내인, 제조된 T 세포의 집단.
154. 3:1 내지 1:3 입자:T 세포의 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일 IL-2를 분비하는, 제조된 T 세포의 집단.
155. 3:1 내지 1:3 입자:T 세포의 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자 및 존재하는 경우 IL-7 및 IL-15 각각에 대해 10 ng/㎖의 농도의 IL-7, IL-15 또는 IL-7와 IL-15의 조합으로의 공동-자극 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일 IL-2 IL-2을 분비하는, 제조된 T 세포의 집단.
156. 존재하는 경우, IL-7 및 IL-15 각각에 대해 10 ng/㎖ 농도의 IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 공동-자극 후 대조 T 세포 집단 또는 T-Rapa 세포에 비해 증가된 IL-2 양을 분리하는, 제조된 T 세포의 집단.
156. 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 적어도 75% 미만의 포스포릴화된 STAT5, 검출 가능한 수준의 STAT1 또는 포스포릴화된 STAT1, 적어도 50% 감소된 p70S6K 및 Raptor, 및 배양된 T-Rapa 세포의 집단과 50% 이하 상이한 수준의 Rictor, SGK1 및 포스포릴화된 SGK1을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
157. 실질적으로 동일한 수준의 Rictor, SGK1 또는 포스포릴화된 SGK1을 특징으로 하는 mTORC2 분자의 보존을 나타내는 하기 중 적어도 하나를 특징으로 하는 감소된 mTORC1 활성화를 나타내는 제조된 T 세포의 집단:
(a) T 세포의 대조 집단에 비해 감소된 수준의 포스포릴화된 P70S6K, 또는
(b) T 세포의 대조 집단에 비해 감소된 수준의 Raptor.
157. 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 적어도 75% 적은 포스포릴화된 STAT5, 검출 가능한 수준의 STAT1 또는 포스포릴화된 STAT1, 적어도 50% 감소된 p70S6K 및 Raptor, 및 배양된 T-Rapa 세포의 집단과 50% 이하 상이한 수준의 Rictor, SGK1 및 포스포릴화된 SGK1을 발현시키는, 제조된 T 세포의 집단.
158. T-Rapa 세포와 실질적으로 동일한 수준의 Rictor, SGK1 또는 포스포릴화된 SGK1을 특징으로 하는 mTORC2 분자의 보존을 나타내는, 하기 중 적어도 하나에 의해 특징되는 감소된 mTORC1 활성화를 나타내는 제조된 T 세포의 집단:
(a) T-Rapa 세포에 비해 감소된 수준의 포스포릴화된 P70S6K, 또는
(b) T-Rapa 세포에 비해 감소된 수준의 Raptor.
159. 실시형태 158에 있어서, 대조 T 세포 배양물에 비해 감소된 STAT5 포스포릴화 및 검출 가능한 수준의 STAT1 또는 포스포릴화된 STAT1을 추가로 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
160. 대조 T 세포 배양물에 비해 감소된 STAT5 포스포릴화 및 검출 가능한 수준의 STAT1 또는 포스포릴화된 STAT1을 특징으로 하는, 제조된 T 세포의 집단.
