KR20170094449A - 아미노산 및 펩타이드 접합체 및 이들의 용도 - Google Patents

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마가렛 앤 브림블
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제프리 마틴 윌리엄스
다니엘 버던
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마가렛 앤 브림블
제프리 마틴 윌리엄스
다니엘 버던
피터 로데릭 던바
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Abstract

본 발명은 펩타이드, 및 아미노산 및 펩타이드 접합체, 아미노산 및 펩타이드 접합체를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 접합체, 펩타이드 및 접합체를 포함하는 약제학적 조성물, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법 및 대상체를 백신접종하는 방법, 이들에 대한 펩타이드 및 접합체의 용도, 및 이들에 대한 약제의 제조에서의 펩타이드 및 접합체의 용도에 관한 것이다.

Description

아미노산 및 펩타이드 접합체 및 이들의 용도{AMINO ACID AND PEPTIDE CONJUGATES AND USES THEREOF}
본 발명은 아미노산 및 펩타이드 접합체, 아미노산 및 펩타이드 접합체를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 접합체, 펩타이드 및 접합체를 포함하는 약제학적 조성물, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법 및 대상체를 백신접종하는 방법, 이들에 대한 펩타이드 및 접합체의 용도, 및 이들에 대한 약제의 제조에서의 펩타이드 및 접합체의 용도에 관한 것이다.
합성 펩타이드 백신은 일반적으로 단백질 항원의 면역원성 부분의 합성 카피를 포함한다. 백신 개발에 대한 이 접근법은 합성의 용이성, 잠재적으로 독성인 생물학적 부산물의 회피 및 간단한 규명을 포함하는 다수의 이익을 가진다.
펩타이드 백신의 개발에서의 주요 논점은 단독의 백신 성분으로서 펩타이드에 의해 나타난 면역원성의 결여이다. 선천성 면역계의 성분을 활성화하도록 설계된 아쥬번트(예를 들어, 프로인트 아쥬번트)를 백신에 포함하는 것이 보통 필요하다.
펩타이드 백신 설계에서의 대안적인 전략은 관심 있는 펩타이드 에피토프가 적절한 아쥬번트에 공유로 연결된 자가 아쥬번팅 백신을 생성하는 것이다. 이러한 자가 아쥬번팅 백신은 외부 아쥬번트와의 항원의 단순한 동시제제화와 비교하여 증대된 항원 흡수, 제시 및 수지상 세포 성숙을 가질 수 있다.
여러 자가 아쥬번팅 백신이 개발되었지만, 백신의 제조가 복잡할 수 있다.
새로운 자가 아쥬번팅 백신 및 자가 아쥬번팅 백신을 제조하는 새로운 방법에 대한 수요가 계속된다. 특히, EBV 잠복성 막 단백질 2(Latent Membrane Protein 2; LMP2)로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함하는, 예를 들어 자가 아쥬번팅 백신을 포함하는 엡스타인 바 바이러스(EBV) 연관 질환, 예컨대 호지킨 질환(HD) 또는 비인두 암종(NPC)을 치료하는 것에 관한 자가 아쥬번팅 백신에 대한 수요가 존재한다.
본 발명의 목적은 이 수요를 만족시키는 것에 대한 방식을 진행하는 것; 및/또는 공중에게 유용한 선택을 적어도 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 오직 예로서 주어진 하기 설명으로부터 명확해질 수 있다.
본 명세서에 포함된 문헌, 작용, 재료, 장치, 물품 등의 임의의 설명은 오로지 본 발명의 맥락을 제공할 목적이다. 임의의 또는 모든 이들 문제가 선행 기술 기본의 일부를 형성하거나, 선행 일자 전에 존재하면서, 본 발명에 속하는 분야에서의 일반 지식에 흔하다는 인정으로서 취해지지 않아야 한다.
일 양태에서, 본 발명은 펩타이드 접합체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
지질화 아미노산 또는 펩타이드를 제공하는 단계, 및
지질화 아미노산 또는 펩타이드를 하나 이상의 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 펩타이드 접합체를 제공하는 단계(여기서, 펩타이드 접합체는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함함)를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 펩타이드 접합체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 티올에 의한 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 지질 함유 접합 파트너를 아미노산 함유 접합 파트너에 접합시키기에 효과적인 조건 하에,
지질 함유 접합 파트너, 및
아미노산 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함하되,
상기 방법은 아미노산 접합체의 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 펩타이드 접합체를 제공하는 단계(여기서, 펩타이드 접합체는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함함)를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 펩타이드 접합체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 티올에 의한 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 지질 함유 접합 파트너를 아미노산 함유 접합 파트너에 접합시키기에 효과적인 조건 하에,
지질 함유 접합 파트너, 및
펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계(여기서, 펩타이드 함유 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함함)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 일 예에서, 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체는 본 발명의 방법에 의해 제조된 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프는 MHCI 에피토프이다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 서열 번호 76 내지 101 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 아미노산 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어진 펩타이드를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 아미노산 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 아미노산 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어진 펩타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 아미노산 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어진 단리된, 정제된 또는 재조합 펩타이드를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 단리된, 정제된 또는 재조합 펩타이드는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 아미노산 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 아미노산 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태는 본 명세서에서의 임의의 양태에 관한 것이다.
다양한 실시형태에서, 지질화 아미노산 또는 펩타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: Pam1Cys, Pa㎡Cys, 및 Pam3Cys. 예를 들어, 지질화 아미노산 또는 펩타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다: Pam1CSK4, Pa㎡ CSK4, 및 Pam3 CSK4. 다양한 실시형태에서, 지질화 아미노산 또는 펩타이드는 아세틸화 또는 아미드화되고, 예를 들어 지질화 아미노산 또는 펩타이드는 아세틸화 Pam1Cys, 아세틸화 Pa㎡Cys 또는 아세틸화 Pam3Cys, 또는 아미드화 Pam1Cys, 아미드화 Pa㎡Cys 또는 아미드화 Pam3Cys를 포함한다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 펩타이드 함유 접합 파트너이고, 지질 함유 접합 파트너는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 커플링된다.
몇몇 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산 또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드이거나 이에 접합된다.
소정의 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산이거나 이에 접합된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 펩타이드 접합체를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 티올에 의한 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 지질 함유 접합 파트너를 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 접합시키기에 효과적인 조건 하에,
지질 함유 접합 파트너, 및
펩타이드 함유 접합 파트너(여기서, 펩타이드 함유 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 함유함)를 반응시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 접합체는 리포펩타이드이어서, 상기 방법은 리포펩타이드를 제조하는 것을 위한 것이다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 티올을 포함한다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 2개 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 2개 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 2개 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 일 실시형태에서, 에피토프는 펩타이드 에피토프이다. 일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 펩타이드로 이루어진다. 일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드로 이루어진다. 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 펩타이드로 이루어진다. 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 접합 파트너 또는 이의 아미노산에 결합된 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 에피토프는 링커기를 통해 펩타이드에 결합된다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 링커기를 통해 접합 파트너 또는 이의 아미노산에 결합된 펩타이드 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 링커기를 통해 펩타이드에 결합된 펩타이드 에피토프를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 항원성 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 항원성 펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 아미노산 접합체의 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 펩타이드 접합체는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드의 커플링은 개별적으로 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 펩타이드의 커플링을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 링커기 또는 이의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 링커기 또는 이의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 접합체의 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 지질 함유 접합 파트너가 링커기를 통해 접합된 아미노산에 결합된 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 지질 함유 접합체가 접합된 펩타이드 접합체의 아미노산은 N 말단 아미노산 잔기이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산에 커플링하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산에 커플링하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 에피토프는 링커기를 통해 커플링되거나 결합된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 에피토프를 펩타이드 접합체의 펩타이드에 커플링하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 펩타이드 에피토프를 펩타이드 접합체의 펩타이드에 커플링하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 에피토프는 링커기를 통해 펩타이드에 결합된다. 다양한 예에서, 에피토프는 EBV LMP2 에피토프이다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 아미노산으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 아미노산의 C 말단의 카복실기는 카복실 보호기에 의해 보호되고/되거나, 아미노산의 Nα-아미노기는 아미노 보호기에 의해 보호된다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드의 C 말단의 카복실기는 카복실 보호기에 의해 보호되고/되거나, 펩타이드의 Nα-아미노기는 아미노 보호기에 의해 보호된다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 적어도 4개의 사슬 연결 원자를 각각 함유하는 하나 이상의 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족 또는 헤테로지방족 사슬을 포함한다. 일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 적어도 6개의 사슬 연결 원자를 각각 함유하는 하나 이상의 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족 또는 헤테로지방족 사슬을 포함한다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 지방족이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 포화된다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 임의로 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 하나 이상의 아릴기에 의해 임의로 치환된다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 적어도 4개, 6개, 8개, 10개, 12개 또는 14개의 사슬 연결 원자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 4개 내지 22개, 6개 내지 22개, 8개 내지 22개, 10개 내지 22개, 12개 내지 22개, 또는 14개 내지 22개의 사슬 연결 원자를 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 이종원자 함유 작용기에 의해 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 모이어티에 공유로 결합된다. 이종원자 함유 작용기의 예는 에터, 아민, 설파이드, 설폭사이드, 설폰, 에스터, 아마이드, 카보네이트, 카바메이트 및 유레아기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 실시형태에서, 하나 이상의 사슬은 에스터 작용기에 의해 모이어티에 공유로 결합된다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 하나 이상의 포화 또는 불포화 지방산 에스터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 지방산은 포화된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 지방산 에스터는 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 모이어티에 결합된다. 일 실시형태에서, 에스터는 지방산의 카복실기 및 모이어티의 알코올의 에스터이다.
일 실시형태에서, 지방산은 C4-22 지방산이다. 일 실시형태에서, 지방산은 C6-22 지방산이다. 또 다른 실시형태에서, 지방산은 C10-22 지방산이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 지방산은 C12-22 지방산이다. 예시적인 일 실시형태에서, 지방산은 C12, C14, C16, C18 또는 C20 지방산이다.
몇몇 실시형태에서, 지방산은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 팔미톨레산, 올레산, 엘라이드산, 리놀레산, α-리놀렌산 및 아라키돈산이다. 일 실시형태에서, 지방산은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산 또는 스테아르산이다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 지방산은 팔미트산이다.
예시적인 일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 1개 또는 2개의 지방산 에스터를 포함한다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 1개의 지방산 에스터를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 지방산 에스터는 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 알코올의 에스터이다. 일 실시형태에서, 알코올은 1가, 2가 또는 3가 C2-6 지방족 알코올이다. 또 다른 실시형태에서, 알코올은 1가 또는 2가 C2-4 지방족 알코올이다. 예시적인 일 실시형태에서, 알코올은 1가 C2 지방족 또는 1가 또는 2가 C3 지방족 알코올이다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 알코올은 1가 C2 알코올이다.
소정의 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다.
예시적인 일 실시형태에서, 알코올은 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 알코올은 비닐 알코올이다.
구체적으로 고려되는 실시형태에서, 펩타이드는 합성 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 접합체는 합성 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 합성 펩타이드는 고상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 포함하는 방법에 의해 제조된 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산은 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 잔기는 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 아미노산 잔기는 말단 아미노산 잔기이다. 몇몇 실시형태에서, 말단 아미노산 잔기는 N 말단 잔기이다.
몇몇 실시형태에서, 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 아미노산의 Nα-아미노기는 아실화된다.
소정의 실시형태에서, 상기 방법은, 지질 함유 접합 파트너가 접합된, 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산 잔기의 Nα-아미노기를 아실화하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 Nα-아미노기를 C2-20 지방산에 의해 아실화하는 단계를 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산은 티올을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 잔기는 티올을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 티올은 시스테인 잔기의 티올이다.
소정의 실시형태에서, 시스테인 잔기는 말단 잔기이다. 소정의 실시형태에서, 시스테인 잔기는 N 말단 잔기이다.
몇몇 실시형태에서, 시스테인 잔기의 아미노기는 아실화된다.
일 실시형태에서, 아미노기는 C2-20 지방산에 의해 아실화된다.
예시적인 일 실시형태에서, C2-20 지방산은 아세틸 또는 팔미토일이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, C2-20 지방산은 아세틸이다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 접합체는 8개 내지 220개, 8개 내지 200개, 8개 내지 175개, 8개 내지 150개, 8개 내지 125개, 8개 내지 100개, 8개 내지 90개, 8개 내지 80개, 8개 내지 70개, 8개 내지 60개, 8개 내지 50개, 8개 내지 40개, 8개 내지 30개, 8개 내지 25개, 8개 내지 20개, 또는 8개 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 8개 내지 220개, 8개 내지 200개, 8개 내지 175개, 8개 내지 150개, 8개 내지 125개, 8개 내지 100개, 8개 내지 90개, 8개 내지 80개, 8개 내지 70개, 8개 내지 60개, 8개 내지 50개, 8개 내지 40개, 8개 내지 30개, 8개 내지 25개, 8개 내지 20개, 또는 8개 내지 15개의 아미노산을 포함한다.
예시적인 일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 접합체는 8개 내지 60개의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 예시적인 일 실시형태에서, 펩타이드는 8개 내지 60개의 아미노산을 포함한다.
다른 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 접합체는 5개 내지 220개, 8개 내지 220개, 5개 내지 175개, 8개 내지 175개, 8개 내지 150개, 10개 내지 150개, 15개 내지 125개, 20개 내지 100개, 20개 내지 80개, 20개 내지 60개, 25개 내지 100개, 25개 내지 80개, 25개 내지 60개, 30개 내지 80개, 40개 내지 60개, 또는 50개 내지 60개의 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 5개 내지 220개, 8개 내지 220개, 5개 내지 175개, 8개 내지 175개, 8개 내지 150개, 10개 내지 150개, 15개 내지 125개, 20개 내지 100개, 20개 내지 80개, 20개 내지 60개, 25개 내지 100개, 25개 내지 80개, 25개 내지 60개, 30개 내지 80개, 40개 내지 60개, 또는 50개 내지 60개의 아미노산을 포함한다.
다른 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 접합체는 5개 내지 150개, 5개 내지 125개, 5개 내지 100개, 5개 내지 75개, 5개 내지 60개, 5개 내지 50개, 5개 내지 40개, 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 5개 내지 20개, 8개 내지 150개, 8개 내지 125개, 8개 내지 100개, 8개 내지 75개, 8개 내지 60개, 8개 내지 50개, 8개 내지 40개, 8개 내지 30개, 8개 내지 25개, 또는 8개 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 5개 내지 150개, 5개 내지 125개, 5개 내지 100개, 5개 내지 75개, 5개 내지 60개, 5개 내지 50개, 5개 내지 40개, 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 5개 내지 20개, 8개 내지 150개, 8개 내지 125개, 8개 내지 100개, 8개 내지 75개, 8개 내지 60개, 8개 내지 50개, 8개 내지 40개, 8개 내지 30개, 8개 내지 25개, 또는 8개 내지 20개의 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및/또는 펩타이드 접합체는 하나 이상의 가용화 기를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 하나 이상의 가용화 기를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. 소정의 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 연속적 친수성 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 아미노산 서열이다. 일 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 양이온성 아미노산 잔기이다. 일 실시형태에서, 양이온성 아미노산 잔기는 아르기닌 또는 라이신 잔기이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 양이온성 아미노산 잔기는 라이신 잔기이다. 일 실시형태에서, 서열은 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 3개 내지 7개, 또는 3개 내지 5개의 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 가용화 기는 트라이-, 테트라-, 펜타-, 헥사- 또는 헵타- 라이신 서열이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 가용화 기는 테트라라이신 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 아미노산 포함 접합 파트너는 지질 함유 접합 파트너가 접합된 아미노산 잔기에 인접한 세린 잔기를 포함한다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 지질 함유 접합 파트너가 접합된 아미노산 잔기에 인접한 세린 잔기를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너가 접합된 아미노산 잔기는 N 말단이다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 펩타이드는 세린 잔기에 인접한 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기의 연속적 서열을 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 아미노산 포함 접합 파트너는 세린 잔기에 인접한 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기의 연속적 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 아미노산 함유 접합 파트너는 오직 자연 발생 아미노산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 오직 자연 발생 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 펩타이드 내의 아미노산 잔기의 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상은 자연 발생 아미노산이다.
다른 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 아미노산 함유 접합 파트너 내의 아미노산 잔기의 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상은 자연 발생 아미노산이다.
예시적인 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 아미노산 함유 접합 파트너는 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다:
(a) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 1](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(b) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 2](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(c) 서열 Xaa1Xaa2DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 3](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(d) 서열 SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 4]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(e) 서열 DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 5]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(f) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 6](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(g) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 7](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(h) 서열 Xaa1Xaa2SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 8](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(i) 서열 SKKKKSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 9]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(j) 서열 SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 10]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(k) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 11](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(l) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 12](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(m) 서열 Xaa1Xaa2SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 13](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(n) 서열 SKKKKSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 14]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(o) 서열 SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[서열 번호 15]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(p) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [서열 번호 16](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(q) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 17](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(r) 서열 Xaa1Xaa2DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 18](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(s) 서열 SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 19]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(t) 서열 DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[서열 번호 20]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(u) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[서열 번호 21](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(v) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[서열 번호 22](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(w) 서열 Xaa1Xaa2LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[서열 번호 23](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(x) 서열 SKKKKLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[서열 번호 24]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(y) 서열 LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[서열 번호 25]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(z) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 26](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(aa) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 27](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(bb) 서열 Xaa1Xaa2LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 28](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(cc) 서열 SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 29]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(dd) 서열 LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 30]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ee) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[서열 번호 31](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ff) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[서열 번호 32](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(gg) 서열 Xaa1Xaa2LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[서열 번호 33](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(hh) 서열 SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[서열 번호 34]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ii) 서열 LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[서열 번호 35]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(jj) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 36](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(kk) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 37](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ll) 서열 Xaa1Xaa2LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 38](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(mm) 서열 SKKKKLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 39]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(nn) 서열 LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[서열 번호 40]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(oo) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL LASALIAGGSI[서열 번호 41](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(pp) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL LASALIAGGSI[서열 번호 42](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(qq) 서열 Xaa1Xaa2LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL LASALIAGGSI[서열 번호 43](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(rr) 서열 SKKKKLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL LASALIAGGSI[서열 번호 44]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ss) 서열 LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[서열 번호 45]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(tt) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA [서열 번호 46](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(uu) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[서열 번호 47](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(vv) 서열 Xaa1Xaa2FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[서열 번호 48](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ww) 서열 SKKKKFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[서열 번호 49]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(xx) 서열 FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[서열 번호 50]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(yy) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQ LSPLL[서열 번호 51](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(zz) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQ LSPLL[서열 번호 52](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(aaa) 서열 Xaa1Xaa2LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQ LSPLL[서열 번호 53](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(bbb) 서열 SKKKKLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[서열 번호 54]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ccc) 서열 LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[서열 번호 55]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ddd) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILT AGFLIFLIGFA[서열 번호 56](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(eee) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILT AGFLIFLIGFA[서열 번호 57](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(fff) 서열 Xaa1Xaa2SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILT AGFLIFLIGFA[서열 번호 58](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ggg) 서열 SKKKKSGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILT AGFLIFLIGFA[서열 번호 59]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(hhh) 서열 SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[서열 번호 60]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(iii) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL PP[서열 번호 61](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(jjj) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL PP[서열 번호 62](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(kkk) 서열 Xaa1Xaa2SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[서열 번호 63](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(lll) 서열 SKKKKSNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[서열 번호 64]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(mmm) 서열 SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[서열 번호 65]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(nnn) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWL AAIAAS[서열 번호 66](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ooo) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWL AAIAAS[서열 번호 67](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ppp) 서열 Xaa1Xaa2GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWL AAIAAS[서열 번호 68](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(qqq) 서열 SKKKKGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[서열 번호 69]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(rrr) 서열 GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[서열 번호 70]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(sss) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTP VTVLT[서열 번호 71](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa4는 부재하거나 하나 이상의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(ttt) 서열 Xaa1Xaa2Xaa3AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTP VTVLT[서열 번호 72](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 친수성 아미노산이고, Xaa3은 부재하거나 1개 내지 10개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(uuu) 서열 Xaa1Xaa2AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[서열 번호 73](여기서, Xaa1은 부재하거나 S 또는 친수성 아미노산이고, Xaa2는 부재하거나 1개 내지 4개의 친수성 아미노산임)로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(vvv) 서열 SKKKKAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[서열 번호 74]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(www) 서열 AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[서열 번호 75]로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(xxx) 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열,
(yyy) ESNEEPPPPY[서열 번호 76],
SNEEPPPPY[서열 번호 77],
HSDYQPLGT[서열 번호 78],
PLGTQDQSL[서열 번호 79],
PLGTQDQSLY[서열 번호 80],
PLGTQDQSLY[서열 번호 80],
LGTQDQSLY[서열 번호 81],
GTQDQSLYL[서열 번호 82],
GTQDQSLYL[서열 번호 83],
GTQDQSLYLG[서열 번호 84],
QSLYLGLQH[서열 번호 85],
SLYLGLQHD[서열 번호 86],
SLYLGLQHD[서열 번호 86],
GLQHDGNDGL[서열 번호 87],
GNDGLPPPPY[서열 번호 88],
GLPPPPYSP[서열 번호 89],
GLPPPPYSPR[서열 번호 90],
GLPPPPYSPR[서열 번호 90],
PRDDSSQHIY[서열 번호 91],
RDDSSQHIY[서열 번호 92],
HIYEEAGRG[서열 번호 93],
ILLARLFLY[서열 번호 94],
SSCSSCPLSKI[서열 번호 95],
LLWTLVVLL[서열 번호 96],
FLYALALLL[서열 번호 97],
CLGGLLTMV[서열 번호 98],
LIVDAVLQL[서열 번호 99],
LTAGFLIFL[서열 번호 100],
TVCGGIMFL[서열 번호 101] 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기,
(zzz) 서열 번호 76 내지 101 중 임의의 하나의 서열,
(aaaa) 또는 상기 (a) 내지 (zzz)의 2개 이상의 임의의 조합.
예시적인 일 실시형태에서, 펩타이드는 잠복성 막 단백질 2(LMP2), 예를 들어 전장 EBV LMP2(아미노산 1-497)로부터 유래한 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74, 또는 75 중 임의의 하나로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
또 다른 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74, 또는 75 중 임의의 하나로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
또 다른 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74, 또는 75 중 임의의 하나로부터의 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상 또는 25개 이상의 인접한 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74 또는 75 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
또 다른 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나로부터의 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상 또는 25개 이상의 인접한 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 76 내지 101 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 예에서, 펩타이드는 서열 번호 76 내지 93 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 76 내지 101 중 임의의 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 예에서, 펩타이드는 서열 번호 76 내지 93 중 임의의 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 아미노산의 반응성 작용기는 비보호된다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 펩타이드 접합체의 아미노산의 하나 이상의 반응성 작용기는 비보호된다.
소정의 실시형태에서, 아미노산 접합체의 아미노산의 하나 이상의 반응성 작용기는 비보호된다.
소정의 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너의 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 반응성 작용기는 비보호된다.
