CN113316454A - 用于利用制造的t细胞治疗癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于治疗癌症的方法。用于治疗癌症的方法可以包含施用喷司他丁和环磷酰胺，之后施用制造的T细胞。本公开进一步提供了用于产生此类制造的T细胞的方法、所述制造的T细胞和包括所述制造的T细胞的组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年11月16日提交的美国临时申请第62/768,145号、于2019年10月28日提交的美国临时申请第62/927,034号和于2019年10月28日提交的美国临时申请第62/927,079号的优先权，所述美国临时申请中的每个美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
I型细胞因子谱的CD4+和CD8+T细胞(分别为Th1和Tc1细胞)是针对过继性T细胞疗法工作的候选T细胞群。通过刺激STAT1和STAT4转录因子的如IL-12和IFN-α等极化细胞因子促进这种Th1型T细胞，所述极化细胞因子进而促进部分地限定Th1型分化状态的TBET转录因子。
过继性T细胞疗法的成功部分依赖于T细胞群在宿主中的体内持久性。T细胞持久性是一种由T细胞增殖和维持T细胞记忆的能力的增加和T细胞凋亡性细胞死亡的倾向的减少两者所决定的平衡。在先前的研究中，已经证明，在药理学药剂雷帕霉素(其抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标mTOR)中体外制造T细胞产生的T细胞表现出这些特性，即：过继转移后，在体内进行抗原驱动的克隆扩增的能力增强；改善的记忆状态，如T中枢记忆(TCM)分化状态例示的；以及以诱导自噬(包含线粒体自噬)和bcl-2基因家族的抗凋亡成员相对于促凋亡成员的优先表达为特征的多层面抗凋亡表型。综上所述，离体制造的雷帕霉素抗性细胞的这些性质与移植反应的体内调节的增强相关联，所述移植反应的体内调节包含移植物抗宿主病(GVHD)和移植物排斥的预防以及人-小鼠异种GVHD的介导；值得注意的是，这些细胞已经在针对多发性骨髓瘤治疗的自体和异体环境中成功转化为临床试验，并且示出对复发性、难治性多发性骨髓瘤安全且有效。对于这些临床试验工作，制造过程包含以下元素：用抗CD3、抗CD28涂覆的磁珠(3/28珠)以3个珠:1个T细胞的相对较高比率共刺激；向离体培养同时添加T细胞和3/28珠；添加大剂量口服施用mTOR抑制剂雷帕霉素(1μM)；以及在细胞因子极化(IFN-α添加)期间向培养添加IL-2。通过该方法产生的细胞在本文中被称为T-Rapa细胞，所述T-Rapa细胞本公开后面对其进行了更具体地限定。
癌症发展可能与免疫功能的改变相关联。此类改变包含与无法排斥肿瘤相关联的细胞介导免疫(CMI)抑制，以及可以加强肿瘤促进和进展的体液免疫增强。CD4+T细胞亚群、Th1 T细胞和Th2 T细胞具有不同的功能并且相互调节。Th1细胞产生白细胞介素(IL-2)和干扰素(IFN-γ)并且指导CMI应答，而Th2细胞产生IL-4和IL-10并且促进局部体液免疫应答。
存在某些癌症中有Th1/Th2失衡的证据，其中在减少Th1细胞数量的情况下，Th2细胞的比例显著升高。有利于Th2的慢性Th1/Th2失衡潜在地导致细胞介导免疫抑制，由此为有效免疫监测降低和恶性肿瘤发展提供了有利的环境。
在大多数患有早期多发性骨髓瘤的患者中发现了独特型特异性T细胞应答。这些应答包含带有IL-2和IFN-γ产生的Th1应答。例如，优先地在无痛疾病的病例中发现Th1型免疫，并且主要在晚期多发性骨髓瘤病例中发现Th2型应答。在多发性骨髓瘤患者中发现缺陷性Th1免疫应答(由IL-6介导)和调节异常的细胞因子网络。源自MM患者的骨髓瘤独特型特异性T辅助细胞一致地是非Th1表型。
尽管多发性骨髓瘤的治疗取得了进展，并且FDA近期批准了新的药剂和单克隆抗体，多发性骨髓瘤几乎是普遍致命的。如此，患有复发性、难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的使用针对多发性骨髓瘤的前五种药物都难以治疗(“五重难治性(penta-refractory)”)的患者只有有限的几个月的生存期和很少的治疗选择。如长期观察的异基因干细胞移植的治愈作用和许多其它方法(包含单克隆抗体疗法、疫苗以及T细胞受体(TCR)修饰的和CAR修饰的T细胞疗法)所证明的，多发性骨髓瘤是易受免疫治疗影响的疾病。如此，该五重难治性患者群体适合于新型T细胞疗法。另外，患有低难治性疾病的患者也迫切需要新型疗法；即，即使在疾病第二次或第三次复发时，中位无进展生存期通常少于两年。
对于某些癌症，需要新型和创新的免疫疗法。
发明内容
本公开涉及一种用于治疗受试者的癌症的方法。
在一个实施例中，一种方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。
在另一个实施例中，所述方法进一步包括在向所述受试者施用治疗有效剂量的所述包括制造的T细胞的组合物之前，使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能。
在一些实施例中，所述免疫耗竭方案包括向所述受试者施用包括喷司他丁(pentostatin)的第一组合物；以及向所述受试者施用包括环磷酰胺的第二组合物。
在一些实施例中，所述方法包括第一治疗周期和一个或多个另外的治疗周期，所述第一治疗周期包括：使所述受试者经受第一免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能；所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期包括：使所述受试者经受第二免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能；以及向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。
在前述实施例中的任何实施例中，所述方法可以进一步包括在向所述受试者施用一个或多个另外剂量的喷司他丁之前，测量所述受试者的肌酐清除率(CrCl)，并且基于所述CrCl调整向所述受试者施用喷司他丁的剂量，其中当CrCl≥60毫升/分钟/1.73平方米时，以4mg/m2施用喷司他丁，其中当60毫升/分钟/1.73平方米>CrCl≥30毫升/分钟/1.73平方米时，以2mg/m2施用喷司他丁，并且其中当CrCl<30毫升/分钟/1.73平方米时，不施用喷司他丁。在一些实施例中，可以基于CrCl调整喷司他丁的剂量，使得当60毫升/分钟/1.73平方米>CrCl≥30毫升/分钟/1.73平方米时，喷司他丁的剂量减少50％，并且其中当CrCl<30毫升/分钟/1.73平方米时，不施用喷司他丁。
在前述实施例中的任何实施例中，所述方法可以进一步包括在施用一个或多个另外剂量的环磷酰胺之前，测量绝对淋巴细胞计数(ALC)和绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)，并且基于所述ALC和ANC调整向所述受试者施用环磷酰胺的剂量，其中当ANC>每微升1000个时，以200mg的剂量施用环磷酰胺，其中当ANC为每微升500-999个并且ALC≥每微升50个时，以100mg的剂量施用环磷酰胺，并且其中当ALC<每微升50个或ANC<每微升500个时，不施用环磷酰胺。在一些实施例中，可以基于ALC和ANC调整环磷酰胺的剂量，使得当ANC为每微升500-999个并且ALC≥每微升50个时，环磷酰胺的剂量减少50％，或者当ALC<每微升50个或ANC<每微升500个时，不施用环磷酰胺。
附图说明
图1A描绘了在第0天以及各种培养条件之后表达FoxP3的CD4+T细胞的百分比。
图1B描绘了在第0天以及各种培养条件之后表达TBET的CD4+T细胞的百分比。
图2A描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的T细胞产率。
图2B描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的T细胞产率。
图3A描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的IFN-γ分泌。
图3B描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的TNF-α分泌。
图4描绘了来自使用T-Rapa方法和本公开的方法(Rapa-T)培养的CD4+和CD8+T细胞的p-4EBP1和肌动蛋白的蛋白质印迹(上图)。在使用T-Rapa方法和本公开的方法(Rapa-T)培养的CD4+和CD8+T细胞中通过肌动蛋白表达使p-4EBP1水平归一化(下图)。
图5描绘了来自使用T-Rapa方法和本公开的方法(Rapa-T)培养的CD4+和CD8+T细胞的P70S6K和肌动蛋白的蛋白质印迹(上图)，以及在使用T-Rapa方法和本公开的方法培养的CD4+和CD8+T细胞中通过肌动蛋白表达归一化的P70S6K水平(下图)。
图6描绘了来自使用T-Rapa方法和本公开的方法(Rapa-T)培养的CD4+和CD8+T细胞的P-STAT5和肌动蛋白的蛋白质印迹(上图)，以及在使用T-Rapa方法和本公开的方法培养的CD4+和CD8+T细胞中通过肌动蛋白表达归一化的P-STAT5水平(下图)。
图7A描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第6天IFN-γ分泌。
图7B描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第13天IFN-γ分泌。
图8A描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第6天TNF-α分泌。
图8B描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第13天TNF-α分泌。
图9A描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第6天GM-CSF分泌。
图9B描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第13天GM-CSF分泌。
图10A描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第6天IL-2分泌。
图10B描绘了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞后的第13天IL-2分泌。
图11描绘了来自在各种条件下培养的CD4+和CD8+T细胞的P62和肌动蛋白的蛋白质印迹(上图)，以及在各种条件下的CD4+和CD8+T细胞中通过肌动蛋白表达归一化的P62蛋白表达(下图)。
图12描绘了来自在各种条件下培养的CD4+和CD8+T细胞的p-RAPTOR和肌动蛋白的蛋白质印迹(上图)，以及在各种条件下培养的CD4+和CD8+T细胞中通过肌动蛋白表达归一化的p-RAPTOR水平(下图)。
图13描绘了来自在各种条件下培养的CD4+和CD8+T细胞的BIM和肌动蛋白的蛋白质印迹(上图)，以及在各种条件下培养的CD4+和CD8+T细胞中通过肌动蛋白表达归一化的BIM蛋白表达(下图)。
图14A描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD45RA的流式细胞术表达分析。
图14B描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD45RA的流式细胞术表达分析。
图14C描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD45RA的流式细胞术表达分析。
图14D描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD45RA的流式细胞术表达分析。
图15A描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD62L、CCR7和CD127的流式细胞术表达分析。
图15B描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD62L、CCR7和CD127的流式细胞术表达分析。
图15C描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD62L、CCR7和CD127的流式细胞术表达分析。
图15D描绘了在各种条件下培养T细胞后，CD4+细胞亚群上CD62L、CCR7和CD127的流式细胞术表达分析。
图16描绘了在各种条件下培养的T细胞的培养产率的增加倍数。
图17A描绘了在各种条件下培养T细胞后第6天的IFN-γ分泌。
图17B描绘了在各种条件下培养T细胞后第13天的IFN-γ分泌。
图18A描绘了在各种条件下培养T细胞后第6天的TNF-α分泌。
图18B描绘了在各种条件下培养T细胞后第13天的TNF-α分泌。
图19描绘了在各种条件下培养T细胞后第6天和第13天CD4+T细胞亚群上CD25的流式细胞术表达分析。
图20描绘了在各种条件下培养T细胞后第6天和第13天CD4+T细胞亚群上CD62L、CCR7和CD127的流式细胞术表达分析。
图21描绘了针对以下比较了不并入珠共刺激的新Rapa-T方法、并入珠共刺激的新Rapa-T方法(珠与T细胞比率为1:3)与旧T-Rapa方法(珠与T细胞比率为3:1)的流式细胞术表达分析：原初和T中枢记忆图：CD45RA表达；CD62L和CCR7的共表达；以及CD62L、CCR7和CD127的共表达。
图22描绘了针对以下比较了不并入珠共刺激的新Rapa-T方法、并入珠共刺激的新Rapa-T方法(珠与T细胞比率为1:3)与旧T-Rapa方法(珠与T细胞比率为3:1)的流式细胞术表达分析：IL-2受体CD25的表达；以及免疫抑制分子CTLA4和TIM3的表达。
图23描绘了在制造结束时和在不使用抑制剂的情况下培养另外6天后的细胞因子分泌结果，其针对以下比较了不并入珠共刺激的新Rapa-T方法、并入珠共刺激的新Rapa-T方法(珠与T细胞比率为1:3)与旧T-Rapa方法(珠与T细胞比率为3:1)：II型细胞因子IL-4的分泌；以及I型细胞因子IFN-γ的分泌。
图24描绘了在制造结束时以及在n＝11种不同培养条件下在不使用抑制剂的情况下培养另外6天后的I型细胞因子分泌(IL-2和IFN-γ)结果，以进一步鉴定无珠共刺激在新Rapa-T细胞群制造中的作用。
图25A描绘了在各种培养条件下针对T细胞的CD45RA+的流式细胞术数据测量。
图25B描绘了在各种培养条件下针对T细胞的CD25+的流式细胞术数据测量。
图25C描绘了在各种培养条件下针对T细胞的CD28+的流式细胞术数据测量。
图25D描绘了在各种培养条件下针对T细胞的ICOS+的流式细胞术数据测量。
图25E描绘了在各种培养条件下针对T细胞的CD39+的流式细胞术数据测量。
图25F描绘了在各种培养条件下针对T细胞的CD73+的流式细胞术数据测量。
图25G描绘了在各种培养条件下针对T细胞的GITR+的流式细胞术数据测量。
图25H描绘了在各种培养条件下针对T细胞的LAG3+的流式细胞术数据测量。
图25I描绘了在各种培养条件下针对T细胞的PD1+的流式细胞术数据测量。
图25J描绘了在各种培养条件下针对T细胞的2B4+的流式细胞术数据测量。
图25K描绘了在各种培养条件下针对T细胞的LAIR1+的流式细胞术数据测量。
图25L描绘了在各种培养条件下针对T细胞的CTLA4+的流式细胞术数据测量。
图25M描绘了在各种培养条件下针对T细胞的KLRG1+的流式细胞术数据测量。
图25N描绘了在各种培养条件下针对T细胞的TIGIT+的流式细胞术数据测量。
图25O描绘了在各种培养条件下针对T细胞的TIM3+的流式细胞术数据测量。
图26描绘了在各种培养条件下细胞的p-STAT5、p-STAT1、STAT1、p70S6K、p-SGK1、SGK1、Raptor、Rictor、细胞色素C和肌动蛋白的蛋白质印迹结果。
图27A描绘了来自在用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共同刺激并暴露于不同细胞因子后24小时上清液的RAPA-T细胞和T-RAPA细胞的IL-2分泌测量。
图27B描绘了来自在用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共同刺激并暴露于不同细胞因子后24小时上清液的RAPA-T细胞和T-RAPA细胞的TNF-α分泌测量。
图28描绘了在使用抗CD3/抗CD28涂覆的珠或可溶解的抗CD3/抗CD28微粒共刺激后的RAPA-T细胞的IL-2、TNF-α和IL-13分泌测量。
图29描绘了在使用抗CD3/抗CD28涂覆的珠或可溶解的抗CD3/抗CD28微粒共刺激后，通过流式细胞术测量的RAPA-T细胞的CD4、CD8、CD25和CTLA4表达。
图30描绘了制造的T细胞疗法方案。
图31描绘了喷司他丁/环磷酰胺方案，然后进行制造的T细胞输注。
图32A-32C详细说明了对照组的性质，即未随机分为接受Rapa-T细胞疗法的受试者将接受适用于患有第二次或第三次复发的MM的受试者的经FDA批准的三种三重方案之一，即：DPd方案(A)；DRd方案(B)；或KRd方案(C)。
图33描绘了用于产生本公开的制造的T细胞的示例性工作流程。
图34A描绘了暴露于胰腺癌细胞后RAPA-T细胞的细胞因子分泌。
图34B描绘了暴露于肺癌细胞后RAPA-T细胞的细胞因子分泌。
图35描绘了在暴露于或未暴露于胰腺癌细胞或肺癌细胞的情况下，RAPA-T细胞的细胞因子分泌。
图36描绘了检查点抑制剂治疗反应与癌症中的肿瘤突变数量之间的相关性。
具体实施方式
本公开提供了用于产生制造的T细胞的方法、通过本文公开的方法产生的制造的T细胞、包括制造的T细胞群的群和组合物以及用于使用所述制造的T细胞或制造的T细胞群治疗受试者的癌症的方法。
定义
提供了以下定义：
如本文所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述”包含复数指示物。权利要求和本公开中术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的。
当与数值一起使用时，术语“约”的使用旨在包含+/-10％。作为举例而非限制，如果鉴定出的氨基酸数目为约200，则这将包含180到220(正负10％)。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指要治疗的哺乳动物受试者，其中人类患者是优选的。在一些情况下，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用以及疾病动物模型的开发，包含但不限于包含小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物；和灵长类动物。
“样品”以其最广泛的意义在本文中使用。包括细胞、多核苷酸、多肽、肽、抗体等的样品可以包括体液；细胞制剂的可溶性级分，或细胞在其中生长的培养基；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或膜；溶液中或与底物结合的基因组DNA、RNA或cDNA、多肽或肽；细胞；组织；组织印迹；指纹、皮肤或头发；等。
“治疗”是旨在防止病症发展或改变病症的病理学或症状所进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和防治性或预防性措施两者。需要治疗的患者包含已经患有所述病症的患者以及需要预防所述病症的患者。例如，在肿瘤(例如，癌症)治疗中，治疗剂可以直接降低肿瘤细胞的病理学，或使肿瘤细胞更易于受到其它治疗剂(例如，放射和/或化学疗法)的治疗。如本文所使用的，“改善”是指接近归一化值(作为举例而非限制，在健康患者或个体中获得的值)的症状，例如，与归一化值相差小于50％的症状，优选地与归一化值相差小于约25％的症状，更优选地与归一化值相差小于10％的症状，并且还更优选地与使用常规统计检验确定的归一化值相差不大的症状。作为举例而非限制，患有传染性疾病生物体(例如，乙型肝炎病毒)的患者的改善或治疗可以通过从患者采集的样品中病毒颗粒的减少来确定，如例如通过噬斑形成单位(p.f.u.)的减少测量的。
如本文所使用的，“治疗周期”通常可以指任何主要治疗周期、第一治疗周期、第二治疗周期或一个或多个另外的治疗周期。
如本文所使用的，术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”意指有效产生所期望治疗应答的本发明的化合物的量。作为举例而非限制，有效地延迟癌症生长或使癌缩小或预防转移的剂量可以是“治疗有效剂量”。具体的治疗有效剂量将随这种因素而变化，如所治疗的特定病状、患者的身体状况、所治疗哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、并发疗法的性质(如果有的话)以及所采用的具体调配物和化合物或其衍生物的结构。
如本文所使用的，“免疫细胞”意在包含可以被测定的免疫系统的任何细胞，包含但不限于B淋巴细胞(也称为B细胞)、T淋巴细胞(也称为T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯(Langerhans)细胞、干细胞、树突状细胞、外周血单核细胞、肿瘤浸润(TIL)细胞、基因修饰的免疫细胞(包含杂交瘤)、药物修饰的免疫细胞以及上述细胞类型的衍生物、前体或祖细胞。
“T细胞”是源自胸腺并且具有与CD3复合物的蛋白质相关联的异二聚体受体(例如，重排的T细胞受体、T细胞表面上负责细胞的抗原/MHC特异性的异二聚体蛋白质)的淋巴细胞的亚群。可以通过测定T细胞应答对其它细胞的作用(例如，靶细胞杀伤、如B细胞等其它免疫细胞的激活)或T细胞应答产生的细胞因子来检测T细胞应答。
如本文所使用的，术语“抗CD3/抗CD28”应理解为是指抗CD3/抗CD28抗体。例如，“抗CD3/抗CD28磁珠”应理解为是指具有与其相关联的抗CD3/抗CD28抗体部分的磁珠。在公开即使通过如抗CD3/抗CD28磁珠等特定形式也没有提供抗CD3/抗CD28共刺激的情况下，应当理解，这也可以排除使用其它形式的抗CD3/抗CD28的共刺激。
如本文所使用的，术语“一个或多个T-Rapa细胞”是指通过以3:1的比率(珠与T细胞比率)使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激并且在培养起始与共刺激之间没有延迟的情况下产生的一个或多个T细胞，其中细胞在X-Vivo或含有IFN-α(10,000IU/mL)、IL-2(20IU/mL)和雷帕霉素(1μM)的补充有5％的AB血清但不添加IL-2信号传导抑制剂的等效培养基中生长，其中细胞在37℃下培养6天，并且然后以1.5×106个细胞/mL的浓度开始培养。如关于方法所使用的，除非另有说明，否则“T-Rapa”是指产生如上文定义的T-Rapa细胞的方法。
如本文所使用的，术语“制造的T细胞”和“Rapa-T细胞”可互换使用，用于指通过本公开的方法产生的T细胞。“制造的T细胞”可以包含CD4+、CD8+T细胞或两者。“制造的T细胞”不包含从患者收集的T细胞，即天然存在的T细胞。
应当理解，如本文所使用的，“表达水平(level of expression)”、“表达水平(expression level)”或等效参考在用于指代通过流式细胞术测量的结果时，是指群中指定类型的阳性细胞的频率。就“表达水平(level of expression)”或等同表达是指特定细胞类型的表达水平来说，应当理解，除非另有说明，否则所提及的任何减少或增加均相对于对应的指定细胞类型。
如本领域技术人员将认识到的，术语“自体”细胞是指与细胞被施用于的受试者或“宿主”的细胞具有相同或相似单倍型的细胞，使得当将这些细胞移植到宿主中时不会发生针对这些细胞的显著免疫应答。
“CD4”是细胞表面蛋白，其对于T细胞受体识别在APC表面上与MHC II类分子结合的抗原肽很重要。激活后，原初CD4 T细胞分化为至少两种细胞类型(Th1细胞和Th2细胞)之一，每种类型均以其产生的细胞因子为特征。“Th1细胞”主要涉及激活巨噬细胞的细胞免疫和炎性反应，而“Th2细胞”或“辅助T细胞”主要涉及刺激B细胞产生抗体(体液免疫)。CD4是人免疫缺陷病毒(HIV)的受体。用于Th1细胞的效应分子包含但不限于IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、CD40配体、Fas配体、IL-3、TNF-β和IL-2。用于Th2细胞的效应分子包含但不限于IL-4、IL-5、IL-13、CD40配体、IL-3、G-CSF、IL-10、TGF-β和嗜酸性粒细胞趋化因子。Th1型细胞因子应答的激活可以抑制Th2型细胞因子应答，并且相反地，Th2型细胞因子应答的激活可以抑制Th1型应答。
“细胞因子”是由细胞制造的蛋白质，所述蛋白质通过细胞因子所作用的细胞的表面上的“细胞因子受体”影响其它细胞的行为。淋巴细胞制造的细胞因子有时被称为“淋巴因子”。细胞因子也被表征为I型(例如，IL-2和IFN-γ)和II型(例如，IL-4和IL-10)。
术语“调节”意指任何提及的活性例如被增加、增强、增加、激动(充当激动剂)、促进、减少、降低、抑制、阻塞或拮抗(充当激动剂)。调节可以使活性增加超过基线值的1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调节还可以将其活性降低到基线值以下。
“底物”是指与核酸分子或蛋白质结合的任何刚性或半刚性载体，并且包含膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁性或非磁性珠、凝胶、毛细管或其它管、板、聚合物以及具有多种表面形式(包含孔、沟槽、销、通道(chamiels)和孔隙)的微粒。
用于产生制造的T细胞的方法、通过本文公开的方法产生的制造的T细胞以及包括制造的T细胞群的组合物
在本公开的方法中，IFN-α用于将包括T细胞的培养物向Th1型分化状态表型离体极化。Th1型分化可以被朝向调节性T(TREG)细胞表型的极化削弱，所述Th1型分化由包含IL-2的细胞因子促进，所述细胞因子通过STAT5发出信号以促进部分限定TREG分化状态的FoxP3转录因子。在本公开的方法中，通过在细胞培养期间省略IL-2的外源使用并且通过添加IL-2信号传导抑制剂的培养来防止自分泌IL-2信号传导，在Th1型极化期间限制了TREG污染。在一些方面，IL-2信号传导抑制剂是抗IL-2受体单克隆抗体。
在本公开中，提供了新的制造方法，与其它T细胞制造方法相比，所述新的制造方法结合了以下干预措施：(1)延迟或不添加抗CD3/CD28珠(可替代地，可以提供抗CD3/抗CD28共刺激的任何替代来源，如纳米颗粒或微粒)进行培养以提高T细胞产率，其中抗CD3/CD28珠或纳米颗粒用于共刺激；(2)使用较低比率的抗CD3/CD28珠来增强抗性T细胞表型，或可替代地，不添加基于人工抗体的珠、纳米颗粒或微粒的共刺激；(3)使用mTOR抑制的肠胃外调配物(替西罗莫司(temsirolimus))以提高制造可行性；以及(4)通过在T细胞培养期间省略外源性IL-2的典型使用并消除内源性自分泌IL-2信号传导来避免IL-2信号传导和由此产生的Th1型分化的TREG细胞污染，例如，通过在T细胞培养期间使用抗IL-2受体单克隆抗体(达克珠单抗(daclizumab)和巴利昔单抗(basiliximab)或其它抑制IL-2受体信号传导的试剂)。在并行培养实验中，通过这种新的组合方法产生的T细胞(被称为“制造的T细胞”)相对于先前在离体培养中产生的T细胞表现出更理想的细胞表型。
图33提供了用于产生本公开的制造的T细胞的示例性工作流程。
在一些实施例中，用于产生制造的T细胞的方法包含在包括替西罗莫司和IL-2信号传导抑制剂的培养基中，以一定细胞密度接种包括来自受试者的T细胞的培养物输入细胞群的步骤。在某些方面，培养基中尚不包含替西罗莫司和/或IL-2信号传导抑制剂，并且可以在或大约在接种的同时添加这些组分。将培养物输入细胞群温育第一时间段而不使用通过抗CD3/抗CD28抗体的共刺激，作为举例而非限制，包含使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠、纳米颗粒或微粒的共刺激。在所述第一时间段之后，可以通过抗CD3/抗CD28抗体，例如，通过添加抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠、纳米颗粒或微粒来刺激培养物输入细胞群。在使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠的情况下，可以以介于1:1与1:12之间的珠比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠。另外，将IFN-α添加到培养基。然后将培养物输入细胞群温育第二时间段以产生制造的T细胞。在一些方面，不存在使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠、纳米颗粒或微粒的共刺激。在一些实施例中，不执行共刺激。
在前述实施例中的任何实施例中，产生制造的T细胞的方法可以进一步包含在收获所述制造的T细胞之后：将所述制造的T细胞的至少一部分包装在包装中；以及冷冻含有所述制造的T细胞的所述部分的所述包装。所述制造的T细胞的冷冻保存可以通过本领域已知的方法进行。
在前述实施例中的任何实施例中，方法可以进一步包含，在培养基中以一定细胞密度接种来自所述受试者的T细胞之前：从所述受试者收获所述培养物输入细胞群。
在前述实施例中的任何实施例中，所述培养基可以不含有IL-2并且没有IL-2可以添加到所述培养基。在前述实施例中的任何实施例中，没有血清可以添加到培养物，例如，培养物是无血清的。在前述实施例中的任何实施例中，培养基可以是基本上无血清的。
在前述实施例中的任何实施例中，可以在或大约在添加抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠的同时添加所述IFN-α。如果没有对培养物进行共刺激，则可以在例如培养开始时或培养开始后48小时内添加IFN-α。作为举例而非限制，IFN-α可以在培养开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时添加。