161. 하기 특성들 중 하나 이상의 갖는 제조된 T 세포의 집단:
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IFN-γ 분비의 적어도 50% 증가 ;
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 TNF-α 분비의 적어도 50% 증가;
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 GM-CSF 분비의 적어도 50% 증가;
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IL-2 분비의 적어도 50% 증가;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 CD4, CD62L, CCR7 및 CD127에 대해 적어도 50% 양성의 세포 백분율의 증가;
T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 50% 이하의 4EBP1 포스포릴화 증가;
동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p70S6K 또는 Raptor의 적어도 50% 발현 감소;
동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p-STAT5의 적어도 50% 발현 감소;
검출 가능한 수준의 STAT1 및 p-STAT1 발현;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 p70S6K 발현의 적어도 10% 증가;
T-Rapa 세포의 집단에 비해 CD25의 발현의 적어도 50% 감소;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20% 이하;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 약 20% 이내의 CD28 발현 수준;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 약 20% 이내의 ICOS 발현 수준;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 약 20% 이내의 CD45RA 발현 수준;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD45RA에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 적어도 50% 증가;
동일한 조건 하에서 인큐베이션된 T-Rapa 배양물에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가;
3:1 내지 1:3 입자:T 세포 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2의 분비;
IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션될 때에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2 분비(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
T-Rapa 세포의 집단의 상응하는 발현 수준에 비해, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 발현의 적어도 25% 감소;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 상응하는 발현 수준의 25% 내의, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준;
적어도 5%의, CD127을 발현시키는 CD4+ T 세포;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 대조 T 세포 집단에 비해 CD127을 발현시키는 CD4+ T 세포의 빈도의 적어도 50% 증가;
배양물 투입 T 세포에 비해 CD62L 및 CCR7을 공동-발현시키는 T 세포의 빈도의 적어도 25% 증가;
5% 미만의 비율 및 더욱 바람직하게는 1% 미만의 비율로 IL-2 수용체 CD25를 공동-발현시키는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도;
높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 이용한 자극 절차 후에 배양물 상청액에 함유된 24시간당 1×106개의 세포당 100 g/㎖ 미만으로 규정된 바와 같은, 제조 종료 시에 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 분비;
6일 분비 수준에 비해 적어도 5배 및 더욱 바람직하게는, 20배 증가된 저해제의 부재 하에서 6일 확장 기간 후 IFN-γ 및 TNF-α 분비의 증가; 및
이들의 조합.
162. 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 제조된 T 세포:
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IFN-γ 분비의 적어도 50% 증가;
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 TNF-α 분비의 적어도 50% 증가;
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 GM-CSF 분비의 적어도 50% 증가;
3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IL-2 분비의 적어도 50% 증가;
T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 50% 이하의 4EBP1 포스포릴화 증가;
동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p70S6K 또는 Raptor 발현의 적어도 50% 감소;
동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p-STAT5 발현의 적어도 50% 감소;
검출 가능한 수준의 STAT1 및 p-STAT1 발현;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 p70S6K 발현의 적어도 10% 증가;
T-Rapa 세포의 집단에 비해 CD25의 발현의 적어도 50% 감소;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 CD28의 발현 수준;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 ICOS의 발현 수준;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 CD45RA의 발현 수준;
유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD45RA에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 적어도 50% 증가;
동일한 조건 하에서 인큐베이션된 T-Rapa 배양물에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가;
3:1 내지 1:3 입자:T 세포 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2의 분비;
IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션될 때에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2 분비(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
T-Rapa 세포의 집단의 상응하는 발현 수준에 비해, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 발현의 적어도 25% 감소;
제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 상응하는 발현 수준의 25% 내의, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준;
CD127을 발현시킴;
높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 이용한 자극 절차 후에 배양물 상청액에 함유된 24시간당 1×106개의 세포당 100 g/㎖ 미만으로 규정된 바와 같은, 제조 종료 시에 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 분비;
6일 분비 수준에 비해 적어도 5배 및 더욱 바람직하게는, 20배 증가된 저해제의 부재 하에서 6일 확장 기간 후 IFN-γ 및 TNF-α 분비의 증가; 및
이들의 조합.

Claims (67)

  1. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포(manufactured T cell)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에, 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 대상체를 상기 면역 고갈 요법으로 수행하기 전에, 상기 대상체로부터의 자가 세포를 수확하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 대상체에게 상기 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하기 전에, 상기 대상체로부터의 자가 세포를 수확하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 면역 고갈 요법이
    상기 대상체에게 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 면역 고갈 요법이
    상기 대상체에게 펜토스타틴을 포함하는 제1 조성물을 투여하는 단계; 및
    상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 펜토스타틴이 상기 대상체에게 투여되며, 상기 펜토스타틴의 용량이 0.5 내지 4 ㎎/㎡인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 사이클로포스파마이드가 상기 대상체에게 투여되며, 상기 사이클로포스파마이드의 용량이 50 내지 400㎎인, 방법.