소정의 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 펩타이드를 포함하고, 펩타이드의 아미노산의 측쇄의 반응성 작용기는, 반응되는 티올 이외의 임의의 티올을 배제하고는, 비보호된다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산의 반응성 작용기는 비보호된다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산의 반응성 작용기는, 반응되는 티올 이외의 임의의 티올을 배제하고는, 비보호된다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (A)의 구조를 포함하는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00001
식 중,
Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 알킬 또는 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (A)의 구조를 포함하는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함한다:
Figure pct00002
식 중,
Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 알킬 또는 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드이고;
R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (B)의 구조를 포함하는 아미노산 또는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함한다:
Figure pct00003
식 중,
Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 알킬 또는 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
p는 0 내지 4의 정수이고;
q는 0 내지 2의 정수이고;
R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R33, R44, R55, R66, R77, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R11, R22, R33, R44, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (B)의 구조를 포함하는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함한다:
Figure pct00004
식 중,
Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 알킬 또는 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
p는 0 내지 4의 정수이고;
q는 0 내지 2의 정수이고;
R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R33, R44, R55, R66, R77, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드이고;
R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R11, R22, R33, R44, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 하기 화학식 (A1)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00005
식 중,
Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 알킬 또는 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
단:
R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, L1 및 L2에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
또 다른 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 하기 화학식 (B1)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00006
식 중,
Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 알킬 또는 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
p는 0 내지 4의 정수이고;
R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R33 및 R44는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
단:
R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R11, R22, R33, R44, L1 및 L2에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물이다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같은 화학식 (IIA)의 화합물이다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같은 화학식 (III)의 화합물이다.
일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같은 화학식 (III)의 화합물이다.
일 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같은 화학식 (IIIA)의 화합물이다.
일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같은 화학식 (IIIA)의 화합물이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (I)의 구조를 포함하는 아미노산 또는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함하고:
Figure pct00007
식 중,
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환되고;
상기 방법은, 화학식 (III)의 화합물 내의 티올에 의한 화학식 (II)의 화합물 내의 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (III)의 화합물과 접합시키기에 효과적인 조건 하에, 하기 화학식 (II)의 지질 함유 접합 파트너와 하기 화학식 (III)의 구조를 포함하는 펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함한다:
Figure pct00008
(식 중, m, R1, R2, R3, R4, R5 및 L1은 화학식 (I)의 화합물에 정의된 바와 같음)
Figure pct00009
(식 중, n, R6, R7, R8, R9 및 A1은 화학식 (I)의 화합물에 정의된 바와 같음).
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (I)의 구조를 포함하는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함하고:
Figure pct00010
식 중,
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R3, R4, R5, R8, 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드이고;
R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환되고;
상기 방법은, 화학식 (III)의 화합물 내의 티올에 의한 화학식 (II)의 화합물 내의 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (III)의 화합물과 접합시키기에 효과적인 조건 하에, 하기 화학식 (II)의 지질 함유 접합 파트너와 하기 화학식 (III)의 구조를 포함하는 펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함한다:
Figure pct00011
(식 중, m, R1, R2, R3, R4, R5 및 L1은 화학식 (I)의 화합물에 정의된 바와 같음)
Figure pct00012
(식 중, n, R6, R7, R8, R9 및 A1은 화학식 (I)의 화합물에 정의된 바와 같음).
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (IA)의 구조를 포함하는 아미노산 또는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함하고:
Figure pct00013
식 중,
p는 0 내지 4의 정수이고;
q는 0 내지 2의 정수이고;
R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R33, R44, R55, R66, R77, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R11, R22, R33, R44, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환되고;
상기 방법은, 화학식 (IIA)의 화합물 내의 티올에 의한 화학식 (IIIA)의 화합물 내의 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 화학식 (IIA)의 화합물을 화학식 (IIIA)의 화합물과 접합시키기에 효과적인 조건 하에, 하기 화학식 (IIA)의 화합물과 하기 화학식 (IIIA)의 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다:
Figure pct00014
(식 중, p, R11, R22, R33, R44 및 L1은 화학식 (IA)의 화합물에 정의된 바와 같음)
Figure pct00015
(식 중, q, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb 및 A1은 화학식 (IA)의 화합물에 정의된 바와 같음).
일 실시형태에서, 상기 방법은 하기 화학식 (IA)의 구조를 포함하는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제조하는 단계를 포함하고:
Figure pct00016
식 중,
p는 0 내지 4의 정수이고;
q는 0 내지 2의 정수이고;
R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
R33, R44, R55, R66, R77, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드이고;
R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
임의의 R11, R22, R33, R44, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환되고;
상기 방법은, 화학식 (IIA)의 화합물 내의 티올에 의한 화학식 (IIIA)의 화합물 내의 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 화학식 (IIA)의 화합물을 화학식 (IIIA)의 화합물과 접합시키기에 효과적인 조건 하에, 하기 화학식 (IIA)의 화합물과 하기 화학식 (IIIA)의 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다:
Figure pct00017
(식 중, p, R11, R22, R33, R44 및 L1은 화학식 (IA)의 화합물에 정의된 바와 같음)
Figure pct00018
(식 중, q, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb 및 A1은 화학식 (IA)의 화합물에 정의된 바와 같음).
일 실시형태에서, L1 및 L2 중 적어도 1개는 C5-22알킬이다.
일 실시형태에서, p는 0 내지 2의 정수이다. 또 다른 실시형태에서, p는 0 또는 1이다.
몇몇 실시형태에서, R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소이거나; R11은 L2-C(O)-OCH2이다. 일 실시형태에서, L1-C(O)-O에 인접한 탄소 상의 R11은 L2-C(O)-OCH2이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소이다.
일 실시형태에서, R33은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이다.
일 실시형태에서, R33 및 R44는 각각 수소이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, q는 0 또는 1이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, q는 0이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R55, R66 및 R77은 각각 수소이다.
몇몇 실시형태에서, Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 수소이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; p는 1이고; R11은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; R22는 수소이고; R33은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; R44는 수소이고; L2는 C11-21알킬이다.
일 실시형태에서, R55, R66, R77, Ra, Rb 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, R55, R66, R77, Ra, Rb 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; p는 1이고; R11은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; R22는 수소이고; R33은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; R44는 수소이고; L2는 C11-21알킬이고; R55, R66, R77, Ra, Rb 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다.
일 실시형태에서, L1은 C5-21알킬이다. 또 다른 실시형태에서, L1은 C9-21알킬이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이다. 예시적인 일 실시형태에서, L1은 C11, C13, C15, C17 또는 C19알킬이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, L1은 C15알킬이다.
일 실시형태에서, L1은 9-21 탄소 원자의 직쇄를 포함한다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, L1은 선형 C15알킬이다.
일 실시형태에서, m은 0 내지 2의 정수이다. 또 다른 실시형태에서, m은 0 또는 1이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, m은 0이다.
몇몇 실시형태에서, R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소이거나; R1은 L2-C(O)-OCH2이다. 일 실시형태에서, L1-C(O)-O에 인접한 탄소 원자 상의 R1은 L2-C(O)-OCH2이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소이다.
일 실시형태에서, R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R3은 수소이다.
일 실시형태에서, L2는 C5-21알킬이다. 또 다른 실시형태에서, L2는 C9-21알킬이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, L2는 C11-21알킬이다. 예시적인 일 실시형태에서, L2는 C11, C13, C15, C17 또는 C19알킬이다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, L2는 C15알킬이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R4 및 R5는 각각 수소이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, n은 1이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R6 및 R7은 각각 수소이다.
예시적인 실시형태에서, R8은 수소이다.
일 실시형태에서, R8 및 R9는 각각 수소이거나; R9는 L3-C(O) 또는 A2이다. 예시적인 일 실시형태에서, R8은 수소이고, R9는 L3-C(O)이다.
몇몇 실시형태에서, L3은 C1-21알킬이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, L3은 메틸 또는 선형 C15알킬이다. 예시적인 실시형태에서, L3은 메틸이다.
당해 분야의 당업자는 화학식 (III) 및 (IIIA)의 구조가 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 바대로, 펩타이드는 펩타이드 함유 접합 파트너를 제공하도록 본 명세서에 기재된 바대로 임의로 치환되거나 변형되거나 다양한 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
일 실시형태에서, A1은 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드이다. 일 실시형태에서 A2는 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, A1은 에피토프에 의해 치환된 펩타이드이다. 일 실시형태에서, A2는 에피토프에 의해 치환된 펩타이드이다
일 실시형태에서, 에피토프는 링커기를 통해 펩타이드에 결합된다.
일 실시형태에서, 에피토프는 펩타이드 에피토프이다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 각각 독립적으로 약 8개 내지 220개, 8개 내지 200개, 8개 내지 175개, 8개 내지 150개, 8개 내지 125개, 8개 내지 100개, 8개 내지 90개, 8개 내지 80개, 8개 내지 70개, 8개 내지 60개, 8개 내지 50개, 8개 내지 40개, 8개 내지 30개, 8개 내지 25개, 8개 내지 20개, 또는 8개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이다. 예시적인 일 실시형태에서, A1 및 A2는 각각 독립적으로 약 8개 내지 60개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이다.
다른 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 각각 독립적으로 약 5개 내지 150개, 5개 내지 125개, 5개 내지 100개, 5개 내지 75개, 5개 내지 60개, 5개 내지 50개, 5개 내지 40개, 5개 내지 30개, 5개 내지 25개, 5개 내지 20개, 8개 내지 150개, 8개 내지 125개, 8개 내지 100개, 8개 내지 75개, 8개 내지 60개, 8개 내지 50개, 8개 내지 40개, 8개 내지 30개, 8개 내지 25개, 또는 8개 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이고, 펩타이드는 8개 내지 60개의 아미노산을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 각각 독립적으로 펩타이드 에피토프를 포함하거나 이에 의해 치환된 펩타이드이고, 펩타이드 에피토프는 8개 내지 60개의 아미노산을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 각각 독립적으로 펩타이드 에피토프를 포함하거나 이에 의해 치환된 펩타이드이고, 펩타이드는 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나, 예를 들어 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상 또는 25개 이상의 인접한 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; L2는 C11-21알킬이고; R4 및 R5는 각각 수소이다.
일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다. 일 실시형태에서, L3은 메틸 또는 선형 C15알킬이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; L2는 C11-21알킬이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고; L2는 C11-21알킬이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이다.
일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이고, 여기서 L3은 메틸이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이고, 여기서 L3은 메틸이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이다.
일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이고, 여기서 L3은 메틸이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이고, 여기서 L3은 메틸이다.
몇몇 실시형태에서, A1은 제1 N 말단 아미노산 잔기로서 세린을 포함하는 펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 가용화 기를 포함하는 펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, A1은 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가용화 기를 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, A1은 제1 N 말단 아미노산 잔기로서 세린 및 세린에 인접한 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가용화 기를 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 연속적 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 친수성 아미노산 잔기는 양이온성 아미노산 잔기이다. 일 실시형태에서, 양이온성 아미노산 잔기는 아르기닌 또는 라이신 잔기이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 양이온성 아미노산 잔기는 라이신 잔기이다. 일 실시형태에서, 서열은 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 3개 내지 7개, 또는 3개 내지 5개의 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 가용화 기는 트라이-, 테트라-, 펜타-, 헥사-, 또는 헵타- 라이신 서열이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 가용화 기는 테트라라이신 서열이다.
몇몇 실시형태에서, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이다. 몇몇 실시형태에서, R9는 수소 또는 L3-C(O)이다.
몇몇 실시형태에서, R9는 수소 또는 아미노 보호기이고, 상기 방법은 L3-C(O)에 의해 R9에서 수소 또는 아미노 보호기를 대체하도록 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체를 아실화하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, L3-C(O)에 의해 R9에서 아미노 보호기를 대체하기 위한 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체의 아실화는 R9에서 수소를 제공하도록 R9에서 아미노 보호기를 제거하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 아미노산 또는 펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, A1은 OH 또는 OP1이고/이거나, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이다. 몇몇 실시형태에서, A1은 OP1 또는 OH이고/이거나, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이다. 몇몇 실시형태에서, A1은 OP1 또는 OH이고, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이다.
몇몇 실시형태에서, A1은 OP1 또는 OH이고/이거나, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이고, 상기 방법은 아미노산 또는 펩타이드에 의해 A1 및/또는 R9를 대체하도록 아미노산 또는 펩타이드를 커플링하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, A1은 OP1 또는 OH이고, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이고, 상기 방법은 아미노산 또는 펩타이드에 의해 A1 및/또는 R9를 대체하도록 아미노산 또는 펩타이드를 커플링하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드의 커플링은 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 펩타이드의 커플링을 개별적으로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 또는 펩타이드의 커플링은 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 아미노산 또는 펩타이드의 커플링은 링커기 또는 이의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 접합체를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 아미노산 또는 펩타이드의 커플링은, 지질 함유 접합 파트너가 링커기를 통해 접합된, 아미노산에 결합된 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 아미노 보호기는 Boc, Fmoc, Cbz(카복시벤질), Nosyl(o- 또는 p-나이트로페닐설포닐), Bpoc(2-(4-바이페닐)아이소프로폭시카보닐) 및 Dde(1-(4,4-디메틸-2,6-다이옥소헥실리덴)에틸)이다. 몇몇 실시형태에서, 아미노 보호기는 Boc 또는 Fmoc이다.
몇몇 실시형태에서, 카복실 보호기는 tert-뷰틸 또는 벤질이다. 일 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (IV)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00019
식 중,
R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고;
R9는 수소, 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드을 포함한다.
일 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (IV)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이다:
Figure pct00020
식 중,
R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고;
R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이고;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 화학식 (IV)의 화합물 내의 L1, A1, A2, L2 및 L3은 각각 독립적으로 화학식 (I)의 화합물에 관한 임의의 실시형태에 정의된 바와 같다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R3은 수소이다.
또 다른 구체적으로 고려되는 실시형태에서, R9는 아세틸이다.
또 다른 구체적으로 고려되는 실시형태에서, R3은 수소이고, R9는 아세틸이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 화학식 (IV)의 화합물을 제조하기 위한 것이고, L1은 C15 선형 알킬이고, R3은 수소이고, R9는 Fmoc이고, A1은 OH이고, 상기 방법은 비닐 팔미테이트 및 Fmoc-Cys-OH를 반응시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 아미노 보호기는 Fmoc가 아니다. 몇몇 실시형태에서, 아미노 보호기는 Boc이다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너는 Fmoc-Cys-OH가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 인접한 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 인접한 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너를 아미노산 함유 접합 파트너에 접합하기에 효과적인 조건은 하나 이상의 유리 라디칼의 생성을 포함한다. 일 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너를 펩타이드 함유 접합 파트너에 접합하기에 효과적인 조건은 하나 이상의 유리 라디칼의 생성을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 유리 라디칼의 생성은 열로 및/또는 광화학으로 개시된다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 유리 라디칼의 생성은 유리 라디칼 개시제의 열 및/또는 광화학 분해에 의해 개시된다. 예시적인 실시형태에서, 하나 이상의 유리 라디칼의 생성은 열 개시제의 열 분해 또는 광화학 개시제의 광화학 분해에 의해 개시된다.
몇몇 실시형태에서, 유리 라디칼 개시제의 열 분해는 반응 혼합물을 적합한 온도에서 가열하는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 반응 혼합물은 약 40℃ 내지 약 200℃, 약 50℃ 내지 약 180℃, 약 60℃ 내지 약 150℃, 약 65℃ 내지 약 120℃, 약 70℃ 내지 약 115℃, 약 75℃ 내지 약 110℃, 또는 약 80℃ 내지 약 100℃의 온도에서 가열된다. 다른 실시형태에서, 반응 혼합물은 적어도 약 40℃, 적어도 약 50℃, 적어도 약 60℃, 또는 적어도 약 65℃의 온도에서 가열된다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 반응 혼합물은 약 90℃의 온도에서 가열된다.
몇몇 실시형태에서, 유리 라디칼 개시제의 광화학 분해는 자외선에 의한 조사를 포함한다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 자외선은 약 365㎚의 파장을 가진다. 예시적인 실시형태에서, 유리 라디칼 개시제의 광화학 분해는 대략 주변 온도에서 수행된다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 열 개시제는 2,2'-아조비스아이소뷰티로나이트릴(AIBN)이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 광개시제는 2,2-다이메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA)이다.
소정의 실시형태에서, 반응은 액체 매질 중에 수행된다. 일 실시형태에서, 액체 매질은 용매를 포함한다. 일 실시형태에서, 용매는 N-메틸피롤리돈(NMP), 디메틸설폭사이드(DMSO), N,N-디메틸폼아마이드(DMF), 다이클로로메탄(DCM), 1,2-다이클로로에탄, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 용매는 NMP, DMSO, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 용매는 DMSO를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 반응은 이합체화, 텔로머화 또는 중합을 저해하는 하나 이상의 첨가제의 존재 하에 수행된다. 몇몇 예시적인 실시형태에서, 첨가제는 환원 글루타티온(GSH), 2,2'-(에틸렌다이옥시)다이에탄티올(DODT), 1,4-다이티오트레이톨(DTT) 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 첨가제는 DTT이다. 몇몇 실시형태에서, 첨가제는 DTT 또는 tert-뷰틸 머캅탄이다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 TFA, tert-뷰틸 머캅탄, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 첨가제는 TFA 및 tert-뷰틸 머캅탄의 조합이다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 약 5분 내지 약 48시간, 5분 내지 약 24시간, 약 5분 내지 약 12시간, 약 5분 내지 약 6시간, 약 5분 내지 약 3시간, 5분 내지 2시간, 또는 약 5분 내지 약 1시간의 시간 기간 동안 수행된다. 예시적인 실시형태에서, 반응은 약 5분 내지 약 1시간의 시간 기간 동안 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 접합 파트너 중 하나가 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 소모될 때까지 수행된다.
소정의 실시형태에서, 반응은 실질적으로 산소 비함유 조건 하에 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은,
지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너를 반응시켜 아미노산 또는 펩타이드 접합체를 제공하는 단계;
고상 펩타이드 합성(SPPS)에 의해 펩타이드의 아미노산 서열을 합성하는 단계;
SPPS에 의해 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산을 고상 결합된 펩타이드에 커플링하여 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체, 링커기 또는 이의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 접합체, 또는, 지질 함유 접합 파트너가 링커기를 통해 접합된, 아미노산에 결합된 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 아미노산 접합체의 아미노산 또는, 지질 함유 접합 파트너가 펩타이드 접합체 중 임의의 하나에 접합된, 아미노산의 Nα-아미노기를 아실화하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 고상 지지체로부터 펩타이드 접합체를 절단하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은,
고상 펩타이드 합성(SPPS)에 의해 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 서열을 합성하는 단계; 및
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 따라 지질 함유 접합 파트너 및 펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함한다.
예시적인 실시형태에서, 상기 방법은,
SPPS에 의해 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 서열을 합성하는 단계,
고상 지지체로부터 펩타이드 접합체를 절단하는 단계; 및
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 따라 지질 함유 접합 파트너 및 펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 지질 함유 접합 파트너와의 반응 전에 정제되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 보호기는 고상 지지체로부터의 펩타이드의 절단 시 제거된다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드에 존재하는 모든 보호기는 제거된다.
일 실시형태에서, SPPS는 Fmoc-SPPS이다.
몇몇 실시형태에서, 반응되는 티올 또는 탄소-탄소 이중 결합을 보유하는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드 내의 아미노산 잔기는 N 말단 아미노산 잔기이고, 상기 방법은 고상으로부터 펩타이드를 절단하기 전에 N 말단 아미노기를 아실화하는 단계를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 아미노산 잔기는 N 말단 잔기이다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, N 말단 잔기는 시스테인 잔기이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 반응 매질로부터 펩타이드 접합체를 분리하는 단계 및 임의로 펩타이드 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (V)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제공한다:
Figure pct00021
식 중,
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고,
L1은 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (V)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 제공한다:
Figure pct00022
식 중,
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
L1은 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
L3은 C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
단:
R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드이고;
임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
일 실시형태에서, m, n, R6, R7, A1 및 A2는 각각 독립적으로 화학식 (I)의 화합물에 관한 임의의 실시형태에 정의된 바와 같다.
일 실시형태에서, L1은 C5-21알킬이다. 일 실시형태에서, L1은 C5-21알킬이다. 또 다른 실시형태에서, L1은 C9-21알킬이다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이다. 예시적인 일 실시형태에서, L1은 C11, C13, C15, C17 또는 C19알킬이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, L1은 C15알킬이다.
일 실시형태에서, L1은 9개 내지 21개의 탄소 원자의 직쇄를 포함한다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, L1은 선형 C15알킬이다.
일 실시형태에서, m은 0 내지 2의 정수이다. 또 다른 실시형태에서, m은 0 또는 1이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, m은 0이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R3은 수소이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R4 및 R5는 각각 수소이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, n은 1이다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, R6 및 R7은 각각 수소이다.
예시적인 실시형태에서, R8은 수소이다.
몇몇 실시형태에서, R8은 수소이고, R9는 수소, 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, R8 및 R9는 각각 수소이거나; R9는 L3-C(O) 또는 A2이다. 예시적인 일 실시형태에서, R8은 수소이고, R9는 L3-C(O)이다. 구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, L3은 메틸이다.
몇몇 실시형태에서, A1은 OP1 또는 OH이고, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)이다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 아미노산 또는 펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드는 에피토프를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, A1은 세린 또는 제1 N 말단 아미노산 잔기로서 세린을 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, A1 및/또는 A2는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가용화 기를 포함하는 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, A1은 제1 N 말단 아미노산 잔기로서 세린 및 세린에 인접한 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가용화 기를 포함하는 펩타이드이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이다.
일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다. 일 실시형태에서, n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이고, 여기서 L3은 메틸이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이다. 일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이다.
일 실시형태에서, L1은 C11-21알킬이고; m은 0이고; R3은 수소이고; R4 및 R5는 각각 수소이고; n은 1이고; R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 수소 또는 L3-C(O)이고, 여기서 L3은 메틸이다.
몇몇 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물 내에 L1은 C15 선형 알킬이고; m은 0이고; n은 1이고; R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 수소이고; R9는 Fmoc이고, A1은 OH이다.
몇몇 실시형태에서, R9의 아미노 보호기는 Fmoc가 아니다. 몇몇 실시형태에서, R9의 아미노 보호기는 Boc이다.
몇몇 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물은 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 인접한 아미노산을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 아미노 및/또는 카복실 보호기는 화학식 (I)의 화합물에 관한 임의의 실시형태에 정의된 바와 같다.
당해 분야의 당업자는 화학식 (V)의 화합물이 펩타이드 접합체이고, 본 명세서에 기재된 접합 방법의 펩타이드 접합체에 관한 소정의 실시형태가 화학식 (V)의 화합물에 또한 적용된다는 것을 이해할 것이다.
몇몇 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물은 자가 아쥬번팅 펩타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 화합물은 링커 또는 이의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드는 링커 또는 이의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드는 링커를 통해, L1이 결합된, 아미노산에 결합된 펩타이드 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드는 2개 이상의 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 약 2개 내지 20개, 2개 내지 18개, 2개 내지 16개, 2개 내지 14개, 2개 내지 12개, 2개 내지 10개, 또는 2 내지 8개의 아미노산의 길이의 아미노산 서열이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 면역원성 조성물이다.
일 실시형태에서, 상기 조성물은 외인성 아쥬번트를 포함하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 상기 조성물은 백신이다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 유효량의 2종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체를 포함하고, 예를 들어 약제학적 조성물은 유효량의 3종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체를 포함한다. 일 예에서, 약제학적 조성물은 유효량의 2종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체를 포함하고, 2종 이상의 펩타이드 접합체는 LMP2의 면역원성 영역의 모두를 실질적으로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 유효량의 2종 이상의 본 발명의 펩타이드를 포함하고, 예를 들어 약제학적 조성물은 유효량의 3종 이상의 본 발명의 펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 1종 이상의 본 발명의 펩타이드와 함께 유효량의 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 유효량의 2종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체 및 1종 이상의 본 발명의 펩타이드, 또는 유효량의 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체 및 2종 이상의 본 발명의 펩타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드 접합체 또는 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 펩타이드 접합체 또는 펩타이드의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 펩타이드 접합체 또는 펩타이드의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 또는 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 백신접종하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체를 백신접종하기 위한, 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 대상체를 백신접종하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물의 용도를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에 대한, 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 및/또는 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체, 예를 들어 1종 이상의 펩타이드 접합체와 조합된 1종 이상의 펩타이드의 투여를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 및/또는 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체, 예를 들어 1종 이상의 펩타이드 접합체와 조합된 1종 이상의 펩타이드는 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위해 또는 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 2종 이상의 펩타이드, 2종 이상의 펩타이드 접합체, 또는 1종 이상의 펩타이드 및 1종 이상의 펩타이드 접합체는 사용되거나 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 2종 이상의 펩타이드, 2종 이상의 펩타이드 접합체, 또는 1종 이상의 펩타이드 및 1종 이상의 펩타이드 접합체는 동시에, 순차적으로 또는 별개로 사용되거나 투여된다.