在前述实施例中的任何实施例中，所述细胞密度可以为约每mL 1×106个T细胞到每mL 50×106个细胞。作为举例而非限制，所述细胞密度可以为约每mL 1×106个细胞到每mL 5×106个细胞、每mL 1×106个细胞到每mL 10×106个细胞、每mL 1×106个细胞到每mL15×106个细胞、每mL 15×106个细胞到每mL 22.5×106个细胞、每mL 10×106个细胞到每mL 22.5×106个细胞、每mL 10×106个细胞到每mL 22.5×106个细胞、每mL 5×106个细胞到每mL 22.5×106个细胞、每mL 1×106个细胞到每mL 50×106个细胞、每mL 10×106个细胞到每mL 40×106个细胞、每mL 20×106个细胞到每mL 40×106个细胞、每mL 1×106个细胞、每mL 2.5×106个细胞、每mL 5×106个细胞、每mL 7.5×106个细胞、每mL 10×106个细胞、每mL 12.5×106个细胞、每mL15×106个细胞、每mL 17.5×106个细胞、每mL 20×106个细胞、每mL 22.5×106个细胞、每mL 25×106个T细胞、每mL 30×106个细胞、每mL 35×106个细胞、每mL40×106个细胞、每mL 45×106个细胞或每mL 50×106个细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，所述替西罗莫司可以以0.1-5μM的浓度存在于所述培养基中。在一些实施例中，替西罗莫司可以以0.1-1μM的浓度存在于所述培养基中。在前述实施例中的任何实施例中，替西罗莫司可以以1μM的浓度存在于所述培养基中。作为举例而非限制，替西罗莫司可以以至少0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM或更大的浓度存在于所述培养基中。作为进一步举例而非限制，替西罗莫司可以以约1-5μM、2-5μM、3-5μM、4-5μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM或更大的浓度存在于所述培养基中。
在前述实施例中的任何实施例中，可以在第二时间段期间，一次或多次将所述替西罗莫司添加到所述培养基以维持期望的浓度。在前述实施例中的任何实施例中，可以将替西罗莫司添加到所述培养基一次。通过非限制性实例的方式，可以在所述第二时间段期间每2天将所述替西罗莫司添加到所述培养基。期望的替西罗莫司浓度可以为介于0.1-5μM之间。在前述实施例中的任何实施例中，期望的替西罗莫司浓度可以为介于0.1-1μM之间。在前述实施例中的任何实施例中，期望的替西罗莫司浓度可以为1μM。作为举例而非限制，期望的替西罗莫司浓度可以为至少0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM或更大。作为进一步举例而非限制，期望的替西罗莫司浓度可以为约1-5μM、2-5μM、3-5μM、4-5μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM或更大的浓度。
IL-2信号传导抑制剂可以是抑制IL-2信号传导的任何物质，并且可以以足以抑制IL-2信号传导的量添加。在前述实施例中的任何实施例中，所述IL-2信号传导抑制剂可以是抗IL-2受体抗体或其片段，如巴利昔单抗或达克珠单抗。所述IL-2信号传导抑制剂可以以5μg/mL到50μg/mL的浓度存在于所述培养基中。通过非限制性实例的方式，IL-2信号传导抑制剂可以以约5μg/mL到50μg/mL、5μg/mL到40μg/mL、5μg/mL到30μg/mL、5μg/mL到20μg/mL、5μg/mL到10μg/mL、40μg/mL到50μg/mL、30μg/mL到50μg/mL、20μg/mL到50μg/mL、20μg/mL到40μg/mL、20μg/mL到30μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL的浓度存在。
在前述实施例中的任何实施例中，所述第一时间段可以为约8小时到约24小时。通过非限制性实例的方式，所述第一时间段可以为约8小时到约20小时、8小时到约16小时、8小时到约12小时、20小时到约24小时、16小时到约24小时、12小时到约24小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时。
在前述实施例中的任何实施例中，所述珠与T细胞比率可以为1:3。在一些实施例中，珠与T细胞比率可以介于1:12与1:1之间，或在最极端的实例中，没有珠添加。作为举例而非限制，可以使用1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1的比率或介于其之间的任何范围。在一些实施例中，可以使用含有抗CD3/抗CD28的纳米颗粒实现培养物输入细胞群的共刺激，所述纳米颗粒可以以低于推荐浓度的浓度使用。作为举例而非限制，此类纳米颗粒可以以推荐剂量的约0.01倍到约0.1倍、约0.025倍到约0.1倍、约0.05倍到约0.1倍、约0.075倍到约0.1倍、约0.01倍到约0.075倍、约0.01倍到约0.05倍、约0.01倍到约0.025倍、约0.025倍到约0.075倍、约0.025倍到约0.05倍、约0.05倍到约0.075倍、或约0.01倍、约0.025倍、约0.05倍、约0.075倍或约0.01倍使用。作为举例而非限制，与推荐剂量(每1×106个T细胞10μL)相比，可以以减少的剂量，作为举例而非限制，如1.1μL(九倍减少)或约0.11倍，来使用如
T Cell TransActTM等试剂。可替代地，如果要将抗CD3/抗CD28共刺激用于产生制造的T细胞，则可以通过可溶解的抗CD3/抗CD28微粒提供共刺激的来源。作为举例而非限制，可以以制造商(例如，
生物技术公司(Bio-Techne))推荐的强度的20％使用可溶解的抗CD3/抗CD28微粒。通过另外的实例，可以以制造商的推荐强度的5％、10％、15％、20％、25％或30％使用可溶解的抗CD3/抗CD28微粒。可以基于最终的Rapa-T细胞产物的期望的功能特性来滴定要添加的特定量的抗CD3/抗CD28试剂。具体地，在存在本公开中描述的抑制性分子的情况下，可以添加足够量的试剂以维持T细胞在体外的活力。然而，任何特定的抗CD3/抗CD28试剂都不应过量添加，具体由以下限定：不适当的高水平T细胞激活(通过流式细胞术的相对于使用最佳、最小量共刺激的T细胞培养物的CD25表达的增加)；通过流式细胞术的不适当的高水平T细胞检查点抑制剂受体表达；以及通过流式细胞术的与T细胞效应记忆细胞相关联的分子的不适当表达改变(如CD62L和CCR7的水平减少；如CD45RO和KLRG的水平增加)。
在前述实施例中的任何实施例中，可以将所述IFN-α添加到所述培养基至约1,000IU/mL到10,000IU/mL的浓度。作为举例而非限制，可以使用2,500IU/mL到10,000IU/mL、5,000IU/mL到10,000IU/mL、7,500IU/mL到10,000IU/mL、1,000IU/mL到7,500IU/mL、1,000IU/mL到5,000IU/mL、1,000IU/mL到2,500IU/mL、2,500IU/mL到7,500IU/mL、2,500IU/mL到5,000IU/mL、5,000IU/mL到7,500IU/mL、5,000IU/mL到10,000IU/mL、7,500IU/mL到10,000IU/mL、或1,000IU/mL、2,500IU/mL、5,000IU/mL、7,500IU/mL或10,000IU/mL的浓度。较低的IFN-α浓度(如1000IU/mL)可以导致向Th1表型的不明显转移。
在前述实施例中的任何实施例中，所述第二时间段可以是约4天到约8天、4天到约6天或6天到约8天。作为非限制性实例，所述第二时间段可以是约4天、5天、6天、7天或8天。在没有执行共刺激的情况下，用于温育的时间段可以是约4天到约8天、4天到约6天或6天到约8天。作为非限制性实例，所述第二时间段可以是约4天、5天、6天、7天或8天。
在前述实施例中的任何实施例中，所述培养基可以进一步包括5％的人血清。在一些实施例中，所述培养基可以进一步包括l％-20％的人血清。作为举例而非限制，所述培养基可以包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的人血清。在一些实施例中，所述培养基可以包括至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的人血清。在前述实施例中的任何实施例中，不可以向培养基添加血清或培养基中不存在血清。
在前述实施例中的任何实施例中，所述培养基可以进一步包括X-Vivo 20培养基。在前述实施例中的任何实施例中，所述培养基可以进一步包括TexMACS
培养基。任何合适的培养基均可以用于培养T细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，可以将另外的培养基添加到培养物。作为举例而非限制，可以在将培养物输入细胞群初始接种到培养物中之后约12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时或其之间的任何范围或时间添加另外的培养基。作为举例而非限制，所添加的培养基的量相对于初始培养基的量的比率可以为约0.5、0.75、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更大，以及其间的任何范围。作为举例而非限制，在将培养物输入细胞群初始接种到培养物中之后添加的培养基的量可以是足以将培养物中的细胞密度降低至目标细胞密度的量。作为举例而非限制，该目标细胞密度可以为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107或4×107以及其间的任何范围，前提是初始细胞密度大于目标细胞密度。
在前述实施例中的任何实施例中，所述培养物输入细胞群可以包括培养物输入细胞群中细胞总数的约5％到约100％、约10％到约100％、约20％到约100％、约30％到约100％、约40％到约100％、约50％到约100％、约60％到约100％、约70％到约100％、约80％到约100％、约90％到约100％、约5％到约90％、约5％到约80％、约5％到约70％、约5％到约60％、约5％到约50％、约5％到约40％、约5％到约30％、约5％到约20％或约5％到约10％的T细胞。作为非限制性实例，所述培养物输入细胞群可以包括所述培养物输入细胞群中细胞总数的约5％、10％、15％、20％、33％、40％、50％、66％、70％、75％、90％、95％、98％或99％或更多的T细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，所述培养物输入细胞群可以进一步包括单核细胞。在前述实施例中的任何实施例中，可以对所述培养物输入细胞群富集T细胞。作为举例而非限制，可以使用自动化菲柯尔(Ficoll)过程使所述培养物输入细胞群经受T细胞富集。进行菲柯尔过程的方法是本领域已知的，并且涉及从样品中去除嗜中性粒细胞和红细胞。可以使用任何合适的方法在细胞群中富集T细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，所述方法可以进一步包括从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及从所述样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。此类样品可以含有外周血干细胞(PBSC)，并且作为举例而非限制，可以通过动员采集、稳态单采血液成分术或简单的抽血获得。在前述实施例中的任何实施例中，在制备制造的T细胞之前，可以冷冻保存含有PBSC和/或培养物输入细胞群的样品。当受试者具有足够数量的免疫细胞时，可以进行稳态单采血液成分术，作为举例而非限制，所述足够数量的免疫细胞可以通过最小绝对淋巴细胞计数(ALC)来表征。例如，所述最小ALC可以是每微升300个淋巴细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，可以通过基于抗体的纯化来分离所述T细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，可以通过逆流离心淘析来进行所述T细胞的富集。这种技术是本领域众所周知的。
在前述实施例中的任何实施例中，可以在或大约在添加含有抗CD3/抗CD28的纳米颗粒的同时添加所述IFN-α。
在前述实施例中的任何实施例中，可以在培养之后通过任何合适的方法去除抗CD3/抗CD28抗体。作为举例而非限制，可以通过磁力捕获去除抗CD3/抗CD28磁珠，并且可以通过添加释放缓冲液并洗涤制造的T细胞来去除可溶解的抗CD3/抗CD28微粒。
在一些实施例中，在使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，制造的T细胞群表现出相对于T-Rapa细胞的IFN-γ分泌增加，所述磁珠以3:1的珠:T细胞比率添加。
在一些实施例中，在使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，制造的T细胞群表现出相对于T-Rapa细胞的TNF-α分泌增加，所述磁珠以3:1的珠:T细胞比率添加。
在一些实施例中，在使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，制造的T细胞群表现出相对于T-Rapa细胞的GM-CSF分泌增加，所述磁珠以3:1的珠:T细胞比率添加。
在一些实施例中，在使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，制造的T细胞群表现出相对于T-Rapa细胞的IL-2分泌增加，所述磁珠以3:1的珠:T细胞比率添加。
在一些实施例中，相对于所述对照T细胞群和T-Rapa细胞，制造的T细胞群包括对CD4、CD62L、CCR7和CD127呈阳性的增加的细胞百分比。
在一些实施例中，相对于所述对照T细胞群，制造的T细胞群表现出4EBP1磷酸化的增加。在一些实施例中，相对于对照T细胞，制造的T细胞表现出增加的4EBP1磷酸化。作为举例而非限制，相对于以产生所述T细胞的T细胞(即，培养物输入T细胞)为特性的对照T细胞群或对照T细胞的4EBP1磷酸化的增加不超过50％、不超过45％、不超过40％、不超过35％或者不超过30％。作为进一步举例而非限制，4EBP1磷酸化的增加可以介于5％-50％、5％-45％、5％-40％、5％-30％、5％-20％、5％-10％、10％-50％、10％-45％、10％-40％、10％-30％、10％-20％、20％-50％、20％-45％、20％-40％、20％-30％、30％-50％、30％-45％、30％-40％、40％-50％或其间的任何值或这些范围内的范围。与T-Rapa细胞相比，4EBP1的磷酸化减少(或减弱)。在一些实施例中，可以在培养开始后的32小时测量4EBP1磷酸化的增加。
在一些实施例中，相对于T-Rapa细胞，制造的T细胞群表现出降低的P70S6K表达，并且相对于以产生制造的T细胞的细胞为特性的所述对照T细胞群表现出增加的P70S6K表达。作为举例而非限制，所述增加可以为至少10％、20％、30％、40％、50％或更多并且所述减少可以为50％、60％、70％、80％或更多。
在一些实施例中，通过流式细胞术，制造的T细胞群相对于T-Rapa细胞表现出IL-2受体CD25表达减少。作为举例而非限制，所述减少可以为至少50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施例中，相对于培养物输入T细胞，制造的T细胞可以表达独特的RNA表达谱，其特征在于去分化分子(如KLF4、KLF10、Nanog和其组合)的RNA含量增加50％或更多，以及分化分子(如穿孔素、颗粒酶B、IFN-□和其组合)的RNA含量降低50％或更多。
在一些实施例中，相对于T-Rapa细胞，制造的T细胞群表现出与免疫抑制作用相关联的以下分子的水平降低：CTLA4；和TIM3。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过10％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达CTLA4来表征，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达CTLA4来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达CTLA4，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CTLA4的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达CTLA4的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CTLA4的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CTLA4的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的频率可以为比所述对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过10％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达TIM3来表征，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达TIM3来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达TIM3，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群中CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率可以为比所述对照群中的所述CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率可以为比所述对照群中的所述CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIM3的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIM3的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIM3的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达PD1来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达PD1，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+和CD8+T-Rapa细胞表达PD1的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出CD4+或CD8+T细胞表达PD1的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达PD1的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达PD1的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达PD1的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达PD1的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+和CD8+制造的T细胞表达2B4来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达2B4，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述制造的T细胞群中至少0.1％的CD4+T细胞表达2B4，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中至少0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％或更多的CD4+T细胞可以表达2B4，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群中CD8+T细胞表达2B4的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD8+T细胞表达2B4的频率，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述减少的CD8+T细胞表达2B4的频率可以为比对照T细胞群中所述CD8+T细胞表达2B4的对应频率少至少50％、60％、70％或80％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达2B4的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达2B4的频率，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达2B4的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达2B4的对应频率少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些实施例中，所述减少为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过10％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达LAIR1来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达LAIR1，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群中CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1的频率，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1的频率可以为比所述对照T细胞群中的所述CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。在一些实施例中，制造的T细胞群的CD4+或CD8+T细胞可以表现出相对于T-Rapa细胞的减少的LAIR1表达水平，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述减少可以为至少30％、40％、50％或更多。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过10％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达TIGIT来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达TIGIT，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述制造的T细胞群中至少0.1％的CD4+T细胞表达2B4，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中至少0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％或更多的CD4+T细胞可以表达TIGIT，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIGIT的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIGIT的频率，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达TIGIT的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIGIT的对应频率少至少40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过10％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达LAG3来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达LAG3，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达LAG3的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达LAG3的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达LAG3的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达LAG3的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达LAG3的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达LAG3的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群的保留水平(即，基本上相同水平)的阳性共刺激分子CD28来表征，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞中的CD28表达频率可以分别在对照群中CD4+或CD8+T细胞中的CD28表达频率的约20％之内。作为举例而非限制，制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞中的CD28表达频率可以分别在对照群中CD4+或CD8+T细胞中的CD28表达频率的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％之内。在一些实施例中，该保留为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群的保留水平(即，基本上相同水平)的阳性共刺激分子ICOS来表征，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞中的ICOS表达频率可以分别在对照群中CD4+或CD8+T细胞中的ICOS表达频率的约20％之内。作为举例而非限制，制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞中的ICOS表达频率可以分别在对照群中CD4+或CD8+T细胞中的ICOS表达频率的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％之内。在一些实施例中，该保留为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群的保留水平(即，基本上相同水平)的CD45RA来表征，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞中的CD45RA表达频率可以分别在对照群中CD4+或CD8+T细胞中的CD45RA表达频率的约20％之内。作为举例而非限制，制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞中的CD45RA表达频率可以分别在对照群中CD4+或CD8+T细胞中的CD45RA表达频率的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％之内。在一些实施例中，该保留为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达CD25来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达CD25，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD25的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD25的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD25的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD25的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD25的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD25的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，制造的T细胞群表现出以减少的KLRG1水平为特征的静态和非衰老表型，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述KLRG1水平的减少为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达KLRG1来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达KLRG1，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达KLRG1的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达KLRG1的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达KLRG1的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达KLRG1的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达KLRG1的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达KLRG1的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群，制造的T细胞群表现出减少的免疫抑制分子CD39的表达。在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过20％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达CD39来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达CD39，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD39的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD39的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD39的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD39的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD39的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD39的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群，制造的T细胞群表现出减少的免疫抑制分子CD73的表达。在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过20％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达CD73来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达CD73，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD73的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD73的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD73的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD73的对应频率少至少50％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达CD73的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CD73的对应频率少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞群，制造的T细胞群表现出减少的免疫抑制分子GITR的表达。在一些实施例中，制造的T细胞群可以通过5％或更少的CD4+或CD8+制造的T细胞表达GITR来表征，如通过流式细胞术所测量的。作为举例而非限制，所述制造的T细胞群中5％、4％、3％、2％、1％或更少的CD4+或CD8+T细胞可以表达GITR，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达GITR的对应频率，所述制造的T细胞群可以表现出减少的CD4+或CD8+T细胞表达GITR的频率，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达GITR的频率可以为比相对于所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达GITR的对应频率少至少20％。作为举例而非限制，所述减少的CD4+或CD8+T细胞表达GITR的频率可以为比所述CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达GITR的对应频率少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施例中，所述减少的频率为将产生制造的T细胞的细胞接种到培养物中之后6天。