  9. 제5항에 있어서, 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드 둘 다가 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 펜토스타틴 및 사이클로포스파마이드가 상기 대상체에게 단일 조성물로 투여되는, 방법.
  11. (누락)
  12. 제10항에 있어서, 상기 단일 조성물이 상기 대상체에게 정맥 투여되는, 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 제1 조성물이 0.5 내지 4 ㎎/㎡의 펜토스타틴의 용량으로 투여되는, 방법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 제2 조성물이 사이클로포스파마이드를 포함하며, 상기 조성물이 50 내지 400㎎의 사이클로포스파마이드의 용량으로 투여되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 유효 용량이 상기 대상체의 체중 1kg당 1×105 내지 5×106개의 제조된 T 세포인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 상기 대상체에게 주입에 의해 투여되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 무증상 다발성 골수종(smoldering multiple myeloma)을 앓고 있는, 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 재발된, 불응성 다발성 골수종(relapsed, refractory multiple myeloma)을 앓고 있는, 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 쿼드- 또는 펜타-불응성 다발성 골수종(quad- or penta-refractory multiple myeloma)을 앓고 있는, 방법.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이전에 프로테아솜 저해제의 투여, 면역 조절 약물의 투여, 알킬레이터의 투여, CD38 단클론성 항체의 투여, 및 글루코코르티코이드의 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 상이한 치료 라인으로 치료된 적이 있으며, 상기 대상체가 적어도 하나의 프로테아솜 저해제 및 적어도 하나의 면역 조절 약물에 불응성인, 방법.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이전 치료에 대한 치료 동안 또는 이전 치료에 대한 치료 중단 후 60일 이내에 M-단백질/유리 경쇄 차이 또는 질환의 진행의 25% 미만의 감소를 갖는, 방법.
  22. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    제1 치료 사이클 및 하나 이상의 추가 치료 사이클을 포함하되,
    상기 제1 치료 사이클은
    상기 대상체에게 제1 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 것을 포함하며;
    상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각은
    상기 대상체에게 제2 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키고 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계; 및
    상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 치료 사이클의 기간이 최소 28일인, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각의 기간이 최소 35일인, 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 제1 면역 고갈 요법이
    상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계; 및
    상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계가 상기 제1 치료 사이클 동안 반복되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계가 상기 제1 치료 사이클의 1, 4, 8 및/또는 11일에 수행되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 펜토스타틴이 상기 대상체에게 0.5 내지 4 ㎎/㎡의 용량으로 투여되는, 방법.
    [청구항 28]
    제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계가 상기 제1 치료 사이클 동안 반복되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계가 상기 제1 치료 사이클의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 및/또는 12일에 수행되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 사이클로포스파마이드가 상기 대상체에게 50 내지 400㎎의 용량으로 투여되는, 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 면역 고갈 요법이
    상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계; 및
    상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계가 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각 동안 반복되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계가 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각의 1, 4, 8 및/또는 11일에 수행되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 펜토스타틴이 상기 대상체에게 1 내지 4 ㎎/㎡의 용량으로 투여되는, 방법.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계가 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각 동안 반복되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계가 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 및/또는 12일에 수행되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 사이클로포스파마이드가 상기 대상체에게 50 내지 400㎎의 용량으로 투여되는, 방법.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각이 0 내지 4주로 분리되는, 방법.
  39. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 치료 사이클 및 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 중 제1 사이클이 0 내지 4주로 분리되는, 방법.
  40. 제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계가 상기 하나 이상의 추가 치료 사이클 각각의 15, 16, 17 또는 18일에 수행되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 치료학적 유효 용량이 대상체의 체중 1kg당 1×105 내지 5×106개의 제조된 T 세포인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제조된 T 세포를 포함하는 조성물이 주입에 의해 투여되는, 방법.
  43. 제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 무증상 다발성 골수종을 앓고 있는, 방법.
  44. 제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 재발된, 불응성 다발성 골수종을 앓고 있는, 방법.
  45. 제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 쿼드- 또는 펜타-불응성 다발성 골수종을 앓고 있는, 방법.