비대칭 중심은 본 명세서에 기재된 화합물에 존재할 수 있다. 비대칭 중심은 키랄 탄소 원자에서의 3차원 공간에서의 치환기의 구성에 따라 (R) 또는 (S)로 지정될 수 있다. 화합물의 모든 입체화학 이성질체 형태, 예컨대 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 에피머 형태, 및 d-이성질체 및 l-이성질체, 및 이들의 혼합물, 예컨대 입체화학 이성질체의 거울상이성질체로 농후한 및 부분입체이성질체로 농후한 혼합물은 본 발명의 범위 내에 있다.
개별 거울상이성질체는 상업적으로 입수 가능한 거울상이성질체 순수 출발 물질로부터 합성에 의해 또는 거울상이성질체 혼합물을 제조하고 혼합물을 개별 거울상이성질체로 분할함으로써 제조될 수 있다. 분할 방법은 부분입체이성질체의 혼합물로의 거울상이성질체 혼합물의 전환 및 예를 들어 재결정화 또는 크로마토그래피, 및 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적절한 방법에 의한 부분입체이성질체의 분리를 포함한다. 한정된 입체화학의 출발 물질은 상업적으로 입수 가능하거나, 필요한 경우, 당해 분야에 널리 공지된 기법에 의해 제조되고 분할될 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물은 입체배좌 또는 기하 이성질체, 예컨대 시스(cis), 트랜스(trans), 신(syn), 안티(anti), 반대쪽(entgegen)(E) 및 같은 쪽(zusammen)(Z) 이성질체로 또한 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 및 임의의 이들의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 있다.
기재된 화합물의 임의의 호변이체 이성질체 또는 이들의 혼합물이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 수 있는 것처럼, 매우 다양한 작용기 및 다른 구조는 호변이체성을 나타낼 수 있다. 예는 케토/엔올, 이민/엔아민, 및 티오케톤/엔티올 호변이체성을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 기재된 화합물은 아이소토폴로그(isotopologue) 및 동위원소이성질체(isotopomer)로 또한 존재할 수 있고, 상기 화합물 내의 하나 이상의 원자는 상이한 동위원소에 의해 대체된다. 적합한 동위원소는 예를 들어 1H, 2H(D), 3H(T), 12C, 13C, 14C, 16O 및 18O를 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물로 이러한 동위원소를 혼입하는 절차는 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 본 명세서에 기재된 화합물의 아이소토폴로그 및 동위원소이성질체는 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본 명세서에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물, 예컨대 수화물은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 염은 산 부가염, 염기 부가염, 및 염기성 질소 함유 기의 4차 염을 포함한다.
산 부가염은 유리 염기 형태의 화합물을 무기 또는 유기 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 무기 산의 예는 염산, 브롬산, 질산, 황산 및 인산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유기 산의 예는 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글라이콜산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 퓨마르산, 피류브산, 아스파르트산, 글루탐산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 이세티온산, 설파닐산, 아디프산, 뷰티르산 및 피발산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
염기 부가염은 유리 산 형태의 화합물을 무기 또는 유기 염기와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 무기 염기 부가염의 예는 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 및 다른 생리학적으로 허용 가능한 금속염, 예를 들어 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 또는 아연 염을 포함한다. 유기 염기 부가염의 예는 아민염, 예를 들어 트리메틸아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민 및 에틸렌다이아민의 염을 포함한다.
상기 화합물 내의 염기성 질소 함유 기의 4차 염은 예를 들어 화합물을 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 뷰틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드, 다이알킬 설페이트, 예컨대 디메틸, 다이에틸, 다이뷰틸 및 다이아밀 설페이트 등과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본 명세서에서의 화학식에 사용된 일반 화학 용어는 이의 일반 의미를 가진다.
용어 "지방족"은 포화 및 불포화, 비방향족, 직쇄, 분지쇄, 비고리형 및 고리형 탄화수소를 포함하도록 의도된다. 당해 분야의 당업자는 지방족 기가 예를 들어 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬 및 사이클로알케닐 기를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 지방족 기는 포화된다.
용어 "헤테로지방족"은 하나 이상의 사슬 탄소 원자가 이종원자에 의해 대체된 지방족 기를 포함하도록 의도된다. 몇몇 실시형태에서, 헤테로지방족은 포화된다.
용어 "알킬"은 포화 또는 불포화 직쇄 및 분지쇄 사슬 탄화수소기를 포함하도록 의도된다. 포화 탄화수소기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸 등을 포함한다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 가진다. 불포화 알킬기의 예는 비닐, 프로프-2-엔일, 크로틸, 아이소펜트-2-엔일, 2-뷰타다이엔일, 펜타-2,4-다이엔일, 펜타-1,4-다이엔일, 에틴일, 프로프-3-인일, 뷰트-3-인일 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 알킬은 포화된다.
용어 "헤테로알킬"은 하나 이상의 사슬 탄소 원자가 이종원자에 의해 대체된 알킬기를 포함하도록 의도된다. 몇몇 실시형태에서, 헤테로알킬은 포화된다.
용어 "사이클로알킬"은 비방향족 사이클릭 알킬기를 포함하도록 의도된다. 사이클로알킬기의 예는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥스-1-엔일, 사이클로헥스-3-엔일, 사이클로헵틸을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 사이클로알킬은 포화된다.
용어 "이종원자"는 산소, 질소, 황 또는 인을 포함하는 것으로 의도된다. 몇몇 실시형태에서, 이종원자는 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "아릴"은 방향족 라디칼을 포함하도록 의도된다. 예는 페닐, 톨릴, 나프틸, 인다닐 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 아릴 기는 방향족 고리계 내에 4개 내지 8개 또는 6개 내지 8개의 탄소 원자를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "치환된"은 표시된 기 내의 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 독립적으로 선택된 적합한 치환기에 의해 대체된다는 것을 의미하도록 의도되고, 단 치환기가 부착된 각각의 원자의 일반 원자가는 초과되지 않고, 치환은 안정한 화합물을 생성시킨다.
본 명세서에 기재된 화합물 내의 지방족, 헤테로지방족, 알킬, 헤테로알킬 및 사이클로알킬기에 대한 임의의 치환기의 예는 할로, CN, NO2, OH, NH2, NHR1, NR1R2, C1-6할로알킬, C1-6할로알콕시, C(O)NH2, C(O)NHR1, C(O)NR1R1, SO2R1, OR1, SR1, S(O)R1, C(O)R1 및 C1-6지방족(여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-6알킬임)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "카복실 보호기"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 카복실기의 OH 기를 제공하고 합성 절차 동안 원치 않는 반응에 대해 카복실기를 보호하도록 용이하게 제거될 수 있는 기를 의미한다. 이러한 보호기는 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis edited by T. W. Greene et al. (John Wiley & Sons, 1999) and 'Amino Acid-Protecting Groups' by Fernando Albericio (with Albert Isidro-Llobet and Mercedes Alvarez) Chemical Reviews 2009 (109) 2455-2504]에 기재되어 있다. 예는 알킬 및 실릴 기, 예를 들어 메틸, 에틸, tert-뷰틸, 메톡시메틸, 2,2,2-트라이클로로에틸, 벤질, 다이페닐메틸, 트리메틸실릴 및 tert-뷰틸디메틸실릴 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "아민 보호기"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 아민기의 NH2 기를 제공하고 합성 절차 동안 원치 않는 반응에 대해 아민기를 보호하도록 용이하게 제거될 수 있는 기를 의미한다. 이러한 보호기는 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis edited by T. W. Greene et al. (John Wiley & Sons, 1999) and 'Amino Acid-Protecting Groups' by Fernando Albericio (with Albert Isidro-Llobet and Mercedes Alvarez) Chemical Reviews 2009 (109) 2455-2504]에 기재되어 있다. 예는 아실 및 아실옥시기, 예를 들어 아세틸, 클로로아세틸, 트라이클로로아세틸, o-나이트로페닐아세틸, o-나이트로페녹시-아세틸, 트라이플루오로아세틸, 아세토아세틸, 4-클로로뷰티릴, 아이소뷰티릴, 피콜리노일, 아미노카프로일, 벤조일, 메톡시-카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐, 2,2,2-트라이플루오로에톡시카보닐, 2-트리메틸실릴에톡시-카보닐, tert-뷰틸옥시카보닐, 벤질옥시카보닐, p-나이트로벤질옥시카보닐, 2,4-다이클로로-벤질옥시카보닐 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 예는 Cbz(카복시벤질), 노실(Nosyl)(o- 또는 p-나이트로페닐설포닐), Bpoc(2-(4-바이페닐)아이소프로폭시카보닐) 및 Dde(1-(4,4-디메틸-2,6-다이옥소헥실리덴)에틸)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "및/또는"은 "및" 또는 "또는", 또는 둘 다를 의미한다.
명사 뒤의 용어 "(들)"은 단수 형태 및 복수 형태, 또는 둘 다를 고려한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "포함하는"은 "중 적어도 일부로 이루어진"을 의미한다. 용어 "포함하는"을 포함하는 본 명세서의 각각의 기술을 해석할 때, 또한 그 용어로 말문을 연 것 또는 것들 이외의 특징이 존재할 수 있다. 관련 용어, 예컨대 "포함한다" 및 "함유한다"는 동일한 방식으로 해석되어야 한다. "함유하는"은 동일한 방식으로 또한 해석되어야 한다.
본 발명은 본원의 명세서에 언급되거나 표시된 부분, 구성요소 또는 특징으로, 개별적으로 또는 총체적으로, 상기 부분, 구성요소 또는 특징의 2개 이상의 임의의 또는 모든 조합으로, 이루어지는 것으로 또한 광범위하게 말해질 수 있고, 본 발명이 관련한 기술에서의 공지된 균등물을 가지는, 특정한 정수가 본 명세서에 언급될 때, 이러한 공지된 균등물은 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다.
본 명세서에 개시된 숫자의 범위(예를 들어, 1 내지 10)의 언급이 또한 그 범위 내의 모든 합리적인 수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 및 10) 및 또한 그 범위 내의 합리적인 수의 임의의 범위(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5, 및 3.1 내지 4.7)의 언급을 포함하고, 따라서 본 명세서에 명확히 개시된 모든 범위의 모든 하위범위가 본 명세서에 명확히 개시되는 것으로 의도된다. 이것은 구체적으로 의도되는 것의 유일한 예이고, 열거된 최저 값과 최고 값 사이의 숫자 값의 모든 가능한 조합은 유사한 방식으로 본원에 명확히 기술된 것으로 고려되어야 한다.
본 발명은 광범위하게 상기 정의된 바와 같지만, 당해 분야의 당업자는 본 발명이 이에 제한되지 않고, 본 발명은 또한 하기 설명이 예를 제공하는 실시형태를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 동반된 도면을 참조하여 기재될 것이다:
도 1은 실시예 4에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 LMP2 S1의 RP-HPLC 트레이스를 보여준다.
도 2는 실시예 4에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 LMP2 S2의 RP-HPLC 트레이스를 보여준다.
도 3은 실시예 5에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 Pam1-C(Ac)SK4-LMP2 S4의 RP-HPLC 트레이스를 보여준다.
본 발명은 아미노산 및 펩타이드 접합체, 및 펩타이드 접합체를 제조하고, 면역치료학적 치료, 특히 EBV와 연관된 병태의 면역치료학적 치료에서 펩타이드 및 펩타이드 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 접합체를 제조하는 특정한 방법은 티올-엔 반응에서 지질 함유 접합 파트너를 아미노산 함유 접합 파트너에 접합하기에 효과적인 조건 하에 지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 티올-엔 반응에서 지질 함유 접합 파트너를 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 접합하기에 효과적인 조건 하에 지질 함유 접합 파트너 및 펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함한다.
티올-엔 반응은 비방향족 탄소-탄소 이중 결합에 걸친 티올의 첨가(즉, 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화)를 포함한다. 반응은 유리 라디칼 기전을 통해 진행한다. 개시, 중합 또는 커플링 및 종료의 반응에서 3개의 명확한 단계가 존재한다. 라디칼 생성은 친전자성 티일 라디칼을 생성시키고, 이것은 엔 기에 걸쳐 전파하여, 탄소 중심화 라디칼을 형성한다. 추가의 티올 분자로부터의 사슬 전달은 이후 탄소 상의 라디칼을 켄칭하여 최종 생성물을 생성한다.
본 발명의 방법에서, 하나의 접합 파트너는 티올을 포함하고, 다른 것은 탄소 탄소 이중 결합을 포함한다.
하나 이상의 유리 라디칼은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 본 발명의 방법에서 생성될 수 있다. 유리 라디칼은 열로 및/또는 광화학적으로 생성될 수 있다. 하나 이상의 유리 라디칼 개시제는 유리 라디칼의 생성을 개시하도록 사용될 수 있다. 적합한 유리 라디칼 개시제는 열 개시제 및 광개시제를 포함한다.
유리 라디칼은 가열에 의해 열 개시제로부터 생성된다. 열 개시제의 분해 및 생성된 유리 라디칼 형성의 속도는 개시제 및 개시제가 가열되는 온도에 따라 달라진다. 온도가 더 높을수록 일반적으로 더 빠른 분해를 발생시킨다. 당해 분야의 당업자는 부당한 실험 없이 개시제를 가열하기 위한 적절한 온도를 선택할 수 있을 것이다.
수많은 열 개시제는 상업적으로 입수 가능하다. 열 개시제의 예는 tert-아밀 퍼옥시벤조에이트, 1,1'-아조비스(사이클로헥산카보나이트릴), 2,2'-아조비스아이소뷰티로나이트릴(AIBN), 벤조일 퍼옥사이드, tert-뷰틸 하이드로퍼옥사이드, tert-뷰틸 퍼아세테이트, tert-뷰틸 퍼옥사이드, tert-뷰틸 퍼옥시벤조에이트, tert-뷰틸퍼옥시 아이소프로필 카보네이트, 라우로일 퍼옥사이드, 과아세트산 및 과황산칼륨을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
유리 라디칼은 광에 의한 조사에 의해 광개시제로부터 생성될 수 있다. 광개시제의 분해 및 유리 라디칼 형성을 유도하는 데 필요한 광의 주파수는 개시제에 따라 달라진다. 많은 광개시제는 자외선에 의해 조사될 수 있다.
특정한 파장 또는 파장 범위의 광은 개시제를 선택적으로 조사하도록 사용될 수 있고, 지질 함유 접합 파트너 또는 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너는 감광성 기를 포함한다. 본 발명의 방법의 소정의 실시형태에서, 약 365㎚의 주파수를 사용한다. 이 주파수의 광은 자연 발생 아미노산의 측쇄에 일반적으로 알맞다.
광개시제의 넓은 범위는 상업적으로 입수 가능하다. 광개시제의 예는 아세토페논, 아니소인, 안트라퀴논, 안트라퀴논-2-설폰산, 벤질, 벤조인, 벤조인 에틸 에터, 벤조인 아이소뷰틸 에터, 벤조인 메틸 에터, 벤조페논, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카복실산 이무수물, 4-벤조일바이페닐, 2-벤질-2-(디메틸아미노)-4'-몰폴리노뷰티로페논, 4'-비스(다이에틸아미노)벤조페논, 4,4'-비스(디메틸아미노)벤조페논, 캄퍼퀴논, 2-클로로티오잔텐-9-온, 다이벤조수베레논, 2,2-다이에톡시아세토페논, 4,4'-다이하이드록시벤조페논, 2,2-다이메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 4-(디메틸아미노)벤조페논, 4,4'-디메틸벤질, 2,5-디메틸벤조페논, 3,4-디메틸벤조페논, 4'-에톡시아세토페논, 2-에틸안트라퀴논, 3'-하이드록시아세토페논, 4'-하이드록시아세토페논, 3-하이드록시벤조페논, 4-하이드록시벤조페논, 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논, 2-메틸벤조페논, 3-메틸벤조페논, 메틸벤조일폼에이트, 2-메틸-4'-(메틸티오)-2-몰폴리노프로피오페논, 페난트렌퀴논, 4'-페녹시아세토페논, 및 티오잔텐-9-온을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
당해 분야의 당업자는 예를 들어 지질 함유 접합 파트너, 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너, 및 반응 혼합물에 존재하는 임의의 다른 성분의 성질에 관한 방법에서 사용하기 위한 적절한 유리 라디칼 개시제를 선택할 수 있을 것이다. 몇몇 실시형태에서, 개시제는 약 20:1 내지 약 0.05:1, 약 10:1 내지 약 0.05:1, 약 5:1 내지 약 0.05:1, 약 3:1 내지 약 0.5:1의 티올을 포함하는 출발 물질에 대한 화학량론적 비율로 반응에 존재한다.
반응에서 지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같다.
지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너는 공지된 합성 화학 기법(예를 들어, 문헌[Louis F Fieser and Mary F, Reagents for Organic Synthesis v. 1-19, Wiley, New York (1967-1999 ed.) 또는 Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. Ed. Springer-Verlag Berlin](부록 포함)(Beilstein 온라인 데이터베이스를 통해 또한 이용 가능)에 일반적으로 기재된 방법)을 이용하여 제조될 수 있거나, 몇몇 실시형태에서, 상업적으로 입수 가능할 수 있다.
하기 화학식 (II)의 지질 함유 접합 파트너 화합물:
(식 중, m, R1, R2, R3, R4, R5 및 L1은 각각 독립적으로 화학식 (I)의 화합물에 대해 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같음)은 에스터화에 효과적인 조건 하에 하기 화학식 (VI)의 화합물:
Figure pct00024
(식 중, X는 OH 또는 적합한 이탈 기임)을 하기 화학식 (VII)의 화합물:
Figure pct00025
과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 에스터화를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, X가 클로로일 때, 반응은 적합한 용매 중에 염기, 예컨대 피리딘 또는 트라이에틸아민의 존재 하에 수행될 수 있다. 산 클로라이드는 더 반응성인 종으로(예를 들어, 나트륨 아이오다이드를 사용하여 상응하는 아이오다이드로) 인시츄로 전환될 수 있다. 반응이 수행되는 온도는 사용된 산 종 및 용매의 반응성에 따라 달라진다.
수많은 화학식 (VI)의 화합물은 상업적으로 입수 가능하다. 기타는 상업적으로 입수 가능한 전구체로부터 표준 합성 화학 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 화학식 (VI)의 화합물(여기서, X는 클로로임)은 적합한 용매 또는 용매의 혼합물 중에 티오닐 클로라이드에 의해 상응하는 카복실산을 처리함으로써 제조될 수 있다.
하기 화학식 (IIA)의 지질 함유 접합 파트너 화합물:
Figure pct00026
(식 중, p, R11, R22, R33, R44 및 L1은 화학식 (IA)의 화합물에 정의된 바와 같음)은 에스터화에 효과적인 조건 하에 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VI)의 화합물을 하기 화학식 (VIII)의 화합물:
Figure pct00027
(식 중, P는 적합한 보호기임)과 반응시키고, 이후 보호기를 제거함으로써 제조될 수 있다.
대안적으로, 화학식 (IIA)의 화합물은 에스터화에 효과적인 조건 하에 상기 정의된 바와 같은 화학식 (VI)의 화합물을 하기 화학식 (IX)의 화합물:
Figure pct00028
(식 중, P는 적합한 보호기임)과 반응시키고, 보호기를 제거하고, 이후 상응하는 알코올을 티올로 전환함으로써 제조될 수 있다. 알코올을 티올로 전환하기 위한 적합한 방법은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다.
상기 화합물의 제조는 다양한 화학 기의 보호 및 탈보호를 포함할 수 있다. 보호 및 탈보호의 필요, 및 적절한 보호기의 선택은 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보호 및 탈보호를 위한 보호기 및 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., Wiley & Sons, Inc., New York (1999)] 참조).
유사하게, 화학식 (VII), (VIII) 및 (IX)의 화합물은 또한 상업적으로 입수 가능하거나, 표준 합성 화학 기법을 사용하여 상업적으로 입수 가능한 전구체로부터 제조될 수 있다.
지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너, 및 반응 혼합물에 존재하는 임의의 다른 성분이 반응 용기로 도입되는 순서는 변할 수 있다. 반응은 1용기 절차로서 수행될 수 있다.
반응에서 지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너의 화학량론은 변할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 대 지질 함유 접합 파트너의 화학량론적 비율은 약 1:0.5 내지 약 1:20, 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:1 내지 약 1:5, 약 1:1 내지 약 1:3이다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너 대 지질 함유 접합 파트너의 화학량론적 비율은 약 1:0.5 내지 약 1:20, 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:1 내지 약 1:5, 약 1:1 내지 약 1:3이다.
반응은 임의의 적합한 온도에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 약 -25℃ 내지 약 200℃, 약 -10℃ 내지 약 150℃, 약 0℃ 내지 약 125℃, 약 주변 온도 내지 약 100℃의 온도에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 약 200℃ 미만, 약 175℃ 미만, 약 150℃ 미만, 약 125℃ 미만 또는 약 100℃의 온도에서 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 반응은 주변 온도 초과의 온도에서 수행된다. 일 실시형태에서, 반응은 40 내지 200℃, 50 내지 150℃, 60 내지 100℃, 65 내지 90℃, 또는 70 내지 80℃의 온도에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 40℃ 초과, 50℃ 초과, 75℃ 초과, 100℃ 초과 또는 150℃ 초과의 온도에서 수행된다.
반응이 수행되는 온도는 유리 라디칼이 반응에서 어떻게 생성되는지에 따라 달라질 수 있다. 사용된 온도는 반응의 속도를 조절하도록 선택될 수 있다. 온도는 반응의 속도를 조절하도록 반응의 과정 동안 조정될 수 있다. 반응의 속도를 조절함으로써, 원치않는 부산물(예를 들어, 텔로머화 또는 중합 생성물)의 형성을 최소화하거나 피할 수 있다.
유리 라디칼이 (예를 들어, 열 개시제를 사용하여) 열로 생성되는 경우, 반응은 일반적으로 주변 온도보다 높은 온도에서 수행될 것이다. 온도는 유리 라디칼이 생성되는 종의 반응성에 따라 달라질 것이다.
유리 라디칼이 광화학적으로 생성되는 경우, 반응은 유리하게는 주변 온도에서 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 반응의 속도를 늦추기 위해 반응 혼합물을 냉각하거나 반응의 속도를 증가시키기 위해 반대로 반응 혼합물을 가열하는 것이 바람직할 수 있다.
당해 분야의 당업자는, 사용되는 경우, 지질 함유 접합 파트너, 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너, 및 유리 라디칼 개시제의 반응성에 관한 방법을 수행하기에 적절한 온도를 선택할 수 있을 것이다.
반응이 수행되는 온도는 반응 혼합물을 가열 또는 냉각함으로써 제어될 수 있다. 반응 혼합물의 온도는 당해 분야에 공지된 적합한 방법에 의해 제어될 수 있다. 열은 예를 들어 반응 용기 내의 열 교환기를 사용하여, 반응 용기를 둘러싼 재킷을 가열함으로써, 또는 가열된 액체(예를 들어, 오일 또는 모래 욕) 중에 반응 용기를 액침함으로써 반응 혼합물에 인가될 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 반응 혼합물은 마이크로파 조사에 의해 가열된다.