在一些实施例中，相对于对照T细胞培养物，制造的T细胞可以表现出细胞因子生物学的早期分化状态，如前体细胞因子IL-2的分泌增加和对稳态细胞因子IL-7和IL-15的反应性增加所证明的。以这种方式，本公开的制造方法描述了用于制造具有对稳态细胞因子的增加的反应性的非辅助依赖型T细胞的过程。
在一些实施例中，与在相同条件下温育的T-Rapa培养物相比，制造的T细胞群表现出增加的IL-2分泌。在一些实施例中，该IL-2分泌增加为至少1.1倍。作为举例而非限制，所述增加可以为至少1.1倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍或更多。在一些实施例中，所述制造的T细胞群在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2。举例来说，在这些条件下，制造的T细胞群可以分泌约500pg/mL/1×106个细胞/天、600pg/mL/1×106个细胞/天、700pg/mL/1×106个细胞/天、800pg/mL/1×106个细胞/天、900pg/mL/1×106个细胞/天、1000pg/mL/1×106个细胞/天或更多的IL-2。
在一些实施例中，当暴露于IL-7或IL-15时，制造的T细胞群可以分泌增加量的IL-2。在一些实施例中，相对于在不存在IL-7或IL-15的条件下，当制造的T细胞群在存在IL-7或IL-15的条件下温育时，所述制造的T细胞群由IL-2分泌增加至少1.1倍表征。作为举例而非限制，所述增加可以为至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍或更多。在一些实施例中，所述制造的T细胞群在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激并且暴露于IL-7浓度为10ng/mL并且IL-15的浓度为10ng/mL的IL-7、IL-15或IL-7和IL-15两者(如果存在)之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2。举例来说，在这些条件下，制造的T细胞群可以分泌约1000pg/mL/1×106个细胞/天、1100pg/mL/1×106个细胞/天、1200pg/mL/1×106个细胞/天、1300pg/mL/1×106个细胞/天、1400pg/mL/1×106个细胞/天、1500pg/mL/1×106个细胞/天、1600pg/mL/1×106个细胞/天、1700pg/mL/1×106个细胞/天、1800pg/mL/1×106个细胞/天、1900pg/mL/1×106个细胞/天、2000pg/mL/1×106个细胞/天或更多的IL-2。IL-2分泌与非辅助依赖型T细胞相关联。Rapa-T细胞的高IL-2分泌可以通过避免在T细胞过继疗法后施用外源性IL-2的需要而是有利的。在一些实施例中，以10ng/mL添加IL-7或IL-15(如果存在)。
在一些实施例中，相对于所述对照T细胞群，所述制造的T细胞群表现出增加的体内功能，所述体内功能的特征在于在人-小鼠异种移植物抗宿主病模型中人T细胞植入增加。
在一些实施例中，所述制造的T细胞群表现出mTORC1活化的减少，如通过磷光体-P70S6K所测量的。作为举例而非限制，所述减少可以是在培养开始后32小时相对于T-Rapa细胞至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施例中，相对于T-Rapa细胞，所述制造的T细胞群表现出减少的磷光体-STAT5。作为举例而非限制，所述减少可以是在培养开始后32小时相对于T-Rapa细胞至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施例中，相对于对照经培养的T-Rapa细胞群，所述制造的T细胞群表现出减少的磷光体-STAT5。作为举例而非限制，所述减少可以是相对于对照经培养的T-Rapa细胞群至少50％。在一些实施例中，所述减少是在将制造的T细胞从包括T细胞的输入细胞群接种到培养物中之后48小时。在一些实施例中，p-STAT5水平是通过蛋白质印迹测量的。
在一些实施例中，所述制造的T细胞群表现出至少某一可检测水平的STAT1和磷光体-STAT1。在一些实施例中，所述水平是在将制造的T细胞从包括T细胞的输入细胞群接种到培养物中之后48小时测量的。在一些实施例中，相对于对照T细胞群和至少某一水平的STAT1和磷光体-STAT1，所述制造的T细胞群表现出减少的磷光体-STAT5。在一些实施例中，STAT1或p-STATl的水平是通过蛋白质印迹测量的。
在一些实施例中，如通过p70S6K或Raptor表达测量的，相对于以制造的T细胞群所获自的T细胞为特性的对照T细胞群，所述制造的T细胞群表现出减少的mTORC1活化。作为举例而非限制，所述减少可以为50％。在一些实施例中，所述减少是在将制造的T细胞从包括T细胞的输入细胞群接种到培养物中之后48小时。在一些实施例中，所述减少是通过蛋白质印迹测量的。
在一些实施例中，相对于对照T细胞群，所述制造的T细胞群表现出大致相同水平的Rictor、SGK1或磷酸化SGK1。作为举例而非限制，Rictor、SGK1或磷酸化SGK1的水平可以在T-Rapa细胞中Rictor、SGK1或磷酸化SGK1的对应水平的50％、40％、30％、20％、10％或5％之内。在一些实施例中，所述水平在将制造的T细胞从包括T细胞的输入细胞群接种到培养物中之后48小时。在一些实施例中，Rictor、SGK1或pSGK1的水平至少是如在对照T细胞群中测量的水平。在一些实施例中，所述水平是通过蛋白质印迹测量的。
在一些实施例中，相对于T-Rapa细胞，在没有抑制剂的情况下制造之后在培养基中扩增6天后，制造的T细胞群表现出IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-2中至少一种的分泌增加。作为举例而非限制，所述增加可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。
在一些实施例中，相对于T-Rapa细胞，在制造结束时(培养的第6天)的制造的T细胞群可以具有增加的表达T细胞标志物CD45RA的CD4+T细胞数量。作为举例而非限制，所述增加可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或更多。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以具有选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT和TIM3的一种或多种检查点抑制剂受体的减少的表达。作为举例而非限制，所述减少的表达可以比T-Rapa细胞中的对应表达水平少至少25％。作为进一步举例而非限制，所述减少的表达可以为比T-Rapa细胞群中的对应表达水平少至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，制造的T细胞群的选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT和TIM3的一种或多种检查点抑制剂的表达水平可以在以产生制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的约25％之内。作为举例而非限制，选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT和TIM3的一种或多种检查点抑制剂的表达水平可以在以产生制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的约25％、20％、15％、10％或5％之内。应当理解，检查点抑制剂的表达水平在相同细胞类型之间进行比较，例如，CD4+制造的T细胞可以与以产生制造的T细胞的T细胞为特性的CD4+T-Rapa细胞或CD4+对照T细胞进行比较。
在一些实施例中，制造的T细胞可以具有选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT和TIM3的一种或多种检查点抑制剂受体的减少的表达。作为举例而非限制，所述减少的表达可以比T-Rapa细胞中的对应表达水平少至少25％。作为进一步举例而非限制，所述减少的表达可以为比T-Rapa细胞中的对应表达水平少至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，制造的T细胞的选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT和TIM3的一种或多种检查点抑制剂的表达水平可以在以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞中的对应表达水平的约25％之内。作为举例而非限制，选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT和TIM3的一种或多种检查点抑制剂的表达水平可以在以产生制造的T细胞的T细胞为特性的对照T细胞中的对应表达水平的约25％、20％、15％、10％或5％之内。应当理解，检查点抑制剂的表达水平在相同细胞类型之间进行比较，例如，CD4+制造的T细胞可以与以产生制造的T细胞的T细胞为特性的CD4+T-Rapa细胞或CD4+对照T细胞进行比较。
在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞的细胞为特性的对照T细胞，制造的T细胞具有增加的CD127表达。作为举例而非限制，此增加可以为至少10％、20％、30％、40％、50％或更多。
在一些实施例中，制造的T细胞群可以具有至少5％的表达CD127的CD4+T细胞，如通过流式细胞术所测量的。作为举例，制造的T细胞群可以具有至少5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达CD127的CD4+T细胞，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施例中，相对于以产生制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，制造的T细胞群可以具有表达CD127的CD4+T细胞的增加的频率。作为举例而非限制，所述增加可以为至少50％、100％、150％、200％、300％或更多。
在与制造的T细胞群相关联的前述性质中的任何性质可以与单个细胞相关联的程度上，制造的T细胞可以通过所述性质表征。在前述实施例中的任何实施例中，制造的T细胞或制造的T细胞群可以具有所述性质中的多于一种性质。
用于治疗受试者的癌症的方法
患有复发性多发性骨髓瘤(MM)的患者的生存期有限，并且治愈性疗法一直难以捉摸。如此，患有复发性MM的患者适合于新型T细胞疗法。
免疫疗法与现有免疫疗法的方法在几个重要类别上有所不同。首先，制造的T细胞产物被制造成是在雷帕霉素(mTOR)途径的哺乳动物靶标水平受到抑制，从而转化为对细胞凋亡的抗性和对中枢记忆分化的富集。第二，制造的T细胞产物在高剂量的促进CD4+Th1和CD8+Tc1分化的IFN-α中制造。第三，制造的T细胞产物最低程度地用单克隆抗体进行共刺激或者不进行共刺激并表达各种T细胞受体(TCR)谱系；如此，预期由制造的T细胞介导的抗肿瘤作用主要通过体内克隆扩增到肿瘤抗原而发生。这种机制在多发性骨髓瘤中可以是有利的，在多发性骨髓瘤中，由于高肿瘤突变率，肿瘤抗原未知或随时间推移可变化。体内新兴T细胞应答的表征对于增进对制造的T细胞疗法的潜在机制的理解至关重要，并且将被评估为此研究的第二个目的。以及第四，将针对新型免疫耗竭和免疫抑制方案评估制造的T细胞疗法，所述方案由喷司他丁与低剂量、剂量调整的环磷酰胺的组合组成(PC方案)。此PC方案相对不影响髓样细胞，由此允许重复治疗周期而基本上无嗜中性粒细胞减少；此方案在成本(可以在门诊中施用)和安全性(由于保存髓样细胞而降低了感染率)方面具有优势。多发性骨髓瘤是很大程度上通过炎性信号传导促进的疾病；如此，由PC方案介导的炎性抑制将是有助于方案功效的一个组成部分。在临床试验的设计过程中考虑了这些因素中的每一个因素，所述临床试验关注于PC调理之后多次输注制造的T细胞。
制造的T细胞表达的检查点抑制剂水平大幅降低，并且因此提供了用于从检查点抑制释放免疫系统的新型离体方法，所述从检查点抑制释放免疫系统目前是通过单克隆抗体疗法来实现的。沿着这条思路，预计制造的T细胞疗法将在易受检查点抑制剂疗法影响的癌症中获得成功，所述癌症包含但不限于：黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和结肠癌。还应该注意，检查点抑制剂单克隆抗体疗法在多发性骨髓瘤患者中具有相对较高的毒性，由此需要替代性方法来避免免疫检查点，如制造的T细胞疗法。
另外，制造的T细胞经历多种肿瘤抗原的广泛的克隆扩增的能力预测了具有增加的突变率的肿瘤细胞和具有微卫星不稳定性的肿瘤将对制造的T细胞疗法特别敏感。
本公开提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包含以治疗有效剂量施用本公开的制造的T细胞。
在一些实施例中，所述用于治疗癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。在一些实施例中，所述包括制造的T细胞的组合物的施用可以以治疗有效剂量重复或累积达到治疗有效剂量。在一些实施例中，所述方法进一步包括在使所述受试者经受所述免疫耗竭方案之前，从所述受试者收获自体细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在向所述受试者施用所述包括制造的T细胞的组合物之前，从所述受试者收获自体细胞。
在前述实施例中的任何实施例中，所述免疫耗竭方案可以包含向所述受试者施用喷司他丁和环磷酰胺中的至少一种。在一些实施例中，向所述受试者施用喷司他丁，并且其中所述喷司他丁的剂量可以为介于0.5-4mg/m2之间、0.5-3mg/m2之间、0.5-2mg/m2之间、0.5-1mg/m2之间、1-4mg/m2之间、2-4mg/m2之间或3-4mg/m2之间。作为非限制性实例，所述喷司他丁的剂量为约0.5mg/m2、1mg/m2、1.5mg/m2、2mg/m2、2.5mg/m2、3mg/m2、3.5mg/m2或4mg/m2。在一些实施例中，向所述受试者施用环磷酰胺，并且其中所述环磷酰胺的剂量可以为介于50-400mg之间、50-300mg之间、50-200mg之间、50-100mg之间、100-400mg之间、200-400mg之间、300-400mg之间、200-300mg之间或100-200mg之间。作为非限制性实例，所述环磷酰胺的剂量为约50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或400mg。在一些实施例中，向所述受试者施用喷司他丁和环磷酰胺两者。在一些实施例中，所述喷司他丁和环磷酰胺以单一组合物的形式施用于所述受试者。在一些实施例中，所述单一组合物静脉内施用于所述受试者。
在前述实施例中的任何实施例中，所述免疫耗竭方案可以包含向所述受试者施用包括喷司他丁的第一组合物；以及向所述受试者施用包括环磷酰胺的第二组合物。在一些实施例中，以1-4mg/m2的喷司他丁的剂量施用所述第一组合物，所述剂量介于0.5-4mg/m2之间、0.5-3mg/m2之间、0.5-2mg/m2之间、0.5-1mg/m2之间、1-4mg/m2之间、1-3mg/m2之间、1-2mg/m2之间或3-4mg/m2之间。作为非限制性实例，所述喷司他丁的剂量为约1mg/m2、1.5mg/m2、2mg/m2、2.5mg/m2、3mg/m2、3.5mg/m2或4mg/m2。在一些实施例中，所述第二组合物包括环磷酰胺，并且以介于50-400mg之间、50-300mg之间、50-200mg之间、50-100mg之间、100-400mg之间、200-400mg之间、300-400mg之间、200-300mg之间或100-200mg之间的所述环磷酰胺的剂量施用所述第二组合物。作为非限制性实例，所述环磷酰胺的剂量为约50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或400mg。
在前述实施例中的任何实施例中，所述治疗有效剂量可以为每千克受试者的体重1×105到5×106个细胞/kg、1×106到2.5×106个细胞/kg、2.5×106到5×106个细胞/kg、1×105到2.5×106个细胞/kg、2.5×105到5×106个细胞/kg、1×105到2.5×105个细胞/kg、2.5×105到5×105个细胞/kg、1×105个细胞/kg、2×105个细胞/kg、3×105个细胞/kg、4×105个细胞/kg、5×105个细胞/kg、1×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg或5×106个细胞/kg的制造的T细胞。在前述实施例中的任何实施例中，通过输注向所述受试者施用所述包括制造的T细胞的组合物。
在前述实施例中的任何实施例中，作为举例而非限制，癌症可以选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤、胃癌和结肠癌。在一些实施例中，癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是复发性多发性骨髓瘤。作为进一步举例而非限制，所述癌症可以是肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或结直肠癌。在一些实施例中，癌症是PDLl阴性癌症。在一些实施例中，癌症易受检查点抑制剂疗法的影响。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是复发性、难治性多发性骨髓瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是四重或五重难治性多发性骨髓瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是郁积型多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述受试者患有复发的多发性骨髓瘤。在某些方面，作为举例而非限制，受试者患有复发1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次的多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述受试者患有郁积型多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述受试者患有四重或五重难治性多发性骨髓瘤。在一些实施例中，作为举例而非限制，所述受试者患有1种、2种、3种、4种、5种或更多种治疗难以治疗的多发性骨髓瘤。
在一些实施例中，所述受试者先前已经进行了治疗并且现在处于在接受选自由以下组成的组的不同治疗系列之后的第二次复发或第三次复发：蛋白酶体抑制剂的施用、免疫调节药物的施用、烷化剂的施用、CD38单克隆抗体的施用和糖皮质激素的施用。此患者群体被认为适合于第3期随机临床试验评估，其中对照群组随机接受针对第二次或第三次复发患者的标准化疗是合理的。
在单独的实施例中，所述受试者对于多种标准药物是高度难治性的，并且因此随机临床试验是不合理的。相反，此类高度难治性患者将在单组II期临床试验中用Rapa-T疗法进行治疗。高度难治性状态可以通过四重或五重难治性命名法来量化，其中此类受试者对于用于治疗多发性骨髓瘤的前多种药物中的4种或5种药物是难治性的，所述药物即：硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)和达雷木单抗(daratumumab)。
在涉及在第二次或第三次复发时治疗MM的第3期临床试验的实施例的情况下，主要研究目的将涉及无进展生存期作为研究终点，无进展状态被定义为：每月监测时，所述受试者的M蛋白/游离轻链差异增加少于25％。
在一些实施例中，所述第一治疗周期的持续时间最少为28天。在一些实施例中，所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期的持续时间最少为35天。
在一些实施例中，所述向所述受试者施用喷司他丁的步骤在所述第一治疗周期期间重复。在一些实施例中，所述向所述受试者施用喷司他丁的步骤在所述第一治疗周期的第1天、第4天、第8天和/或第11天进行。在一些实施例中，所述向所述受试者施用环磷酰胺的步骤在所述第一治疗周期期间重复。在一些实施例中，所述向所述受试者施用环磷酰胺的步骤在所述第一治疗周期的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天、第9天、第10天、第11天和/或第12天进行。
在上述实施例中的任何实施例中，所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期间隔0到4周。在上述实施例中的任何实施例中，所述第一治疗周期与所述一个或多个另外的治疗周期中的第一个治疗周期间隔0到4周。在上述实施例中的任何实施例中，所述向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤在所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期的第15天、第16天、第17天和/或第18天进行。
在一些实施例中，所述受试者处于在接受由以下组成的组的方案之后的第二次MM复发或第三次MM复发：蛋白酶体抑制剂的施用、免疫调节药物的施用、烷化剂的施用、CD38单克隆抗体的施用和糖皮质激素的施用。
在一些实施例中，所述受试者处于MM复发的晚期并且是四重或五重难治性的，其中不存在标准疗法。
在涉及第3期临床试验的一些实施例中，主要研究目的将涉及无进展生存期，无进展被定义为在治疗之间M蛋白/游离轻链差异增加小于25％。
在一些实施例中，所述方法包括使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能；以及在所述免疫耗竭方案之后，向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。
在一些实施例中，所述免疫耗竭方案包括：向所述受试者施用喷司他丁；以及向所述受试者施用环磷酰胺；如果所述受试者的肌酐清除率>30毫升/分钟/1.73平方米，则向所述受试者施用一个或多个另外剂量的喷司他丁；如果所述受试者的绝对淋巴细胞计数为每微升50个或更大并且所述受试者的绝对嗜中性粒细胞计数为每微升500个或更大，则向所述受试者施用一个或多个另外剂量的环磷酰胺。
在一些实施例中，所述测量所述受试者的CrCl和调整要施用的喷司他丁剂量的步骤在所述免疫耗竭方案的第1天、第4天、第8天和/或第11天进行。
在一些实施例中，所述测量ALC和ANC和调整要施用的环磷酰胺剂量的步骤在所述免疫耗竭方案的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天第9天、第10天、第11天和/或第12天进行。
在一些实施例中，所述在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤在所述免疫耗竭方案开始后15-18天进行。
在前述实施例中的任何实施例中，所述使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能以及在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤重复至少两次。在前述实施例中的任何实施例中，所述使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能以及在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤可以重复多达8次或更多次。在前述实施例中的任何实施例中，在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的每个步骤可以间隔0到9周。
还应该理解，在前述实施例中的任何实施例中，在进行通过抗CD3/抗CD28抗体共刺激的情况下，可以以任何形式的抗CD3/抗CD28抗体提供此共刺激。作为举例而非限制，在指示通过使用抗CD3/抗CD28珠进行共刺激的情况下，可以使用抗CD3/抗CD28纳米颗粒或微粒。
实例
提供了以下实例以更好地展示本公开的方法和所得的制造的T细胞。这些实例不旨在限制或以其它方式改变本公开中公开的方法、细胞和组合物的范围。
实例1
将抗IL-2受体阻断和mTOR阻断用于Th1富集。对于过继性T细胞疗法，重要的是制造优先表达Th1表型的T细胞，其中来自具有调节性T(TREG)细胞表型的细胞的污染最小。Th1型细胞可以部分通过其细胞命运转录因子TBET的表达来表征，而TREG细胞则表达FoxP3转录因子。
评估了用于促进TBET同时限制FoxP3的方法。评估了mTOR抑制剂替西罗莫司，其是经FDA批准的用于治疗难治性肾细胞癌的静脉施用药物。使用mTOR抑制剂制造针对Th1表型而富集的T细胞似乎是自相矛盾的，因为对mTOR的抑制通常与促进TREG表型的T细胞相关。当前的实验与先前的研究有所不同，因为替西罗莫司是静脉内调配物，由此其相对于雷帕霉素是有利的，所述雷帕霉素由于在培养基中的溶解度有限，因此对于细胞培养而言不太可行。
当前的实验也与过去的研究有所不同，因为评估了替西罗莫司与抗IL-2受体单克隆抗体达克珠单抗的组合。达克珠单抗和巴利昔单抗均为经FDA批准的单克隆抗体，具有共同的作用机制，并且因此可以在开发的系统中互换使用。
如所指示的，使用抗CD3、抗CD28珠与T细胞的各种比率(1:1或1:12)；mTOR抑制剂替西罗莫司(1μM)；不使用或使用抗IL-2受体单克隆抗体达克珠单抗(5μg/ml或50μg/ml)；以及Th1极化细胞因子(IFN-α；10,000IU/ml)或对照调节性T细胞极化(IL-2加TGF-β)进行T细胞离体培养。在培养的第6天，评估T细胞的调节性T细胞转录因子FoxP3和Th1转录因子TBET的细胞内表达。(图1A-1B)。
发现相对于第0天输入T细胞群，在I型极化细胞因子IFN-α的环境中添加替西罗莫司(1.0μM浓度)减少了FoxP3的所得T细胞表达(参见图1A)。此外，发现对IL-2受体的阻断进一步减少了FoxP3的表达；使用50μg/ml的抗体比使用5μg/ml的抗体更有效，由此指示了剂量-应答关系。如果将外源性IL-2与IFN-α组合添加，则替西罗莫司对于减少FoxP3的表达无效(图1A)；此外，如果培养条件允许TREG细胞分化，则替西罗莫司和达克珠单抗对于限制FoxP3的表达无效，所述培养条件即：珠比率减少到1:12；从培养物中消除IFN-α；以及添加外源性IL-2加TGF-β(图1A)。
除了限制FoxP3表达外，替西罗莫司与抗IL-2受体单克隆抗体的组合对于促进Th1表型是有效的，如TBET表达增加所指示(图1B)。再次，存在剂量应答关系，其中50μg/ml达克珠单抗比5μg/ml达克珠单抗更高程度地促进TBET表达(图1B)。尽管将IL-2添加到IFN-α极化中增加了TBET，但这也与FoxP3的增加相关联，由此通过添加外源IL-2指示了缺乏Th1纯度。值得注意的是，如所预期的，TREG对照条件——IL-2和TGF-β具有降低的TBET表达(图1B)。
如此，mTOR抑制和IL-2受体阻断的组合表示了用于Th1细胞产生的新方法。
用于在离体制造期间抑制T细胞的干预措施组合的发展：mTOR抑制；IL-2受体阻断；T细胞共刺激减少；以及在共刺激之前抑制T细胞(过夜预温育)。鉴于这些结果表明，mTOR抑制与IL-2受体阻滞的组合可以促进Th1型细胞的制造(TBET与FoxP3比率的提高；TREG细胞污染的限制)，认为另外的干预措施也可能促进Th1细胞的制造。
将mTOR抑制用于过继性T细胞疗法的一个益处是，此干预措施可以促进具有更原始分化状态的T细胞的制造，如T中枢记忆亚群(TCM)或T干细胞记忆亚群(TSCM)。在使用离体雷帕霉素的先前研究中，发现离体雷帕霉素对于制造TCM表型的T细胞是有效的；此结果与mTOR在对照T细胞记忆状态中的已知作用一致。在制造期间促进TCM和/或TSCM状态很重要，因为此类具有更原始分化状态的T细胞在过继转移后增加了长期植入，并且在实验模型中介导了体内效应的增加。已经描述了若干其它方法来促进受限分化状态的T细胞的制造，所述其它方法包含：使用GSK3抑制剂用于促进WNT信号传导；抑制ART信号传导；以及抑制PI3激酶信号传导。