  46. 제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이전에 프로테아솜 저해제의 투여, 면역 조절 약물의 투여, 알킬레이터의 투여, CD38 단클론성 항체의 투여, 및 글루코코르티코이드의 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 상이한 치료 라인으로 치료받은 적이 있으며, 상기 대상체가 적어도 하나의 프로테아솜 저해제 및 적어도 하나의 면역 조절 약물에 불응성인, 방법.
  47. 제22항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이전 치료에 대한 치료 동안 또는 이전 치료에 대한 치료 중단 후 60일 이내에 M-단백질/유리 경쇄 차이 또는 질환의 진행의 25% 미만의 감소를 갖는, 방법.
  48. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계; 및
    상기 면역 고갈 요법 후에 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 면역 고갈 요법이
    상기 대상체에게 펜토스타틴을 투여하는 단계;
    상기 대상체에게 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계;
    상기 대상체의 크레아티닌 청소율이 30 ㎖/분/1.73㎡ 초과인 경우 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 용량의 펜토스트타틴을 투여하는 단계; 및
    상기 대상체의 절대 림프구 수가 50 이상이고 상기 대상체의 절대 호중구 수가 500 이상인 경우 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 용량의 사이클로포스파마이드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 대상체에게 하나 이상의 추가 용량의 펜토스타틴을 투여하기 전에, 상기 대상체의 크레아티닌 청소율(CrCl)을 측정하고, CrCl을 기초로 하여 상기 대상체에게 투여되는 펜토스타틴의 용량을 조정하는 단계를 더 포함하며, CrCl > 60 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴이 4 ㎎/㎡로 투여되며, 60 ㎖/분/1.73㎡ > CrCl > 30 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴이 2 ㎎/㎡로 투여되며, CrCl < 30 ㎖/분/1.73㎡일 때 펜토스타틴이 투여되지 않는, 방법.
  51. 제48항 또는 제49항에 있어서, 하나 이상의 추가 용량의 사이클로포스파마이드를 투여하기 전에, 절대 림프구 수(ALC) 및 절대 호중구 수(ANC)를 측정하고 ALC 및 ANC를 기초로 하여 상기 대상체에게 투여되는 사이클로포스파마이드의 용량을 조정하는 단계를 더 포함하며, ANC > 1000/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드가 200㎎의 용량으로 투여되며, ANC가 500 내지 999/마이크로리터이고 ALC > 50/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드가 100㎎의 용량으로 투여되며, ALC < 50/마이크로리터 또는 ANC < 500/마이크로리터일 때 사이클로포스파마이드가 투여되지 않는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 대상체의 CrCl을 측정하고 투여되는 펜토스타틴의 용량을 조정하는 상기 단계가 상기 면역 고갈 요법의 1, 4, 8 및/또는 11일에 수행되는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, ALC 및 ANC를 측정하고 투여되는 사이클로포스파마이드의 용량을 조정하는 상기 단계가 면역 고갈 요법의 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 및/또는 12일에 수행되는, 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 상기 단계가 면역 고갈 요법의 개시 후 15 내지 18일에 수행되는, 방법.
  55. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계, 및 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계가 적어도 2회 반복되는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 대상체에게 면역 고갈 요법을 적용하여 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 적어도 일부분을 감소시키거나 조절 T 세포 및/또는 말기 노화 이펙터 T 세포의 기능의 적어도 일부분을 감소시키는 단계, 및 상기 면역 고갈 요법 후 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계가 최대 5회 반복되는, 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 면역 고갈 요법 후에 상기 대상체에게 치료학적 유효 용량의 제조된 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 각 단계가 0 내지 9주로 분리되는, 방법.
  58. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 유효 용량이 상기 대상체의 체중 1kg당 1×105 내지 5×106개의 제조된 T 세포인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제조된 T 세포를 포함하는 조성물이 주입에 의해 투여되는, 방법.
  60. 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 무증상 다발성 골수종을 앓고 있는, 방법.
  61. 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 재발된, 불응성 다발성 골수종을 앓고 있는, 방법.
  62. 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 쿼드- 또는 펜타-불응성 다발성 골수종을 앓고 있는, 방법.