반응의 진행은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 박층 크로마토그래피(TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 모니터링될 수 있다. 반응은, 출발 물질 중 적어도 하나의 소모에 의해 모니터링되는 바대로, 실질적인 완료로 진행되도록 허용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 1분 내지 7일, 5분 내지 72시간, 10분 내지 48시간, 10분 내지 24시간의 시간 기간 동안 진행되도록 허용된다. 다른 실시형태에서, 반응은 72시간 미만, 48시간 미만, 24시간 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 4시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만의 시간 기간 동안 진행되도록 허용된다.
몇몇 실시형태에서, 반응은 지질 함유 접합 파트너 또는 아미노산 함유 접합 파트너의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 99%(어느 쪽이든 화학량론적으로 적은)가 소모될 때까지 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 반응은 지질 함유 접합 파트너 또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 99%(어느 쪽이든 화학량론적으로 적은)가 소모될 때까지 수행된다. 출발 물질의 소모는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 HPLC에 의해 모니터링될 수 있다.
반응 혼합물은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 자기 또는 기계 교반기를 사용하여 혼합될 수 있다. 사용된 방법은 반응이 수행되는 규모에 따라 달라질 수 있다.
반응은 일반적으로 액체 반응 매질 중에 수행된다. 액체 반응 매질은 용매를 포함할 수 있다. 적합한 용매의 예는 디메틸폼아마이드, 다이클로로메탄, 1,2-다이클로로에탄, 클로로폼, 사염화탄소, 물, 메탄올, 에탄올, 디메틸설폭사이드, 트라이플루오로아세트산, 아세트산, 아세토나이트릴, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
용매는 용매 중의 지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너의 용해도에 기초하여 선택될 수 있다. 유리 라디칼 개시제의 용해도가 또한 관련될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 지질 함유 접합 파트너는 소수성이다. 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너의 소수화도 또는 친수화도는 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 서열에 따라 달라질 수 있다. 펩타이드 함유 접합 파트너 내의 가용화 기의 존재는 극성 용매, 예컨대 물 중의 용해도를 증가시킬 수 있다. 당해 분야의 당업자는 부당한 실험 없이 적절한 용매를 선택할 수 있을 것이다.
반응은 실질적으로 산소 비함유 조건 하에 수행될 수 있다. 산소는 반응에서 형성된 유리 라디칼을 켄칭할 수 있다. 반응 혼합물은 유리 라디칼이 생성되기 전에 임의의 용존 산소를 제거하도록 실질적으로 산소 비함유인 불활성 가스(예를 들어, 질소 또는 아르곤)에 의해 탈기될 수 있다. 대안적으로, 반응 혼합물의 개별 성분은 반응 용기에서 배합되기 전에 실질적으로 산소 비함유인 불활성 가스에 의해 탈기될 수 있다. 반응은 실질적으로 산소 비함유인 불활성 가스의 분위기 하에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 주변 압력에서 수행될 수 있다.
티올-엔 반응에서의 전파에 비해 사슬 전달의 속도가 느린 경우, 원치않는 이합체화, 텔로머화 또는 중합이 발생할 수 있다.
이합체화, 텔로머화 또는 중합을 저해하는 첨가제는 본 발명의 방법에서 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 본 발명자들은, 몇몇 실시형태에서, 반응 혼합물 내의 첨가제로서의 사슬 전달을 수월하게 하는 외인성 티올의 포함이 원치않는 부산물의 형성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 외인성 티올은, 몇몇 실시형태에서, 원하는 티올-엔 반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 적합한 외인성 티올의 예는 환원 글루타티온, DODT, DTT, 단백질 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명자들은, 몇몇 실시형태에서, DTT의 포함이 원치않는 부산물을 생성시키지 않는다는 것을 발견하였다.
소정의 실시형태에서, 외인성 티올은 입체 장애 티올이다. 적합한 입체 장애 외인성 티올의 비제한적인 예는 tert-뷰틸 머캅탄 및 1-메틸프로필 머캅탄을 포함한다.
산의 포함은 몇몇 실시형태에서 또한 이합체화, 텔로머화 또는 중합을 저해할 수 있다. 산은 강한 무기 산, 예를 들어 HCl, 또는 유기 산, 예를 들어 TFA일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 첨가제는 TFA이다.
본 발명자들은 반응 혼합물 내의 첨가제로서 tert-뷰틸 머캅탄 및 TFA 둘 다를 포함하는 몇몇 실시형태에서 올리고머의 형성을 감소시키고, 원하는 생성물로의 출발 물질의 전환을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 소정의 예시적인 실시형태에서, 반응 혼합물은 TFA 및 tert-뷰틸 머캅탄의 조합을 포함한다.
첨가제는, 상기 방법에서의 반응 또는 임의의, 선택적인, 후속 단계에 불리하게 영향을 미치지 않으면서, 원치않는 부산물의 형성을 최소화하기에 충분한 양으로 일반적으로 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 첨가제는 약 20:1 내지 약 0.05:1, 약 10:1 내지 약 0.5:1, 약 5:1 내지 약 1:1, 약 3:1 내지 약 1:1의 티올을 함유하는 출발 물질에 대한 화학량론적 비율로 반응에 존재한다.
몇몇 실시형태에서, 반응에서 사용된 지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 함유 접합 파트너 출발 물질의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만 또는 약 1중량% 미만은 이합체화, 텔로머화 또는 중합으로부터 생긴 원치않는 부산물이다. 몇몇 실시형태에서, 반응에서 사용된 지질 함유 접합 파트너 및 펩타이드 함유 접합 파트너 출발 물질의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만 또는 약 1중량% 미만은 이합체화, 텔로머화 또는 중합으로부터 생긴 원치않는 부산물이다. 반응의 생성물의 순도는 예를 들어 HPLC에 의해 결정될 수 있다.
반응 혼합물 내의 각각 지질 함유 접합 파트너 및 아미노산 포함 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너의 농도는 반응에 또한 영향을 미칠 수 있다. 당해 분야의 당업자는, 예를 들어 부당한 실험 없이 수율 및 순도를 최적화하기 위해, 반응 혼합물 내의 지질 함유 접합 파트너 및 펩타이드 함유 접합 파트너의 농도를 변화시킬 수 있을 것이다.
몇몇 실시형태에서, 티올을 포함하는 출발 물질은 약 0.05mM 내지 약 1M, 약 0.5mM 내지 약 1M, 약 1mM 내지 약 1M의 농도로 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 농도는 적어도 약 0.05mM, 0.5mM 또는 1mM이다.
몇몇 실시형태에서, 알켄을 포함하는 출발 물질의 농도는 적어도 약 0.05mM, 0.5mM 또는 1mM이다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체는 반응 후 반응 매질로부터 분리되고 임의로 정제될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 반응 후 반응 매질로부터 분리되고 임의로 정제될 수 있다. 접합체는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어 침전에 의해 반응 매질로부터 분리될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 또는 펩타이드 접합체는 반응 매질로부터 분리 후 정제된다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 반응 매질로부터 분리 후 정제된다. 구체적으로 고려되는 실시형태에서, 접합체는 하나 이상의 적합한 용매를 사용하여 HPLC에 의해 정제된다.
본 발명의 방법에서 제조된 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 합성 펩타이드를 포함할 수 있다. 합성 펩타이드는 고상 펩타이드 합성(SPPS)을 이용하여 제조될 수 있다.
고상 펩타이드 합성(SPPS)의 기본 원칙은 링커 분자를 통해 고상 지지체, 통상적으로 수지 입자에 고정된 성장하는 폴리펩타이드 사슬에 대한 아미노산의 단계별 첨가이고, 이것은 폴리펩타이드 사슬이 완료되면 절단 및 정제를 허용한다. 간단히 말하면, 고상 수지 지지체 및 출발 아미노산은 링커 분자를 통해 서로에 부착된다. 이러한 수지-링커-산 매트릭스는 상업적으로 입수 가능하다.
수지에 커플링하고자 하는 아미노산은 화학 보호기에 의해 이의 Nα-말단에서 보호된다.
아미노산은 측쇄 보호기를 또한 가질 수 있다. 이러한 보호기는 커플링하고자 하는 아미노산의 카복실기와 수지에 부착된 펩타이드 사슬의 비보호된 Nα-아미노기 사이의 새로운 펩타이드 결합을 형성하는 공정 동안 원치 않는 또는 해로운 반응이 일어나는 것을 막는다.
커플링하고자 하는 아미노산은 펩타이드 사슬의 N 말단 아미노산의 비보호된 Nα-아미노기와 반응하여, 펩타이드 사슬의 사슬 길이를 1개의 아미노산으로 증가시킨다. 커플링하고자 하는 아미노산의 카복실기는 펩타이드 사슬의 Nα-아미노기와의 반응을 수월하게 하도록 적합한 화학 활성제에 의해 활성화될 수 있다. 펩타이드 사슬의 N 말단 아미노산의 Nα-보호기는 이후 다음의 아미노산 잔기와의 커플링을 위해 제조 시 제거된다. 이 기법은 가능할 때마다 자동화가 매력적이게 만드는 많은 반복적 단계로 이루어진다. 당해 분야의 당업자는, 예를 들어 수렴 펩타이드 합성이 원해지는 경우, 펩타이드가 개별 아미노산 대신에 고상 결합된 아미노산 또는 펩타이드의 Nα-아미노기에 커플링될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
아미노산의 원하는 서열이 달성되는 경우, 펩타이드는 링커 분자에서 고상 지지체로부터 절단된다.
SPPS는 연속 흐름 방법 또는 뱃취 흐름 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 연속 흐름은 분광광도계를 통한 반응 진행의 실시간 모니터링을 허용하지만, 수지 상의 펩타이드와 접촉한 시약이 희석된다는 것, 및 규모가 고상 수지의 물리적 크기 구속으로 인해 더 제한된다는 것의 2개의 명확한 단점을 가진다. 뱃취 흐름은 필터 반응 용기에서 발생하고, 반응물질이 접근 가능하고 수동으로 또는 자동으로 첨가될 수 있으므로 유용하다.
보호기의 유형은 N-알파-아미노 말단: "Boc"(tert-뷰틸옥시카보닐) 및 "Fmoc"(9-플루오레닐메틸옥시카보닐)을 보호하기 위해 흔히 사용된다. Boc 방법을 위한 시약은 비교적 저렴하지만, 이것은 매우 부식성이고, 고가의 장비를 요하고, 더 엄격한 주의가 취해진다. 덜 부식성이지만 매우 고가인 시약을 사용하는 Fmoc 방법이 통상적으로 바람직하다.
SPPS의 경우, 매우 다양한 고체 지지체 상이 구입 가능하다. 합성에 사용된 고상 지지체는 합성 목적에 적합한 합성 수지, 합성 중합체 필름 또는 실리콘 또는 실리케이트 표면(예를 들어, 제어 기공 유리)일 수 있다. 일반적으로, 수지, 흔히 폴리스타이렌 현탁액, 또는 폴리스타이렌-폴리에틸렌글라이콜, 또는 중합체 지지체, 예를 들어 폴리아마이드가 사용된다. Boc-화학물질에 적합한 링커에 의해 작용기화된 수지의 예는 PAM 수지, 옥심 수지 SS, 페놀 수지, 브롬화 Wang 수지 및 브롬화 PPOA 수지를 포함한다. Fmoc 화학에 적합한 수지의 예는 AMPB-BHA 수지, Sieber 아마이드 수지, Rink 산 수지, Tentagel S AC 수지, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지, 2-클로로트리틸 알코올 수지, TentaGel S Trt-OH 수지, Knorr-2-클로로트리틸 수지, 하이드라진-2-클로로트리틸 수지, ANP 수지, Fmoc 광불안정 수지, HMBA-MBHA 수지, TentaGel S HMB 수지, 방향족 안전성 Catch 수지, BAl 수지 및 Fmoc-하이드록실아민 2 클로로트리틸 수지를 포함한다. 다른 수지는 PL Cl-Trt 수지, PL-옥심 수지 및 PL-HMBA 수지를 포함한다.
각각의 수지에 대해, 적절한 커플링 조건은 출발 단량체 또는 하위단위의 부착에 대해 문헌에 공지되어 있다.
고상 지지체의 제조는 적절한 용매(예를 들어, 디메틸폼아마이드) 중에 지지체를 용매화하는 것을 포함한다. 고상은 통상적으로 용매화 동안 용적을 증가시키고, 이것은 결국 펩타이드 합성을 수행하기에 이용 가능한 표면적을 증가시킨다.
링커 분자는 이후 펩타이드 사슬을 고상 지지체에 연결하기 위한 지지체에 부착된다. 링커 분자는 최후의 절단이 C 말단에서 유리 산 또는 아마이드를 제공하도록 일반적으로 설계된다. 링커는 일반적으로 수지 특이적이 아니다. 링커의 예는 펩타이드 산, 예를 들어 4-하이드록시메틸페녹시아세틸-4'-메틸벤지하이드릴아민(HMP), 또는 펩타이드 아마이드, 예를 들어 벤즈하이드릴아민 유도체를 포함한다.
펩타이드 서열의 제1 아미노산은 링커가 고상 지지체에 부착된 후 링커에 부착되거나, 펩타이드 서열의 제1 아미노산을 포함하는 링커를 사용하여 고상 지지체에 부착될 수 있다. 아미노산을 포함하는 링커는 상업적으로 입수 가능하다.
다음의 단계는 제1 아미노산의 Nα-아미노기를 탈보호하는 것이다. Fmoc SPPS의 경우, Nα-아미노기의 탈보호는 온화한 염기 처리(예를 들어, 피페라진 또는 피페리딘)에 의해 수행될 수 있다. 측쇄 보호기는 보통의 산분해(예를 들어, 트라이플루오로아세트산(TFA))에 의해 제거될 수 있다. Boc SPPS의 경우, Nα-아미노기의 탈보호는 예를 들어 TFA를 사용하여 수행될 수 있다.
탈보호 후, 아미노산 사슬 연장 또는 커플링은 펩타이드 결합의 형성에 의해 진행한다. 이 공정은 커플링하고자 하는 아미노산의 C-α-카복실기의 활성화를 요한다. 이것은 예를 들어 인시츄 시약, 미리 형성된 대칭 언하이드라이드, 활성 에스터, 산 할라이드 또는 유레탄 보호된 N-카복시언하이드라이드를 사용하여 달성될 수 있다. 인시츄 방법은 공존하는 활성화 및 커플링을 허용한다. 커플링 시약은 카보다이이미드 유도체, 예를 들어 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드 또는 N,N-다이아이소프로필카보다이이미드를 포함한다. 커플링 시약은 또한 벤조트라이아졸의 우로늄 또는 포스포늄염 유도체를 포함한다. 이러한 우로늄 및 포스포늄염의 예는 HBTU(O-1H-벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), BOP(벤조트라이아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBOP(벤조트라이아졸-1-일-옥시-트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, HCTU(O-(1H-6-클로로-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TCTU(O-1H-6-클로로벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HATU(O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TATU(O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), TOTU(O-[사이아노(에톡시카보닐)메틸렌아미노]-N,N,N',N"-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트) 및 HAPyU(O-(벤조트라이아졸-1-일)옥시비스-(피롤리디노)-우로늄 헥사플루오로포스페이트를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 커플링 시약은 HBTU, HATU, BOP 또는 PyBOP이다.
원하는 아미노산 서열이 합성된 후, 펩타이드는 수지로부터 절단된다. 이 공정에 사용된 조건은 측쇄 보호기 및 펩타이드의 아미노산 조성의 민감도에 따라 달라진다. 일반적으로, 절단은 보호기 및 링커로부터 생긴 반응성 카보늄 이온을 켄칭하도록 복수의 소거제를 함유하는 환경에서 수행된다. 흔한 절단제는 예를 들어 TFA 및 불화수소(HF)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드가 링커를 통해 고상 지지체에 결합된 경우, 펩타이드 사슬은 링커로부터 펩타이드를 절단함으로써 고상 지지체로부터 절단된다.
수지로부터 펩타이드를 절단하기 위해 사용된 조건은 하나 이상의 측쇄 보호기를 부수적으로 제거할 수 있다.
SPPS 내의 보호기의 사용은 잘 확립되어 있다. 흔한 보호기의 예는 아세트아미도메틸(Acm), 아세틸(Ac), 아다만틸옥시(AdaO), 벤조일(Bz), 벤질(Bzl), 2-브로모벤질, 벤질옥시(BzlO), 벤질옥시카보닐(Z), 벤질옥시메틸(Bom), 2-브로모벤질옥시카보닐(2-Br-Z), tert-뷰톡시(tBuO), tert-뷰톡시카보닐(Boc), tert-뷰톡시메틸(Bum), tert-뷰틸(tBu), tert-뷰틸티오(tBu티오), 2-클로로벤질옥시카보닐(2-Cl-Z), 사이클로헥실옥시(cHxO), 2,6-다이클로로벤질(2,6-다이Cl-Bzl), 4,4'-다이메톡시벤즈하이드릴(Mbh), 1-(4,4-디메틸-2,6-다이옥소-사이클로헥실리덴)3-메틸-뷰틸(ivDde), 4-{N-[1-(4,4-디메틸-2,6-다이옥소-사이클로헥실리덴)3-메틸뷰틸]-아미노) 벤질옥시(ODmab), 2,4-다이나이트로페닐(Dnp), 플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 폼일(For), 메시틸렌-2-설포닐(Mts), 4-메톡시벤질(MeOBzl), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸-벤젠설포닐(Mtr), 4-메톡시트리틸(Mmt), 4-메틸벤질(MeBzl), 4-메틸트리틸(Mtt), 3-나이트로-2-피리딘설페닐(Npys), 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조퓨란-5-설포닐(Pbf), 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-설포닐(Pmc), 토실(Tos), 트라이플루오로아세틸(Tfa), 트리메틸아세트아미도메틸(Tacm), 트리틸(Trt) 및 잔틸(Xan)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
펩타이드의 아미노산의 하나 이상의 측쇄가 작용기, 예컨대 추가의 카복실릭, 아미노, 하이드록시 또는 티올 기 등을 함유하는 경우, 추가의 보호기가 필요할 수 있다. 예를 들어, 전략이 이용되는 경우, Mtr, Pmc, Pbf는 Arg의 보호에 사용될 수 있고; Trt, Tmob는 Asn 및 Gln의 보호에 사용될 수 있고; Boc는 Trp 및 Lys의 보호에 사용될 수 있고; tBu는 Asp, Glu, Ser, Thr 및 Tyr의 보호에 사용될 수 있고; Acm, tBu, tBu티오, Trt 및 Mmt는 Cys의 보호에 사용될 수 있다. 당해 분야의 당업자는 수많은 다른 적합한 조합이 존재한다는 것을 이해할 것이다.
상기 기재된 SPPS에 대한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Atherton and Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach," New York: IRL Press, 1989; Stewart and Young: "Solid-Phase Peptide Synthesis 2nd Ed.," Rockford, Illinois: Pierce Chemical Co., 1984; Jones, "The Chemical Synthesis of Peptides," Oxford: Clarendon Press, 1994; Merrifield, J. Am. Soc . 85:2146-2149 (1963); Marglin, A. and Merrifield, R.B. Annu . Rev. Biochem . 39:841-66 (1970); and Merrifield R.B. JAMA. 210(7):1247-54 (1969); 및 "Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach" (W.C. Chan and P.D. White, eds. Oxford University Press, 2000)]을 참조한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 자동화 합성에 대한 장비는 공급처, 예컨대 Perkin Elmer/Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터 시티)로부터 용이하게 상업적으로 입수 가능하고, 제조사의 지시에 따라 조작될 수 있다.
수지로부터의 절단 후, 펩타이드는 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 반응 매질로부터 분리될 수 있다. 펩타이드는 하나 이상의 적합한 용매를 사용하여 예를 들어 HPLC에 의해 이후 후속하여 정제될 수 있다.
유리하게는, 본 발명자들은 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너가 수지로부터의 펩타이드의 절단 후 정제 없이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 본 발명의 방법이 펩타이드 함유 접합 파트너를 사용하여 수행될 수 있다는 것을 유리하게 또한 발견하였고, 펩타이드는 Nα-아미노기 보호기 또는 임의의 측쇄 보호기를 함유하지 않는다. 반응은 일반적으로 티올 및 비방향족 탄소-탄소 이중 결합의 반응에 선택적이다.
본 발명의 방법에서 원치않는 경쟁 반응을 막기 위해 보호기에 의해 펩타이드 함유 접합 파트너(예를 들어, 펩타이드의 시스테인 잔기)에 존재하는 티올기를 보호하는 것이 필요할 수 있다. 티올기는 펩타이드에 존재하는 하나 이상의 다른 보호기를 제거하기 위해 또는 수지로부터 펩타이드를 절단하기 위해 사용되는 조건 하에 제거 가능하지 않은 보호기에 의해 보호될 수 있다. 통상적으로, 펩타이드는 적절한 보호기를 보유하는 아미노산을 사용하여 합성될 것이다. 당해 분야의 당업자는 부당한 실험 없이 적절한 보호기를 선택할 수 있을 것이다.
소정의 실시형태에서, 아미노산 함유 접합 파트너 및 지질 함유 접합 파트너는 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합 이외에 하나 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너 및 지질 함유 접합 파트너는 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합 이외에 하나 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 포함한다. 당해 분야의 당업자는 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합에 대한 티올의 선택도가 이러한 실시형태에서 하나 이상의 불포화 탄소-탄소 결합에 비해 예를 들어 탄소-탄소 이중 결합의 입체 및/또는 전자 환경에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 소정의 실시형태에서, 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합은 아미노산 함유 접합 파트너 및 지질 함유 접합 파트너 내의 임의의 다른 불포화 탄소-탄소 결합에 비해 활성화된다. 소정의 실시형태에서, 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합은 펩타이드 함유 접합 파트너 및 지질 함유 접합 파트너 내의 임의의 다른 불포화 탄소-탄소 결합에 비해 활성화된다.
몇몇 실시형태에서, 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산의 Nα-아미노기는 아실화, 예를 들어 아세틸화된다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산의 Nα-아미노기를 아실화, 예를 들어 아세틸화하는 단계를 포함할 수 있다.
펩타이드 함유 접합 파트너가 SPPS에 의해 합성될 때, 아실화는 수지로부터의 절단 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 반응시키고자 하는 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 보유하는 펩타이드 함유 접합 파트너의 아미노산 잔기는 N 말단 아미노산 잔기이고, 상기 방법은 펩타이드의 절단 전에 N 말단 아미노기의 아실화를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 지질 함유 접합 파트너가 접합된, 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산 잔기의 Nα-아미노기의 아실화를 추가로 포함한다.
아미노산의 Nα-아미노기의 아실화는 적합한 용매, 예를 들어 DMF 중에 염기의 존재 하에 아미노산 또는 펩타이드와 아실화를 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 아실화의 비제한적인 예는 산 할라이드, 예를 들어 산 클로라이드, 예컨대 아세틸 클로라이드, 및 산 무수물, 예를 들어 아세트산 무수물을 포함한다. 이러한 물질은 상업적으로 입수 가능하거나, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합한 염기의 비제한적인 예는 트라이에틸아민, 다이아이소프로필에틸아민, 4-메틸몰폴린 등을 포함한다.
다른 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 합성은, Nα-아미노기에서 아실화되고, 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 펩타이드와 반응되는, 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는, 아미노산 또는 아미노산을 포함하는 펩타이드의 커플링을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 펩타이드 접합체를 제공하도록, 아미노산 또는 펩타이드에 대한 아미노산 접합체의 아미노산의 커플링을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, SPPS에 의해 고상 수지 지지체에 결합된, 아미노산 또는 펩타이드에 대한 아미노산 접합체의 아미노산의 커플링을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, SPPS에 의해 고상 수지 지지체에 결합된, 펩타이드에 대한 아미노산 접합체의 아미노산의 커플링을 포함한다. 상기 방법은, SPPS에 의해 고상 수지 지지체에 결합된, 펩타이드의 합성을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하도록, 하나 이상의 아미노산 또는 펩타이드에 대한 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 아미노산의 커플링을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 커플링하고자 하는 펩타이드는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프는 커플링 시 형성된다. 커플링은 본 명세서에 기재된 바대로 SPPS에 의해 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하도록, SPPS에 의해 고상 수지 지지체에 결합된, 펩타이드에 대한 아미노산 접합체의 아미노산의 커플링을 포함한다.