开发了一种方法，由此将T细胞平板接种于补充有5％人AB血清的X-Vivo 20培养基中并在所述培养基中进行温育，所述人AB血清不含外源性细胞因子并且含有mTOR抑制剂替西罗莫司和通过单克隆抗体添加而实现的IL-2受体阻断。在使用抗CD3、抗CD28涂覆的磁珠共刺激之前，这种方法结合了大约16小时的“预温育”。据知，先前没有报告过这种方法。
作为评估这些越来越严格的培养条件的第一步，评估了在各种条件下培养CD4+和CD8+T细胞是否可行，如通过在培养间隔(针对Th1制造，6天的培养间隔)结束时活细胞的存在所限定的。在图2A-2B中，如所指示的，在各种条件下将CD4+和CD8+T细胞置于培养物中。3/28珠与T细胞的比率为3:1、1:1或1:3。在向培养物添加的同时(“无过夜预温育”)或在经过16小时的过夜预温育之后共同刺激T细胞。在一些条件下，以50μg/ml的浓度添加抗IL-2受体单克隆抗体达克珠单抗。对于mTOR抑制，以1.0或0.1μM添加替西罗莫司；可替代地，以1.0μM的浓度添加对照mTOR抑制剂雷帕霉素。大多数培养物还补充有I型细胞因子促进剂IFN-α(10,000IU/ml)。如所指示的，大多数培养条件不包含添加外源性IL-2。培养6天后计算T细胞产率并且与培养开始时(“第0天输入培养物”)进行比较。
如图2A-2B所展示的，将培养条件修改为不仅包含mTOR抑制(使用1.0μM或0.1μM的替西罗莫司；对照使用1.0μM的雷帕霉素)和IL-2受体阻断(达克珠单抗)，而且包含减少的共刺激(从3:1珠与T细胞比率减少到1:1和1:3的比率)和过夜预温育使得相对于对照T细胞培养物，产生了相似数量的活T细胞。
预温育和高剂量替西罗莫司在Th1/Tc1制造中的重要性。在冷冻保存Th1/Tc1细胞产物时(培养结束)，重要的是除了TCM表型之外，T细胞还应具有相对静止的表型。也就是说，先前发现雷帕霉素产生的T细胞在过继转移时分泌了非常少量的细胞因子，但是在体内却产生了大量的细胞因子；值得注意的是，其它人已经鉴定了细胞产物效应子功能(最小)与体内效应子功能(最大)之间的类似逆相关。过继转移时的T细胞静止可以促进转移后的T细胞存活，并且对于降低细胞因子释放综合征的风险也可能是重要的，所述细胞因子释放综合征是其它形式的过继性T细胞疗法，尤其是基因修饰的嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法之后发病和死亡的原因。
为了对此进行评估，在细胞培养结束时(第6天)测试了制造的T细胞的细胞因子分泌潜力，并且然后在最大共刺激(3/28珠与T细胞比率为3:1)和无任何抑制剂的培养基中繁殖后离体扩增后一周再次测试。
在图3A-3B中，在共刺激之前，将CD4+和CD8+T细胞纯化，并且在有或没有16小时间隔的预温育的情况下培养6天(3/28珠与T细胞比率为1:1)。如所指示的，以1.0或0.1μM的浓度添加替西罗莫司；所有培养均物补充有IFN-α(10,000IU/ml)和达克珠单抗(50μg/ml)。在培养的第6天，使用3:1的3/28珠与所得T细胞的比率对所得T细胞进行共刺激24小时；通过路明克斯(Luminex)测定来测试上清液中的细胞因子含量(结果描述为每24小时每百万个细胞分泌的每毫升的pg数)。另外，以3:1的3/28珠与所得T细胞的比率对所得T细胞进行共刺激，并且在不含有任何外源细胞因子或抑制剂的培养基中培养一周；在此T细胞培养之后，在培养的第13天，收获T细胞，使用3/28珠(3:1的比率)进行再刺激，并且如上所述对24小时上清液进行胞因子含量评估。缩写N.A表示不适用(T细胞产率不足以进行测定)。
结果示出在图3A-3B中，在图3A中展示了IFN-γ的分泌并且在图3B中展示了TNF-α的分泌。在每种情况下，左图示出了第6天的T细胞细胞因子潜力，而右图示出了第13天的T细胞细胞因子潜力。
这些数据指示，在过夜预温育条件和没有预温育的条件两者下的最大共刺激24小时后，高剂量替西罗莫司(1.0μM)产生期望的非常低水平的第6天T细胞IFN-γ和TNF-α分泌。值得注意的是，使用浓度为0.1μM的替西罗莫司仅部分地减少第6天T细胞细胞因子分泌潜力。如此，所述方法中的替西罗莫司应以更高的浓度使用，即至少1μM。这些数据还指示，单独使用过夜预温育干预措施时不足以产生静止的T细胞表型。如此，过夜预温育步骤必须与高剂量替西罗莫司结合使用，以达到完全的期望结果。
另外，此方法引起初始T细胞静止与随后再刺激之的所得效应子功能增强之间的期望的反比关系。也就是说，对于IFN-γ和TNF-α分泌两者的第13天T细胞值，具有最低水平的第6天细胞因子潜力(预温育与高剂量替西罗莫司的组合)的条件产生最高的第13天细胞因子分泌值。值得注意的是，由高剂量替西罗莫司和没有过夜预温育组成的条件在培养的第13天未产生足够的产率用于评估细胞因子分泌潜力；如此，此结果进一步证实了高剂量替西罗莫司加预温育步骤对于Th1/Tc1细胞产生的价值。
新的组合方法引起增强的mTOR抑制和STAT5磷酸化的消除。新的组合方法(mTOR抑制；IL-2受体阻断；延迟共刺激的预温育；以及使用较低强度的共刺激)制造期望表型的T细胞的能力部分取决于其增强的控制先前与雷帕霉素抗性T细胞表型相关联的分子和细胞事件的能力。
此表型的一个组成部分是对mTOR依赖性信号传导事件(如在4EBP1水平发生的事件)的控制，所述事件有助于控制蛋白质翻译。为解决此问题，使用T-Rapa方法制造了Th1/Tc1细胞，所述T-Rapa方法同时将T细胞以及高水平共同刺激(3/28珠与T细胞比率为3:1)、高剂量雷帕霉素(1.0μM)和细胞因子(IL-2加IFN-α)添加到培养物中。在并行比较中，使用本公开的新的组合方法(16小时预温育步骤；降低水平(比率为1:1)的共刺激；使用替西罗莫司(1.0μM)和达克珠单抗(50μg/ml)两者；以及仅添加IFN-α而没有IL-2)制造了T细胞。
在图4中，使用先前的方法[“T-Rapa”：同时将T细胞以及高水平共同刺激(3/28珠与T细胞比率为3:1)、高剂量雷帕霉素(1.0μM)和细胞因子(IL-2加IFN-α)添加到培养物中]或针对制造的T细胞的新的组合方法[“Rapa-T”：16小时预温育步骤；低水平共刺激(1:1的比率)；使用替西罗莫司(1.0μM)和达克珠单抗(50μg/ml)两者；以及仅添加IFN-α而没有IL-2]对CD4+和CD8+T细胞进行了培养。在T细胞培养的第16小时和第32小时，收获一部分T细胞，分离蛋白质，并且对管家基因β-肌动蛋白和mTOR途径分子磷光体-4EBP1的蛋白质印迹分析进行定量。将结果相对于在任何T细胞活化之前从第0天输入T细胞获得的蛋白质进行比较。
如图4所展示的，相对于使用先前描述的方法(“T-Rapa”)制造的T细胞，在第16小时和第32小时的培养时间点两者，用于产生制造的T细胞的新的组合方法(图4中的“Rapa-T”)使mTOR途径活化减少(如通过4EBP1磷酸化所测量的)。
P70S6激酶是mTOR途径中的另一个关键分子。在图5和6中，使用先前的方法[“T-Rapa”：同时将T细胞以及高水平共同刺激(3/28珠与T细胞比率为3:1)、高剂量雷帕霉素(1.0μM)和细胞因子(IL-2加IFN-α)添加到培养物]或用于产生制造的T细胞的新的组合方法[“Rapa-T”：16小时预温育步骤；低水平共刺激(1:1的比率)；使用替西罗莫司(1.0μM)和达克珠单抗(50μg/ml)两者；以及仅添加IFN-α而没有IL-2]对CD4+和CD8+T细胞进行了培养。在T细胞培养的第16小时和第32小时，收获一部分T细胞，分离蛋白质，并且对管家基因β-肌动蛋白和mTOR途径分子P70S6K(图5)或磷酸化STAT5(图6)的蛋白质印迹分析进行定量。将结果相对于在任何T细胞活化之前从第0天输入T细胞获得的蛋白质进行比较。
与之形成鲜明对比的是，使用用于产生制造的T细胞的新的组合方法的制造使P70S6K的水平大大降低(图6，Rapa-T条件)。这些数据提供了进一步的证据，表明Th1/Tc1制造的组合方法改善了对mTOR活化的控制。使用先前的制造雷帕霉素抗性T细胞的方法，发现在T细胞培养的第16小时和第32小时P70S6K都显著上调(图5，T-Rapa条件)。
组合方法与提高Th1型细胞的纯度相关联(减少了表达FoxP3的细胞的污染)。先前的制造方法导致了大量的STAT5磷酸化(图6，在培养的第16小时和第32小时的T-Rapa结果)；与之形成鲜明对比的是，组合方法消除了STAT5磷酸化(图6；在培养的第16小时和第32小时的Rapa-T结果)。
如此，新的组合方法在T细胞制造期间增加对mTOR信号传导的控制以及消除促进TREG细胞污染的信号传导事件(控制STAT5磷酸化)方面也是有利的。
Th1/Tc1细胞生成组合方法的单独组成部分进一步描述。建立进一步的培养以获得关于培养干预措施对所得的Th1/Tc1表型的单独贡献的另外的信息。对于图7-10，如图7-10所指示的，使用各种3/28珠比率、各种mTOR抑制方法、抗IL-2受体阻断的可变添加、I型极化细胞因子IFN-α的可变添加以及初始过夜预温育步骤的可变使用对CD4+和CD8+T细胞进行培养。在培养的第6天和第13天收集通过重复共刺激(3:1珠比率)产生的上清液，并且路明克斯测定测试IFN-γ(图7A-7B)、TNF-α(图8A-8B)、GM-CSF(图9A-9B)或IL-2(图10A-10B)的含量(结果表示为每24小时每百万个细胞每ml的pg数)。
图7A-7B示出了在培养结束时(第6天)和在没有抑制剂的情况下进一步培养后一周(第13天)的IFN-γ分泌结果。期望的表型由第6天相对低的细胞因子分泌值和第13天相对高的细胞因子值构成。图7A-7B证明了包含组合元素中的每种组合元素(低水平共刺激[1:1比率]；过夜预温育后延迟的共刺激；添加极化细胞因子IFN-α；添加mTOR抑制剂[在此实验中，使用0.1μM的次优浓度]；以及包含IL-2受体抗体达克珠单抗)的培养条件具有期望的表型，因为所述条件在第6天的IFN-γ分泌中减少，但在第13天的IFN-γ分泌中却高。省略这些元素中一个或多个元素的T细胞培养条件在第6天趋于具有较高的细胞因子值，和/或在第13天趋于具有较低的细胞因子值。另外，先前用于制造雷帕霉素抗性T细胞的方法(T-Rapa；图7A-7B)表达了不太有利的细胞因子分泌模式(在第6天的值更高；在第13天的值更低)。
当评估以下细胞因子时，Th1/Tc1制造组合方法还产生了有利的细胞因子表型(第6天减少的值结合第13天增加的值)：TNF-α(图8A-8B)；GM-CSF(图9A-9B)；和IL-2(图10A-10B)。
综上所述，这些结果提供了进一步的证据，表明制造的T细胞的新制造方法相对于现有T-Rapa方法具有重要的优势。
与使用组合方法的Th1/Tc1细胞制造相关联的分子变化。进行了另外的实验以表征在使用组合方法的Th1/Tc1细胞制造期间改变的分子。这样的信息是有价值的，不仅因为其可以导致对T细胞表型的更好的理解，而且因为这样的信息可以在制造期间用作质量控制要素。另外，可以在筛选可能在未来的制造努力中使用的其它组合步骤期间使用这样的信息。
在先前的努力中，发现耐雷帕霉素抗性T细胞在T细胞制造期间经历了自噬。长久以来已经知道，自噬是mTOR抑制的直接结果：当mTOR被激活时，T细胞保持生长和增殖状态(自噬信号被关闭)；相反，当mTOR被抑制时，自噬被促进，由此导致T细胞体积的减少，包含线粒体体积的减少(线粒体自噬)。实际上，自噬是T细胞生物学中必不可少的体内平衡过程，并且与T细胞健康相关联，因为可以减少能量需求并且可以消除细胞内细胞器和其它细胞碎片。
对于图11-13，在以减少的1:3的珠与T细胞比率添加3/28珠之前，使用16小时的预温育间隔培养人CD4+和CD8+T细胞。如图11-13所指示的，各种T细胞培养物接受了不同的mTOR抑制方法(1.0μM的雷帕霉素；1.0μM或0.1μM的替西罗莫司)、外源性IL-2添加的不同条件以及相对于添加抗IL-2受体单克隆抗体达克珠单抗的不同条件。在16小时的预温育间隔后，从T细胞培养物中收获细胞，分离出蛋白质，并且通过蛋白质印迹法对p62(图11)、磷酸-RAPTOR(图12)或BIM(图13)和管家基因β-肌动蛋白进行定量。
评估了组合方法促进自噬的能力，如通过自噬标志物p62的T细胞表达所测量的。如图11所指示的，所述组合方法包含预温育步骤、低水平共刺激(3/28珠与T细胞的比率为1:3)、IL-2受体的达克珠单抗阻断以及mTOR抑制剂上调的自噬标志物p62的表达。如果存在这些因素中的每个因素，则可以通过使用雷帕霉素(1μM)或替西罗莫司(1.0或0.1μM)的mTOR抑制来实现自噬。从方案中消除IL-2受体阻断基本上减弱了自噬的诱导。
另外，组合方法还导致了促进的mTOR途径的抑制，如RAPTOR的磷酸化形式的表达减少所指示的(图12)。值得注意的是，与使用低剂量替西罗莫司或高剂量雷帕霉素相比，结合了高剂量替西罗莫司的组合方法产生了低水平的磷酸-RAPTOR。
还评估了bcl-2基因家族促凋亡成员BIM的制造的T细胞表达。bcl-2家族成员主要在线粒体水平上运行，并且如此，线粒体自噬(mitophagy)可以影响bcl-2家族成员基因的平衡，这有助于确定细胞凋亡阈值。线粒体自噬已被证明在减少细胞凋亡阈值方面是有益的，潜在地选择性地消除线粒体，而bcl-2家族分子的平衡则是不利的。发现制造的组合方法导致BIM的表达减少(图13)。
总之，这些实验指示了增强的自噬、减少的mTOR信号传导和减少的促凋亡分子表达与Th1/Tc1细胞制造的组合方法相关联。这些变化可能有助于制造的T细胞的体内功能增强，并且如此可以用作质量控制步骤或用于筛选未来的下一代T细胞制造方法。
组合方法促进T细胞静止、T细胞去分化。进行了另外的实验以表征通过组合方法制造的Th1/Tc1细胞的表面表型，如通过预温育步骤、低水平共刺激(1:3的3/28珠与T细胞比率)、IL-2受体的达克珠单抗阻断和mTOR抑制剂的结合所定义的。首先评估了培养变量对CD45亚型RA的T细胞表达的影响，所述CD45亚型RA是T细胞原初态(naivety)的标志物，包含干细胞记忆亚群的T细胞。如此，期望开发保留或增加CD45RA表达的T细胞制造方法。
对于图14A-15D，如图14A-15D现在所指示的，使用各种3/28珠比率、各种mTOR抑制方法、抗IL-2受体阻断的可变添加、I型极化细胞因子IFN-α的可变添加以及初始过夜预温育步骤的可变使用对CD4+和CD8+T细胞进行培养。在培养的第6天，收获T细胞并评估T细胞的CD4细胞亚群上CD45RA(图14A-14D)或CD62L、CCR7和CD127(图15A-15D)的流式细胞表达，并且将结果与培养第0天的表达水平(“第0天输入培养”)进行比较。
如图14A-14D所展示的，在没有组合方法的关键元素的情况下进行T细胞制造(以3:1的珠与T细胞的比率使用高共刺激；不使用达克珠单抗；不使用mTOR抑制剂)导致CD45RA表达迅速下降(请参阅柱#2)。与之形成鲜明对比的是，所有这些组分的使用导致CD45RA表达的完全保留(参见柱#4)。值得注意的是，使用鉴定的先前制造方法繁殖的T细胞没有最佳保存的CD45RA的表达(T-Rapa细胞；图14B，柱#3)。
另外，评估了组合方法是否导致T细胞分化减少的其它标志物，包含CD62L、CCR7和CD127。图15A(柱#4)指示使用预温育步骤、低水平共刺激、IL-2受体的抗体阻断和mTOR抑制剂制造的T细胞增加了这些T细胞标志物的共表达。值得注意的是，使用鉴定的先前制造方法繁殖的T细胞没有这三种记忆标志物的最佳增加表达(T-Rapa细胞；图15A，柱#3)。
如此，就制造有限分化状态的T细胞而言，Th1/Tc1细胞制造的组合方法是有利的，所述方法已经清楚地且可再现地示出了介导增加的体内作用。
通过降低培养开始时的T细胞纯度优化组合方法。对于T细胞制造，重要的是确定培养物输入群是否必须被高度纯化至高T细胞含量，或者是否可以容忍如单核细胞等辅助细胞群。从财务成本和劳动力的角度来看，通常期望使用未高度纯化的群开始培养。然而，在培养开始时污染细胞群可能不利于T细胞扩增或期望的T细胞表型的生成。为了评估此参数，使用组合方法开始培养，所述组合方法使用T细胞含量分别为100％、66％、33％或10％的输入群；剩余的细胞群主要是单核细胞。
对于图16-20，在培养开始之前，调节输入细胞群，使得T细胞的纯度为100％、66％、33％或10％；剩余的细胞群由外周血单核细胞(主要是单核细胞)中含有的非T细胞群构成。如所指示的，T细胞在可变地含有或不含替西罗莫司(浓度为1.0或0.1μM)的培养基中扩增；另外，培养物可变地包含在抗CD3、抗CD28磁珠共刺激(比率为1:3)之前的16小时预温育或没有预温育。示出的每种培养物均在含有抗IL-2受体单克隆抗体达克珠单抗(50μg/ml)和IFN-α(10,000IU/ml)的培养基中繁殖。在6天的制造间隔结束时，T细胞接受高水平共刺激(磁珠与T细胞比率为3:1)。对于图16，在高水平共刺激之后，然后将T细胞在不含抑制剂的培养基中扩增一周。在此扩增间隔结束时，计算T细胞的量并且相对于第0天输入数字绘制图表。对于图17-18，在高水平共刺激之后，扩增T细胞直至培养的第13天。在第6天和第13天，共刺激T细胞，并评估24小时上清液的IFN-γ(图17A-17B)或TNF-α(图18A-18B)含量(结果以每24小时每百万个细胞每ml的pg数示出)。对于图19-20，在高水平共刺激之后，扩增T细胞直至培养的第13天。在第6天和第13天，通过流式细胞术评估T细胞的CD25表达(示出的结果为共表达CD25的CD4+T细胞的百分比)(图19)或CD62L、CCR7和CD127的表达(图20)。
如图16中所详述的，在培养物输入时以降低的T细胞纯度开始的培养导致更大的T细胞扩增能力，这种关系以剂量依赖性方式发生。值得注意的是，相对于在培养开始时共刺激的T细胞，使用过夜预温育步骤繁殖的T细胞具有更大的扩增能力。这些数据为组合方法提供了进一步的支持，并且指示培养开始时可能被认为是污染物的细胞群似乎实际上促进了T细胞的扩增潜力。如此，组合方法的优化使用还应包含在培养开始时未高度富集的T细胞的使用；为了保证质量，重要的是控制纯度水平，作为非限制性实例，用T细胞含量为66％或33％的接种物开始每次培养。如图17A-17B和18A-18B所详述的，使用组合方法制造的T细胞和未高度纯化的输入T细胞导致了期望的细胞因子分泌模式，即：(图17A-17B)在制造结束时(第6天)减少了IFN-γ分泌，并且在不含抑制剂的培养基中扩增了一周后(第13天)增加了IFN-γ分泌；以及(图18A-18B)在制造结束时(第6天)减少了TNF-α分泌，并且在不含抑制剂的培养基中扩增了一周后(第13天)增加了TNF-α分泌。
另外，使用降低的T细胞纯度的输入群评估了使用组合方法制造的T细胞中的细胞表面标志物表达。如图19所示出的，此类T细胞在制造结束时(第6天)具有减少的CD25表达，与静态表型一致；在无抑制剂的条件下培养一周后，T细胞极大地上调了CD25。如图20所示出的，此类T细胞也具有记忆标志物CD62L、CCR7和CD127的增加的共表达；然后在一周的T细胞扩增后，这些标志物会减少。
总之，这些数据指示，在使用对非T细胞群具有大量污染的输入T细胞情况下，使用组合方法制造Th1/Tcl细胞是有可能的。事实上，有目的地包含此类非T细胞群可以用来提高T细胞产率并改善所得T细胞记忆曲线。
从冷冻保存的细胞底物制造。在先前收集的PBSC产物的情况下，此类冷冻保存的细胞将被储存在液氮的气相中，直到细胞解冻并制造Rapa-T细胞。在通过单采血液成分术或者未来通过简单血液采集新鲜分离的细胞的情况下，则将立即处理细胞，并且然后可以直接放入培养物中，或者也可以通过受控速率冷冻技术将其冷冻保存，并且储存在液氮的气相中以供后续使用。
从新鲜分离的细胞群中冷冻保存的细胞底物进行T细胞培养需要有些类型的T细胞富集，例如，通过使用单克隆抗体和柱技术(阳性或阴性选择)。Rapa-T制造中使用的原始细胞材料的富集不需要此类基于抗体的方法，因为在培养间隔期间T细胞被有效富集；如此，本方法与在全球层面针对有效细胞治疗的建议相一致。制造Rapa-T细胞的初始加工步骤着重于冷冻保存步骤(当适用时)中使用的二甲基亚砜(DMSO)的去除、红细胞(RBC)的裂解以及污染性粒细胞以及在一定程度上单核细胞的离心去除。这些步骤在主要使用封闭系统技术的相对自动化的方法中执行；此程序是有利的，因为其减少了人为错误，为批记录提供了详细的制造数据，提高了整个制造过程的一致性，并且降低了最终产物被传染剂污染的风险。Rapa-T产物的处理结合了以下步骤：(1)使用固态非水基方法解冻冷冻保存的产物(当适用时)以减少传染剂污染；(2)使用LOVO可渗透膜装置自动洗涤细胞产物；(3)在LOVO洗涤步骤期间使用氯化铵钾(ACK)缓冲液对RBC的裂解进行整合；(4)使用LOVO方法体积减少细胞含量，随后将细胞铺板到封闭系统逆流离心淘析(CCE)装置(艾鲁特拉(Elutra)；泰尔茂公司(Terumo))中；以及(5)艾鲁特拉装置的预编程操作用于通过CCE有效去除粒细胞和单核细胞。
在淋巴细胞富集和培养基纯化后，将细胞接种到具有丰富的氧交换能力的专用室中(G-Rex容器；威尔逊·沃尔夫公司(Wilson-Wolf))。除了具有增强的透气性特性之外，G-Rex容器是封闭系统单元，并且具有自动化封闭系统介质体积减少的另外的优势(GatheRex液体处理泵)。淋巴细胞富集的细胞在G-Rex容器中保持6天。
可以利用几种特定的培养条件来促进在G-Rex容器中利用制造的T细胞功能属性进行CD4+和CD8+T细胞混合物的制造。这些特定条件包含：(1)使用进一步补充了5％人血清的富集的培养基(包含但不限于X-Vivo 20；龙沙公司(Lonza))；(2)结合共刺激之前的到G-Rex中的细胞平板接种的16小时间歇(以每毫升1.5×106个细胞的相对较高的密度铺板细胞)；(3)在此初始间歇期间，通过加入单克隆抗体巴利昔单抗(阻断IL-2受体并且由此通过内源性产生的IL-2防止自主性T细胞活化)和替西罗莫司(mTORC1的药理抑制剂)使细胞最佳地休息；(4)在此16小时间歇后，在次佳条件下，细胞不被共刺激或者被抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠(3/28珠)共刺激，如1:3的珠与T细胞比率所定义的(通常，大多数T细胞扩增条件利用9倍更高的共刺激水平，即珠与T细胞的比率为3:1)；(5)重要地，至关重要的是在最初的间歇后不要清洗T细胞；(6)在间歇之后，除了添加3/28珠外，至关重要的是以高剂量(10,000IU/ml)添加极化细胞因子IFN-α，以促进分化成CD4+Th1和CD8+Tc1表型；(7)重要地，至关重要的的避免添加IL-2，IL-2是用于T细胞培养的常见添加剂；以及(8)加入珠和IFN-α之后，重要的是保持细胞不受干扰，直到在培养的第6天收获为止(无细胞清洗，无进一步培养添加剂)。
制造的T细胞的冷冻保存。1)在G-Rex容器中进行6天的细胞培养后，可以通过GatheRex仪器以封闭系统的方式减少培养物的体积。随后，可以收获细胞，可以用手持磁铁除去3/28珠，并且可以将细胞放入LOVO装置中以进行连续清洗以去除>99％的培养添加剂(替西罗莫司、巴利昔单抗、IFN-α)。
经过清洗的细胞可以重建到冷冻保存培养基中，所述培养基含有5％DMSO和5％五聚淀粉(pentastarch)。冷冻保存是在50ml冷冻袋中以多个单次使用的等分试样进行的。Rapa-T细胞通过符合GMP的受控速率冷冻方法进行冷冻保存，并且在Rapa-T细胞通过指定的释放标准测试后，由经过认证的冷冻运输商在液氮的气相中运输。
Rapa-T细胞的释放标准测试包含标准测试，如CD3+、CD4+和CD8+T细胞含量纯度(通过流式细胞术，最终产物的CD3+T细胞含量可以>70％；CD4+和CD8+亚群可以分别以5％的水平存在)。如通过流式细胞术膜联蛋白和7-AAD测定所确定的，细胞可以>70％是存活的。此外，在最少3天的培养间隔(理想地，14天的培养间隔)内，细胞应不受细菌和真菌的污染；此外，细胞产物应低于细菌LPS内毒素的检测限制。
除了这些标准测试之外，专门的功能测试还将构成用于Rapa-T细胞产物的释放标准。在释放产物和细胞疗法之前，相对于培养物输入T细胞，Rapa-T细胞可以具有以下属性：(1)增强的T中枢记忆表型，如由CD62配体和CCR7的增加的流式细胞术共表达所定义；(2)检查点抑制性分子(如程序性死亡1(PD1))的低水平表达；(3)静止状态，如最大共刺激时Th1/Tc1型细胞因子分泌水平降低所定义；(4)自噬签名，如通过流式细胞术MitoTracker测定的线粒体质量减少所证明；(5)抗性表型，如由对mTORC1和mTORC2下游靶标的至少50％抑制所证明；以及(6)n＝80个关键转录因子和分化分子的多方面差异基因表达谱。
图21展示了相对于T-Rapa细胞，新的Rapa-T方法产生的T细胞带有增加的初始或T中枢记忆标志物的表达，而与新的Rapa-T方法不使用珠共刺激或使用低水平珠共刺激(珠与T细胞的比率为1:3)无关。在图21中，Rapa-T1细胞是通过在IFN-α、替西罗莫司和巴利昔单抗中培养而产生的，如先前所描述的，既没有进行珠共刺激(每个图的前两个柱)，也没有使用1:3的珠与T细胞比率的共刺激(每个图的第三个和第四个柱)；将结果与使用先前的T-Rapa方法的培养进行比较(使用雷帕霉素和3:1的珠与T细胞的比率；每个图的第五个和第六个柱)。在培养结束时进行流式细胞术，并详细记录了CD4+T细胞亚群(黑色柱)和CD8+T细胞亚群(灰色柱)的结果。示出的结果是针对CD45RA+表达定义的初始T细胞亚群(左图)；针对T中枢记忆亚群，如CD62L和CCR7的共表达所定义；以及针对共表达CD62L、CCR7和CD127的更原始的T细胞亚群。
如图21中所详述的，根据本公开所描述的方法制造的CD4+和CD8+T细胞相对于T-Rapa细胞具有通过流式细胞术增加的初始和T中枢记忆标志物的表达水平，包含与T-Rapa方法相比，在方法不涉及任何珠共刺激或降低水平的共刺激的条件下。
图22展示了相对于T-Rapa细胞，新的Rapa-T方法产生的T细胞带有减少的CD25、CTLA4和TIM3的表达，而与新的Rapa-T方法不使用珠共刺激或使用低水平珠共刺激(珠与T细胞的比率为1:3)无关。在图22中，Rapa-T1细胞是通过在IFN-α、替西罗莫司和巴利昔单抗中培养而产生的，如先前所描述的，既没有进行珠共刺激(每个图的前两个柱)，也没有使用1:3的珠与T细胞比率的共刺激(每个图的第三个和第四个柱)；将结果与使用先前的T-Rapa方法的培养进行比较(使用雷帕霉素和3:1的珠与T细胞的比率；每个图的第五个和第六个柱)。在培养结束时进行流式细胞术，并详细记录了CD4+T细胞亚群(黑色柱)和CD8+T细胞亚群(灰色柱)的结果。示出的结果是IL-2受体CD25的表达的结果(左图)；针对免疫抑制和TREG相关联分子CTLA4；以及针对免疫检查点分子TIM3。
如图22中所详述的，根据本公开所描述的方法制造的CD4+和CD8+T细胞相对于T-Rapa细胞具有通过流式细胞术减少的IL-2受体CD252(其与T细胞活化和TREG细胞功能相关联)的表达水平以及减少的免疫抑制分子CTLA43和免疫检查点抑制性分子TIM34的水平，包含与T-Rapa方法相比，在方法不涉及任何珠共刺激或降低水平的共刺激的条件下。
图23展示了新的Rapa-T方法产生的T细胞带有类似Th2对比Th1极化的模式，但是带有相对于T-Rapa细胞的增加的静止，而与新的Rapa-T方法不使用珠共刺激或使用低水平珠共刺激(珠与T细胞的比率为1:3)无关。在图23中，Rapa-T1细胞是通过在IFN-α、替西罗莫司和巴利昔单抗中培养而产生的，如先前所描述的，既没有进行珠共刺激(每个图的前两个柱)，也没有使用1:3的珠与T细胞比率的共刺激(每个图的第三个和第四个柱)；将结果与使用先前的T-Rapa方法的培养进行比较(使用雷帕霉素和3:1的珠与T细胞的比率；每个图的第五个和第六个柱)。在培养结束时进行细胞因子分泌分析(IL-4和IFN-g测量)，其结果在T细胞制造结束时(第6天)和在没有抑制剂的培养条件下再培养6天(第12天)后进行了详细说明。
如图23中所详述的，根据本公开所描述的方法制造的CD4+和CD8+T细胞相对于T-Rapa细胞具有相当程度的Th2对比Th1细胞因子极化，包含与T-Rapa方法相比，在方法不涉及任何珠共刺激或降低水平的共刺激的条件下。具体地，Th2型细胞因子IL-4的分泌水平低(在制造结束时[第6天]和无抑制剂的另外的培养时期[第12天]之后的值在第6天和第12天均在100pg/ml到200pg/ml之间)，并且在培养的第12天时Th1型细胞因子IFN-γ的分泌水平高(值介于1000pg/ml与3000pg/ml之间)。相对于旧的T-Rapa条件，在制造结束时(第6天)在新的Rapa-T条件下的IFN-γ分泌大大减少，由此指示了在新的Rapa-T制造方法中T细胞静止的有利特性，而与方法不使用珠共刺激或使用低水平珠共刺激(珠与T细胞的比率为1:3)无关。
如图24中所详述的，根据本公开所描述的方法制造的CD4+和CD8+T细胞相对于T-Rapa细胞具有Th1细胞因子极化模式，包含与T-Rapa方法相比，在方法不涉及任何珠共刺激或降低水平的共刺激的条件下。
图24展示了相对于T-Rapa细胞，新的Rapa-T方法产生的T细胞带有有利的Thl极化模式，而与新的Rapa-T方法不使用珠共刺激或使用低水平珠共刺激(珠与T细胞的比率为1:3)无关。在图24中，Rapa-T1细胞是通过在IFN-α、替西罗莫司和巴利昔单抗中培养而产生的，如先前所描述的，既没有进行珠共刺激，也没有使用1:3的珠与T细胞比率的共刺激；还评估了各种对照培养，包含先前的T-Rapa方法(使用雷帕霉素和3:1的珠与T细胞比率)。除非另有说明，否则所有培养物的浓度均为9×106个细胞/ml，无珠共刺激，无IL-2添加，具有延迟添加IFN-α，包含浓度为1μM的替西罗莫司和浓度为10μM的巴利昔单抗，并且使用补充了5％AB血清的X-Vivo 20培养基。按照图中的图例的特定培养条件如下：条件1，Rapa-T方法，如上所述；条件2，不使用血清的Rapa-T方法；条件3，不使用巴利昔单抗的Rapa-T方法；条件4，不使用巴利昔单抗并且使用减少的替西罗莫司(0.1μM)的Rapa-T方法；条件5，不使用替西罗莫司或巴利昔单抗的Rapa-T方法；条件6，使用被高频率单核细胞污染的输入T细胞的Rapa-T方法(输入细胞的79％为单核细胞，与其它具有约10％的单核细胞污染的所有培养物相比有所增加)；条件7，使用无单核细胞污染的Rapa-T方法(<1％)；条件8，使用同时添加IFN-α的Rapa-T方法(无过夜延迟)；条件9，使用1:3珠共同刺激的Rapa-T方法；条件10，对照T细胞条件(无抑制剂；3:1珠)；以及条件11，旧的T-Rapa条件，雷帕霉素(1μM)、以20IU/ml添加IL-2、3:1磁珠、无过夜预温育。在培养结束时进行细胞因子分泌分析(IL-2和IFN-γ测量)，其结果在T细胞制造结束时(第6天)和在没有抑制剂的培养条件下再培养6天(第12天)后进行了详细说明。
如图24中所详述的，根据本公开所描述的方法制造的CD4+和CD8+T细胞相对于T-Rapa细胞具有Th1细胞因子极化模式，包含与T-Rapa方法相比，在方法不涉及任何珠共刺激或降低水平的共刺激的条件下。
如图24中所描绘的，条件#1，不使用珠的Rapa-T条件制造具有良好的高水平的IL-2分泌能力，尤其是在没有抑制剂的情况下在T细胞扩增后第12天。在条件#2中观察到了类似的模式，所述模式在不补充血清的培养基中进行，由此指示了在有或没有血清补充的情况下制造Rapa-T细胞的能力。IL-2分泌能力增强，尤其是与培养物#11(旧的T-Rapa条件)相比，指示了新的Rapa-T制造方法产生分化前体谱减少的T细胞，所述T细胞可以非辅助依赖型方式在体内起作用。在这一方面，相对于培养#9，条件#1也是有利的，所述条件#1是使用1:3的珠与T细胞比率的共刺激的新的Rapa-T条件。