  63. 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이전에 프로테아솜 저해제의 투여, 면역 조절 약물의 투여, 알킬레이터의 투여, CD38 단클론성 항체의 투여, 및 글루코코르티코이드의 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 상이한 치료 라인으로 치료된 적이 있으며, 상기 대상체가 적어도 하나의 프로테아솜 저해제 및 적어도 하나의 면역 조절 약물에 불응성인, 방법.
  64. 제48항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 이전 치료에 대한 치료 동안 또는 이전 치료에 대한 치료 중단 후 60일 이내에 M-단백질/유리 경쇄 차이 또는 질환의 진행의 25% 미만의 감소를 갖는, 방법.
  65. 제1항 내지 제16항, 제20항 내지 제42항, 제46항 내지 제59항, 제63항 및 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 다발성 골수종, 신장 세포 암종, 방광암, 폐암, 간암, 림프종, 위암, 결정암, 육종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조된 T 세포가 하기 특성들 중 하나 이상을 갖는 제조된 T 세포의 집단인, 방법:
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IFN-γ 분비의 적어도 50% 증가 ;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 TNF-α 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 GM-CSF 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IL-2 분비의 적어도 50% 증가;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 CD4, CD62L, CCR7 및 CD127에 대해 적어도 50% 양성의 세포 백분율의 증가;
    T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 50% 이하의 4EBP1 포스포릴화 증가;
    동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p70S6K 또는 Raptor의 적어도 50% 발현 감소;
    동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p-STAT5의 적어도 50% 발현 감소;
    검출 가능한 수준의 STAT1 및 p-STAT1 발현;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 p70S6K 발현의 적어도 10% 증가;
    T-Rapa 세포의 집단에 비해 CD25의 발현의 적어도 50% 감소;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CTLA4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIM3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 PD1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 2B4를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAIR1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 TIGIT를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 LAG3을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 10% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD25를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 KLRG1을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD39를 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD73을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 20% 이하;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 GITR을 발현시키는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 5% 이하;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 약 20% 이내의 CD28 발현 수준;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 약 20% 이내의 ICOS 발현 수준;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 약 20% 이내의 CD45RA 발현 수준;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD45RA에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 적어도 50% 증가;
    동일한 조건 하에서 인큐베이션된 T-Rapa 배양물에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가;
    3:1 내지 1:3 입자:T 세포 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2의 분비;
    IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션될 때에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
    IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2 분비(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
    T-Rapa 세포의 집단의 상응하는 발현 수준에 비해, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 발현의 적어도 25% 감소;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 상응하는 발현 수준의 25% 내의, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준;
    적어도 5%의, CD127을 발현시키는 CD4+ T 세포;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 대조 T 세포 집단에 비해 CD127을 발현시키는 CD4+ T 세포의 빈도의 적어도 50% 증가;
    배양물 투입 T 세포에 비해 CD62L 및 CCR7을 공동-발현시키는 T 세포의 빈도의 적어도 25% 증가;
    5% 미만의 비율 및 더욱 바람직하게는 1% 미만의 비율로 IL-2 수용체 CD25를 공동-발현시키는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도;
    높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 이용한 자극 절차 후에 배양물 상청액에 함유된 24시간당 1×106개의 세포당 100 g/㎖ 미만으로 규정된 바와 같은, 제조 종료 시에 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 분비;
    6일 분비 수준에 비해 적어도 5배 및 더욱 바람직하게는, 20배 증가된 저해제의 부재 하에서 6일 확장 기간 후 IFN-γ 및 TNF-α 분비의 증가; 및
    이들의 조합.