일 실시형태에서, 커플링하고자 하는 펩타이드 접합체의 펩타이드는 고상 수지 지지체에 결합되고, 상기 방법은, 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하도록, 아미노산 또는 펩타이드에 커플링되는, 펩타이드 접합체의 아미노산의 커플링을 포함한다.
대안적인 실시형태에서, 상기 방법은, 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하도록, SPPS에 의해 고상 수지 지지체에 결합된, 아미노산 또는 펩타이드에 대한 펩타이드 접합체의 아미노산의 커플링을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 아미노산 접합체 또는 펩타이드 접합체에 대한 에피토프, 예를 들어 펩타이드 에피토프의 커플링을 추가로 포함한다. 상기 방법이, 펩타이드 에피토프의 커플링을 포함할 때, 커플링은 본 명세서에 기재된 바대로 SPPS에 의해 수행될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 에피토프, 예를 들어 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프는 링커기를 통해 커플링되거나 결합된다. 소정의 실시형태에서, 링커기는 아미노 서열, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 인접한 아미노산의 서열이다. 소정의 실시형태에서, 링커는 약 2개 내지 20개, 2개 내지 18개, 2개 내지 16개, 2개 내지 14개, 2개 내지 12개, 2개 내지 10개, 4개 내지 20개, 4개 내지 18개, 4개 내지 16개, 4개 내지 14개, 4개 내지 12개, 또는 4개 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 또 다른 아미노산 또는 펩타이드에 대한 아미노산 또는 펩타이드의 커플링이, 하나의 커플링 파트너의 아미노산 또는 펩타이드의 아미노산의 Nα-말단과 다른 커플링 파트너의 아미노산 또는 펩타이드의 아미노산의 C 말단 사이의 펩타이드 결합의 형성을 포함할 수 있는 것으로 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SPPS에 의한 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 서열의 합성; 및 지질 함유 접합 파트너와 펩타이드 함유 접합 파트너의 반응을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, SPPS에 의한 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 서열의 합성은, 펩타이드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 제공하도록, 고상 수지 지지체에 결합된, 아미노산 또는 펩타이드에 아미노산 또는 펩타이드를 커플링하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 전체 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드의 아미노산 서열은 SPPS에 의해 합성된다.
펩타이드 함유 접합 파트너는, 고상 수지 지지체에 결합된, 지질 함유 접합 파트너와 반응할 수 있다. 대안적으로, 펩타이드는 지질 함유 접합 파트너와의 반응 전에 고상 수지 지지체로부터 절단되고, 임의로 정제될 수 있다.
펩타이드 접합체 및/또는 아미노산 함유 접합 파트너, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너는 하나 이상의 가용화 기를 포함할 수 있다. 하나 이상의 가용화 기는 극성 용매, 예컨대 물 중의 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너의 용해도를 증가시킨다. 예시적인 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 접합체의 생물학적 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다.
가용화 기의 존재는 약제학적 조성물로서의 펩타이드 접합체의 제조 및/또는 투여에 유리할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체의 펩타이드 및/또는 펩타이드 함유 파트너의 펩타이드는 가용화 기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 파트너의 펩타이드는 가용화 기를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내의 아미노산의 측쇄에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬의 C 또는 N 말단에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내의 2개의 아미노산 잔기 사이에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내의 1개의 아미노산 잔기의 Nα-아미노기 및 펩타이드 사슬 내의 또 다른 아미노산 잔기의 카복실기에 결합된다.
적합한 가용화 기의 예는 친수성 아미노산 서열 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 친수성 아미노산 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 가용화 기는 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 연속적 친수성 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 아미노산 서열이다. 이러한 가용화 기는 SPPS에 의해 펩타이드 사슬에 가용화 기의 각각의 아미노산을 첨가함으로써 형성될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 가용화 기는 폴리에틸렌 글라이콜이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리에틸렌 글라이콜은 펩타이드 사슬 내의 1개의 아미노산 잔기의 Nα-아미노기 및 펩타이드 사슬 내의 또 다른 아미노산 잔기의 카복실기에 결합된다.
몇몇 실시형태에서, 폴리에틸렌 글라이콜은 약 1개 내지 약 100개, 약 1개 내지 약 50개, 약 1개 내지 약 25개, 약 1개 내지 약 20개, 약 1개 내지 약 15개, 약 1개 내지 약 10개, 약 2개 내지 약 10개, 또는 약 2개 내지 약 4개의 에틸렌 글라이콜 단량체 단위를 포함한다. 펩타이드에 폴리에틸렌 글라이콜을 커플링하는 방법이 공지되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 항원, 예를 들어 항원성 펩타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 접합체의 펩타이드 또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 항원이거나 이를 포함하거나; 항원은 임의로 링커를 통해 펩타이드에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 항원, 예를 들어 항원성 펩타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 항원이거나 이를 포함하거나; 항원은 임의로 링커를 통해 펩타이드에 결합된다.
일 실시형태에서, 항원은 에피토프를 포함하는 펩타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 에피토프를 포함하는 펩타이드는 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드이다. 일 실시형태에서, 항원은 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 에피토프를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 2개 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하고, 예를 들어 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 2개 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드이거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 글라이코펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 펩타이드 함유 접합 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드이거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 글라이코펩타이드이다. 또 다른 예에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 단백질분해 절단 부위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 단백질분해 절단 부위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 단백질분해 절단 부위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 단백질분해 절단 부위를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 하나 이상의 링커기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는 하나 이상의 링커기를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 링커기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 링커기를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너는 링커기를 통해 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된 에피토프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 링커기를 통해 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드에 결합된 에피토프를 포함한다.
링커기의 예는 아미노산 서열(예를 들어, 펩타이드), 폴리에틸렌 글라이콜, 알킬 아미노산 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 단백질분해 절단 부위이거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 링커는 가용화 기이거나 이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 링커는 펩타이드 사슬 내의 2개의 아미노산 잔기 사이에 결합된다.
몇몇 실시형태에서, 링커기는 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너 내의 1개의 아미노산 잔기의 Nα-아미노기 및 펩타이드 함유 접합 파트너 내의 또 다른 아미노산 잔기의 카복실기에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 링커기는 펩타이드 함유 접합 파트너 내의 1개의 아미노산 잔기의 Nα-아미노기 및 펩타이드 함유 접합 파트너 내의 또 다른 아미노산 잔기의 카복실기에 결합된다.
소정의 실시형태에서, 링커기는 이것이 결합된 아미노산으로부터 생체내 절단 가능하다. 소정의 실시형태에서, 링커기는 생체내 가수분해에 의해 절단 가능하다. 소정의 실시형태에서, 링커기는 생체내 효소 가수분해에 의해 절단 가능하다. 링커기는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 도입될 수 있다.
상기 방법은 에피토프를 아미노산 접합체의 아미노산 또는 펩타이드 접합체의 펩타이드에 커플링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 에피토프는 상기 기재된 바대로 링커기를 통해 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 에피토프는 펩타이드 에피토프이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 에피토프를 포함하는 글라이코펩타이드를 커플링하는 단계를 포함한다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 접합체는 항원 제시 세포에 의한 적절한 흡수, 가공 및 제시를 유지시키는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 지질 함유 접합체는 항원 제시 세포에 의해 접합체에 존재하는 임의의 항원성 펩타이드의 제시를 방해하지 않는다. 본 명세서에 제시된 예는 본 발명의 접합체가 비접합된 관련 펩타이드와 동등하게 항원 제시 세포에 의해 제시된다는 것을 확립한다.
합성된 펩타이드의 정체성의 확인은 예를 들어 아미노산 분석, 질량 분광법, Edman 분해 등에 의해 편리하게 달성될 수 있다.
본 발명의 방법은 액체 반응 매질로부터 아미노산 접합체를 분리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 액체 반응 매질로부터 펩타이드 접합체를 분리시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 분리 방법, 예를 들어 침전 및 여과를 이용할 수 있다. 접합체는 하나 이상의 적합한 용매를 사용하여 예를 들어 HPLC에 의해 후속하여 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 아미노산 접합체 및 펩타이드 접합체에 관한 것이다. 접합체는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 아미노산 접합체인 화학식 (V)의 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 펩타이드 접합체인 화학식 (V)의 화합물에 관한 것이다.
펩타이드 접합체는 순수하거나 정제되거나 실질적으로 순수할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로 "정제된"은 절대 순도를 요하지 않고; 오히려, 이것은 해당 재료가 이것이 이전에 있은 환경에서보다 더 순수한 상대 용어로서 의도된다. 실제로, 재료는 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 예를 들어 분별화로 통상적으로 처리되고, 생성된 재료는 실질적으로 이의 원하는 생물학적 활성 또는 활성들이 보유된다. 용어 "실질적으로 정제된"은 이것이 제조 동안 연관될 수 있는 다른 성분으로부터 적어도 약 60% 비함유, 바람직하게는 적어도 약 75% 비함유, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 비함유, 적어도 약 95% 비함유, 적어도 약 98% 비함유인 재료를 의미한다.
용어 "α-아미노산" 또는 "아미노산"은 α-탄소라 칭하는 탄소에 결합된 아미노기 및 카복실기 둘 다를 함유하는 분자를 의미한다. 적합한 아미노산은, 제한 없이, 천연 발생 아미노산, 및 유기 합성 또는 다른 대사 경로에 의해 제조된 천연 비발생 아미노산의 D- 및 L-이성질체 둘 다를 포함한다. 문맥이 달리 표시하지 않은 한, 용어 아미노산은, 본 명세서에 사용된 바대로, 아미노산 유사체를 포함하도록 의도된다.
소정의 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너는 오직 천연 아미노산을 포함한다. 용어 "자연 발생 아미노산"은 자연에서 합성된 펩타이드에서 흔히 발견되는 임의의 1개 내지 20개의 아미노산을 의미하고, 1 철자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 알려져있다.
용어 "아미노산 유사체" 또는 "비자연 발생 아미노산"은 아미노산과 구조적으로 유사하고 아미노산에 치환될 수 있는 분자를 의미한다. 아미노산 유사체는, 제한 없이, 아미노기와 카복실기(예를 들어, a-아미노 β-카복시 산) 사이의 하나 이상의 추가의 메틸렌기의 포함, 또는 유사하게 반응성 기에 의한 아미노 또는 카복시기의 치환(예를 들어, 2차 또는 3차 아민에 의한 1차 아민의 치환 또는 에스터에 의한 카복시기의 치환)을 제외하고, 본 명세서에 정의된 바대로 아미노산과 구조적으로 동일한 화합물을 포함한다.
달리 표시되지 않은 한, 당해 분야의 기술 내인, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기법은 본 명세서에 기재된 방법의 실행에서 사용될 수 있다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (David Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow et al., eds., 1987); 및 Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)]에 완전히 설명되어 있다.
용어 "펩타이드" 등은 임의의 길이의 아미노산 잔기의 임의의 중합체를 의미하도록 본 명세서에 사용된다. 중합체는 선형 또는 비선형(예를 들어, 분지형)일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 상기 용어는 천연으로 또는 중재, 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글라이코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 변형 또는 조작, 예를 들어 표지 또는 바이오활성 성분에 의한 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 소정의 펩타이드 접합체가 면역학적 활성을 가진다는 것을 발견하였다.
세포 매개 면역력은 T 림프구에 의해 주로 매개된다. 병원균성 항원은 주요 조직적합성 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시 세포(예컨대, 마크로파지, B-림프구 및 수지상 세포)의 표면에서 발현된다. MHC 클래스 II에 커플링된 병원균성 항원의 제시는 헬퍼(CD4+) T 세포 반응을 활성화한다. 항원-MHC II 복합체에 대한 T 세포의 결합 시, CD4+ T 세포는 사이토카인을 방출하고 증식한다.
MHC 클래스 I 분자에 결합된 병원균성 항원의 제시는 세포독성(CD8+) T 세포 반응을 활성화한다. 항원-MHC I 복합체에 대한 T 세포의 결합 시, CD8+ 세포는 퍼포린 및 다른 중재물질을 분비하여서, 표적 세포 사멸을 발생시킨다. 어떠한 이론에 구속됨이 없이, 출원인은 소정의 실시형태에서 CD8+ 세포에 의해 증대된 반응이 CD4+ 세포가 인식하는 하나 이상의 에피토프의 존재 하에 달성된다고 여겨진다.
대상체에서 세포 매개 반응의 발생 또는 진행을 평가하고 모니터링하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 편리한 예시적인 방법은 세포 매개 반응과 연관된 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 본 명세서에서 확인된 것의 존재 또는 수준이 평가되는 것을 포함한다. 유사하게, 세포 매개 반응의 발생 및 진행을 평가하거나 모니터링하기 위한 세포 기반 방법은 본 발명에서의 사용에 처리 가능하고, 면역 세포, 예컨대 T 림프구의 하나 이상의 집단의 활성화 또는 증식을 확인하는 데에 표적화된 검정을 포함하는 세포 증식 또는 활성화 검정을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 매개 면역 반응 및 체액 반응 둘 다를 유발한다.
체액 면역 반응은 B 세포에 의해 생성된 분비된 항체에 의해 매개된다. 분비된 항체는 침입 병원균의 표면에 제시된 항원에 결합하여, 파괴에 대해 이것을 쇠약하게 한다.
다시, 체액 반응의 발생 또는 진행을 평가하고 모니터링하기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이것은 항체 결합 검정, ELISA, 피부 단자 시험 등을 포함한다.
이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 본 발명자들은 펩타이드 접합체가 몇몇 실시형태에서 톨 유사 수용체(TLR)를 자극한다고 믿는다.
톨 유사 수용체(TLR)는 병원균 연관 분자 패턴을 인식하고 위험 신호를 세포에 전송하는 매우 보존된 패턴 인식 수용체(PRR)이다(Kawai, T., Akira, S., Immunity 2011, 34, 637-650). TLR2는 수지상 세포, 마크로파지 및 림프구를 포함하는 일련의 상이한 세포 유형에서 발현된 세포-표면 수용체이다(Coffman, R. L, Sher, A., Seder, R. A., Immunity 2010, 33, 492-503).
TLR2는 리포폴리사카라이드, 펩티도글라이칸 및 리포테이코산을 포함하는 광범위한 미생물 성분을 인식한다. 이것은 TLR1 또는 TLR6과 헤테로이합체를 형성한다는 점에서 TLR 중에서 독특하고; 다른 PRR과 복합체를 형성하는 능력은 TLR2에 대한 광범위한 작용제를 설명할 수 있다(Feldmann, M., Steinman, L., Nature 2005, 435, 612-619). 리간드 결합 및 헤테로이합체화 시, 신호전달은 MyD88 경로를 통해 발생하여서, NFκB 활성화 및 결과적인 염증성 및 이팩터 사이토카인의 생성을 발생시킨다.
박테리아 세포벽 성분으로부터 유래한 다이- 및 트라이아실화 리포펩타이드는 TLR2 작용제로서 광범위하게 연구되었다(Eriksson, E. M. Y., Jackson, D. C, Curr . Prot . and Pept . Sci . 2007, 8, 412-417). 리포펩타이드는 수지상 세포 성숙을 촉진하여서, 세포 표면 상의 동시자극 분자의 상향조절 및 증대된 항원 제시를 발생시키는 것으로 보고되었다. 리포펩타이드는 마크로파지를 자극하여 사이토카인을 방출하고 B 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 림프구의 활성화를 촉진하는 것으로 또한 보고되었다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 TLR2 작용제 활성을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 Pam3CSK4와 필적하는 TLR2 작용제 활성을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 Pam3CSK4의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%의 TLR2 작용제 활성을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 조절된 면역 반응이 바람직한 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 Pam3CSK4보다 낮은 TLR2 작용제 활성을 가진다. 예를 들어, 펩타이드 접합체는 Pam3CSK4의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 또는 약 10% 미만의 TLR2 작용제 활성을 가진다.
몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체 및/또는 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는, 지질 함유 접합 파트너가 펩타이드에 접합된, 아미노산에 인접한 세린 아미노산 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 함유 접합 파트너의 펩타이드는, 지질 함유 접합 파트너가 펩타이드에 접합된, 아미노산에 인접한 세린 아미노산 잔기를 포함한다. 이 부분에서의 세린 아미노산 잔기의 존재는 TLR2 결합을 증대시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세린 아미노산 잔기는, 지질 함유 접합 파트너가 펩타이드에 접합된, 아미노산의 C 말단에 결합된다.
본 개시내용을 읽을 시 당해 분야의 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 펩타이드 접합체는 예를 들어 2개 이상의 에피토프를 포함하는 에피토프를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 에피토프는 펩타이드 에피토프이다. 당해 분야의 당업자는 넓은 범위의 펩타이드 에피토프가 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
항원
다양한 병원균성 유기체로부터의 매우 많은 항원, 예를 들어 종양 항원 또는 항원이 규명되었고, 본 명세서에 구체적으로 언급된 EBV LMP2 에피토프 및 펩타이드를 포함하는 예를 들어 조성물, 백신 및 접합체와 조합되어 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 이해될 것이다. 면역 반응을 유발할 수 있는 모든 항원은, 현재 규명되든 아니든, 고려된다.
본 발명의 펩타이드 및 접합체는, 예를 들어 골수 이식 또는 조혈 줄기 세포 이식을 받은 환자에서, 광범위한 면역치료, 예컨대 EBV와 연관된 병태 또는 질환의 치료 및 예방(이것으로 제한되지는 않음), 예컨대 암 및 신생물 병태, 예컨대 호지킨 질환, 비호지킨 림프종, 림프종, 및 림프상피종, 에컨대 NPC의 치료 및 예방, 및 면역억제 동안에 또는 후에 바이러스 재활성화의 치료(이것으로 제한되지는 않음)에서 용도가 발견된다.
하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 항원, 특히 EBV LMP2 펩타이드 항원이 또한 고려된다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 또는 유도체화된 측쇄를 가지는 또 다른 잔기에 의해 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 예를 들어 당해 분야에 정의되어 있다. 이 패밀리는 예를 들어 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가지는 아미노산을 포함한다. 아미노산 유사체(예를 들어, 인산화 또는 글라이코실화 아미노산)는, 비자연 발생 아미노산, 예컨대 N-알킬화 아미노산(예를 들어, N-메틸 아미노산), D-아미노산, β-아미노산 및 γ-아미노산(이들로 제한되지는 않음)에 의해 치환된 펩타이드처럼, 본 발명에 또한 고려된다.
항원의 단편 및 변이체는 또한 구체적으로 고려된다.
펩타이드의 "단편"은 효소 또는 결합 활성에 필요한 기능을 수행하고/하거나, 펩타이드의 3차원 구조, 예컨대 폴리펩타이드의 3차원 구조를 제공하는 펩타이드의 하위서열이다.
용어 "변이체"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 예를 들어 구체적으로 확인된 서열과 다른 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 서열을 의미하고, 하나 이상의 아미노산 잔기는 결실되거나 치환되거나 부가된다. 변이체는 천연 발생 변이체, 또는 천연 비발생 변이체이다. 변이체는 동일한 또는 다른 종 유래이고, 동족체, 파라로그 및 오쏘로그를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드를 포함하는 펩타이드의 변이체는 야생형 펩타이드와 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 보유한다. 펩타이드와 관련된 용어 "변이체"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 펩타이드의 모든 형태를 포함한다.
당해 분야의 당업자는 본 발명의 접합체가 소정의 실시형태에서 예를 들어 암을 포함하는 신생물 질환의 치료에서 T 세포 반응을 자극하는 데 특히 적합하다는 것을 이해할 것이다. 하나 이상의 종양 항원을 포함하는 본 발명의 접합체, 조성물 및 백신이 고려된다. 본 발명의 조성물, 백신, 및/또는 펩타이드 접합체의 제조에서 사용에 고려되는 종양 항원이 일반적으로 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는, 본 발명의 소정의 실시형태에서, 종양 항원을 포함하는 하나 이상의 추가의 종양 항원이 존재할 수 있고, 여기서 하나 이상의 종양 항원은 펩타이드를 포함하지 않는다. 종양 항원은 통상적으로 독특한 항원, 또는 공유된 항원으로 분류되고, 후자 그룹은 분화 항원, 암 특이적 항원 및 과발현된 항원을 포함한다. 항원의 각각의 종류의 예는 본 발명에서의 사용에 처리 가능하다. 치료, 예를 들어 면역치료학적 치료, 또는 암을 포함하는 신생물 질환에 대한 백신접종에서 사용하기 위한 대표적인 종양 항원은 하기 기재되어 있다. 면역화의 방법을 이용하여 제조된 하나 이상의 항원을 포함하는 화합물, 백신 및 조성물은 구체적으로 고려된다.
소정의 실시형태에서, 종양 항원은 펩타이드 함유 종양 항원, 예컨대 폴리펩타이드 종양 항원 또는 당단백질 종양 항원이다. 소정의 실시형태에서, 종양 항원은 사카라이드 함유 종양 항원, 예컨대 글라이코지질 종양 항원 또는 강글리오사이드 종양 항원이다. 소정의 실시형태에서, 종양 항원은, 폴리펩타이드 함유 종양 항원, 예를 들어 RNA 벡터 작제물 또는 DNA 벡터 작제물, 예컨대 플라스미드 DNA를 발현하는, 폴리뉴클레오타이드 함유 종양 항원이다.
본 발명에서의 사용에 적절한 종양 항원은 매우 다양한 분자, 예컨대 (a) 펩타이드 함유 종양 항원, 예컨대 펩타이드 에피토프(예를 들어, 8개 내지 20개의 아미노산 길이의 범위일 수 있지만, 이 범위 밖의 길이가 또한 흔함), 리포폴리펩타이드 및 당단백질, (b) 사카라이드 함유 종양 항원, 예컨대 폴리사카라이드, 뮤신, 강글리오사이드, 글라이코지질 및 당단백질, 및 (c) 항원성 폴리펩타이드를 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다시, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 접합체 또는 조성물에 존재하는 종양 항원이 통상적으로 펩타이드를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 그러나, 하나 이상의 접합체는 그 자체가 펩타이드를 포함하지 않지만, 예를 들어 아미노산 함유 또는 펩타이드 함유 접합 파트너에 결합된, 종양 항원을 포함하는, 본 발명의 실시형태가 고려된다. 유사하게, 그 자체가 펩타이드를 포함하지 않는 하나 이상의 종양 항원이 존재하는 본 발명의 조성물이 고려된다.
소정의 실시형태에서, 종양 항원은 예를 들어 (a) 암 세포와 연관된 전장 분자, (b) 이의 동족체 및 변형된 형태, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환 부분을 가지는 분자, 및 (c) 이의 단편(단, 상기 단편은 항원성 또는 면역원성으로 있음)이다. 소정의 실시형태에서, 종양 항원은 재조합 형태로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 종양 항원은 예를 들어 CD8+ 림프구가 인식한 클래스 I 제한된 항원 또는 CD4+ 림프구가 인식한 클래스 II 제한된 항원을 포함한다.
공유된 종양 항원은 발생상 억압된 유전자의 활성화를 허용하는 후성적 변화로 인해 종양에 의해 발현된 네이티브, 비돌연변이된 서열인 것으로 일반적으로 생각된다. 따라서, 공유된 항원은 정상 조직에서 발현이 없으므로 과발현된 또는 분화 연관된 항원에 바람직한 것으로 통상적으로 생각된다. 또한, 동일한 항원은 다수의 암 환자에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, 암-고환 항원 NY-ESO-1은 많은 종양을 가지는 대부분의 환자 및 상당한 소수의 다른 종양을 가지는 환자에 존재한다. 또 다른 예에서, 유방 분화 종양 항원 NYBR-1 및 NYBR-1.1은 유방암 환자의 특정 비율에서 발견된다. 공유된 종양 항원은 따라서 개발을 위한 매력적인 표적을 나타낸다.