如图24所描绘的，条件#1(不使用珠的Rapa-T条件制造)在制造第6天结束时的IFN-γ分泌方面也是优选的，因为水平接近检测下限，由此指示了Rapa-T细胞产物处于静止状态。相比之下，不含抑制剂的条件#5在第6天具有几乎4000pg/ml的IFN-γ分泌；类似地，旧的T-Rapa条件在第6天具有大约6000pg/ml的高水平的IFN-γ分泌。值得注意的是，使用1:3的珠与T细胞比率的细胞共同刺激的新的Rapa-T条件比不使用珠的条件#1的静止更少，因为在制造结束时(第6天)存在大约200pg/ml的IFN-γ分泌。最后，新的Rapa-T制造方法(不使用珠的条件#1或使用珠的条件#9)在不存在抑制剂的情况下在6天的培养间隔之后的培养的第12天，IFN-γ分泌能力有了有利的提高。
总之，新的Rapa-T方法可导致具有以下表型特性的T细胞制造：(a)相对于输入正常T细胞，调节性T细胞标志物(如转录因子FOXP3)的表达减少；以及Th1型转录因子TBET增加；(b)相对于旧的T-Rapa方法，静止状态增加，如部分由IL-2受体CD25的表达减少和在制造结束时炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌减少所指示的；(c)相对于旧的T-Rapa方法，p-STAT5的表达减少并且mTOR途径分子p-RAPTOR、p-4EBP1和p70S6K的水平降低；(d)相对于输入正常T细胞，自噬标志物增加，包含但不限于分子p62表达的改变；(e)相对于输入正常T细胞，初始或T中枢记忆群(包含CD45RA、CD62L/CCR7的共表达、CD62L/CCR7/CD127的伴随表达)的流式细胞术标志物增加；(f)相对于旧的T-Rapa方法，共抑制分子(包含但不限于CTLA4)的表达减少；(g)相对于旧的T-Rapa方法，检查点抑制性受体表达(包含但不限于TIM3)的表达减少；以及(h)相对于输入正常T细胞，RNA表达模式变化，包含但不限于去分化标志物(包含但不限于Nanog、KLF4和KLF10)的增加和分化标志物(包含但不限于穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ)的减少。
可以在培养结束时确定根据本公开中详述的Rapa-T方法制造的T细胞产物的大多数表型特征。然而，重要的是要注意，T细胞产物可以冷冻保存，并且如此，在解冻后状态下T细胞的表型特征反映了将被过继转移到受试者的实际产物。解冻后状态下的Rapa-T细胞可以通过以下来表征：(a)维持静止状态，如IL-2受体CD25的低水平表达所指示的，所述低水平表达在第6天制造结束的样品与解冻后的样品之间是可比的；(b)相对于第6天制造结束的样品，解冻后的样品将继续具有炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α的低水平分泌(相对于制造结束时收集的样品没有增加)；(c)相对于输入正常T细胞，解冻后的样品将维持初始或T中枢记忆群(包含CD45RA、CD62L/CCR7的共表达、CD62L/CCR7/CD127的伴随表达)的流式细胞术标志物增加；(f)解冻后的样品将继续具有减少的共抑制性分子(包含但不限于CTLA4)表达(相对于制造结束时收集的样品，在解冻后的样品中没有增加)；(g)解冻后的样品将继续具有减少的检查点抑制性受体表达(包含但不限于TIM3)的表达(相对于制造结束时收集的样品，在解冻后的样品中没有增加)；以及(h)相对于输入正常T细胞，RNA表达模式变化，包含但不限于去分化标志物(包含但不限于Nanog、KLF4和KLF10)的增加和分化标志物(包含但不限于穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ)的减少。
从冷冻保存的细胞底物制造。在先前收集的PBSC产物的情况下，此类冷冻保存的细胞将被储存在液氮的气相中，直到细胞解冻并制造Rapa-T细胞。在通过单采血液成分术或者未来通过简单血液采集新鲜分离的细胞的情况下，则将立即处理细胞，并且然后可以直接放入培养物中，或者也可以通过受控速率冷冻技术将其冷冻保存，并且储存在液氮的气相中以供后续使用。
从新鲜分离的细胞群中冷冻保存的细胞底物进行T细胞培养需要有些类型的T细胞富集，例如，通过使用单克隆抗体和柱技术(阳性或阴性选择)。Rapa-T制造中使用的原始细胞材料的富集不需要此类基于抗体的方法，因为在培养间隔期间T细胞被有效富集；如此，本方法与在全球层面针对有效细胞治疗的建议相一致。制造Rapa-T细胞的初始加工步骤着重于冷冻保存步骤(当适用时)中使用的二甲基亚砜(DMSO)的去除、红细胞(RBC)的裂解以及污染性粒细胞以及在一定程度上单核细胞的离心去除。这些步骤在主要使用封闭系统技术的相对自动化的方法中执行；此程序是有利的，因为其减少了人为错误，为批记录提供了详细的制造数据，提高了整个制造过程的一致性，并且降低了最终产物被传染剂污染的风险。Rapa-T产物的处理可以包含以下步骤：(1)使用固态非水基方法解冻冷冻保存的产物(当适用时)以减少传染剂污染；(2)使用LOVO可渗透膜装置自动洗涤细胞产物；(3)在LOVO洗涤步骤期间使用氯化铵钾(ACK)缓冲液对RBC的裂解进行整合；(4)使用LOVO方法体积减少细胞含量，随后将细胞铺板到封闭系统逆流离心淘析(CCE)装置(艾鲁特拉；泰尔茂公司)中；以及(5)艾鲁特拉装置的预编程操作用于通过CCE有效去除粒细胞和单核细胞。
在淋巴细胞富集和培养基纯化后，可以将细胞接种到具有丰富的氧交换能力的专用室中(G-Rex容器；威尔逊·沃尔夫公司)。除了具有增强的透气性特性之外，G-Rex容器是封闭系统单元，并且具有自动化封闭系统介质体积减少的另外的优势(GatheRex液体处理泵)。淋巴细胞富集的细胞可以在G-Rex容器中保持6天。
可以利用几种特定的培养条件来促进在G-Rex容器中利用制造的T细胞功能属性进行CD4+和CD8+T细胞混合物的制造。这些特定条件包含：(1)使用进一步补充了5％人血清的或在一些实施例中不添加血清的富集的培养基(包含但不限于X-Vivo 20；龙沙公司)；(2)结合共刺激之前的到G-Rex中的细胞平板接种的16小时间歇(以每毫升1.5×106个细胞的相对较高的密度铺板细胞)；(3)在此初始间歇期间，通过加入单克隆抗体巴利昔单抗(阻断IL-2受体并且由此通过内源性产生的IL-2防止自主性T细胞活化)和替西罗莫司(mTORC1的药理抑制剂)使细胞最佳地休息；(4)在此16小时间歇后，在次佳条件下，细胞被抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠(3/28珠)共刺激，如1:3的珠与T细胞比率所定义的(通常，大多数T细胞扩增条件利用9倍更高的共刺激水平，即珠与T细胞的比率为3:1；在一些情况下，避免添加任何共刺激试剂是有益的)；(5)重要地，至关重要的是在最初的间歇后不要清洗T细胞；(6)在间歇之后，除了添加3/28珠外，至关重要的是以高剂量(10,000IU/ml)添加极化细胞因子IFN-α，以促进分化成CD4+Th1和CD8+Tc1表型；(7)重要地，至关重要的的避免添加IL-2，IL-2是用于T细胞培养的常见添加剂；以及(8)加入珠和IFN-α之后，重要的是保持细胞不受干扰，直到在培养的第6天收获为止(无细胞清洗，无进一步培养添加剂)。
制造的T细胞的冷冻保存。1)在G-Rex容器中进行6天的细胞培养后，可以通过GatheRex仪器以封闭系统的方式减少培养物的体积。随后，可以收获细胞，可以用手持磁铁除去3/28珠，并且可以将细胞放入LOVO装置中以进行连续清洗以去除>99％的培养添加剂(替西罗莫司、巴利昔单抗、IFN-α)。
经过清洗的细胞可以重建到冷冻保存培养基中，所述培养基含有5％DMSO和5％五聚淀粉。冷冻保存是在50ml冷冻袋中以多个单次使用的等分试样进行的。Rapa-T细胞通过符合GMP的受控速率冷冻方法进行冷冻保存，并且在Rapa-T细胞通过指定的释放标准测试后，由经过认证的冷冻运输商在液氮的气相中运输。
Rapa-T细胞的释放标准测试包含标准测试，如CD3+、CD4+和CD8+T细胞含量纯度(通过流式细胞术，最终产物的CD3+T细胞含量可以>70％；CD4+和CD8+亚群可以分别以5％的水平存在)。如通过流式细胞术膜联蛋白和7-AAD测定所确定的，细胞可以>70％是存活的。此外，在最少7天的培养间隔(理想地，14天的培养间隔)内应不受细菌和真菌的污染；此外，细胞产物应低于细菌LPS内毒素和支原体的检测限制。
除了这些标准测试之外，专门的功能测试还可以构成用于Rapa-T细胞产物的释放标准。在释放产物和细胞疗法之前，相对于培养物输入T细胞，Rapa-T细胞可以具有以下属性：(1)增强的T中枢记忆表型，如由CD62配体和CCR7的增加的流式细胞术共表达所定义；(2)检查点抑制性分子(如程序性死亡1(PD1))的低水平表达；(3)静止状态，如最大共刺激时Th1/Tc1型细胞因子分泌水平降低所定义；(4)自噬签名，如通过流式细胞术MitoTracker测定的线粒体质量减少所证明；(5)抗性表型，如由对mTORC1和mTORC2下游靶标的至少50％抑制所证明；以及(6)n＝80个关键转录因子和分化分子的多方面差异基因表达谱。
实例2
进行稳态单采血液成分术以获得含有PBMC的患者样品。样品中的淋巴细胞通过在GE公司的
仪器上使用自动化菲柯尔过程进行富集，消除>95％的不希望的污染嗜中性粒细胞数量。然后将淋巴细胞富集的细胞群以初始细胞密度在下表1所指示的培养基和血清补充条件下铺板到G-REX培养容器中，并且在培养物中温育6天。条件1表示培养前的对照(自动化菲柯尔后富集的淋巴细胞)。通过以表1所指示的剂量添加替西罗莫司、西罗莫司和/或抗IL2受体单克隆抗体巴利昔单抗，以可变的抑制剂条件开始培养。对于条件2-5，以10μg/mL的浓度添加巴利昔单抗，并且对于条件6-8，以20μg/mL的浓度添加巴利昔单抗。一些培养条件接受使用
3/28珠以0.88:1(条件2-3和5-6)或3:1(条件8-9)的珠:T细胞比率进行的抗CD3、抗CD28共刺激。在指示的时间添加细胞因子，所述细胞因子由单独的IFN-α(10,000IU/mL)或由IFN-α(10,000IU/mL)与IL-2(20IU/mL)结合构成。在培养开始时(条件8-9)或在培养开始后一天(条件2-7)添加细胞因子。培养3-4和6-7在培养开始之后两天接受了其它培养基，以将其稀释至所指示的最终细胞密度。
表1：培养条件
M/mL＝每毫升百万个细胞；TEM＝替西罗莫司；RAPA＝1μM的西罗莫司口服溶液；
XV＝X-Vivo
TexMACS是专有培养基调配物。
条件9表示T-Rapa产物。发现条件7提供了表1中测试的条件中的最佳RAPA-T条件。此条件具有若干关键属性：(1)无血清培养基；(2)非常高的初始细胞密度(30M/mL)；(3)非常高的替西罗莫司浓度(4.5μM)；(4)存在抗IL2受体的单克隆抗体；(5)不存在共刺激；(6)在培养开始之后一天仅添加IFN-α(无IL-2)的细胞因子支持；以及(7)培养第2天的细胞稀释。
培养6天后，收获所得的T细胞，并且通过流式细胞术评估所得的T细胞在CD4+(以黑色柱指示)和CD8+(以灰色柱指示)T细胞亚群内的特定分子表达，如图25A-25O所示出的。
图25A(CD45RA+)证明了相对于培养物输入细胞，RAPA-T培养条件对于维持CD4+和CD8+T细胞两者上的初始T细胞标志物表达的重要性；与之形成鲜明对比的是，先前的T-RAPA条件导致CD45RA+细胞显著减少。
图25B(CD25+)证明了相对于培养物输入细胞，RAPA-T培养条件对于在CD4+和CD8+T细胞两者中维持T细胞静止的重要性；与之形成鲜明对比的是，先前的T-RAPA条件导致显著活化的T细胞状态，如增加的CD25表达所指示的。
图25C(CD28+)和图25D(ICOS+)示出，RAPA-T和T-RAPA细胞产物具有与这些活化共刺激分子相似的CD4+和CD8+T细胞表达。
图25E-25F(分别为CD39+和CD73+)示出，相对于T-RAPA条件，RAPA-T培养条件导致这些外核苷酸酶(ecto-nucleotidase)分子的表达减少。这些分子通过将ATP代谢为腺苷发挥免疫抑制作用。因此，就治疗用途而言，预期RAPA-T细胞产物相对于T-RAPA细胞产物是有利的。
图25G-25O中的剩余数据指示，新的RAPA-T方法导致与免疫衰老(KLRG1)相关联、与免疫抑制调节性T细胞表型(GITR)相关联或与检查点抑制性功能(LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、TIGIT和TIM3)相关联的分子的表达大大降低。相对于T-RAPA细胞产物，与RAPA-T细胞产物有关的可变培养条件中的每个培养条件中的这些分子的每一种分子均大大减少。条件7证明了测试的条件中这些分子的最严重且一致的减少。
实例3
使用与实例2的培养条件2-9相对应的培养条件1-8如实例2中所示制备T细胞。在培养间隔的第2天，收获所得T细胞，并且通过蛋白质印迹分析(根据制造商的说明的方法；生物技术公司韦斯先生仪器(BioTechne Mr.Wes instrumentation))对所得T细胞的与mTORC1、mTORC2和STAT途径相关的分子进行评估。
对于最佳的Th1/Tc1型制造，重要的是限制STAT5的活化(磷酸化)，所述STAT5可以驱动调节性T细胞表型。如图26所示出的，Rapa-T细胞培养条件(条件1-6)中的每一个培养条件都相对不含磷酸化STAT5；与之形成鲜明对比的是，T-Rapa条件示出了明显存在磷酸化STAT5(条件7-8)。相对于T-Rapa细胞，Rapa-T细胞的STAT5磷酸化的减少可以超过75％。
对于最佳Th1/Tc1型制造，重要的是通过驱动I型分化的特定STAT分子(包含STAT1)进行主动信号传导。如图26所示出的，Rapa-T培养条件中的每一个培养条件均示出可检测水平的STAT1磷酸化，尽管在条件6中所述水平有所降低(实例2，条件7)。然而，条件6中的总STAT1水平也降低了。
Rapa-T细胞的最佳表型还可以通过与mTORC1途径相关联的分子的减少来表征。在与mTORC1相关联的分子p70S6K的表达中基本上不含Rapa-T条件6(对应于实例2，条件7)。在其它Rapa-T培养条件(条件1、2、4和5)中提供共刺激增加了p70S6K表达。因此，在Rapa-T制造过程期间避免共刺激可能是有益的。
Th1/Tc1型RAPA-T细胞制造的最佳表型也可以取决于mTORC2信号传导途径的保留。在这一方面，有益的是，最佳RAPA-T细胞条件(条件6，对应于实例2，条件7)具有与mTORC2相关联分子总SGK1和磷酸化SGK1的表达的保留。条件6进一步例证了关于mTORC1显著减少和mTORC2相对保留的最佳RAPA-T细胞产物的这一特性，即，mTORC1相关联亚基分子Raptor的显著减少和mTORC2相关联亚基分子Rictor的相对保留。
实例4
进行稳态单采血液成分术以获得含有PBMC的患者样品。样品中的淋巴细胞通过在GE公司的
仪器上使用自动化菲柯尔过程进行富集。然后在两种条件(一个条件对应于表1中的条件7并且一个条件对应于表1中的条件9(T-RAPA))下将淋巴细胞富集的细胞群铺板在G-REX培养容器中并且如实例2中在培养物中温育6天。培养6天后，收获T细胞并以1×106个细胞/mL的浓度重新铺板以产生24小时上清液。在重新铺板时，以3:1、1:1、1:3或1:9的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠对T细胞进行共刺激。在这些比率中的每一个比率下，在不添加细胞因子(由“-”符号指示)、添加rhuIL-2(100IU/mL，由“+IL-2”指示)、添加rhuIL-7(10ng/mL，由“+IL-7”表示)、添加rhuIL-15(10ng/mL，由“+IL-15”指示)、或同时添加rhuIL-7(10ng/mL)和rhuIL-15(10ng/mL)两者(由“+IL-7+IL-15”指示)的情况下进行24小时上清液生成。根据制造商的说明(路明克斯公司)通过已知方法测量细胞中的IL-2和TNF-α分泌。结果示出于图27A-27B中。
处于早期分化状态的CD4+和CD8+T细胞(如初始的、中枢记忆或干细胞中枢记忆亚群)可有对过继性转移有益。这种早期分化T细胞在功能上部分地通过其对关键稳态细胞因子即IL-7和IL-15的差别应答来表征。如此，给定的T细胞产物对IL-7和IL-15应答的能力是期望的特性。
图27A示出了最佳RAPA-T细胞产物的IL-2分泌概况，而下图示出了T-RAPA细胞产物的IL-2分泌概况。在最大共刺激挑战下并且没有外源性细胞因子的支持，相对于T-RAPA细胞产物，RAPA-T细胞产物分泌大约高5倍的IL-2的量。值得注意的是，即使在非常低的共刺激水平下(1:9的珠:T细胞比率)，RAPA-T细胞产物仍会分泌大量的IL-2；与之形成鲜明对比的是，在T-RAPA条件下的这种刺激条件产生了不可检测水平的IL-2。IL-2分泌能力已与有益的非辅助依赖型T细胞表型相关联，这是在处于分化早期的T细胞中观察到的细胞因子分泌特性。最后，在RAPA-T条件下而不在T-RAPA条件下，添加IL-7或IL-15进一步增强了IL-2分泌能力。如此，RAPA-T细胞对稳态细胞因子IL-7和IL-15作出独特应答。
图27B示出了最佳RAPA-T细胞产物的TNF-α分泌概况，而下图示出了先前的T-RAPA细胞产物的TNF-α分泌概况。在最大共刺激挑战下并且没有外源性细胞因子的支持，相对于T-RAPA细胞产物，RAPA-T细胞产物分泌大约等量的TNF-α。然而，相对于T-RAPA条件，在共刺激中添加IL-7或IL-15导致在RAPA-T条件下更高的TNF-α分泌能力。如此，在诱导Th1/Tc1效应细胞因子TNF-α的分泌方面，RAPA-T细胞对稳态细胞因子IL-7和IL-15作出独特应答。
实例5
在不使用任何抑制剂的情况下对人T细胞进行共刺激(“常规”；添加抗CD23/抗CD28磁珠；磁珠:T细胞比率为3:1)。可替代地，根据RAPA-T细胞条件(“经雷帕霉素处理”)共刺激T细胞，并且通过抗CD3/抗CD28磁珠(“Dynabeads”；磁珠:T细胞比率为1:3)或通过
可溶性共刺激微粒(生物技术公司；以制造商建议剂量的20％使用
每1×106个细胞50μL
储液)。培养6天后，收获T细胞，调节至1×106个细胞/mL，并使用抗CD3/抗CD28珠(珠:T细胞比率为3:1)进行共刺激。然后收集24小时上清液，并通过路明克斯测定来测试IL-2、TNF-α和IL-13的含量(结果示出为每24小时每1×106个细胞每mL的pg数)。使用相同的方案，收获培养6天后的细胞，并进行流式细胞术评估细胞表面标志物(包含CD4、CD8、CD25和CTLA4)的表达。
图28示出了IL-2、TNF-α和IL-13的分泌数据。如图28所示出的，由抗CD3/抗CD28纳米颗粒(“Dynabeads”)和可溶性抗CD3/抗CD28微粒(
试剂；生物技术公司)共刺激的RAPA-T细胞之间的结果相似。如先前所描述的，这些细胞具有Th1型细胞因子谱，如通过IL-2和TNF-α的大量分泌以及Th2型细胞因子IL-13的最少分泌证明的。
图29示出了如通过流式细胞术测量的表达细胞表面标志物CD4、CD8、CD25和CTLA4的细胞的频率。如图29所示出的，由抗CD3/抗CD28纳米颗粒(“Dynabeads”)和可溶性抗CD3/抗CD28微粒(
试剂；生物技术公司)共刺激的RAPA-T细胞之间的结果相似。如先前所描述的，这些细胞是静止的(如CD25的表达减少所指示的)，并且具有减少的检查点抑制性受体表达(如CTLA4的表达所减少所指示的)。
实例6：Rapa-T细胞疗法的III期随机临床试验图30描绘了随机第3期协议方案。在图30的上图中，对于随机选择接受Rapa-T疗法的患者，用于Rapa-T细胞制造的自体细胞将来源于随机化之后收集的稳态单采血液成分术。免疫耗竭方案将由喷司他丁和低剂量、剂量调整的环磷酰胺(PC方案)构成。第一个PC周期将在Tl.Rapa制造间隔期间的研究开始时单独施用(不使用T细胞疗法)并且持续时间为28天；在四次Tl.Rapa细胞输注的每一次之前，将进行PC周期二、三、四和五，并且持续时间将为35天。图30的下图描绘了用于稳定疾病的扩展的T1.Rapa细胞疗法。对于在周期4之后病情稳定的Tl.Rapa细胞接受者，将制造另外一批Tl.Rapa细胞，以允许多达四个另外的Tl.Rapa细胞治疗周期(周期6到周期9)。
图30详述了制造的T细胞疗法，其将向随机分配到制造的T细胞群组的所有患者施用。此疗法将涉及：(1)收集免疫细胞用作制造的T细胞的制造的底物，所述免疫细胞将从先前收获的外周血干细胞移植程序或新鲜的稳态单采血液成分是术程序中获得；(2)富集单核细胞群，并随后在制造的T细胞培养条件下温育单核细胞；(3)冷冻保存一次性的制造的T细胞治疗产物，所述产物经过身份和功能验证步骤；(4)采用喷司他丁加环磷酰胺药物方案(PC方案)的患者治疗将首先被隔离，并且然后与制造的T细胞疗法相结合，以使患者为制造的T细胞治疗做好准备并且直接促进抗肿瘤的作用；以及(5)在治疗期间和之后的专门的免疫监测。
免疫耗竭方案将由喷司他丁和低剂量、剂量调整的环磷酰胺(PC方案)构成。第一个PC周期将在制造的T细胞制造间隔期间的研究开始时单独施用(不使用T细胞疗法)并且持续时间为最少28天以允许血细胞计数恢复；在四次制造的T细胞输注的每一次之前，将进行PC周期二、三、四和五，并且持续时间将为最少35天以允许血细胞计数恢复。制造的T细胞疗法的周期5完成后，将不再进行维持疗法。根据临床情况，治疗周期可以比指定的间隔长，延长到无限期间隔。作为举例而非限制，如果患者处于缓解期，则可以延迟周期，直到疾病复发的证据为止。此外，还设想了PC方案的另外维护周期加上过继性制造的T细胞疗法，以使患者保持处于缓解期，也许是每年进行1到4个治疗周期，或者治疗疾病复发(如果发生)。
如图30所指示的，对于经过4个周期治疗后疾病稳定的患者，可以进行另外的Rapa-T细胞制造，由此通过另外的周期(多达总共9个Rapa-T细胞疗法周期)促进潜在的疗法。
图31详细描述了PC化疗方案的细节。PC疗法的每个周期将由在周期的第15天输注Tl.Rapa细胞之前(T1.Rapa剂量：介于0.1个细胞/kg与5×106个细胞/kg之间)的14天进程构成。对于周期1，喷司他丁(P)将在第1、4、8和11天以4mg/m2的剂量施用(静脉内)；环磷酰胺(Cy)将在第1天到第5天以及第8天到第12天以每天200mg的剂量施用。对于随后的周期，喷司他丁的剂量将减少到2mg/m2。
图32A-32C详细说明了对照组的性质，即未随机分为接受Rapa-T细胞疗法的受试者将接受适用于患有第二次或第三次复发的MM的受试者的经FDA批准的三种三重方案中的一种，即：DPd方案(图32A)；DRd方案(图32B)；或KRd方案(图32C)。
对于图32A-32C中描绘的对照群组，患者将在多发性骨髓瘤(MM)第二次或第三次复发时被招募并且随后随机分组。患者必须是接受用于治疗此患者群体的三种经FDA批准的方案之一的候选者。随机分配至对照群组的患者将接受使用已公布的标准方案的DPd、DRd或KRd方案。这些标准方案的特定方面已经在上文中的以部分中指示：[图32A]DPd方案；[图32B]DRd方案；和[图32C]KRd方案。
制造的T细胞功效的统计学评估主要目标将是相对于随机分配到标准治疗疗法的接受者，比较制造的T细胞疗法的接受者的无进展生存期。相比之下，次要目标将使用描述性统计进行初步评估。患有第二次或第三次复发的MM的符合条件的患者将以1:1的方式随机分组，以接受经FDA批准的由DPd、DRd或KRd构成的三联疗法的标准护理疗法，或接受采用离体制造的自体抗雷帕霉素Th1/Tc1细胞(制造的T细胞)的过继性T细胞疗法。N＝65位可评估患者将被纳入每个群组。主要研究目标是确定相对于标准治疗群组中接受治疗的患者，制造的T细胞群组中接受治疗的患者的无进展生存期(PFS)是否增加。
患者的无进展生存期(PFS)和总生存期将通过卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)方法在两组患者中进行估计，并以逐点95％置信区间呈现。通过对卡普兰-梅尔估计值反相，可以得出中位生存期和其95％置信区间的非参数估计。将通过单侧对数秩测试来测试主要功效结果(PFS)。当研究中发生了130个PFS事件或达到募集目标并且所有患者均已随访至少12个月时，将进行最终分析。将从治疗开始时测量总生存期(OS)；任何原因导致的死亡将是事件，并且将在最后一次接触日期检查对患者进行检查。
将以描述性方式(如平均值、标准偏差、置信区间、卡普兰-梅尔分析或表征多发性骨髓瘤缓解状态的其它方法)评估次要终点。客观应答率(ORR)和最小残留病率(MRD)将被估计为观察到的具有对应结果的患者群体，并且以95％的置信区间呈现。
人口统计和基线数据将进行描述性汇总。分类数据将呈现为频率和百分比，而连续数据将使用汇总统计(如平均值、中位数和标准偏差)来呈现。将特别关注的是确定多发性骨髓瘤的先前治疗方法和对于所用单个药物的难治程度。
当总共发生了28个和55个PFS事件(将两组结合)时，将进行两项可能因无效而终止的期中分析。将使用具有二次错误率损耗函数的β错误率损耗方法，这是奥布赖恩·弗莱明方法(O'Brien-Fleming)与波考克(Pocock)界限之间的折衷。下表示出了两次期中分析和一次最终分析的零假设接受界限。如果修改了期中分析的时间，则可以使用错误率损耗函数来修改这些值。
下表显示了由于无效导致的早期停止试验的概率作为真实效应大小函数：
收集免疫细胞用作用于制造的T细胞制造的底物
对于随机分到制造的T细胞疗法群组的患者，需要收集和运输用于制造的T细胞的细胞。
此外，在受试者具有如绝对淋巴细胞计数(ALC；每微升至少300个淋巴细胞的值)所定义的血液中免疫细胞的必要值的情况下，将进行稳态单采血液成分术并且将由10升到15升收集构成。单采血液成分术应在研究开始后的10天内应进行。单采血液成分术产物将被立即运输(无冷冻保存)到Rapa治疗公司(Rapa Therapeutics)。
PC方案的第一个周期应在研究开始后的10天内开始。
制造的T细胞疗法的后续迭代可能会变得更高效，并且如此可以使用更少量的输入细胞来开始制造。此类改进的方法将至少部分地涉及改进的主体准备和改进的制造工艺。在此类方法中，将有可能使用从500mL或更少的单次抽血获得的起始材料来制造T细胞。
制造的T细胞的制造
在先前收集的细胞产物的情况下，此类冷冻保存的细胞将被储存在液氮的气相中，直到细胞解冻和制造的T细胞的制造。在通过单采血液成分术或者未来通过简单血液采集新鲜分离的细胞的情况下，则将立即处理细胞，并且然后可以直接放入培养物中，或者也可以通过受控速率冷冻技术将其冷冻保存，并且储存在液氮的气相中以供后续使用。
来自新鲜分离的细胞群的冷冻保存的细胞底物的T细胞培养需要某种类型的T细胞富集。作为举例而非限制，T细胞富集可以通过使用单克隆抗体和色谱柱技术(正向或负向选择)来实现。制造的T细胞的制造中使用的原始细胞材料的富集不需要此类基于抗体的方法，因为在培养间隔期间T细胞被有效富集；如此，本方法与在全球层面针对有效细胞治疗的建议相一致。制造的T细胞的初始加工步骤着重于冷冻保存步骤(当适用时)中使用的二甲基亚砜(DMSO)的去除、红细胞(RBC)的裂解以及污染性粒细胞以及在一定程度上单核细胞的离心去除。这些步骤在主要使用封闭系统技术的相对自动化的方法中执行。此程序是有利的，因为其减少了人为错误，为批记录提供了详细的制造数据，提高了整个制造过程的一致性，并且降低了最终产物被传染剂污染的风险。制造的T细胞产物的处理结合了以下步骤：(1)使用固态非水基方法解冻冷冻保存的产物(当适用时)以减少传染剂污染，如Triana E,Ortega S,Azqueta C等人,“将使用新的干热装置解冻冷冻保存的来自单采血液成分术的造血祖细胞(Thawing of cryopreserved hematopoietic progenitor cellsfrom apheresis will be with using a new drywarming device)”.《输血(Transfusion)》.2013；53(l):85-90；(2)使用LOVO可渗透膜装置自动洗涤细胞产物，如Mfarrej B,Bouchet G,Couquiaud J等人,“对解冻的造血祖细胞移植物中的Lovo装置进行二甲亚砜去除和细胞浓度的临床前评估(Pre-clinical assessment of the Lovo devicefor dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoieticprogenitor cell grafts)”.《细胞疗法》.2017；19(12):1501-1508；(3)在LOVO洗涤步骤期间，使用氯化铵钾(ACK)缓冲液对RBC的裂解进行整合，在Brown WE,Hu JC,Athanasiou KA.“完全分化细胞的氯化铵钾裂解缓冲液处理提高了细胞纯度并产生新组织功能特性(Ammonium-Chloride-Potassium Lysing Buffer Treatment of Fully DifferentiatedCells Increases Cell Purity and Resulting Neotissue Functional Properties)”.《组织工程化C部分，方法(Tissue engineering Part C,Methods)》.2016；22(9):895-903中描述；(4)使用LOVO方法体积减少细胞含量，随后将细胞铺板到封闭系统逆流离心淘析(CCE)装置(艾鲁特拉；泰尔茂公司)中，如先前在Stroncek DF,Fellowes V,Pham C等人,“临床外周血单核细胞浓缩液的逆流淘析用于生产树突状细胞和T细胞疗法(Counter-flowelutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates forthe production of dendritic and T cell therapies)”.《转化医学杂志(J TranslMed.)》2014；12:241.(doi):10.1186/sl2967-12014-10241-γ中所描述的；以及(5)艾鲁特拉装置的预编程操作用于通过CCE有效去除粒细胞和单核细胞。
在淋巴细胞富集和培养基纯化后，将细胞接种到具有丰富的氧交换能力的专用室中(G-Rex容器；威尔逊·沃尔夫公司)，在Bajgain P,Mucharla R,Wilson J等人,“使用G-Rex“M”系列优化悬浮细胞的生产(Optimizing the production of suspension cellsusing the G-Rex“M”series)”.《分子疗法方法与临床发展(Molecular Therapy Methods&Clinical Development)》.2014；1:14015中描述。除了具有增强的透气性特性之外，G-Rex容器是封闭系统单元，并且具有自动化封闭系统介质体积减少的另外的优势(GatheRex液体处理泵)。淋巴细胞富集的细胞在G-Rex容器中保持6天。