    [청구항 162]
    하기 특성들 중 하나 이상을 갖는, 제조된 T 세포:
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IFN-γ 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 TNF-α 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 GM-CSF 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IL-2 분비의 적어도 50% 증가;
    T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 50% 이하의 4EBP1 포스포릴화 증가;
    동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p70S6K 또는 Raptor 발현의 적어도 50% 감소;
    동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p-STAT5 발현의 적어도 50% 감소;
    검출 가능한 수준의 STAT1 및 p-STAT1 발현;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 p70S6K 발현의 적어도 10% 증가;
    T-Rapa 세포의 집단에 비해 CD25의 발현의 적어도 50% 감소;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 CD28의 발현 수준;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 ICOS의 발현 수준;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 CD45RA의 발현 수준;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD45RA에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 적어도 50% 증가;
    동일한 조건 하에서 인큐베이션된 T-Rapa 배양물에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가;
    3:1 내지 1:3 입자:T 세포 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2의 분비;
    IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션될 때에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
    IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2 분비(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
    T-Rapa 세포의 집단의 상응하는 발현 수준에 비해, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 발현의 적어도 25% 감소;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 상응하는 발현 수준의 25% 내의, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준;
    CD127을 발현시킴;
    높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 이용한 자극 절차 후에 배양물 상청액에 함유된 24시간당 1×106개의 세포당 100 g/㎖ 미만으로 규정된 바와 같은, 제조 종료 시에 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 분비;
    6일 분비 수준에 비해 적어도 5배 및 더욱 바람직하게는, 20배 증가된 저해제의 부재 하에서 6일 확장 기간 후 IFN-γ 및 TNF-α 분비의 증가; 및
    이들의 조합.
  67. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조된 T 세포가 하기 특성들 중 적어도 하나를 갖는, 방법:
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IFN-γ 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 TNF-α 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 GM-CSF 분비의 적어도 50% 증가;
    3:1의 입자:T 세포의 항-CD3/항-CD28 자성 입자로의 자극을 이용한 1주 인큐베이션 후에 T-Rapa 세포에 비해 IL-2 분비의 적어도 50% 증가;
    T 세포의 집단을 생산하는 T 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 50% 이하의 4EBP1 포스포릴화 증가;
    동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p70S6K 또는 Raptor 발현의 적어도 50% 감소;
    동일한 조건 하에서 배양된 T-Rapa 세포의 집단에 비해 p-STAT5 발현의 적어도 50% 감소;
    검출 가능한 수준의 STAT1 및 p-STAT1 발현;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에 비해 p70S6K 발현의 적어도 10% 증가;
    T-Rapa 세포의 집단에 비해 CD25의 발현의 적어도 50% 감소;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 CD28의 발현 수준;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 ICOS의 발현 수준;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단의 20% 이내의 CD45RA의 발현 수준;
    유세포 분석법에 의해 측정한 경우 CD45RA에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 적어도 50% 증가;
    동일한 조건 하에서 인큐베이션된 T-Rapa 배양물에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가;
    3:1 내지 1:3 입자:T 세포 비의 항-CD3/항-CD28 코팅된 자성 입자로의 공동-자극 후 적어도 500 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2의 분비;
    IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션될 때에 비해 IL-2 분비의 적어도 1.1배 증가(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
    IL-7, IL-15 또는 IL-7과 IL-15의 조합의 존재 하에서 인큐베이션 후 적어도 1000 g/㎖/1×106개의 세포/일의 IL-2 분비(여기서, IL-7 및 IL-15는 존재할 때, 각각 10 ng/㎖로 첨가됨);
    T-Rapa 세포의 집단의 상응하는 발현 수준에 비해, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제 발현의 적어도 25% 감소;
    제조된 T 세포의 집단을 생산하는 세포에 특징적인 T 세포의 대조 집단에서 상응하는 발현 수준의 25% 내의, CD39, CD73, GITR, LAG3, PD1, 2B4, LAIR1, CTLA4, KLRG1, TIGIT, TIM3 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 관문 저해제의 발현 수준;
    CD127을 발현시킴;
    높은 수준의 공동-자극(3:1 입자-대-T 세포 비)을 이용한 자극 절차 후에 배양물 상청액에 함유된 24시간당 1×106개의 세포당 100 g/㎖ 미만으로 규정된 바와 같은, 제조 종료 시에 낮은 수준의 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α 분비;
    6일 분비 수준에 비해 적어도 5배 및 더욱 바람직하게는, 20배 증가된 저해제의 부재 하에서 6일 확장 기간 후 IFN-γ 및 TNF-α 분비의 증가; 및
    이들의 조합.
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