본 발명의 펩타이드 또는 접합체와 조합된, 공유된 종양 항원, 예를 들어 암-고환 항원, 예컨대 NY-ESO-1, CTSP-1, CTSP-2, CTSP-3, CTSP-4, SSX2, 및 SCP1, 및 유방암 항원 NYBR-1 및 NYBR-1.1의 사용은 본 명세서에서 구체적으로 고려된다.
예시적인 일 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드, 예를 들어 펩타이드 함유 접합 파트너 또는 펩타이드 접합체의 펩타이드는 EBV LMP2로부터 유래한 하나 이상의 에피토프를 포함한다. LMP2로부터 유래한 대표적인 에피토프는 하기 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00029
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드, 예를 들어 단리된, 정제된 또는 재조합 펩타이드 또는 펩타이드 함유 접합 파트너 또는 펩타이드 접합체의 펩타이드는 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나, 예를 들어 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나, 예를 들어 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나로부터의 8개 이상의 인접한, 10개 이상의 인접한, 12개 이상의 인접한, 15개 이상의 인접한, 20개 이상의 인접한, 또는 25개 이상의 인접한 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 초과의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드는 서열 번호 76 내지 101로 이루어진 군, 또는 서열 번호 76 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
구체적으로 고려되는 일 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드, 예를 들어 단리된, 정제된 또는 재조합 펩타이드 또는 펩타이드 함유 접합 파트너 또는 펩타이드 접합체의 펩타이드는 하기 표 2에 기재된 서열 중 임의의 하나로부터의 8개 이상의 인접한, 10개 이상의 인접한, 12개 이상의 인접한, 15개 이상의 인접한, 20개 이상의 인접한, 또는 25개 이상의 인접한 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진다.
Figure pct00030
유사하게, 항원 전립선 산성 인산효소(antigen prostatic acid phosphatase; PAP)를 포함하는 전립선 백신 Sipuleucel-T(APC8015, Provenge(상표명))는 전립선암 세포 중 95%에 존재한다. 적어도 일부는 전립선암 환자의 상당한 비율로 효율에 대한 이의 가능성으로 인해, Sipuleucel-T는 무증상, 호르몬 불응성 전립선암의 치료에서의 사용에 대해 2010년에 FDA에 의해 승인받았다. 본 발명의 접합체에서의 PAP 항원의 사용은 본 발명에서 구체적으로 고려된다.
독특한 항원은 개인에게 독특하거나 적은 비율의 암 환자가 공유하는 항원인 것으로 생각되고, 통상적으로 독특한 단백질 서열을 발생시키는 돌연변이로부터 생긴다. 독특한 종양 항원의 대표적인 예는 돌연변이된 Ras 항원, 및 돌연변이된 p53 항원을 포함한다. 본 명세서를 읽은 당해 분야의 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명의 방법은 예를 들어 환자 특이적 치료제의 제조 시 예를 들어 하나 이상의 독특한 종양 항원에 대한 특이적 T 세포 반응을 유발하기 위해 하나 이상의 독특한 종양 항원을 포함하는 접합체의 신속한 제조가 가능하게 한다.
따라서, 대표적인 종양 항원은 (a) 항원, 예컨대 RAGE, BAGE, GAGE 및 MAGE 패밀리 폴리펩타이드, 예를 들어 GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 및 MAGE-12(예를 들어, 흑색종, 폐, 두경부, NSCLC, 유방, 위장관 및 방광 종양을 해소하기 위해 사용될 수 있음), (b) 돌연변이된 항원, 예를 들어 p53(다양한 고형 종양, 예를 들어 결장직장, 폐암, 두경부암과 연관됨), p21/Ras(예를 들어, 흑색종, 췌장암 및 결장직장암과 연관됨), CDK4(예를 들어, 흑색종과 연관됨), MUM1(예를 들어, 흑색종과 연관됨), 카스파제-8(예를 들어, 두경부암과 연관됨), CIA 0205(예를 들어, 방광암과 연관됨), HLA-A2-R1701, 베타 카테닌(예를 들어, 흑색종과 연관됨), TCR(예를 들어, T 세포 비호지킨 림프종과 연관됨), BCR-abl(예를 들어, 만성 골수성 백혈병과 연관됨), 트리오스포스페이트 아이소머라제, MA 0205, CDC-27 및 LDLR-FUT, (c) 과발현된 항원, 예를 들어 갈렉틴 4(예를 들어, 결장직장암과 연관됨), 갈렉틴 9(예를 들어, 호지킨 질환과 연관됨), 프로테이나제 3(예를 들어, 만성 골수성 백혈병과 연관됨), 윌름스 종양 항원-1(WT 1, 예를 들어 다양한 백혈병과 연관됨), 탄산무수화효소(예를 들어, 신장암과 연관됨), 알도라제 A(예를 들어, 폐암과 연관됨), PRAME(예를 들어, 흑색종과 연관됨), HER-2/neu(예를 들어, 유방암, 결장암, 폐암 및 난소암과 연관됨), 알파-태아단백질(예를 들어, 간세포암과 연관됨), KSA(예를 들어, 결장직장암과 연관됨), 가스트린(예를 들어, 췌장암 및 위암과 연관됨), 텔로머라제 촉매 단백질, MUC-1(예를 들어, 유방암 및 난소암과 연관됨), G-250(예를 들어, 신장 세포 암종과 연관됨), p53(예를 들어, 유방암, 결장암과 연관됨), 및 암배아 항원(예를 들어, 유방암, 폐암 및 위장관의 암, 예컨대 결장직장암과 연관됨), (d) 공유된 항원, 예를 들어 흑색종-멜라닌세포 분화 항원, 예컨대 MART-1/Melan A, gp100, MC1R, 멜라닌세포 자극 호르몬 수용체, 타이로시나제, 타이로시나제 관련 단백질-1/TRP1 및 타이로시나제 관련 단백질-2/TRP2(예를 들어, 흑색종과 연관됨), (e) 전립선 연관 항원, 예를 들어 전립선암과 연관된, 예컨대 PAP, 전립선 혈청 항원(PSA), PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, (f) 면역글로불린 이디오타이프(예를 들어, 골수종 및 B 세포 림프종과 연관됨), 및 (g) 다른 종양 항원, 예컨대 폴리펩타이드- 및 사카라이드 함유 항원, 예컨대 (i) 당단백질, 예컨대 시알릴 Tn 및 시알릴 Le.sup.x(예를 들어, 유방암 및 결장직장암과 연관됨), 및 다양한 뮤신; 운반 단백질에 커플링된 당단백질(예를 들어, KLH에 커플링된 MUC-1); (ii) 리포폴리펩타이드(예를 들어, 지질 모이어티에 연결된 MUC-1); (iii) 운반 단백질(예를 들어, KLH)에 커플링된 폴리사카라이드(예를 들어, Globo H 합성 헥사사카라이드), (iv) 운반 단백질(예를 들어, KLH)에 또한 커플링된, 강글리오사이드, 예컨대 GM2, GM12, GD2, GD3(예를 들어, 뇌암, 폐암, 흑색종과 연관됨)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용하도록 처리 가능한 다른 대표적인 종양 항원은 TAG-72(예를 들어, 미국 특허 제5,892,020호 참조); 인간 암종 항원(예를 들어, 미국 특허 제5,808,005호 참조); 골암종 세포로부터의 TP1 및 TP3 항원(예를 들어, 미국 특허 제5,855,866호 참조); 선암종 세포로부터의 톰젠-프리덴라이히(Thomsen-Friedenreich; TF) 항원(예를 들어, 미국 특허 제5,110,911호 참조); 인간 전립선 선암종으로부터의 KC-4 항원(예를 들어, 미국 특허 제4,743,543호 참조); 인간 결장직장암 항원(예를 들어, 미국 특허 제4,921,789호 참조); 낭선암종으로부터의 CA125 항원(예를 들어, 미국 특허 제4,921,790호 참조); 인간 유방암종으로부터의 DF3 항원(예를 들어, 미국 특허 제4,963,484호 및 제5,053,489호 참조); 인간 유방 종양 항원(예를 들어, 미국 특허 제4,939,240호 참조); 인간 흑색종의 p97 항원(예를 들어, 미국 특허 제4,918,164호 참조); 암종 또는 오로소뮤코이드 관련 항원(CORA)(예를 들어, 미국 특허 제4,914,021호 참조); MSA 유방암종 당단백질인 인간 유방암종의 당단백질에서의 T 및 Tn 합텐; MFGM 유방암종 항원; DU-PAN-2 췌장 암종 항원; CA125 난소 암종 항원; YH206 폐 암종 항원, 알파태아단백질(AFP), 간세포 암종 항원; 암배아 항원(CEA); 장암 항원; 상피 종양 항원(ETA); 유방암 항원; 타이로시나제; raf 암유전자 생성물; gp75; gp100; EBV-LMP 1 및 2; EBV-EBNA 1, 2 및 3C; HPV-E4, 6, 7; CO17-1A; GA733; gp72; p53; 프로테이나제 3; 텔로머라제; 및 흑색종 강글리오사이드를 포함한다. 이들 및 다른 종양 항원은, 현재 규명되든 아니든, 본 발명에서 사용에 고려된다.
소정의 실시형태에서, 종양 항원은 돌연변이된 또는 변경된 세포 성분으로부터 유래한다. 변경된 세포 성분의 대표적인 예는 ras, p53, Rb, 윌름스 종양 유전자에 의해 코딩된 변경된 단백질, 유비퀴틴, 뮤신, DCC, APC 및 MCC 유전자에 의해 코딩된 단백질, 및 수용체 또는 수용체 유사 구조, 예컨대 neu, 갑상선 호르몬 수용체, 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor; PDGF) 수용체, 인슐린 수용체, 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 수용체 및 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor; CSF) 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드 함유 항원은 폴리펩타이드 종양 항원, 예컨대 상기 기재된 것을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 함유 항원은 생체내 폴리펩타이드 종양 항원을 발현할 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터 작제물, 예컨대 플라스미드 벡터(예를 들어, pCMV)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 면역억제되거나 되었던 환자, 예를 들어 골수 이식, 조혈 줄기 세포 이식을 받거나 그렇지 않으면 면역억제를 겪은 환자에서 효과적인 항-바이러스 면역력을 유발하도록 T 세포를 자극할 수 있는 바이러스 항원을 포함하는 접합체의 제조를 고려한다.
유사하게, 증가한 암 발병률과 연관되거나, 암 유발인 것으로 보고된 바이러스, 예컨대 인간 유두종바이러스, A형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스로부터 유래한 항원은 본 발명에서 사용에 고려된다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, 종양 항원은 p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, 예컨대 E6 및 E7, B형 및 C형 간염 바이러스 항원, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 항원, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기 기재된 또는 언급된 항원은 본 발명의 제한이 아니라 예시적이다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은, 조합되어, 유효량의 2종 이상의 본 발명의 펩타이드, 2종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체, 또는 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 및 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체를 포함할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 대상체에게 투여될 수 있는 담체(아쥬번트 또는 비히클)를 의미한다.
상기 조성물에서 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 이온 교환기, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 자기 유화 약물 전달 시스템(SEDDS) 예컨대 d-α-토코페롤 폴리에틸렌글라이콜 1000 숙시네이트, 약제학적 제형에서 사용된 계면활성제, 예컨대 Tweens 또는 다른 유사한 중합체 전달 매트릭스, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제, 예컨대 포스페이트, 글라이신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글라이세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌 글라이콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글라이콜 및 양모지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 사이클로덱스트린, 예컨대 α-, β- 및 γ-사이클로덱스트린, 또는 화학적으로 변형된 유도체, 예컨대 하이드록시알킬사이클로덱스트린, 예컨대 2- 및 3-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 또는 다른 가용화 유도체가 전달을 증대시키도록 유리하게 또한 사용될 수 있다. 오일 용액 또는 현탁액은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 또는 카복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 또한 함유할 수 있고, 이것은 약제학적으로 허용 가능한 제형, 예컨대 에멀션 및 또는 현탁액의 제제에서 흔히 사용된다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구(국소, 피하, 근육내 및 정맥내 포함) 투여(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 임의의 선택된 경로에 의한 대상체에 대한 투여를 허용하도록 제제화된다.
예를 들어, 상기 조성물은 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실행과 관련하여 선택된 적절한 약제학적으로 허용 가능한 담체(부형제, 희석제, 보조제, 및 이들의 조합 포함)와 제제화될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 분말, 액체, 정제 또는 캡슐로서 경구로, 또는 연고, 크림 또는 로션으로서 국소로 투여될 수 있다. 적합한 제제는, 유화제, 항산화제, 항료 또는 착색제를 포함하는, 필요한 바대로, 추가의 물질을 함유할 수 있고, 즉시, 지연, 변형, 지속, 박동성 또는 제어 방출에 채택될 수 있다.
상기 조성물은 생체이용률, 면역원성을 최적화하거나, 연장된 기간 동안 면역원성 또는 치료학적 범위 내에 혈장, 혈액, 또는 조직 농도를 유지시키기 위해 제제화될 수 있다. 제어 전달 제제는 예를 들어 작용 부위에서 항원 농도를 최적화하도록 또한 사용될 수 있다.
상기 조성물은 예를 들어 연속 노출을 제공하도록 정기적 투여를 위해 제제화될 수 있다. 유리한 면역학적 반응을 유도하는 전략, 예를 들어 하나 이상의 "부스터" 백신접종을 사용하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이러한 전략이 채택될 수 있다.
상기 조성물은 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구 제형의 예는 수용액, 등장성 식염수 또는 활성제의 5% 글루코스, 또는 다른 널리 공지된 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 예를 들어, 사이클로덱스트린 또는 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지된 다른 가용화제는 치료제의 전달을 위해 약제학적 부형제로서 사용될 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형의 예는 치료학적 유효량의 조성물을 제공할 수 있는, 정제, 캡슐, 로젠지제, 또는 유사한 형태, 또는 임의의 액체 형태, 예컨대 시럽, 수용액, 에멀션 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 캡슐은 임의의 표준 약제학적으로 허용 가능한 재료, 예컨대 젤라틴 또는 셀룰로스를 함유할 수 있다. 정제는 활성 성분과 고체 담체 및 활택제의 혼합물을 압축함으로서 종래의 절차에 따라 제제화될 수 있다. 고체 담체의 예는 전분 및 당 벤토나이트를 포함한다. 활성 성분은 결합제, 예를 들어 락토스 또는 만니톨, 종래의 충전제 및 타정제를 함유하는 경질 쉘 정제 또는 캡슐의 형태로 또한 투여될 수 있다.
경피 투여에 적합한 제형의 예는 경피 패치, 경피 밴드 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기 조성물의 국소 투여에 적합한 제형의 예는, 피부로 직접적으로 또는 중재자, 예컨대 패드, 패치 등을 통해 도포되든, 임의의 로션, 스틱, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 겔 등을 포함한다.
상기 조성물의 좌제 투여에 적합한 제형의 예는 체구로 삽입된 임의의 고체 제형, 특히 직장으로, 질로 및 요도로 삽입된 것을 포함한다.
상기 조성물의 주사에 적합한 형태의 투약량의 예는 정맥내 주사, 피하, 진피하 및 근육내 투여 또는 경구 투여에 의한 볼루스, 예컨대 단일 또는 다수 투여를 통한 전달을 포함한다.
상기 조성물의 데포 투여에 적합한 제형의 예는 펩타이드 또는 펩타이드 접합체가 생분해성 중합체, 마이크로에멀션, 리포솜의 매트릭스에 포획되거나 마이크로캡슐화된 펩타이드 또는 펩타이드 접합체의 펠렛 또는 고체 형태를 포함한다.
상기 조성물에 대한 점적주사 장치의 예는 원하는 수의 용량 또는 정상 상태 투여를 제공하기 위한 점적주사 펌프를 포함하고, 이식형 약물 펌프를 포함한다.
상기 조성물에 대한 이식형 점적주사 장치의 예는 펩타이드 또는 펩타이드 접합체가 생분해성 중합체 또는 합성 중합체, 예컨대 실리콘, 실리콘 고무, 실라스틱 또는 유사한 중합체 내에 캡슐화되거나 이에 걸쳐 분산된 임의의 고체 형태를 포함한다.
상기 조성물의 점막경유 전달에 적합한 제형의 예는 관장, 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼, 분무된 용액, 분말을 위한 보관소 용액을 포함하고, 활성 성분 이외에 이러한 담체를 함유하는 유사한 제제는 적절한 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 제형은 약제학적으로 허용 가능한, 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 및/또는 분말 중의 용액 및/또는 현탁액을 포함하는 조성물을 포함하는, 조성물의 흡입 또는 통기법에 적합한 형태를 포함한다. 상기 조성물의 점막경유 투여는 임의의 점막을 이용할 수 있지만 흔히 비강, 협측, 질내 및 직장 조직을 이용한다. 상기 조성물의 비강 투여에 적합한 제제는 액체 형태로, 예를 들어 비강 스프레이, 점비액으로 또는 중합체 입자의 수성 또는 유성 용액을 포함하는 분무기에 의한 에어로졸 투여에 의해 투여될 수 있다. 제제는 예를 들어 식염수, 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제를 사용하는 용액, 생체이용률을 증대시키는 흡수 프로모터, 불화탄소 및/또는 당해 분야에 공지된 다른 흡수제 또는 분산제 중의 수용액으로서 제조될 수 있다.
상기 조성물의 협측 또는 설하 투여에 적합한 제형의 예는 로젠지제, 정제 등을 포함한다. 조성물의 안과용 투여에 적합한 제형의 예는 약제학적으로 허용 가능한, 수성 또는 유기 용매 중의 용액 및/또는 현탁액을 포함하는 인서트 및/또는 조성물을 포함한다.
백신을 포함하는 조성물의 제제의 예는 예를 들어 문헌[Sweetman, S. C. (Ed.). Martindale. The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical Press, Chicago, 2002, 2483 pp.; Aulton, M. E. (Ed.) Pharmaceutics. The Science of Dosage Form Design. Churchill Livingstone, Edinburgh, 2000, 734 pp.; 및 Ansel, H. C., Allen, L. V. and Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott 1999, 676 pp.]에서 발견될 수 있다. 약물 전달 시스템의 제조에서 사용된 부형제는 예를 들어 문헌[Kibbe, E. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, 2000, 665 pp]을 포함하는 당해 분야의 당업자에게 공지된 다양한 공보에 기재되어 있다. 미국 약전은 또한 정제 또는 캡슐로서 제제화된 것을 포함하는 변형 방출 경구 제형의 예를 제공한다. 연장 방출 및 지연 방출 정제 및 캡슐의 약물 방출 능력을 결정하기 위한 특정한 시험을 기재한 또한 예를 들어 문헌[The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 1995(이하, "USP")]을 참조한다. 연장 방출 및 지연 방출 물품에 대한 약물 방출에 대한 USP 시험은 경과한 시험 기간에 대한 투약량 단위로부터의 약물 분해에 기초한다. 다양한 시험 장치 및 절차의 설명은 USP에서 발견될 수 있고, 연장된 방출 제형의 분석에 관한 추가의 가이던스는 F.D.A.에 의해 제공된다(문헌[Guidance for Industry. Extended release oral dosage forms: development, evaluation, and application of in vitro/in vivo correlations. Rockville, MD: Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration, 1997] 참조).
상기 조성물이 하나 이상의 외인성 아쥬번트를 포함할 수 있지만, 유리하게는 몇몇 실시형태에서 이것이 필요하지 않다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드 접합체는 에피토프를 포함하고, 자가 아쥬번팅이다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드 접합체 또는 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 펩타이드 접합체 또는 펩타이드의 용도, 및, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 펩타이드 접합체 또는 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 약제학적 조성물의 용도, 및, 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 또는 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 접합체의 용도, 및, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 펩타이드 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 백신접종하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명의 접합체의 용도, 및, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의, 본 발명의 펩타이드 접합체의 용도에 관한 것이다.
대상체에서의 백신접종 또는 면역 반응의 유도를 위한, 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 및/또는 1종 이상의 본 발명의 펩타이드 접합체, 예를 들어 1종 이상의 펩타이드 접합체와 함께 1종 이상의 펩타이드의 투여 또는 사용은 본 명세서에서 고려된다.
2종 이상의 펩타이드, 2종 이상의 펩타이드 접합체, 또는 1종 이상의 펩타이드 및 1종 이상의 펩타이드 접합체가 투여되거나 사용되는 경우, 2종 이상의 펩타이드, 2종 이상의 펩타이드 접합체, 또는 1종 이상의 펩타이드 및 1종 이상의 펩타이드 접합체는 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여되거나 사용될 수 있다.
"대상체"는 포유류, 예를 들어 인간인 척추동물을 의미한다. 포유류는 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 랫트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"유효량"은 임상 결과를 포함하는 유리한 또는 원하는 결과를 실행시키기에 충분한 양이다. 유효량은 다양한 투여 경로에 의해 하나 이상의 투여에서 투여될 수 있다.
유효량은, 다른 인자 중에서, 표시된 질환, 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대 건강, 투여된 화합물의 효력, 투여 방식 및 원하는 치료에 따라 달라질 것이다. 당해 분야의 당업자는 이들 임의의 다른 관련 인자와 관련한 적절한 투약량을 결정할 수 있을 것이다.
조성물의 효율은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 세포 매개 면역 반응을 유도하는 이의 능력에 대해 시험관내 또는 생체내 시험될 수 있다. 생체내 연구를 위해, 조성물은 동물(예를 들어, 마우스)로 공급되거나 주사될 수 있고, 면역 반응을 유발하는 이의 효과가 이후 평가된다. 결과에 기초하여, 적절한 투약량 범위 및 투여 경로가 결정될 수 있다.
상기 조성물은 단일 용량 또는 다수의 용량 스케줄로 투여될 수 있다. 다수의 용량은 1차 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에서 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 면역 반응의 유도는 면역 반응의 상승 또는 증대를 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 면역 반응의 유도는 체액 및 세포 매개 반응의 유도를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 면역 반응의 유도는 면역력을 제공한다.
면역 반응은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 유도된다. 당해 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 펩타이드 및 펩타이드 접합체가, EBV 연관 신생물 병태, 예컨대 B 및 T 세포 비호지킨 림프종, 호지킨 질환, 및 림프상피종 유사 암종, 예컨대 비인두 암종(NPC)(이것으로 제한되지는 않음)으로부터 선택된 하나 이상의 질환 또는 병태를 포함하는, EBV와 연관된 다양한 질환 및 병태를 치료하는 데 유용하다는 것을 이해할 것이다.
몇몇 실시형태에서, 질환 또는 병태는 임의의 다른 이유에 대해 골수 이식 후 또는 심오한 면역억제의 유도 이후 감염성 질환, 암 또는 바이러스 불활화이다.
용어 "치료", 및 관련 용어, 예컨대 "치료하는" 및 "치료한다"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 일반적으로 몇몇 원하는 치료학적 효과가 달성되는 인간 또는 비인간 대상체의 치료를 의미한다. 치료학적 효과는 예를 들어 질환 또는 병태의 저해, 감소, 완화, 정지 또는 예방일 수 있다.
상기 조성물은 전신 및/또는 점막 면역력을 유발하도록 사용될 수 있다. 증대된 전신 및/또는 점막 면역력은 증대된 TH1 및/또는 TH2 면역 반응에 반영될 수 있다. 증대된 면역 반응은 IgG1 및/또는 IgG2a 및/또는 IgA의 생성의 증가를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기로 이루어지고, 하기가 오직 예를 제공하고 어떤 방식으로든 이의 범위를 제한하지 않는 구성을 또한 예상한다.