利用几种特定的培养条件来促进在G-Rex容器中利用制造的T细胞功能属性进行CD4+和CD8+T细胞混合物的制造。这些特定条件包含：(1)使用进一步补充了5％人血清的富集的培养基(包含但不限于X-Vivo 20；龙沙公司；培养基也可以进一步补充5％AB血清)，Zhang HD,Song ZL,Li WP.[无血清培养基的树突状细胞体外培养(In vitro cultivationof dendritic cells with serum-free medium)],《中国实验血液学杂志(Zhongguo shiyan xue ye xue za zhi)》.2006；14(5):985-989；龙沙公司)；(2)结合共刺激之前的到G-Rex中的细胞平板接种的16小时间歇(以每毫升1.5×106个T细胞的相对较高的密度铺板细胞)；(3)在此初始间歇期间，通过加入单克隆抗体巴利昔单抗(阻断IL-2受体并且由此通过内源性产生的IL-2防止自主性T细胞活化)和替西罗莫司(mTORC1的药理抑制剂)使细胞最佳地休息；(4)在此16小时间歇后，在次佳条件下，细胞不被共刺激或者被抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠(3/28珠)共刺激，如1:3的珠与T细胞比率所定义的(通常，大多数T细胞扩增条件利用9倍更高的共刺激水平，即珠与T细胞的比率为3:1)；(5)重要地，至关重要的是在最初的间歇后不要清洗T细胞；(6)在间歇之后，除了添加3/28珠外，至关重要的是以高剂量(10,000IU/ml)添加极化细胞因子IFN-α，以促进分化成CD4+Th1和CD8+Tc1表型；(7)重要地，至关重要的的避免添加IL-2，IL-2是用于T细胞培养的常见添加剂；以及(8)加入珠和IFN-α之后，重要的是保持细胞不受干扰，直到在培养的第6天收获为止(无细胞清洗，无进一步培养添加剂)。
制造的T细胞产品的冷冻保存以及身份和功能的验证
在G-Rex容器中进行6天的细胞培养后，将通过GatheRex仪器以封闭系统的方式减少培养物的体积。随后，将收获细胞，用手持磁铁除去3/28珠，并且将细胞放入LOVO装置中以进行连续清洗以去除>99％的培养添加剂(替西罗莫司、巴利昔单抗、IFN-α)。
经过清洗的细胞将重建到冷冻保存培养基中，所述培养基含有5％DMSO和5％五聚淀粉。冷冻保存将在50ml冷冻袋中以多个单次使用的等分试样进行。制造的T细胞剂量将介于每千克受体体重0.1个T细胞与5×106个T细胞之间。将冷冻保存四个一次性等分试样，以允许连续四次、大约每月一次的制造的T细胞的输注。制造的T细胞将通过符合GMP的受控速率冷冻方法进行冷冻保存，如先前在Hunt CJ.“用于临床应用的人类干细胞冷冻保存：综述(Cryopreservation of Human Stem Cells for Clinical Application:A Review)”.《输血医学和血液疗法：德国输血医学和免疫血液学学会的官方机构(Transfusion medicineand hemotherapy:offizielles Organ der Deutschen Gesellschaft furTransfusionsmedizin und Immunhamatologie)》.2011；38(2):107-123中描述的，并且；并且在制造的T细胞通过指定的释放标准测试后，细胞将由经过认证的冷冻运输商在液氮的气相中运输。
制造的T细胞的释放标准测试包含标准测试，如CD3+、CD4+和CD8+T细胞含量纯度(通过流式细胞术，最终产物的CD3+T细胞含量必须>70％；CD4+和CD8+亚群必须分别以5％的水平存在)。如通过流式细胞术膜联蛋白和7-AAD测定所确定的，细胞必须>70％是存活的。此外，在最少3天的培养间隔(理想地，14天的培养间隔)内，细胞必须不受细菌和真菌的污染；此外，细胞产物必须低于细菌LPS内毒素和支原体的检测限制。
除了这些标准测试之外，专门的功能测试还将构成用于制造的T细胞产物的释放标准。在释放产物和细胞疗法之前，相对于培养物输入T细胞，制造的T细胞可以具有以下属性：(1)增强的T中枢记忆表型，如由CD62配体和CCR7的增加的流式细胞术共表达所定义；(2)检查点抑制性分子(如程序性死亡1(PD1))的低水平表达；(3)静止状态，如最大共刺激时Th1/Tc1型细胞因子分泌水平降低所定义；(4)自噬签名，如通过流式细胞术MitoTracker测定的线粒体质量减少所证明，参见Xiao B,Deng X,Zhou W,Tan EK.“使用MitoTracker的基于流式细胞术的线粒体自噬评估(Flow Cytometry-Based Assessment of MitophagyUsing MitoTracker)”.《细胞神经科学前沿(Frontiers in cellular neuroscience)》.2016；10:76；(5)抗性表型，如由对mTORC1和mTORC2下游靶标的至少50％抑制所证明；以及(6)n＝80个关键转录因子和分化分子的多方面差异基因表达谱。
使用PC方案的主体准备
接受制造的T细胞治疗的患者接受喷司他丁加环磷酰胺(PC)方案。PC方案的周期1将在制造的T细胞制造期间施用，并且因此无需伴随T细胞输注即可施用。周期1在两个层面上是有利的：第一，其将减少主体调节性T细胞和晚期衰老效应T细胞的数量和功能，由此增强制造的T细胞疗法的未来周期；以及第二，其将直接介导针对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用，由此在制造间隔期间控制疾病。在周期#1之后，PC方案的后续周期之后将是在两周的PC方案间隔(第15天)之后一天的制造的T细胞的过继性转移。PC方案的这些周期是额外地有利的，因为所述周期将进一步调节主体生物学，包含增加T细胞稳态细胞因子，如IL-7和IL-15，这将允许过继性转移后促进制造的T细胞扩增。
PC方案后进行制造的T细胞输注。PC疗法的每个周期将由在周期的第15天输注制造的T细胞之前的14天进程构成。制造的T细胞剂量将介于1个细胞/kg与5×106个细胞/kg之间，包含介于1×105个细胞/kg与5×106个细胞/kg之间的T细胞剂量。喷司他丁(P)将在第1、4、8和11天以4mg/m2的剂量施用(静脉内)；环磷酰胺(Cy)将在第1天到第5天以及第8天到第12天以每天200mg的剂量施用。
在施用喷司他丁之前，需要进行术前用药和预水化。在施用喷司他丁之前60分钟，将使用1升0.9％氯化钠进行预水化。需要进行带有止吐药物的术前用药。止吐药物方案建议如下：(1)地塞米松(Dexamethasone)，每次喷司他丁给药(即周期的第1天、第4天、第8天和第11天)前60分钟静脉内输注12mg；(2)此外，口服地塞米松可按需在其它日子按每天4mg的剂量施用；(3)将在每次喷司他丁给药前60分钟，静脉内输注8mg恩丹西酮(Ondansetron)；(4)对于其余治疗，在第1天到第14天，可按需要每12小时以口服8毫克(片剂)的剂量施用恩丹西酮；以及(5)对于恶心和呕吐未得到控制的患者，可以根据需要将阿瑞匹坦(Aprepitant)添加到止吐药物方案中。喷司他丁剂量将为4mg/m2；每个喷司他丁剂量将在30-60分钟内静脉内施用。
将对喷司他丁进行剂量调整，向患者施用的喷司他丁剂量为介于1mg/m2-4 mg/m2之间。将根据肌酐清除率(CrCl)对喷司他丁进行剂量调整，肌酐清除率可通过24小时尿液获得或通过Cockcroft-Gault公式计算得出。如果受试者在喷司他丁和环磷酰胺疗法期间肌酐水平升高，则随后的剂量将进行如下修改：CrCl>60毫升/分钟/1.73平方米→施用4mg/m2的喷司他丁(全剂量)；CrCl<60毫升/分钟/1.73平方米但是>30毫升/分钟/1.73平方米→以减少50％的剂量2mg/m2施用喷司他丁；以及CrCl<30mL→停止施用喷司他丁。喷司他丁很少与器官毒性相关联，如神经系统毒性(癫痫、昏迷)或心脏毒性(射血分数减少)。如此，应特别注意评估PC疗法期间出现的任何器官毒性。如果喷司他丁与任何2级或更高严重程度的器官毒性相关联，则应联系机构PI以讨论是否需要进一步喷司他丁治疗和进一步方案治疗。
口服环磷酰胺(Cy)将用作PC方案的组成部分，其中环磷酰胺的剂量将介于50-400mg之间。在PC方案周期一到周期五期间，Cy的剂量将在第1-5天和第8-12天为每天200mg。出于耐受性问题或财务考虑，也允许通过静脉内输注200mg环磷酰胺。由于环磷酰胺膀胱毒性，因此在PC方案期间必须保持充分的水合作用。患者每天应至少喝2升到4升液体以保持尿液颜色清晰。
将根据下表基于在周期的第1天、第4天、第8天和第11天获得的全血细胞计数(CBC)和差异细胞值(绝对淋巴细胞计数[ALC]和绝对中性粒细胞计数[ANC])，根据需要调整环磷酰胺剂量。PC方案的既定目标是在最小化髓样细胞抑制的同时实现免疫耗竭和免疫抑制。为帮助确保达到这一目标，将根据下表基于在喷司他丁施用当天(即周期的第1天、第4天、第8天和第11天)获得的ALC和ANC值，根据需要调整环磷酰胺的剂量。表中的符号如下：1不会根据ALC/ANC值对喷司他丁进行剂量调整；2对于<500的ANC值，除了减少环磷酰胺的剂量外，患者还将接受G-CSF治疗，直到下一次进行ANC测量为止；3指示的环磷酰胺剂量将每天持续进行，直到下一次ALC/ANC测量(在周期的第1天、第4天、第8天和第11天进行)为止。
设想了PC方案的变化。第一，喷司他丁和环磷酰胺在其免疫耗竭和免疫抑制作用方面协同作用；在抗肿瘤作用方面，此协同作用也可能存在，尽管关于这种可能性的信息很少。如此，设想了PC方案可以用作癌症疗法(包含实体瘤)的独立疗法；在一个先前的实例中，接受部分由PC方案构成的联合方案的难治性间皮瘤患者具有前所未有的抗肿瘤益处。第二，由于这种协同作用，建议通过静脉输注同时施用两种药物是有利的，优选地通过将喷司他丁和环磷酰胺混合到同一静脉内输液袋中，以便于施用并减少药房错误。在这样的应用中，重要的是要提供PC混合物的选择，所述选择应涵盖各种临床相关的喷司他丁与环磷酰胺比率。
制造的T细胞输注
在所有制造的T细胞施用之前，都需要进行术前用药。在制造的T细胞输注之前，施用苯海拉明(diphenhydramine)(25mg到50mg静脉输注或口服)和对乙酰氨基酚(acetaminophen)(650毫克，口服)30-60分钟。
制造的T细胞输注将发生在周期二到周期五的第15天；然而，出于逻辑上的原因，制造的T细胞输注最多可能会延迟3天。此外，由于逻辑上的原因，允许最多延迟4周，以及以允许毒性恢复。制造的T细胞剂量将为5×106个细胞/kg；然而，如果在制造过程中出现次优的细胞产率，则允许低至0.1×106个细胞/kg的剂量。将冷冻保存的制造的T细胞解冻，并且根据针对血液制品管理的适当的机构SOP，通过重力立即并快速(30分钟内)静脉内施用。除非有无法预料的情况需要住院施用，否则将在门诊中进行这种T细胞输注。除非认为毒性威胁生命，否则不允许在DMSO相关毒性(发冷、肌肉酸痛)的管理中使用类固醇，所述毒性可能在细胞输注后立即发生。
可以设想，低于0.1×106个细胞/kg的更少量的制造的T细胞输注也可能与临床有关(作为举例而非限制，低一个对数，在1×105个细胞/kg)。第一，将优化制造以产生介导进一步增强的体内效应的制造的T细胞，由此减少所需的T细胞剂量；这将是有利的，部分是因为T细胞收集可以通过简单的抽血来发生，并且部分是因为提高的制造可行性。第二，如以上所详述的，随着PC方案的进一步改进，过继性转移的制造的T细胞相对于宿主细胞将具有进一步改善的体内选择性优势，由此有效地减少了所需的制造的T细胞剂量。
疗法期间和之后的专门的免疫监测
外周血单核细胞和骨髓细胞将被送到Rapa治疗剂，使得可以进行免疫监测测试；这些测试的目的是探索制造的T细胞疗法的作用机制，以及开发将预测制造的T细胞功效的生物标志物。在一种努力中，将评估制造的T细胞受体响应于各种刺激而产生各种Th1型和Th2型细胞因子的能力，所述各种刺激包含自体多发性骨髓瘤肿瘤细胞或已知的或可疑的肿瘤抗原，如癌症-睾丸抗原(CTA)家族中的分子。CTA基因家族数量众多，并且已示出与多发性骨髓瘤相关；由于CTA基因的序列是已知的并且特定的CTA基因的相关性已在多发性骨髓瘤中表征，因此可以证明制造的T细胞疗法可以特异性诱导T细胞介导的针对一系列CTA抗原的免疫。可以使用RNA表达分析、通过ELISA或路明克斯多分析物方法的分泌分析、流式细胞术或ELISPOT测定进行此类细胞因子应答的测量。抗原特异性免疫也可以通过使用抗体产生测定或细胞溶解测定来定量。
将评估制造的T细胞疗法之后获得的T细胞相对于制造的T细胞疗法之前获得的T细胞是否对自体多发性骨髓瘤细胞具有增强的反应性。这种努力的一个障碍是患者特异性多发性骨髓瘤细胞系的繁殖通常不成功。为了克服这一障碍，将使用以下来繁殖骨髓瘤细胞：专门的容器，如在Zhang W,Gu Y,Sun Q等人,“通过优化成骨细胞生态位的原发人多发性骨髓瘤细胞的离体维持(Ex Vivo Maintenance of Primary Human Multiple MyelomaCells through the Optimization of the Osteoblastic Niche)”.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》.2015；10(5)中，以及添加了已知能增强多发性骨髓瘤增殖和存活的因子组合的培养基，包含IL-6、CD40配体以及获得对卡非佐米的耐药性。患者特异性多发性骨髓瘤细胞可以在免疫T细胞抗肿瘤反应性的评估中单独用作刺激剂；可替代地，可以将此类肿瘤细胞变成凋亡状态，将内容物装载到专业的抗原呈递细胞中，所述抗原呈递细胞可以在制造的T细胞的制造期间由从淘析过程中收集的患者特异性单核细胞制造。
此外，设想了T细胞受体(TCR)免疫库分析将可用作制造的T细胞疗法的生物标志物。优选地，此类库分析将通过RNA测序而不是更常用的DNA测序进行。与靶向的大多数T细胞疗法不同，制造的T细胞疗法是多克隆方法，因为制造过程不会优先地将T细胞反应性转移到任何特定肿瘤抗原上。如此，预期在制造的T细胞疗法后的任何有益的抗肿瘤效应都源自体内克隆扩增到多种肿瘤抗原；考虑到这种生物学，在将患者治疗前的库与治疗后的库进行比较时，成功的制造的T细胞疗法将导致不同的TCR库。在其它癌症疗法环境中，如解除检查点抑制的单克隆抗体治疗，成功的疗法与新的TCR克隆特异性的出现相关联，所述特异性被称为可通过量化Morisito指数来确定的TCR库的偏移，Robert L,Harview C,EmersonR等人,“通过分析血淋巴细胞中TCR的使用揭示CTLA-4和PD-1阻断的独特免疫学机制(Distinct immunological mechanisms of CTLA-4and PD-1blockade revealed byanalyzing TCR usage in blood lymphocytes)”.《肿瘤免疫学(OncoImmunology)》.2014；3:e29244。以类似的方式，随着成功的制造的T细胞疗法，将会有TCR库偏移；超出制造的T细胞疗法间隔的TCR偏移的持续将与T细胞对恶性肿瘤的长期免疫一致。随着制造的进步，将产生改进形式的制造的T细胞；在这种情况下，TCR偏移将更广泛，将在减少的治疗周期数时发生，并且将在治疗后间隔中更持久。
多发性骨髓瘤疗法的方案纳入标准
年龄>18岁的男性或女性患者可能有资格接受制造的T细胞疗法。没有正式的年龄上限。但是，对于有心血管病状或症状病史的65岁以上患者(即使不能完全符合以下详述的排除标准)，应由在多中心场所的心脏病专家进行评估。然后将在逐例的基础上考虑这样的受试者。总体患者表现状态应至少为中等良好健康状况，如ECOG表现状态<2所量化的。
患者必须通过组织学或细胞学研究明确诊断为患有多发性骨髓瘤。此外，所述疾病必须是有症状的，并且患者在接受来自以下类别的药剂的药物后，必须处于疾病的第二次或第三次复发中：蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、烷化剂、CD38单克隆抗体和糖皮质激素。
处于第二次或第三次疾病复发中的患者处于疾病的相对晚期阶段。然而，通过证明制造的T细胞疗法的安全性和有效性，可以设想，疗法整体框架中较早的多发性骨髓瘤患者将受益于制造的T细胞疗法。作为举例而非限制，制造的T细胞疗法可以用作高剂量化学疗法与自体造血细胞移植相结合的替代方法，也可以用于大量不适合移植的患者。此外，可以设想在临床症状之前的多发性骨髓瘤进展的最早阶段，即在郁积型疾病阶段的早期检测期间，进行制造的T细胞疗法。
在另一方面，可以设想，此处描述的Rapa-T细胞疗法将适用于处于多发性骨髓瘤更晚期的患者和患有高度难治性疾病的患者的治疗。具体地，Rapa-T细胞疗法可用于治疗五重难治性MM，所述五重难治性MM被定义为患有复发性MM且对用于治疗MM的前多种药物中的五种药物有难治性的患者，所述药物即：来那度胺、泊马度胺、硼替佐米、卡非佐米和达雷木单抗。
由于五重难治性MM患者没有标准疗法选择，因此在这种情况下评估Rapa-T细胞疗法的临床方案将是单组II期研究，类似于先前在Chen C,Siegel D,Gutierrez M等人,“塞利尼索在复发或难治性多发性骨髓瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症中的安全性和有效性(Safety and efficacy of selinexor in relapsed or refractory multiple myelomaand Waldenstrom macroglobulinemia)”.《血液学(Blood)》.2018；131(8):855-863中执行的用于评估新型抗癌药物的研究。对于此II期研究，将执行Rapa-T细胞疗法，如图30、31和32A-32C中所描述的。所述研究的统计目标将是确定Rapa-T细胞疗法是否可以诱导明显的至少部分难治性MM缓解率，如至少与30％一致的比率所定义的。
必须具有潜在的可能足以制造制造的T细胞的自体T细胞来源。具体地，患者必须具有足够数量的先前冷冻保存的可用于制造的PBSC单位(由>200万个细胞/kg的CD34+总含量定义)或足够数量的可通过稳态单采血液成分术收集的循环T细胞(由每微升大于300个细胞的ALC定义)。
患者必须距骨髓瘤疗法、大手术、放射疗法、参与其它调查性试验至少两周，并且已经从这些先前治疗的临床显著毒性中恢复(CTCAE毒性解析为2或更低)。通过MUGA或2D超声心动图检查得出的心脏射血分数(EF)必须在机构正常限制内，且EF水平至少为40％。如通过血清肌酐测量的肾功能必须小于或等于2.5mg/dl。肝功能必须足够，如通过AST和ALT小于或等于正常值上限的3倍以及总胆红素小于或等于1.5(除非由于吉尔伯特氏病(Gilbert's disease))所测量的。肺功能必须足够，如由校正后的DLCO大于或等于肺功能测试中预期的50％所定义的。不得有异常出血倾向病史。在进行任何不属于标准医疗服务的研究相关程序之前必须获得自愿的书面同意书，应了解患者可以随时撤回同意书，而不会影响将来的医疗服务。
随机III期试验：护理疗法的标准
为了证明制造的T细胞疗法的益处，将进行随机研究，以正式比较制造的T细胞疗法与护理标准疗法的结果，所述护理标准疗法由DPd、DRd或KRd方案构成；所述方案将根据其针对处于第二次或第三次复发的MM患者的经FDA批准的状态，按照文献中所规定的进行管理。
实例7
进行稳态单采血液成分术以获得含有PBMC的患者样品。样品中的淋巴细胞通过在GE公司的
仪器上使用自动化菲柯尔过程进行富集。然后将淋巴细胞富集的细胞群铺板在G-REX培养容器中，并且在TexMACS培养基(无血清补充；无IL-2补充)中培养6天，并且含有IFN-α、替西罗莫司和巴利昔单抗。在制造结束时，将所得的Th1/Tc1细胞暴露于胰腺癌细胞(MIA-Paca2细胞系)或暴露于通过暴露于依托泊苷(etoposide)而凋亡的肺癌细胞(H23细胞系)。用此肿瘤裂解物脉冲，然后在IL-2(200IU/mL)中培养7天，在所述培养7天时进行第二次暴露于肿瘤裂解液。在含有IL-2的培养基中另外的7天培养间隔之后，进行第三次肿瘤裂解液暴露，并且通过路明克斯测定来测试所得的24小时上清液的细胞因子含量(结果以pg/mL/1×106个细胞/24小时示出)。细胞因子测定的结果在图34A-B中示出。条件A指示以次佳的肿瘤裂解物调配物脉冲；条件B表示肿瘤裂解物的最佳调配物。“<”指示值低于检测限制。
如图34A-B示出的，RAPA-T细胞可以通过其对包含实体肿瘤(如胰腺癌细胞和肺癌细胞)的肿瘤细胞的反应能力来进一步表征。如图34A-B进一步示出的，RAPA-T细胞可以维持特征性Th1细胞因子表型，如通过IFN-γ和GM-CSF的高水平分泌以及Th2细胞因子IL-4和IL-10的分泌减少所证明。
在另一个实验中，在制造结束时，将所得的Th1/Tc1细胞暴露于胰腺癌细胞(MIA-Paca2细胞系)或暴露于通过暴露于依托泊苷(etoposide)而凋亡的肺癌细胞(H23细胞系)。用此肿瘤裂解物脉冲，然后在IL-7(20ng/mL)和IL-15(10ng/mL)中培养7天，在所述培养7天时进行第二次暴露于肿瘤裂解液。在含有IL-7和IL-15的培养基中另外的7天培养间隔之后，进行第三次肿瘤裂解液暴露，并且通过路明克斯测定来测试所得的24小时上清液的细胞因子含量(结果以pg/mL/1×106个细胞/24小时示出)。对照培养物(“RAPA-201，无肿瘤”)由制造的抗性Th1/Tc1细胞构成，所述细胞在含有IL-7和IL-15的培养基中繁殖，但未接受肿瘤裂解液的脉冲。细胞因子测定的结果在图35中示出。
如图35示出的，RAPA-T细胞可以通过其对包含实体肿瘤(如胰腺癌细胞和肺癌细胞)的肿瘤细胞的反应能力来进一步表征。通过在补充有IL-7和IL-15的培养基中进行培养扩增，可以很容易地证明这种对实体瘤细胞系的体外敏化作用，所述IL-7和IL-15是两种稳态细胞因子，其已被证明可以选择性地驱动RAPA-T细胞的效应子功能。如IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的高水平分泌所证明的，肿瘤细胞的RAPA-T细胞细胞因子分泌可以维持特征性Th1细胞因子表型。
如图36示出的，许多癌症(如肾细胞癌、肝癌、肺癌、膀胱癌和胃癌)已被证明对检查点抑制剂疗法有反应，如针对检查点抑制剂分子(如可以诱导实体瘤缓解的PD-1和CTLA4)的单克隆疗法。在进一步的实验中，根据西蒙(Simon)的2阶段设计，将对患有肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌和低突变PDL1阴性或低突变率癌症的患者(n＝7)进行制造的T细胞治疗。如果任何群组有至少一名反应性患者，则所述群组将扩展为20名患者的群组。
不受理论的约束，期望Rapa-T细胞可以在癌症中提供治疗益处，因为所述细胞具有减少的检查点抑制剂受体或没有检查点抑制剂受体。怀疑某些癌症可能是由于PD1和CTLA4以外的检查点抑制剂受体而对某些治疗无反应。因此，可以预期，不受理论的约束，由于缺乏另外的检查点抑制剂受体，Rapa-T细胞在治疗其它癌症中可以是有效的。
实例8
Rapa-T细胞通过6天的培养来制造，且后菲柯尔细胞群在含有替西罗莫司(2μM)和抗IL-2受体单克隆抗体巴利昔单抗(30μg/mL)的培养基中培养。24小时后，向培养物补充IFN-α(20,000IU/mL)，培养物没有补充IL-2。在培养物中没有使用任何形式的抗CD3/抗CD28共刺激。
相比之下，对于“对照”：后菲柯尔细胞群在没有替西罗莫司和没有巴利昔单抗的培养基中培养。在培养开始的当天，使用抗CD3/抗CD28涂覆的珠以3:1的珠与T细胞比率对细胞进行共刺激。在培养开始当天向培养基补充IL-2(20IU/mL)和IFN-α(20,000IU/mL)。针对培养物输入群、Rapa-T细胞和对照细胞的CD4+和CD8+T细胞亚群，通过流式细胞术测量了BTLA、CTLA4、PD1和TIM3的平均荧光强度(MFI)。数据在下表2中示出。在Rapa-T细胞和对照细胞之间观察到检查点抑制剂受体表达的减少，对于每个检查点，MFI对于Rapa-T细胞和培养物输入细胞而言大约相同。
表2：平均荧光强度
制造实施例：
1.一种用于产生制造的T细胞的方法，所述方法包括：
在包括替西罗莫司和IL-2信号传导抑制剂的培养基中，以一定细胞密度接种包括来自受试者的T细胞的培养物输入细胞群；
将IFN-α添加到所述培养基；
温育所述T细胞和培养基持续一定时间段以产生制造的T细胞；
收获所述制造的T细胞。
2.根据实施例1所述的方法，其进一步包括：
将另外的培养基添加到所述T细胞和培养基。
3.根据实施例2所述的方法，其中在所述培养基中接种所述培养物输入细胞群后约48小时添加所述另外的培养基。
4.根据实施例2到3中任一项所述的方法，其中添加到培养物的另外的培养基的量足以将培养物中的细胞的细胞密度降低到目标细胞密度，其中接种时的所述培养物输入细胞群的细胞密度大于9×106个细胞/mL，并且其中所述目标细胞密度为约9×106个细胞/mL。
5.根据实施例1所述的方法，其中不进行抗CD3/抗CD28共刺激。
6.根据实施例2所述的方法，其中当所述培养物输入细胞群接种到所述培养基中时，添加到培养物的另外的培养基的量与所述培养基的量的比率介于1:1与3:1之间。
7.根据实施例1到6中任一项所述的方法，其进一步包括，在收获所述制造的T细胞后：
将所述制造的T细胞的至少一部分包装在包装中；以及
冷冻含有所述制造的T细胞的所述部分的所述包装。
8.根据实施例1到7中任一项所述的方法，其中所述培养基不含有IL-2并且没有IL-2添加到所述培养基。
9.根据实施例1到8中任一项所述的方法，其中在接种所述培养物输入细胞群的约同一时间或在接种所述培养物输入细胞群的24小时内将所述IFN-α添加到所述培养基。
10.根据实施例1到9中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为至少每mL 1.5×106个细胞。
11.根据实施例1到9中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为约每mL 7.5×106个细胞。
12.根据实施例1到9中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为约每mL 30×l06个细胞。
13.根据实施例1到12中任一项所述的方法，其中所述替西罗莫司以约4.5μM的浓度存在于所述培养基中。
14.根据实施例1到12中任一项所述的方法，其中将所述替西罗莫司在所述时间段期间一次或多次添加到所述培养基以维持期望的浓度。
15.根据实施例14所述的方法，其中在所述时间段期间每2天将所述替西罗莫司添加到所述培养基。
16.根据实施例14到15中任一项所述的方法，其中所述期望的浓度为约4.5μM。
17.根据实施例1到16中任一项所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂是抗IL-2受体抗体或其片段。
18.根据实施例17所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂是巴利昔单抗或达克珠单抗。
19.根据实施例1到18中任一项所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂以5μg/mL到50μg/mL的浓度存在于所述培养基中。
20.根据实施例1到19中任一项所述的方法，其中将所述IFN-α添加到所述培养基至1,000IU/mL到10,000IU/mL的浓度。
21.根据实施例1到20中任一项所述的方法，其中所述时间段为约4天到约8天。
22.根据实施例1到20中任一项所述的方法，其中所述时间段为6天。
23.根据实施例1到22中任一项所述的方法，其中所述培养基基本上不含血清。
24.根据实施例1到23中任一项所述的方法，其中血清不添加到所述培养基。
25.根据实施例1到22中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包括5％的人血清。
26.根据实施例1到25中任一项所述的方法，其中所述培养基包括TexMACS培养基。
27.根据实施例1到26中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占不超过所述培养物输入细胞群中细胞总数量的66％的T细胞。
28.根据实施例1到26中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约50％到约95％的T细胞。
29.根据实施例1到28中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群进一步包括单核细胞。
30.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其进一步包括：
从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及
从所述样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
31.根据实施例30所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约99％或更多的T细胞。
32.根据实施例30到31中任一项所述的方法，其中所述T细胞是通过基于抗体的纯化分离的。
33.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其进一步包括：
从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及
对所述样品富集T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
34.根据实施例33所述的方法，其中所述富集通过逆流离心淘析或菲柯尔过程进行。
35.根据实施例33到34中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约70％的T细胞。
36.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
从所述受试者收获所述培养物输入细胞群。
37.一种制造的T细胞，其通过根据实施例1到36中任一项所述的方法产生。
38.一种用于产生制造的T细胞的方法，所述方法包括：
在包括替西罗莫司和IL-2信号传导抑制剂的培养基中，以一定细胞密度接种包括来自受试者的T细胞的培养物输入细胞群；
将所述培养物输入细胞群与培养基温育第一时间段，而不通过抗CD3/抗CD28共刺激所述培养物输入细胞群；
在所述第一时间段的温育之后，以介于1:1与1:12之间的珠:T细胞比率将抗CD3/
抗CD28涂覆的磁珠添加到所述T细胞和培养基以刺激所述T细胞；
将IFN-α添加到所述培养基；
在含有所述抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠和IFN-a的所述培养基中温育所述培养物输入细胞群第二时间段以产生制造的T细胞；
从所述制造的T细胞中分离出所述抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠；以及
收获所述制造的T细胞。
39.根据实施例38所述的方法，其进一步包括，在收获所述制造的T细胞后：
将所述制造的T细胞的至少一部分包装在包装中；以及
冷冻含有所述制造的T细胞的所述部分的所述包装。
40.根据实施例38到39中任一项所述的方法，其中所述培养基不含有IL-2并且没有IL-2添加到所述培养基。
41.根据实施例38到40中任一项所述的方法，其中在或大约在添加抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠的同时添加所述IFN-α。
42.根据实施例38到41中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为至少每mL 1.5×106个细胞。