실시예
실시예 1. 접합체 200, 20, 22 및 26의 제조
1.1 일반 상세내용
상업적으로 입수 가능한 출발 물질을 Acros Organics, Ajax Finechem, Alfa Aesar, CEM, GL-Biochem, Merck, NOVA Biochem, Sigma Aldrich 및 TCI로부터 구입하고, 제공된 바대로 사용하였다. 건조된 용매를 N2 또는 아그곤 분위기 하에 증류를 통해 제조하였다. 테트라하이드로퓨란(THF)을 나트륨/벤조페논 케틸 위로 새로 증류시켰다. 메탄올(MeOH) 및 톨루엔을 수소화칼슘 위로 새로 증류시켰다. 수율은, 달리 언급되지 않은 한, 크로마토그래피로 및 분광학적으로(1H NMR) 균일한 재료를 의미한다.
박층 크로마토그래피(TLC)를 Merck Kieselgel F254 200㎛ 실리카 플레이트에서 수행하였다. 자외선을 수성 염기성 용액 중의 과망간칼륨 및 에탄올성 용액 중의 바닐린의 일반적인 전개 물질 및 가시화 물질로서 사용하였다. 사용된 특정한 전개 물질은 1차 아민의 확인을 위한 산과의 닌하이드린의 에탄올성 용액이다. 임의의 전개 물질을 사용할 때 가열을 적용하였다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 대해 실리카 겔(0.063 내지 0.100㎜)을 사용하였다.
1H 핵에 대해 400MHz 및 13C 핵에 대해 100MHz에서 조작되는 Bruker DRX400 분광기에서 CDCl3 또는 D2O 중에 실온에서 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 얻었다. 1H 및 13C 스펙트럼에 대한 기준 피크는 CDCl3에 대해 δ0.00 및 δ77.0 및 1H 스펙트럼에 대해 D2O 중에 δ4.79로 각각 설정되었다. NMR 데이터는 δ 스케일로 백만분율(ppm)로서의 화학 이동의 값 및 헤르츠(Hz)의 커플링 상수로 기록된다. 다중항은 s = 일중항, d = 이중항, t = 삼중항, q = 사중항, dd = 이중항의 이중항, dt = 삼중항의 이중항, tt = 삼중항의 삼중항, dq = 사중항의 이중항, dqn = 오중항의 이중항, sx = 육중항, br s = 넓은 일중항 및 m = 다중항으로 기록된다. Cq의 배정은 4차 탄소를 나타내도록 사용된다.
5000의 공칭 해상으로 Bruker microOTOF-Q II 질량 분광기에서 고해상 질량 스펙트럼을 얻었다. Finnigan Surveyor MSQ Plus 질량 분광기가 구비된 Dionex UltiMate 3000 HPLC 시스템 또는 Hewlett Packard Series 1100 MSD 질량 분광기가 구비된 Agilent 1120 Compact LC 시스템에서 분석용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분광광도법(LC-MS) 크로마토그램을 획득하였다. MeCN/H2O + 0.1% TFA 용매 시스템을 사용하여 분석용 역상(RP) HPLC를 수행하였다. MeCN/H2O + 0.1% TFA 용매 시스템을 사용하여 Dionex UltiMate 3000 HPLC 시스템에서 반분취용 RP HPLC를 수행하였다. CEM Liberty Automated Microwave 시스템을 사용하여 마이크로파 반응을 수행하였다.
1.2 펩타이드 사슬 연장에 대한 일반 방법
수동 합성 방법
팽윤된 펩타이드 수지를 DMF(5.0㎖) 중의 20% v/v 피페리딘에 의해 처리하고, 실온에서 20분 동안 진탕시켰다. 용액을 배수시키고, 수지를 DMF(2회) 및 DCM(2회)에 의해 세척하였다. DMF(1㎖) 중의 Fmoc-AA-OH(2.0당량), HBTU(2.0당량) 및 iPr2NEt(4.0당량)의 커플링 혼합물을 첨가하고, 수지를 1시간 동안 진탕시켰다. 수지를 배수시키고 다시 세척하였다. 서열에서 남은 잔기에 대해 절차를 반복하였다.
자동화 합성 방법(표준, 0.2m㏖ 스케일)
펩타이드 수지를 트리뷰트(Tribute) 자동화 펩타이드 합성장치의 반응 용기로 옮겼다. Fmoc 탈보호 및 Fmoc-AA-OH 커플링 단계의 사이클에 의해 자동화 합성을 수행하였다. DMF(6.0㎖) 중의 20% v/v 피페리딘의 첨가 및 교반(2 x 7분)에 의해 탈보호를 수행하였다. 수지 배수 및 DMF 세척(4㎖ x 3) 후, HBTU(0.24mM, DMF 중, 4㎖) 중에 용해된 5당량의 Fmoc-AA-OH에 의해 커플링 단계를 수행하였다. 염기-첨가 단계에서 DMF(4㎖) 중의 2M N-메틸몰폴린(NMM)을 사용하였다. 커플링을 1시간 동안 진행하였다. DMF 세척 단계 후, 탈보호 및 커플링의 다음 사이클을 시작하여, 모든 아미노산이 커플링될 때까지 반복하였다.
시스테인 유도체( 0.1m㏖ 스케일)의 커플링에 대한 절차
펩타이드 수지를 30분 동안 1:1 CH2Cl2:DMF 중에 팽윤시키고, 이후 배수시켰다. Cys 아미노산(0.2m㏖, 2당량), BOP(0.4m㏖, 4당량) 및 HOBt.H2O(0.4m㏖, 4당량)의 커플링 혼합물을 1:1 CH2Cl2:DMF(2㎖) 중에 용해시켰다. 이후, 2,4,6-콜리딘(0.4m㏖, 4당량)을 첨가하고, 생성된 용액을 펩타이드 수지에 첨가하였다. 닌하이드린 시험이 유리 아민을 나타내지 않을 때까지 수지를 1시간 동안 교반하였다. 이후, 수지를 배수시키고, DMF(2회) 및 CH2Cl2(2회)에 의해 세척하고, 건조시켰다.
닌하이드린 시험 절차
수지의 적은 부분을 채우고, CH2Cl2에 의해 세척하고, 건조시켰다. EtOH 중의 5% v/v 닌하이드린, EtOH 중의 80% w/v 페놀 및 피리딘 중의 2% v/v KCN의 용액의 각각의 1방울을 수지에 첨가하고, 혼합물을 90℃에서 2분 동안 가열하였다. 청색 색상의 비드 및 용액은 유리 1차 아민의 존재를 나타내지만, 황색 색상은 유리 아미노기가 존재하지 않음을 나타내지 않는다.
1.3 아미노산 접합체 200의 제조
N- 플루오레닐메톡시카보닐 -[ R ]-시스테인
Figure pct00031
Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.0g, 1.7m㏖)를 CH2Cl2(50㎖) 중에 용해시켰다. TFA(1.5㎖, 19.6m㏖) 및 iPr3SiH(0.75㎖)를 첨가하여, 용액이 황색이 되게 하였다. 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이때 용액은 무색으로 변했다. 혼합물을 Na2CO3.H2O를 첨가하여 pH 9로 염기성화시키고, EtOAc에 의해 세척하였다. 용액을 10M HCl에 의해 산성화시키고, EtOAc에 의해 추출하고, 진공 하에 농축시켜, 백색의 분말 및 분홍색의 잔류물을 얻었다. 분말 및 잔류물을 4:1 MeCN:H2O 중에 용해시키고 동결건조시켜, 미정제 핑크색 내지 흰색의 분말(424㎎, 미정제 수율 73.1%)을 얻었다. 이 미정제 생성물을 하기 기재된 티올-엔 반응을 거쳐 옮겼다.
( R )-2-((((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 ) 카보닐 )아미노)-3-((2-( 팔미토일옥시 )에틸)티오)프로판산(200)
Figure pct00032
열 개시(Li, J. Dong, S. et ai. Chemistry as an Expanding Resource in Protein Science: Fully Synthetic and Fully Active Human Parathyroid Hormone-Related Protein (1-141). Angewandte Chemie International Edition 2012, 51 (49), 12263-12267).
Fmoc-Cys-OH(100㎎, 0.29m㏖), 비닐 팔미테이트(476㎕, 1.5m㏖) 및 AIBN(9.6㎎, 59μ㏖)을 탈기된 1,2-다이클로로에탄(3㎖) 중에 용해시켰다. 이후, 반응 혼합물을 환류(90℃) 하에 24시간 동안 가열하고, 이후 TLC는 Fmoc-Cys-OH의 완전한 소모를 나타냈다. 이후, 용액을 실온으로 냉각시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 반응 혼합물 중의 원하는 생성물 200의 존재는 질량 분광광도법에 의해 확인되었다.
광 개시
Fmoc-Cys-OH(100㎎, 0.29m㏖)를 탈기된 무수 DMF(500㎕) 중에 용해시켰다. 비닐 팔미테이트(90㎕, 0.3m㏖) 및 DMPA(5.0㎎, 20μ㏖)를 탈기된 CH2Cl2(200㎕) 중에 용해시켰다. 2개의 용액을 합하고, 생성된 혼합물을 표준 광화학 장치에서 6시간 동안 조사하였다(365㎚ UV). 반응 혼합물 중의 추가의 변화가 TLC에 의해 관찰될 수 없을 때, 용매를 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(3:1 EtOAc:n-헥산 + 2% AcOH)에 의해 정제한 후, 1:1 H2O:MeCN + 0.1% TFA로부터 동결건조하여 표제 화합물을 분말의 흰색의 고체(24㎎, 13%)로서 얻었다. 원하는 생성물 200의 구조는 질량 분광광도법에 의해 확인되었다.
1.4 펩타이드 접합체 20, 22 및 26의 제조
펩타이드
AcN-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Asp-Arg-His-Ser-Asp-Tyr-Gln-Pro-Leu-Gly-Thr-Gln-Asp-Gln-Ser-Leu-Tyr-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Asp-Gly-Asn-Asp-Gly-Leu-OH 25
1:1 CH2Cl2:DMF 중의 미리 팽윤된 아미노메틸 폴리스타이렌(PS) 수지(0.20g, 1.0m㏖/g 로딩, 0.2m㏖ 스케일)에 DMF(3㎖) 중의 Fmoc-L-Val-O-CH2-phi-OCH2-CH2-COOH(155.2㎎, 0.3m㏖), HBTU(113.8㎎, 0.3m㏖) 및 iPr2NEt(104㎕, 0.6m㏖)의 커플링 혼합물을 첨가하였다. 수지를 실온에서 2시간 동안 진탕시키고, 이후 완전한 커플링을 모니터링하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. 이후, 실온에서 20분 동안 DMF(5㎖) 중의 20% v/v 피페리딘에 의한 수지의 처리에 의해 Fmoc-Val 아미노기를 탈보호하였다. 수지를 트리뷰트 자동화 펩타이드 합성장치로 옮겼다. 일반적인 자동화 커플링 방법을 이용하여 Ser 잔기까지 포함하는 사슬 연장을 수행하였다. Fmoc-Cys(Trt)-OH 잔기의 커플링을 1:1 CH2Cl2:DMF(2㎖) 중의 Fmoc-Cys(Trt)-OH(235㎎, 0.4m㏖), BOP(360㎎, 0.8m㏖), HOBt.H2O(120㎎, 0.8m㏖) 및 2,4,6-콜리딘(120㎕, 0.8m㏖)의 혼합물의 첨가에 의해 수동으로 수행하였다. 수지를 실온에서 1시간 동안 진탕시키고, 이후 완전한 커플링을 모니터링하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. 실온에서 20분 동안 DMF(5㎖) 중의 20% v/v 피페리딘에 의한 수지의 처리에 의해 최종 Fmoc 탈보호를 달성하였다.
Fmoc 탈보호 후, DMF(3㎖) 중의 아세트산 무수물(50㎕) 및 iPr2NEt(50㎕)를 수지에 첨가함으로써 N-아세틸화를 수행하였다. 이후, 수지를 실온에서 30분 동안 진탕시키고, 이후 남은 유리 아민이 없음을 보장하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. 수지를 배수시키고, DMF 및 CH2Cl2에 의해 세척하고, 공기 건조시켰다. TFA:H2O:DODT:iPr3SiH(94: 2.5: 2.5: 1% v/v, 10.0㎖)의 절단 칵테일을 건조 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 진탕시켰다. 이후, 절단 칵테일을 차가운 다이에틸 에터에 의해 처리하여 미정제 펩타이드를 침전시키고, 이것을 4000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 다이에틸 에터에 의해 세척한 후, 스피닝 단계를 반복하였다. 이후, 에터 상을 버리고, 펩타이드를 N2 흐름에 의해 건조시켰다. 이후, 미정제 펩타이드를 H2O + 0.1% TFA로부터 동결건조시켰다. 미정제 생성물을 하기 기재된 티올-엔 반응 단계를 거쳐 옮겼다.
Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH 2
Figure pct00033
1:1 CH2Cl2:DMF 중의 예비 팽윤된 아미노메틸 폴리스타이렌(PS) 수지(0.20g, 1.0m㏖/g 로딩, 0.2m㏖ 스케일)에 DMF(2㎖) 중의 Fmoc-Rink-아마이드-OH(216㎎, 0.4m㏖), HBTU(151.8㎎, 0.4m㏖) 및 iPr2NEt(140㎕, 0.8m㏖)의 커플링 혼합물을 첨가하였다. 수지를 실온에서 1시간 동안 진탕시키고, 이후 완전한 커플링을 확립하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. 이후, 실온에서 20분 동안 DMF(5㎖) 중의 20% v/v 피페리딘에 의한 수지의 처리에 의해 링커 아미노기를 탈보호하였다. 수지를 트리뷰트 자동화 펩타이드 합성장치로 옮겼다. 일반적인 자동화 커플링 방법을 이용하여 Ser 잔기까지 포함하는 사슬 연장을 수행하였다. Cys 잔기의 커플링을 1:1 CH2Cl2:DMF(2㎖) 중의 Fmoc-Cys(Trt)-OH(235㎎, 0.4m㏖), BOP(360㎎, 0.8m㏖), HOBt.H2O(120㎎, 0.8m㏖) 및 2,4,6-콜리딘(120㎕, 0.8m㏖)의 혼합물의 첨가에 의해 수동으로 수행하였다. 수지를 실온에서 1시간 동안 진탕시키고, 이후 완전한 커플링을 확립하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. 실온에서 20분 동안 DMF(5㎖) 중의 20% v/v 피페리딘에 의한 수지의 처리에 의해 최종 Fmoc 탈보호를 달성하였다.수지를 배수시키고, DMF 및 CH2Cl2에 의해 세척하고, 공기 건조시켰다. TFA:H2O:DODT:iPr3SiH(94: 2.5: 2.5: 1% v/v, 10.0㎖)의 절단 칵테일을 건조 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 이후, 절단 칵테일을 차가운 다이에틸 에터에 의해 처리하여 미정제 펩타이드를 침전시키고, 이것을 4000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 다이에틸 에터에 의해 세척한 후, 스피닝 단계를 반복하였다. 이후, 에터 상을 버리고, 펩타이드를 N2 흐름에 의해 건조시켰다. 이후, 미정제 펩타이드를 H2O + 0.1% TFA로부터 동결건조시켰다. 미정제 생성물을 하기 기재된 티올-엔 반응 단계를 거쳐 옮겼다.
Ac- Cys - Ser - Lys - Lys - Lys - Lys -NH 2 24
Figure pct00034
1:1 CH2Cl2:DMF 중의 예비 팽윤된 아미노메틸 폴리스타이렌(PS) 수지(0.20g, 1.0m㏖/g 로딩, 0.2m㏖ 스케일)에 DMF(2㎖) 중의 Fmoc-Rink-아마이드-OH(216㎎, 0.4m㏖), HBTU(151.8㎎, 0.4m㏖) 및 iPr2NEt(140㎕, 0.8m㏖)의 커플링 혼합물을 첨가하였다. 수지를 실온에서 1시간 동안 진탕시키고, 이후 닌하이드린 시험은 완전한 커플링을 나타냈다. 이후, 실온에서 20분 동안 DMF(5㎖) 중의 20% v/v 피페리딘에 의한 수지의 처리에 의해 링커 아미노기를 탈보호하였다. 수지를 트리뷰트 자동화 펩타이드 합성장치로 옮겼다. 일반적인 자동화 커플링 방법을 이용하여 Ser(Trt) 잔기까지 포함하는 사슬 연장을 수행하였다. Cys 잔기의 커플링을 1:1 CH2Cl2:DMF(2㎖) 중의 Fmoc-Cys(Trt)-OH(235㎎, 0.4m㏖), BOP(360㎎, 0.8m㏖), HOBt.H2O(120㎎, 0.8m㏖) 및 2,4,6-콜리딘(120㎕, 0.8m㏖)의 혼합물의 첨가에 의해 수동으로 수행하였다. 수지를 실온에서 1시간 동안 진탕시키고, 이후 완전한 커플링을 확립하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. Fmoc 탈보호 후, DMF(3㎖) 중의 아세트산 무수물(50㎕) 및 iPr2NEt(50㎕)를 수지에 첨가함으로써 N-아세틸화를 수행하였다. 이후, 수지를 실온에서 30분 동안 진탕시키고, 이후 남은 유리 아민이 없음을 확립하도록 닌하이드린 시험을 수행하였다. 수지를 배수시키고, DMF 및 CH2Cl2에 의해 세척하고, 공기 건조시켰다. TFA:H2O:DODT:iPr3SiH(94: 2.5: 2.5: 1% v/v, 10.0㎖)의 절단 칵테일을 건조 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 진탕시켰다. 이후, 절단 칵테일을 차가운 다이에틸 에터에 의해 처리하여 미정제 펩타이드를 침전시키고, 이것을 4000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 다이에틸 에터에 의해 세척한 후, 스피닝 단계를 반복하였다. 이후, 에터 상을 버리고, 펩타이드를 N2 흐름에 의해 건조시켰다. 이후, 미정제 펩타이드를 H2O + 0.1% TFA로부터 동결건조시켰다. 미정제 생성물을 하기 기재된 티올-엔 반응 단계를 거쳐 옮겼다.
펩타이드 접합체
Ac- Cys - Ser - Lys - Lys - Lys - Lys -NH 2 24 및 비닐 팔미테이트 22 의 티올 -엔 반응 생성물
Figure pct00035
NMP(4㎖)의 용액 중의 미정제 펩타이드 24(25㎎, 32.6μ㏖) 및 DMPA(3.3㎎, 13.1μ㏖)에 비닐 팔미테이트(52.9㎕, 0.16m㏖)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 표준 UV 광화학 장치에서 365㎚에서 1시간 동안 교반하면서 조사하였다. 질량 분석에 의해 원하는 생성물 22를 검출하였다. 5-65% MeCN:H2O + 0.1% TFA(분당 3% MeCN, 50℃)의 구배에서 실행되는 Phenomenex Gemini C18 칼럼에서 반분취용 RP HPLC를 통해 미정제 생성물 22를 정제하였다. 원하는 생성물 22의 구조를 확인하도록 질량 분광광도법을 이용하였다.
Cys - Ser - Lys - Lys - Lys - Lys -NH 2 및 비닐 팔미테이트 20 의 티올 -엔 반응 생성물
Figure pct00036
미정제 Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2와 NMP 중의 5당량의 비닐 팔미테이트, 0.4당량의 DMPA의 티올-엔 반응, 365㎚에서의 1시간 조사는 원하는 생성물 20(Pam-CSK4)를 제공하고, 이의 정체성은 MS 분석에 의해 결정되었다.
AcN-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Asp-Arg-His-Ser-Asp-Tyr-Gln-Pro-Leu-Gly-Thr-Gln-Asp-Gln-Ser-Leu-Tyr-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Asp-Gly-Asn-Asp-Gly-Leu-OH 25 및 비닐 팔미테이트 26의 티올-엔 반응 생성물
Figure pct00037
NMP(3㎖)의 용액 중의 미정제 펩타이드 25(20㎎) 및 DMPA(1.2㎎, 4.74μ㏖)에 비닐 팔미테이트(19.2㎕, 59.3μ㏖)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 표준 광화학 장치에서 365㎚에서 1시간 동안 교반하면서 조사하였다. 질량 분석에 의해 원하는 생성물 26을 검출하였다. 5-65% MeCN:H2O + 0.1% TFA(분당 3% MeCN, 50℃)의 구배에서 실행되는 Phenomenex Gemini C18 칼럼에서 반분취용 RP HPLC를 통해 미정제 생성물 26을 정제하였다. 원하는 생성물 26 및 산화된 Met(O) 부산물의 구조를 확인하도록 질량 분광광도법을 이용하였다.
1.5 펩타이드에서의 티올 -엔 반응에 대한 일반 방법
DMSO의 용액 중의 미정제 또는 정제된 펩타이드(10mM), DTT(30mM) 및 DMPA(4mM)에 비닐 팔미테이트(50mM)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 표준 UV 광화학 장치에서 365㎚에서 15분 동안 교반하면서 조사하였다. ESI 질량 분석에 의해 원하는 생성물을 검출하였다. 완전 전환을 달성하기 위해, DMPA 광개시제의 추가의 첨가가 때때로 필요하다. 1-65% MeCN:H2O + 0.1% TFA(분당 3% MeCN)의 구배에서 실행되는 Phenomenex Gemini C18 칼럼에서 반분취용 RP HPLC를 통해 미정제 생성물을 정제하였다. 혼주된 분획을 동결건조시켜 백색의 분말로서 순수한 생성물을 얻었다.
1.6 토의
Fmoc-Cys-OH와 비닐 팔미테이트의 열 반응을 라디칼 개시제로서 5당량의 알켄 및 0.2당량의 AIBN을 사용하여 1,2-다이클로로에탄 중에 수행하였다.
반응을 24시간 동안 환류(90℃) 하에 수행하였다. 마이크로파 가열(100W, 1시간)을 또한 소정의 실시형태에서 사용하였다. 원하는 생성물을 TLC에 의해 검출하였다. 다수의 부산물이 몇몇 실시형태에서 또한 형성되었다.
반응의 광 개시를 광 개시제로서 1당량의 비닐 팔미테이트 및 0.2당량의 DMPA에 의해 수행하였다. 반응을 탈기된 DMF:DCM 용매 혼합물 중에 수행하고, 표준 광화학 장치에서 365㎚ UV 광에 의해 1시간 동안 조사하였다. Fmoc-Cys-OH의 거의 완전한 전환을 TLC에 의해 모니터링하였다. 바람직하게는, 최소 부산물이 형성되었다. 정제는 생성물 200을 거의 합당한 내지는 높은 수율로 제공하였다. 2당량의 비닐 팔미테이트의 사용은 정제 후 높은 수율로 200을 제공하였다.
티올-엔 반응을 NAc-CSK4를 사용하여 수행하였다. 필요한 펩타이드 모티프 24를 상기 기재된 바대로 합성하였다. 아미노메틸 수지에 대한 Rink-아마이드 링커의 부착 후, 자동화 Fmoc-SPPS(표준 커플링 조건)를 사용하여 SK4 서열을 구축하였다. 이후, Fmoc-Cys(Trt)-OH를 에피머화를 감소시키는 조건 하에 수동으로 커플링하였다. 이후, N-아세틸화를 수행하였다.
질량 분석을 이용하여 시스테인의 tert-뷰틸화(+56)로 인한 수지로부터의 펩타이드의 절단 시 부산물 형성이 발생하는지를 확립하였다. Fmoc-Ser(t-Bu)-OH 대신에 Fmoc-Ser(Trt)-OH를 이용하는 NAc-CSK4의 합성의 반복을 소정의 실시형태에서 사용하여 시스테인-알킬화 생성물이 없는 생성물을 생성하였다. 펩타이드를 절단하고 이후 동결건조시켰다.
이후, 미정제 펩타이드 24와 비닐 팔미테이트의 티올-엔 반응을 수행하였다. N-메틸피롤리돈(NMP)은 친수성 CSK4 펩타이드 및 소수성 비닐 팔미테이트 분자 둘 다를 효과적으로 용매화하였다.