43.根据实施例38到41中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为约每mL 7.5×106个细胞。
44.根据实施例38到41中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为约每mL 30×106个细胞。
45.根据实施例38到44中任一项所述的方法，其中所述替西罗莫司以1μM的浓度存在于所述培养基中。
46.根据实施例38到44中任一项所述的方法，其中将所述替西罗莫司在所述第二时间段期间一次或多次添加到所述培养基以维持期望的浓度。
47.根据实施例46所述的方法，其中在所述第二时间段期间每2天将所述替西罗莫司添加到所述培养基。
48.根据实施例46到47中任一项所述的方法，其中所述期望的浓度为1μM。
49.根据实施例38到48中任一项所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂是抗IL-2受体抗体或其片段。
50.根据实施例49所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂是巴利昔单抗或达克珠单抗。
51.根据实施例38到50中任一项所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂以5μg/mL到50μg/mL的浓度存在于所述培养基中。
52.根据实施例38到51中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约8小时到约24小时。
53.根据实施例38到51中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为16小时。
54.根据实施例38到53中任一项所述的方法，其中所述珠:T细胞比率为1:3。
55.根据实施例38到54中任一项所述的方法，其中将所述IFN-α添加到所述培养基至1,000IU/mL到10,000IU/mL的浓度。
56.根据实施例38到55中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约4天到约8天。
57.根据实施例38到55中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为6天。
58.根据实施例38到57中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包括5％的人血清。
59.根据实施例38到58中任一项所述的方法，其中所述培养基包括TexMACS培养基。
60.根据实施例38到59中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占不超过所述培养物输入细胞群中细胞总数量的66％的T细胞。
61.根据实施例38到60中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约50％到约95％的T细胞。
62.根据实施例38到61中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群进一步包括单核细胞。
63.根据实施例38到62中任一项所述的方法，其进一步包括：
从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及
从所述样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
64.根据实施例63所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约99％或更多的T细胞。
65.根据实施例63到64中任一项所述的方法，其中所述T细胞是通过基于抗体的纯化分离的。
66.根据实施例38到62中任一项所述的方法，其进一步包括：
从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及
对所述样品富集T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
67.根据实施例66所述的方法，其中所述富集通过逆流离心淘析或菲柯尔过程进行。
68.根据实施例66到67中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约70％的T细胞。
69.根据实施例38到62中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
从所述受试者收获所述培养物输入细胞群。
70.一种制造的T细胞，其通过根据实施例38到69中任一项所述的方法产生。
71.一种用于产生制造的T细胞的方法，所述方法包括：
在包括替西罗莫司和IL-2信号传导抑制剂的培养基中，以一定细胞密度接种包括来自受试者的T细胞的培养物输入细胞群；
将所述培养物输入细胞群与培养基温育第一时间段，而不通过抗CD3/抗CD28共刺激所述培养物输入细胞群；
在所述第一时间段的温育之后，以推荐剂量的约0.01倍到约0.1倍的剂量将含有抗CD3/抗CD28的纳米颗粒添加到所述T细胞和培养基以刺激所述T细胞；
将IFN-α添加到所述培养基；
在含有包含抗CD3/抗CD28的纳米颗粒和IFN-α的所述培养基中温育所述培养物输入细胞群第二时间段以产生制造的T细胞；
收获所述制造的T细胞。
72.根据实施例71所述的方法，其进一步包括，在收获所述制造的T细胞后：
将所述制造的T细胞的至少一部分包装在包装中；以及
冷冻含有所述制造的T细胞的所述部分的所述包装。
73.根据实施例71到72中任一项所述的方法，其中所述培养基不含有IL-2并且没有IL-2添加到所述培养基。
74.根据实施例71到73中任一项所述的方法，其中在或大约在添加含有抗CD3/抗CD28的纳米颗粒的同时添加所述IFN-α。
75.根据实施例71到74中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为至少每mL 1.5×106个细胞。
76.根据实施例71到74中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为约每mL 7.5×106个细胞。
77.根据实施例71到74中任一项所述的方法，其中所述细胞密度为约每mL 30×l06个细胞。
78.根据实施例71到77中任一项所述的方法，其中所述替西罗莫司以1μM的浓度存在于所述培养基中。
79.根据实施例71到78中任一项所述的方法，其中将所述替西罗莫司在所述第二时间段期间一次或多次添加到所述培养基以维持期望的浓度。
80.根据实施例79所述的方法，其中在所述第二时间段期间每2天将所述替西罗莫司添加到所述培养基。
81.根据实施例71到80中任一项所述的方法，其中所述期望的浓度为1μM。
82.根据实施例71到81中任一项所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂是抗IL-2受体抗体或其片段。
83.根据实施例82所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂是巴利昔单抗或达克珠单抗。
84.根据实施例71到83中任一项所述的方法，其中所述IL-2信号传导抑制剂以5μg/mL到50μg/mL的浓度存在于所述培养基中。
85.根据实施例71到84中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约8小时到约24小时。
86.根据实施例71到84中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为16小时。
87.根据实施例71到86中任一项所述的方法，其中将所述IFN-α添加到所述培养基至1,000IU/mL到10,000IU/mL的浓度。
88.根据实施例71到87中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约4天到约8天。
89.根据实施例71到87中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为6天。
90.根据实施例71到89中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包括5％的人血清。
91.根据实施例71到90中任一项所述的方法，其中所述培养基包括TexMACS培养基。
92.根据实施例71到91中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占不超过所述培养物输入细胞群中细胞总数量的66％的T细胞。
93.根据实施例71到91中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约50％到约95％的T细胞。
94.根据实施例71到93中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群进一步包括单核细胞。
95.根据实施例71到94中任一项所述的方法，其进一步包括：
从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及
从所述样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
96.根据实施例95所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约99％或更多的T细胞。
97.根据实施例95到96中任一项所述的方法，其中所述T细胞是通过基于抗体的纯化分离的。
98.根据实施例71到94中任一项所述的方法，其进一步包括：
从所述受试者收获包括T细胞的样品；以及
对所述样品富集T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
99.根据实施例98所述的方法，其中所述富集通过逆流离心淘析或菲柯尔过程进行。
100.根据实施例98到99中任一项所述的方法，其中所述培养物输入细胞群包括占所述培养物输入细胞群中细胞总数量的约70％的T细胞。
101.根据实施例71到94中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种来自所述受试者的T细胞之前：
从所述受试者收获所述培养物输入细胞群。
102.一种制造的T细胞，其通过根据实施例71到101中任一项所述的方法产生。
103.一种制造的T细胞群，其相对于在存在外源性IL-2的情况下产生的对照制造的T细胞群表现出减少的STAT5磷酸化形式水平，其中观察到的减少为至少少50％并且优选地为少90％或更多。
104.一种制造的T细胞群，其表现出从效应记忆状态向T中枢记忆状态的分化的转变，如相对于培养物输入T细胞，共表达CD62L和CCR7的T细胞的频率增加至少25％所指示。
105.一种制造的T细胞群，其表现出处于静止状态，如CD4+和CD8+T细胞以低于5％的速率并且更优选地低于1％的速率共表达IL-2受体CD25的频率所指示的。
106.一种制造的T细胞群，其表现出处于静止状态，如在制造结束时分泌低水平的炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α的T细胞所指示，如在使用高水平共刺激(珠与T细胞比率为3:1)的刺激过程之后，培养上清液中含有的水平为每24小时每1×106个细胞<100pg/ml所限定。
107.一种制造的T细胞，其从静止状态转变到高水平炎性细胞因子分泌状态，如在不存在抑制剂的情况下，6天扩增周期后，IFN-γ和TNF-α分泌相对于第6天的分泌水平增加至少5倍并且更优选地增加20倍所限定。
108.一种制造的T细胞群，其表达低水平的免疫抑制分子CTLA4，如通过流式细胞术的至少少于10％CTLA4+并且更优选地少于5％CTLA4+的CD4+和CD8+T细胞表达所限定。
109.一种制造的T细胞群，其表达低水平的免疫抑制分子TIM3，如通过流式细胞术的至少少于10％TIM3+并且更优选地少于2％TIM3+的CD4+和CD8+T细胞表达所限定。
110.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
从所述受试者收获所述培养物输入细胞群。
111.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
从来自所述受试者的包括T细胞的样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
112.根据实施例1到29中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
富集来自所述受试者的包括T细胞的样品以产生所述培养物输入细胞群。
113.根据实施例38到62中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
从来自所述受试者的包括T细胞的样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
114.根据实施例38到62中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
富集来自所述受试者的包括T细胞的样品以产生所述培养物输入细胞群。
115.根据实施例71到94中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
从来自所述受试者的包括T细胞的样品中分离出T细胞以产生所述培养物输入细胞群。
116.根据实施例71到94中任一项所述的方法，其进一步包括，在培养基中以一定细胞密度接种包括来自所述受试者的T细胞的所述培养物输入细胞群之前：
富集来自所述受试者的包括T细胞的样品以产生所述培养物输入细胞群。
117.根据实施例1到36、38到69和71到100中任一项所述的方法，其中在将所述培养物输入细胞群接种到所述培养基中之后24小时添加所述IFN-α。
118.一种制造的T细胞，其通过根据实施例110到117中任一项所述的方法产生。
119.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CTLA4，如通过流式细胞术所测量的。
120.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达CTLA4的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达CTLA4的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
121.根据实施例120所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
122.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3，如通过流式细胞术所测量的。
123.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中CD4+或CD8+T细胞的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
124.根据实施例123所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
125.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIM3的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达TIM3的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
126.根据实施例125所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
127.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达PD1，如通过流式细胞术所测量的。
128.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达PD1的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达PD1的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
129.根据实施例128所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
130.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达2B4，如通过流式细胞术所测量的。
131.所述制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中5％或更少的CD8+T细胞表达2B4，如通过流式细胞术所测量的。
132.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中CD8+T细胞的对应频率，CD8+T细胞表达2B4的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
133.根据实施例132所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
134.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达2B4的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达2B4的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
135.根据实施例134所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少20％。
136.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1，如通过流式细胞术所测量的。
137.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中CD4+或CD8+T细胞的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
138.根据实施例137所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
139.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达LAIR1的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
140.根据实施例139所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
141.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达TIGIT，如通过流式细胞术所测量的。
142.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达TIGIT的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达TIGIT的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
143.根据实施例142所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少40％。
144.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达LAG3，如通过流式细胞术所测量的。
145.一种制造的T细胞群，其特征在于，相对于CD4+或CD8+T-Rapa细胞表达LAG3的对应频率，CD4+或CD8+T细胞表达LAG3的频率减少，如通过流式细胞术所测量的。
146.根据实施例144所述的制造的T细胞群，其中减少的频率为比所述对应频率少至少50％。
147.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中1％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD25，如通过流式细胞术所测量的。
148.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达KLRG1，如通过流式细胞术所测量的。
149.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中20％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD39，如通过流式细胞术所测量的。
150.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中20％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD73，如通过流式细胞术所测量的。
151.一种制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中4％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达GITR，如通过流式细胞术所测量的。
152.根据实施例108到109和119到150中任一项所述的制造的T细胞群，其中所述制造的T细胞群中CD4+或CD8+T细胞表达CD28或ICOS的频率基本上与以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中CD4+或CD8+T细胞表达CD28或ICOS的对应频率相同。
153.根据实施例108到109和119到150中任一项所述的制造的T细胞群，其中CD4+或CD8+T细胞表达CD28或ICOS的频率在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群中CD4+或CD8+T细胞表达CD28或ICOS的对应频率的10％之内。
154.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2。
155.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠，以及以IL-7和IL-15各自10ng/mL的浓度使用IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合(如果存在)共刺激之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2IL-2。
156.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的存在下以IL-7和IL-15各自10ng/mL的浓度(如果存在)共刺激之后，分泌相对于对照T细胞群或T-Rapa细胞的增加量的IL-2。
156.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群表达：相对于经培养的T-Rapa细胞群的至少少75％的磷酸化STAT5，可检测水平的STAT1或磷酸化STAT1，p70S6K和Raptor减少至少50％，以及与经培养的T-Rapa细胞群相差不超过50％的Rictor、SGK1和磷酸化SGK1水平。
157.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群表现出减少的mTORCl激活，所述mTORCl激活以以下中的至少一个为特征：
(a)相对于对照T细胞群的减少的磷酸化P70S6K水平，或
(b)相对于对照T细胞群的减少的Raptor水平；并且
所述制造的T细胞群表现出mTORC2分子保留，所述mTORC2分子保留以基本上相同水平的Rictor、SGK1或磷酸化SGK1为特征。
157.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群表达：相对于经培养的T-Rapa细胞群的至少少75％的磷酸化STAT5，可检测水平的STAT1或磷酸化STAT1，p70S6K和Raptor减少至少50％，以及与经培养的T-Rapa细胞群相差不超过50％的Rictor、SGK1和磷酸化SGK1水平。
158.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群表现出减少的mTORCl激活，所述mTORCl激活以以下中的至少一个为特征：
(a)相对于T-Rapa细胞的减少的磷酸化P70S6K水平，或
(b)相对于T-Rapa细胞的减少的Raptor水平；并且
所述制造的T细胞群表现出mTORC2分子保留，所述mTORC2分子保留以相对于T-Rapa细胞的基本上相同水平的Rictor、SGK1或磷酸化SGK1为特征。
159.根据实施例158所述的制造的T细胞群，其进一步以相对于对照T细胞培养物的减少的STAT5磷酸化以及可检测水平的STAT1或磷酸化STAT1为特征。
160.一种制造的T细胞群，所述制造的T细胞群以相对于对照T细胞培养物的减少的STAT5磷酸化以及可检测水平的STAT1或磷酸化STAT1为特征。
161.一种制造的T细胞群，其具有以下性质中的一种或多种性质：
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IFN-γ分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的TNF-α分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的GM-CSF分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IL-2分泌至少增加50％；
相对于以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，对CD4、CD62L、CCR7和CD127呈阳性的细胞的百分比增加至少50％；
相对于以产生T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，4EBP1磷酸化增加不超过50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p70S6K或Raptor的表达减少至少50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p-STAT5的表达减少至少50％；
可检测水平的STAT1和p-STATl表达；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，p70S6K的表达增加至少10％；
相对于T-Rapa细胞群，CD25的表达减少至少50％；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CTLA4，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达PD1，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达2B4，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达TIGIT，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达LAG3，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD25，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达KLRG1，如通过流式细胞术测量的；
20％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD39，如通过流式细胞术测量的；
20％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD73，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达GITR，如通过流式细胞术测量的；
CD28的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
ICOS的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
CD45RA的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
对CD45RA呈阳性的CD4+T细胞增加至少50％，如通过流式细胞术测量的；
相对于在相同条件下温育的T-Rapa培养物，IL-2分泌增加至少1.1倍；
在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育时，IL-2分泌相对增加至少1.1倍，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
相对于T-Rapa细胞群的对应表达水平，选自以下的一个或多个检查点抑制剂的表达减少至少25％：CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合；
选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合的一个或多个检查点抑制剂的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的25％之内；
至少5％的CD4+T细胞表达CD127；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，CD4+T细胞表达CD127的频率增加至少50％；
相对于培养物输入T细胞，T细胞共表达CD62L和CCR7的频率增加至少25％；
CD4+和CD8+T细胞以低于5％的速率并且更优选地低于1％的速率共表达IL-2受体CD25的频率；
在制造结束时分泌低水平的炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α，如在使用高水平共刺激(珠与T细胞比率为3:1)的刺激过程之后，培养上清液中含有的水平为每24小时每1×106个细胞<100pg/ml所限定的；
在不存在抑制剂的情况下，6天扩增周期后，IFN-γ和TNF-α分泌相对于第6天的分泌水平增加至少5倍并且更优选地增加20倍；以及
其组合。
162.一种制造的T细胞，其具有以下性质中的一种或多种性质：
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IFN-γ分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的TNF-α分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的GM-CSF分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IL-2分泌至少增加50％；
相对于以产生T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，4EBP1磷酸化增加不超过50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p70S6K或Raptor的表达减少至少50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p-STAT5的表达减少至少50％；
可检测水平的STAT1和p-STATl表达；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，p70S6K的表达增加至少10％；
相对于T-Rapa细胞群，CD25的表达减少至少50％；
CD28的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
ICOS的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
CD45RA的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
对CD45RA呈阳性的CD4+T细胞增加至少50％，如通过流式细胞术测量的；
相对于在相同条件下温育的T-Rapa培养物，IL-2分泌增加至少1.1倍；
在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育时，IL-2分泌相对增加至少1.1倍，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
相对于T-Rapa细胞群的对应表达水平，选自以下的一个或多个检查点抑制剂的表达减少至少25％：CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合；
选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合的一个或多个检查点抑制剂的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的25％之内；
表达CD 127；
在制造结束时分泌低水平的炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α，如在使用高水平共刺激(珠与T细胞比率为3:1)的刺激过程之后，培养上清液中含有的水平为每24小时每1×106个细胞<100pg/ml所限定的；
在不存在抑制剂的情况下，6天扩增周期后，IFN-γ和TNF-α分泌相对于第6天的分泌水平增加至少5倍并且更优选地增加20倍；以及其组合。
Claims (68)
1.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
在向所述受试者施用治疗有效剂量的所述包括制造的T细胞的组合物之前，使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括：
在使所述受试者经受所述免疫耗竭方案之前，从所述受试者收获自体细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
在向所述受试者施用所述包括制造的T细胞的组合物之前，从所述受试者收获自体细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫耗竭方案包括：
向所述受试者施用喷司他丁(pentostatin)和环磷酰胺(cyclophosphamide)中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫耗竭方案包括：
向所述受试者施用包括喷司他丁的第一组合物；以及
向所述受试者施用包括环磷酰胺的第二组合物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中向所述受试者施用喷司他丁，并且其中所述喷司他丁的剂量为介于0.5-4mg/m2之间。
8.根据权利要求5所述的方法，其中向所述受试者施用环磷酰胺，并且其中所述环磷酰胺的剂量为介于50-400mg之间。
9.根据权利要求5所述的方法，其中向所述受试者施用喷司他丁和环磷酰胺两者。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述喷司他丁和环磷酰胺以单一组合物的形式施用于所述受试者。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述单一组合物静脉内施用于所述受试者。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一组合物以0.5-4mg/m2喷司他丁的剂量施用。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二组合物包括环磷酰胺，并且其中所述组合物以介于50-400mg之间的所述环磷酰胺的剂量施用。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效剂量为每千克受试者的体重1×105到5×106个制造的T细胞。
15.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物通过输注施用于所述受试者。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有郁积型多发性骨髓瘤。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中所述受试者患有复发性、难治性多发性骨髓瘤。
18.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中所述受试者患有四重或五重难治性多发性骨髓瘤。
19.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用选自由以下组成的组的三种或更多种不同治疗系列进行了治疗：施用蛋白酶体抑制剂、施用免疫调节药物、施用烷化剂、施用CD38单克隆抗体和施用糖皮质激素，并且其中所述受试者是至少一种蛋白酶体抑制剂和至少一种免疫调节药物难以治疗的。
20.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中在治疗期间或在先前治疗的治疗停止后60天内，所述受试者的M蛋白/游离轻链差异或疾病进展减少少于25％。
21.一种用于有需要的受试者的癌症治疗的方法，所述方法包括：
第一治疗周期和一个或多个另外的治疗周期，
所述第一治疗周期包括：
使所述受试者经受第一免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能；
所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期包括：
使所述受试者经受第二免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能；以及
向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。
22.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一治疗周期的持续时间最少为28天。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期的持续时间最少为35天。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一免疫耗竭方案包括：
向所述受试者施用喷司他丁；以及
向所述受试者施用环磷酰胺。
25.根据权利要求25所述的方法，其中所述向所述受试者施用喷司他丁的步骤在所述第一治疗周期期间重复。
26.根据权利要求26所述的方法，其中所述向所述受试者施用喷司他丁的步骤在所述第一治疗周期的第1天、第4天、第8天和/或第11天进行。
27.根据权利要求27所述的方法，其中喷司他丁以介于0.5-4mg/m2之间的剂量施用于所述受试者。
28.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其中所述向所述受试者施用环磷酰胺的步骤在所述第一治疗周期期间重复。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述向所述受试者施用环磷酰胺的步骤在所述第一治疗周期的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天、第9天、第10天、第11天和/或第12天进行。
30.根据权利要求29所述的方法，其中环磷酰胺以50-400mg的剂量施用于所述受试者。
31.根据权利要求22到30中任一项所述的方法，其中所述第二免疫耗竭方案包括：
向所述受试者施用喷司他丁；以及向所述受试者施用环磷酰胺。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述向所述受试者施用喷司他丁的步骤在所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期期间重复。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述向所述受试者施用喷司他丁的步骤在所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期的第1天、第4天、第8天和/或第11天进行。
34.根据权利要求33所述的方法，其中喷司他丁以介于1-4mg/m2之间的剂量施用于所述受试者。
35.根据权利要求32到33中任一项所述的方法，其中所述向所述受试者施用环磷酰胺的步骤在所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期期间重复。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述向所述受试者施用环磷酰胺的步骤在所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天、第9天、第10天、第11天和/或第12天进行。
37.根据权利要求36所述的方法，其中环磷酰胺以50-400mg的剂量施用于所述受试者。
38.根据权利要求22到37中任一项所述的方法，其中所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期间隔0到4周。
39.根据权利要求22到37中任一项所述的方法，其中所述第一治疗周期与所述一个或多个另外的治疗周期中的第一个治疗周期间隔0到4周。
40.根据权利要求22到40中任一项所述的方法，其中所述向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤在所述一个或多个另外的治疗周期中的每个治疗周期的第15天、第16天、第17天和/或第18天进行。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述治疗有效剂量介于每千克所述受试者的体重1×105到5×106个制造的T细胞之间。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述包括制造的T细胞的组合物通过输注施用。
43.根据权利要求22到42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有郁积型多发性骨髓瘤。
44.根据权利要求22到42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有复发性、难治性多发性骨髓瘤。
45.根据权利要求22到42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有四重或五重难治性多发性骨髓瘤。
46.根据权利要求22到42中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用选自由以下组成的组的三种或更多种不同治疗系列进行了治疗：施用蛋白酶体抑制剂、施用免疫调节药物、施用烷化剂、施用CD38单克隆抗体和施用糖皮质激素，并且其中所述受试者是至少一种蛋白酶体抑制剂和至少一种免疫调节药物难以治疗的。
47.根据权利要求22到42中任一项所述的方法，其中在治疗期间或在先前治疗的治疗停止后60天内，所述受试者的M蛋白/游离轻链差异或疾病进展减少少于25％。
48.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能；以及
在所述免疫耗竭方案之后，向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述免疫耗竭方案包括：
向所述受试者施用喷司他丁；以及
向所述受试者施用环磷酰胺；
如果所述受试者的肌酐清除率>30毫升/分钟/1.73平方米，则向所述受试者施用一个或多个另外剂量的喷司他丁，
如果所述受试者的绝对淋巴细胞计数为50或更大并且所述受试者的绝对嗜中性粒细胞计数为500或更大，则向所述受试者施用一个或多个另外剂量的环磷酰胺。
50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括在向所述受试者施用一个或多个另外剂量的喷司他丁之前，测量所述受试者的肌酐清除率(CrCl)，并且基于所述CrCl调整向所述受试者施用喷司他丁的剂量，其中当CrCl>60毫升/分钟/1.73平方米时，以4mg/m2施用喷司他丁，其中当60毫升/分钟/1.73平方米>CrCl>30毫升/分钟/1.73平方米时，以2mg/m2施用喷司他丁，并且其中当CrCl<30毫升/分钟/1.73平方米时，不施用喷司他丁。
51.根据权利要求48到49中任一项所述的方法，其进一步包括，在施用一个或多个另外剂量的环磷酰胺之前，测量绝对淋巴细胞计数(ALC)和绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)，并且基于所述ALC和ANC调整向所述受试者施用环磷酰胺的剂量，其中当ANC>每微升1000个时，以200mg的剂量施用环磷酰胺，其中当ANC为每微升500-999个并且ALC>每微升50个时，以100mg的剂量施用环磷酰胺，并且其中当ALC<每微升50个或ANC<每微升500个时，不施用环磷酰胺。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述测量所述受试者的CrCl和调整要施用的喷司他丁剂量的步骤在所述免疫耗竭方案的第1天、第4天、第8天和/或第11天进行。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述测量ALC和ANC和调整要施用的环磷酰胺剂量的步骤在所述免疫耗竭方案的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天第9天、第10天、第11天和/或第12天进行。
54.根据权利要求48到53中任一项所述的方法，其中所述在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤在所述免疫耗竭方案开始后15-18天进行。
55.根据权利要求48到53中任一项所述的方法，其中所述使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能以及在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤重复至少两次。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述使所述受试者经受免疫耗竭方案以减少至少一部分调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞或减少调节性T细胞和/或晚期衰老效应T细胞的至少一部分功能以及在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的步骤重复最多5次。
57.根据权利要求55到56中任一项所述的方法，其中在所述免疫耗竭方案之后向所述受试者施用治疗有效剂量的包括制造的T细胞的组合物的每个步骤间隔0到9周。
58.根据权利要求48到57中任一项所述的方法，其中所述治疗有效剂量介于每千克所述受试者的体重1×105到5×106个制造的T细胞之间。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述包括制造的T细胞的组合物通过输注施用。
60.根据权利要求48到59中任一项所述的方法，其中所述受试者患有郁积型多发性骨髓瘤。
61.根据权利要求48到59中任一项所述的方法，其中所述受试者患有复发性、难治性多发性骨髓瘤。
62.根据权利要求48到59中任一项所述的方法，其中所述受试者患有四重或五重难治性多发性骨髓瘤。
63.根据权利要求48到59中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用选自由以下组成的组的三种或更多种不同治疗系列进行了治疗：施用蛋白酶体抑制剂、施用免疫调节药物、施用烷化剂、施用CD38单克隆抗体和施用糖皮质激素，并且其中所述受试者是至少一种蛋白酶体抑制剂和至少一种免疫调节药物难以治疗的。
64.根据权利要求48到59中任一项所述的方法，其中在治疗期间或在先前治疗的治疗停止后60天内，所述受试者的M蛋白/游离轻链差异或疾病进展减少少于25％。
65.根据权利要求1到16、20到42、46到59和63到64中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤、胃癌、结肠癌、肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和结直肠癌。
66.根据权利要求1到65中任一项所述的方法，其中所述制造的T细胞是具有以下性质中的一种或多种性质的制造的T细胞群：
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IFN-γ分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的TNF-α分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的GM-CSF分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IL-2分泌至少增加50％；
相对于以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，对CD4、CD62L、CCR7和CD127呈阳性的细胞的百分比增加至少50％；
相对于以产生T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，4EBP1磷酸化增加不超过50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p70S6K或Raptor的表达减少至少50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p-STAT5的表达减少至少50％；
可检测水平的STAT1和p-STATl表达；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，p70S6K的表达增加至少10％；
相对于T-Rapa细胞群，CD25的表达减少至少50％；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CTLA4，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达TIM3，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达PD1，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达2B4，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达LAIR1，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达TIGIT，如通过流式细胞术测量的；
10％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达LAG3，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD25，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达KLRG1，如通过流式细胞术测量的；
20％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD39，如通过流式细胞术测量的；
20％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达CD73，如通过流式细胞术测量的；
5％或更少的CD4+或CD8+T细胞表达GITR，如通过流式细胞术测量的；
CD28的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
ICOS的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
CD45RA的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
对CD45RA呈阳性的CD4+T细胞增加至少50％，如通过流式细胞术测量的；
相对于在相同条件下温育的T-Rapa培养物，IL-2分泌增加至少1.1倍；
在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育时，IL-2分泌相对增加至少1.1倍，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
相对于T-Rapa细胞群的对应表达水平，选自以下的一个或多个检查点抑制剂的表达减少至少25％：CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合；
选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合的一个或多个检查点抑制剂的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的25％之内；
至少5％的CD4+T细胞表达CD127；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，CD4+T细胞表达CD127的频率增加至少50％；
相对于培养物输入T细胞，T细胞共表达CD62L和CCR7的频率增加至少25％；
CD4+和CD8+T细胞以低于5％的速率并且更优选地低于1％的速率共表达IL-2受体CD25的频率；
在制造结束时分泌低水平的炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α，如在使用高水平共刺激(珠与T细胞比率为3:1)的刺激过程之后，培养上清液中含有的水平为每24小时每1×106个细胞<100pg/ml所限定的；
在不存在抑制剂的情况下，6天扩增周期后，IFN-γ和TNF-α分泌相对于第6天的分泌水平增加至少5倍并且更优选地增加20倍；以及
其组合。
67.一种制造的T细胞，其具有以下性质中的一种或多种性质：
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IFN-γ分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的TNF-α分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的GM-CSF分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IL-2分泌至少增加50％；
相对于以产生T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，4EBP1磷酸化增加不超过50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p70S6K或Raptor的表达减少至少50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p-STAT5的表达减少至少50％；
可检测水平的STAT1和p-STATl表达；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，p70S6K的表达增加至少10％；
相对于T-Rapa细胞群，CD25的表达减少至少50％；
CD28的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
ICOS的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
CD45RA的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
对CD45RA呈阳性的CD4+T细胞增加至少50％，如通过流式细胞术测量的；
相对于在相同条件下温育的T-Rapa培养物，IL-2分泌增加至少1.1倍；
在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育时，IL-2分泌相对增加至少1.1倍，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
相对于T-Rapa细胞群的对应表达水平，选自以下的一个或多个检查点抑制剂的表达减少至少25％：CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合；
选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合的一个或多个检查点抑制剂的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的25％之内；
表达CD 127；
在制造结束时分泌低水平的炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α，如在使用高水平共刺激(珠与T细胞比率为3:1)的刺激过程之后，培养上清液中含有的水平为每24小时每1×106个细胞<100pg/ml所限定的；
在不存在抑制剂的情况下，6天扩增周期后，IFN-γ和TNF-α分泌相对于第6天的分泌水平增加至少5倍并且更优选地增加20倍；以及
其组合。
68.根据权利要求1到65中任一项所述的方法，其中所述制造的T细胞具有以下性质中的至少一种性质：
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IFN-γ分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的TNF-α分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的GM-CSF分泌至少增加50％；
在以3:1的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28磁珠刺激温育一周后，相对于T-Rapa细胞的IL-2分泌至少增加50％；
相对于以产生T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群，4EBP1磷酸化增加不超过50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p70S6K或Raptor的表达减少至少50％；
相对于在相同条件下培养的T-Rapa细胞群，p-STAT5的表达减少至少50％；
可检测水平的STAT1和p-STATl表达；
相对于以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群，p70S6K的表达增加至少10％；
相对于T-Rapa细胞群，CD25的表达减少至少50％；
CD28的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
ICOS的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
CD45RA的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的T细胞为特性的对照T细胞群的约20％之内；
对CD45RA呈阳性的CD4+T细胞增加至少50％，如通过流式细胞术测量的；
相对于在相同条件下温育的T-Rapa培养物，IL-2分泌增加至少1.1倍；
在以介于3:1与1:3之间的珠:T细胞比率使用抗CD3/抗CD28涂覆的磁珠共刺激之后，分泌至少500pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育时，IL-2分泌相对增加至少1.1倍，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
在存在IL-7、IL-15或IL-7与IL-15的组合的情况下温育之后，分泌至少1000pg/mL/1×106个细胞/天的IL-2，其中所述IL-7和IL-15(存在时)分别以10ng/mL添加；
相对于T-Rapa细胞群的对应表达水平，选自以下的一个或多个检查点抑制剂的表达减少至少25％：CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合；
选自CD39、CD73、GITR、LAG3、PD1、2B4、LAIR1、CTLA4、KLRG1、TIGIT、TIM3和其组合的一个或多个检查点抑制剂的表达水平在以产生所述制造的T细胞群的细胞为特性的对照T细胞群中的对应表达水平的25％之内；
表达CD 127；
在制造结束时分泌低水平的炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α，如在使用高水平共刺激(珠与T细胞比率为3:1)的刺激过程之后，培养上清液中含有的水平为每24小时每1×106个细胞<100pg/ml所限定的；
在不存在抑制剂的情况下，6天扩增周期后，IFN-γ和TNF-α分泌相对于第6天的分泌水平增加至少5倍并且更优选地增加20倍；以及
其组合。
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