AIBN 및 마이크로파 가열을 이용한 열 개시를 과량의 비닐 팔미테이트(20당량 이하)를 사용하여 미정제 및 정제된 펩타이드 둘 다 에서 수행하였다. 반응의 광 개시는 소정의 실시형태에서 더 우수한 결과를 제공할 것이다. 광 개시제로서 DMPA와 함께 미정제 펩타이드를 사용하여, 반응은 소정의 실시형태에서 1시간의 조사(2㎖의 NMP 중의 5당량의 비닐 팔미테이트, 0.4당량의 DMPA) 후 완료로 진행할 것이다. 원하는 생성물은 MS(이상적으로, 90% 초과의 전환율, HPLC에 의해 60% 순도)에 의해 확인되었다.
유리하게는, 티올-엔 커플링 전에 절단 후 정제가 필요하지 않다. RP-HPLC에 의한 정제는 통상적으로 비효율적이고, 50% 초과의 재료의 소실이 흔했다. 일반적으로, 가능할 때마다 필요한 HPLC 정제 단계의 수를 감소시키는 것이 유리하다.
분당 5-95% MeCN:H2O + 0.1% TFA, 3% MeCN의 구배로 실행되는 Phenomenex C18 칼럼을 사용하여 반분취용 RP-HPLC에 의해 N-아세틸화 모노아실 리포펩타이드 22의 정제를 달성하였다. 이후, 정제된 펩타이드를 동결건조시켜 백색의 분말로서 원하는 생성물을 얻었다.
25mM으로의 펩타이드 농도의 증가는 소정의 실시형태에서 부산물 형성의 약간의 감소를 발생시킬 것이다(예를 들어, 90% 초과의 전환율, HPLC에 의해 80% 순도). 5mM으로의 농도의 감소는 소정의 경우에 반대의 효과를 가질 것이다.
5mM의 펩타이드 농도와 함께 글루타티온(GSH)(3당량)의 존재 하의 NMP:H2O:DMSO(4:2:1)의 혼합물 중의 반응의 수행은 소정의 경우에 혼합된 다이설파이드 형성(예를 들어, 50% 전환율, HPLC에 의해 75% 순도)을 생성시킬 것이다. 5mM의 펩타이드 농도와 함께 NMP 중의 2,2'-(에틸렌다이옥시)다이에탄티올(DODT)(3당량)의 사용은 소정의 경우에 생성물의 복잡한 혼합물(예를 들어, HPLC에 의해 80% 전환율)을 생성시킬 것이다.
소정의 실시형태에서, 반응 혼합물(NMP 중의 10mM 펩타이드)에 대한 3당량의 DTT의 첨가는 비닐 팔미테이트 텔로머화로부터 생긴 부산물, 또는 관찰되는 혼합된 다이설파이드를 생성시키지 않고, 반응은 높은 전환율(예를 들어, 90% 초과의 전환율, HPLC에 의해 85% 순도)로 진행하였다. DTT를 사용하여, DMSO, 양성 및 더 다양한 용매(예를 들어, 90% 전환율, HPLC에 의해 95% 초과의 순도를 달성하도록) 중에 반응(25mM 펩타이드)을 또한 수행할 수 있다.
비아세틸화 유사체 CSK4를 사용하여 티올-엔 반응을 또한 수행하였다. 상기 기재된 절차를 이용하여 CSK4 모티프의 합성을 수행하였다. 이후, 펩타이드를 수지로부터 절단시키고 동결건조시켰다. 소정의 실시형태에서, 미정제 생성물과 비닐 팔미테이트의 티올-엔 반응은 NMP 중의 5당량의 비닐 팔미테이트, 0.4당량의 DMPA, 365㎚에서의 1시간 조사를 이용하여 순조롭게 진행하여, 원하는 생성물 20(Pam-CSK4)을 생성시키고, 이의 정제성은 MS 분석에 의해 확인되었다.
비닐 팔미테이트와 EBV LMP2 에피토프를 포함하는 긴 펩타이드, LMP2 S-1[서열 번호 5]의 티올-엔 반응을 또한 수행하였다.
LMP2 S-1 서열을 표준 조건을 사용하여 자동화 Fmoc-SPPS에 의해 구축하였다. 이후, K4 태그 및 세린 잔기를 서열 번호 4로서 본 명세서에 도시된 서열의 N 말단에 커플링하였다. 이후, 펩티딜 수지를 합성장치로부터 제거하고, 시스테인 잔기를 표준 조건을 사용하여 수동으로 커플링하였다. 이후, N-아세틸화를 수행하였다. 이후, 펩타이드를 수지로부터 절단하고 동결건조시켜 흰색의 분말을 우수한 수율로 얻었다.
비보호된 펩타이드 25 및 비닐 팔미테이트의 티올-엔 반응을 펩타이드 20 및 22에 대해 기재된 바대로 광 개시를 사용하여 수행하였다. 질량 분석을 수행하여 팔미토일화 생성물 26으로의 전환을 확립하였다. 0.1% TFA와 5-95% MeCN:H2O의 구배로 실행되는 Phenomenex C18 칼럼을 사용하여 반분취용 RP-HPLC에 의해 정제를 달성하였다. 정제된 펩타이드를 동결건조시켜 상응하는 Met(O) 생성물과 함께 백색의 분말로서 원하는 생성물을 제공하였다.
미정제 25와 비닐 팔미테이트의 티올-엔 반응을 상기 기재된 일반 절차에 따라 또한 수행하였다. ESI-MS 및 HPLC 분석을 수행하여 팔미토일화 생성물 26으로의 우수한 전환을 확립하였다. 정제를 반분취용 RP-HPLC에 의해 달성하여, 예를 들어 95% 초과의 순도로 원하는 생성물을 얻었다.
실시예 2. 펩타이드 접합체 20, 22 및 26의 생물학적 활성
2.1 절차
전혈 중의 인간 단핵구의 활성화
100㎕의 헤파린화 전혈(WB)을 각각의 화합물의 100nM, 1μM 및 10μM과 2회 항온처리하고, 5% CO2 습윤 항온처리기에서 37℃에서 밤새 항온처리하였다. Pam3CSK4(10μM; EMC Microcollections)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 단핵구의 활성화를 검출하기 위해, WB 샘플을 실온에서 20분 동안 항-CD14-FITC, 항-HLA-DR-Alexa700, 항-CD80-PE-Cy7, 항-CD40-PE, 항-CD86-APC, 항-CD16-APC-Cy7(모두 Biolegend사제)에 의해 염색하고, 광으로부터 보호하였다. 항온처리 후, 2㎖의 BD FACS 용해물(BD Biosciences)을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 항온처리하고, 이후 얼음처럼 차가운 세척 완충제(PBS, 1% 인간 혈청)에 의해 2회 세척하였다. 데이터 획득을 BD FACS Aria II(Becton Dickinson)에서 수행하고, FlowJo 소프트웨어 버전 7.6.5(TreeStar)를 사용하여 분석하였다. CD14+ HLADR+ 세포에서 게이팅에 의해 단핵구 상의 CD80 수용체 발현을 검출하였다.
HekBlue 세포를 사용한 톨 유사 수용체 2( TLR2 ) 효현작용
HEK-블루(상표명)-hTLR2 및 HEK-블루(상표명)-mTLR2를 Invivogen으로부터 구입하였다. 이 HEK-블루 세포를 리포터 유전자 SEAP(분비된 배아 알칼리 포스파타제) 둘 다 및 각각 인간 또는 쥣과 TLR2의 동시형질감염에 의해 생성하였다. SEAP 리포터 유전자는 5개의 AP-1 및 5개의 NFkB 결합 부위에 융합된 IFN-B 최소 프로모터의 제어 하에 있다. 세포를 제조사의 지시에 따라 배양하였다. 평가 일에, 작제물을 96웰 플레이트에서 20㎕의 용적의 내독소 유리수 중에 선택된 농도로 첨가하였다. HEK-블루(상표명)-hTLR2 또는 HEK-블루(상표명)-hTLR2 세포를 HEK-블루(상표명) 검출 배지 중의 약 2.83x104개 세포/㎖로 재현탁시키고, 즉시 180㎖의 세포 현탁액(웰당 약 5x104개 세포)를 첨가하였다. 세포를 5% CO2 중에 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 635nM에서 EnSpire 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 SEAP 발현을 정량화하였다.
TLR2 -일시적으로 형질감염된 Hek293 세포로부터의 IL-8 분비의 검출 방법
Hek-293 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM(매질을 항생제에 의해 보충하지 않음)을 가지는 96웰 플레이트에서 웰마다 50㎕로 3x104개 세포로 플레이팅하였다. 세포를 \pFLAG-TLR2 플라스미드 및 pcDNA3.1의 조합(문헌[Shimizu, T., Y. Kida and K. Kuwano (2005). "A dipalmitoylated lipoprotein from Mycoplasma pneumoniae activates NF-kappa B through TLR1, TLR2, and TLR6." J Immunol 175(7): 4641-4646]에 보고된 바대로, Shimizu사가 선뜻 기증), 또는 대조군 플라스미드 단독(pcDNA3.1)에 의해 형질감염시켰다. 리포펙타민/DNA 복합체의 마스터 혼합물을 샘플마다 50㎕의 용적으로 0.3㎕의 리포펙타민 중에 100ng DNA에서 Opti-MEM에서 구성하였다. 20분의 항온처리 후, 플라스미드 혼합물을 세포에 첨가하였다. 작제물의 첨가 전에 24시간 동안 단백질 발현을 유도하였다.
작제물을 웰당 200㎕의 최종 용적을 만들도록 선택된 농도에서 웰에 첨가하였다. 18시간의 자극 후, 상청액을 각각의 샘플로부터 수확하고 필요할 때까지 -20℃에서 저장하였다. IL-8 분비를 제조사의 프로토콜에 따라 임의로 1 변형에 의해 Cytometric Bead Array(BD Biosciences)에 의해 결정하였다: 50㎕ 대신에 25㎕의 순화 배지를 사용할 수 있다. 분비된 IL-8의 농도를 정확히 결정하기 위해, 11점 표준 곡선(1 내지 5000ng/㎖)을 수행하였다. 샘플을 BD-FACS Aria II(BD Biosciences)를 사용하여 분석하고, 이후 데이터를 FCAP ARRAY 소프트웨어(버전 1.0.1)를 사용하여 분석하였다.
2.2 토의
새로운 혈액 샘플에서 인간 단핵구 상의 동시자극 분자 CD80의 상향조절을 측정하도록 리포펩타이드 20, 22 및 26의 바이오활성을 유세포분석법에 의해 평가하였다.
단핵구를 특징적인 세포 표면 마커, 및 양성 대조군으로서 작용하는 상업적으로 입수 가능한 Pam3CSK4(10μM)에 의해 3개의 투약량으로 각각의 화합물에 대한 노출 전에 및 후에 결정된 CD80의 발현에 의해 도너 샘플 중에 확인하였다.
시험 리포펩타이드 20, 22 및 26이 예를 들어 양성 대조군 Pam3CSK4와 동등하거나 더 높은 효력에서 시험된 모든 용량에서 CD80의 발현을 강하게 상향조절한다는 것을 보여주는 결과는 효과적인 TLR 효현작용을 나타낸다.
시험 리포펩타이드 20, 22 및 26이 Hek블루(상표명) 및 IL-8 리포터 시스템에서 TLR 효현작용, 예를 들어 적정 가능한 TLR 효현작용을 나타낸다는 것을 보여주는 결과는 효과적인 TLR 효현작용을 나타낸다.
20, 22 및 26의 높은 효력을 보여주는 결과는 항원성 펩타이드의 접합이 TLR2 효현작용에 영향을 미치지 않는다는 발견을 지지한다.
실시예 3. 접합체 200, 120, 121, 110-112, 112A 및 113-116의 제조
3.1 일반 상세내용
보호된 아미노산 및 커플링 시약을 GL-Biochem(Shanghai)으로부터 구입하였다. 고체 지지된 합성에서 사용된 수지는 Rapp Polymere GmbH(Tuebingen)로부터 예비 로딩된 텐타겔(tentagel) 수지이고, 다른 용매 및 시약은 Sigma(미주리주 세인트 루이스) 및 Novabiochem으로부터 얻었다.
트리뷰트 펩타이드 합성장치(Protein Technologies International(아리조나주 투산))에서 표준 반복적 Fmoc 고상 펩타이드 합성 기법을 이용하여 하기 기재된 펩타이드 합성을 수행하였다. 0.1m㏖ 스케일에서 수행된 통상적인 탈보호 및 커플링 사이클은 DMF(4㎖ x 5분) 중의 20% 피페리딘의 2의 처리를 이용한 수지-결합된 아미노산으로부터 Fmoc 보호기의 제거, 이후, DMF에 의한 수지의 세척을 수반하였다. 별개의 용기에서, Fmoc 아미노산(0.5m㏖) 및 커플링제(1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트라이아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU), 0.45m㏖)를 DMF(1.5㎖) 중에 용해시키고, 염기(4-메틸몰폴린, 1m㏖)를 첨가하였다. 1분 동안 혼합 후, 이 용액을 수지로 옮기고, 이것을 실온에서 1시간 동안 교반하고 배수시키고 세척하였다.
수지를 5%(v/v) 에탄다이티올(EDT)을 함유하는 5㎖ 트라이플루오로아세트산(TFA) 중에 현탁시키고 실온에서 3시간 동안 교반함으로써 펩타이드(0.1m㏖ 스케일)의 절단을 달성하였다. 이후, 트라이아이소프로필실란(TIPS)을 1%(v/v)로 첨가하고, 교반을 냉각된 다이에틸 에터(40㎖)로 TFA를 배수하기 전에 추가의 5분 동안 동안 계속하였다. 침전된 재료를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 에터를 버리고, 펠렛을 에터(25㎖)에 의해 1회 세척하고, 공기 건조시키거나 동결건조시켰다.
Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 사용하여 역상(RP)-HPLC를 수행하였다. 반분취용 정제의 경우, 펩타이드 샘플을 용리제 A(물/0.1% TFA) 및 용리제 B(MeCN/0.1%TFA)의 적합한 혼합물 중에 평형화된 역상 Phenomenex Gemini C18 칼럼(5μ, 110Å; 10x250㎜)으로 주입하고, 이후 용리제 B의 증가하는 구배가 생겨서 구성 성분을 용리시켰다. Phenomenex Gemini C18 칼럼(3μ, 110Å; 4.6x150㎜)을 사용하여 분석용 HPLC를 유사하게 수행하였다.
Agilent Technologies 6120 Quadrapole 질량 분광기를 사용하여 저해상도 질량 스펙트럼을 얻었다.
1H NMR에 대해 400MHz에서 및 13C NMR에 대해 100MHz에서 조작되는 Bruker BRX400 분광기를 사용하여 NMR 스펙트럼을 얻었다.
하기 기재된 아미노산 접합체 및 펩타이드 접합체에서, 약어 AcN-C(Pam-1)- 및 H2N-C(Pam-1)-은
Figure pct00038
(여기서, R은 적절한 바대로 Ac 또는 H임)을 의미한다.
3.2 직접 접합에 의한 펩타이드 접합체의 제조
펩타이드
하기 표 3에 도시된 바와 같은, 펩타이드 100 및 102(LMP2 S-2, 서열 번호 10 포함), 103 및 104(LMP2 S-3, 서열 번호 15 포함), 및 105 및 106(LMP2 5-2, 서열 번호 30 포함)을 하기 기재되고 도시된 바대로 합성하였다(반응식 1).
반응식 1
Figure pct00039
(i) 반복적 Fmoc-SPPS; (ii) Fmoc-Cys(Trt)-OH, HATU, NMM, DMF; (iii) 20% 피페리딘/DMF; (iv) Ac2O/NMM, DMF; (v) TFA/EDT; (vi) 비닐팔미테이트, DTT, DMPA, NMP, 365㎚.
반복적 Fmoc-SPPS를 사용한 끝에서 두 번째 아미노산까지의 펩타이드 서열의 합성 후, Fmoc-시스테인을 DMF 중의 Fmoc-Cys(Trt)-OH, HATU 및 4-메틸몰폴린과의 반응에 의해 온-수지 펩타이드의 N 말단 잔기로서 도입하였다. DMF 중의 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc기를 제거하였다. 필요한 바대로, 생성된 아민 기를 DMF(2㎖) 및 4-메틸몰폴린(1m㏖) 중의 20% 아세트산 무수물의 혼합물에 의한 처리에 의해 아세트아마이드로 전환시켰다.
TFA/EDT에 의한 수지로부터의 펩타이드의 절단 및 에터 중의 이의 침전 후, 고체를 1:1 물/MeCN 중에 용해시키고 동결건조시켰다. 펩타이드가 메티오닌 잔기를 함유하는 경우, 용액을 동결-건조 전에 1시간 동안 60℃에서 가열하여, 절단 동안 발생할 수 있는 임의의 S-알킬화를 역전시켰다. 이후, 펩타이드를 RP-HPLC에 의해 정제하여 95% 초과의 재료를 얻었다.
Figure pct00040
펩타이드 접합체
이후, 티올-엔 반응을 펩타이드 100 및 102-106에서 수행하여 상응하는 펩타이드 접합체 110, 112 및 113-116을 생성시켰다(표 4).
DMPA(2.6㎎), 다이티오트레이톨(9.2㎎) 및 비닐 팔미테이트(40mg, m㏖)를 탈기된 NMP(2㎖) 중에 용해시켰다. 이후, 100㎕의 이 용액을 작은 폴리프로필렌 용기로 칭량된 1μ㏖의 펩타이드에 첨가하여 10mM 펩타이드, 5mM DMPA, 30mM DTT 및 50mM 비닐 팔미테이트를 함유하는 용액을 제공하였다. NMP는 반응 조건과 알맞고, 반응 혼합물의 모든 성분을 효과적으로 용매화하였다.
반응 용기를 질소에 의해 수세 처리하고, 격렬하게 교반된 혼합물을 365㎚에서 조작되는 휴대용 6와트 UV 램프(Spectronics(뉴욕주))에 의해 조사하였다. 30분 후, 반응을 HPLC에 의해 분석하고, 원하는 생성물로의 전환율을 결정하였다. 이후, 생성물을 RP-HPLC에 의해 단리하고, 반응하지 않은 출발 물질을 회수하였다.
비아세틸화 N 말단 시스테인을 가지는 펩타이드는 소정의 실시형태에서 환원제 DTT의 존재에도 불구하고 상당한 양의 다이설파이드 이합체를 형성할 것이다. 이것은 상응하는 N-아세틸화 펩타이드에 의해 통상적으로 관찰되지 않는다.
펩타이드 접합체 110 및 113-116을 하기 대안적인 절차(표 4B)에 의해 펩타이드 100 및 103-106으로부터 또한 제조하였다.
이 절차에서, DTT 대신에 tert-뷰틸 머캅탄(tBuSH) 티올을 사용하였다. 소정의 실시형태에서, 이것은 원하는 펩타이드 접합체로의 기질 펩타이드의 증가한 및 더 깨끗한 전환을 발생시켰다.
트라이플루오로아세트산(TFA)을 또한 반응 혼합물로 도입하였다. 소정의 실시형태에서, 이것은 반응 프로필을 추가로 개선한다. 비스-팔미토일화 종을 생성시키는, 생성물 펩타이드 접합체와 비닐 팔미테이트의 제2 분자의 반응에 의해 형성된 적은 부산물인 올리고머의 형성은 TFA의 첨가에 의해 주로 억제되었다.
이 조건 하에 상응하는 설폭사이드로 산화시키는 메티오닌의 임의의 명확한 경향이, 메티오닌 기를 보유하는 이 펩타이드의 미정제 생성물 혼합물의 동결건조, 이어서 TFA 중의 용해 및 메티오닌 옥사이드를 메티오닌으로 다시 환원시키는 테트라뷰틸암모늄 아이오다이드의 처리에 의해, 해결될 수 있다.
통상적인 절차는 하기와 같다. DMPA(6.5㎎)를 탈기된 NMP(0.5㎖) 중에 용해시키고, tert-뷰틸 머캅탄(17㎕)을 첨가하고, 별개의 용기에서 비닐 팔미테이트(11.3㎎)를 탈기된 N-메틸피롤리디논(NMP)(0.5㎖) 중에 용해시켰다. 펩타이드(1μ㏖)를 작은 교반기가 구비된 작은 폴리프로필렌 용기로 칭량하고, 10㎕의 DMPA/tBuSH 용액, 이어서 100㎕의 비닐 팔미테이트 용액을 첨가하여, 대략 10mM 펩타이드, 5mM DMPA, 30mM DTT 및 80mM 비닐 팔미테이트의 용액을 얻었다. 이후, TFA(5.5㎕)를 첨가하여, 5% 용액을 얻었다. 반응 용기를 질소에 의해 수세 처리하고, 격렬하게 혼합된 혼합물을 365㎚에서 조작되는 휴대용 6와트 UV 램프(Spectronics(뉴욕주))에 의해 조사하였다. 20분 후, 추가의 DMPA(10㎕) 및 비닐 팔미테이트(50㎕)를 첨가하고, 조사를 20분 동안 계속하였다.
메티오닌을 함유하는 펩타이드에 대해, 물(0.5㎖) 및 MeCN(0.5㎖)을 첨가하고, 혼합물을 동결건조시켰다. 생성된 고체를 니트 TFA(150㎕) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시키고, 25㎕ TFA 중의 테트라-n-뷰틸암모늄 아이오다이드(3.7㎎, 10μ㏖)를 첨가하였다. 1분 후, 차가운 다이에틸 에터(0.5㎖)를 첨가하여 환원된 리포펩타이드를 침전시키고, 이것을 원심분리에 의해 펠렛화하하고 동결건조시켰다.
반응을 HPLC에 의해 분석하여 원하는 생성물(표 4B)로의 전환을 나타내고, 이것을 이후 RP-HPLC에 의해 단리하였다.
Figure pct00041
3.3 아미노산 접합체의 제조
아미노산 접합체 200, 120 및 121을 하기 기재되고 도시된 바대로 각각 N-α-Fmoc-, N-α-아세틸- 및 N-α-Boc-보호된 시스테인으로부터 제조하였다(반응식 2).
반응식 2
Figure pct00042
(i) 라디칼 개시제, hu(365㎚) 또는 열
고체 N-α-보호된 시스테인을 표시된 용매(표 5) 중의 100mg/㎖의 농도로 용해시키거나 현탁시키고, 비닐 팔미테이트(1.5몰 당량), 이어서 표시된 분량의 개시제를 첨가하였다. 광분해 조건 하에 수행되는 반응을 위해, 용액을 폴리프로필렌 용기 중에 제조하고, DMPA를 표시된 비율(표 5)로 첨가하고, 교반된 혼합물을 이후 365㎚에서 조사하였다. 열 조건 하에 수행된 반응을 위해, 용액을 유리 관에서 제조하고, 표시된 분량의 AIBN(아조비스아이소뷰티로나이트릴)을 첨가하고, 교반된 혼합물을 오일 욕 또는 마이크로파 오븐에서 가열하였다.
반응 진행을 박층 크로마토그래피를 사용하여 모니터링하고, 시스테인 출발 물질의 소모에 기초하여 완료까지 진행시켰다. 이후, 용매를 제거하고, 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트 혼합물에 의해 용리되는 실리카 겔에서 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Fmoc-Cys(Pam-1)-OH(200), Ac-Cys(Pam-1)-OH(120) 및 Boc-Cys(Pam-1)-OH(121)의 정체성은 1H 및 13C NMR 및 질량 분광광도법에 의해 확인되었다.
N-Fmoc-Cys(Pam-1)-OH(200)
Figure pct00043
N-Ac-Cys(Pam-1)-OH(120)
Figure pct00044
N-Boc-Cys(Pam-1)-OH(121)
Figure pct00045
접합 반응을 다양한 조건 하에 수행하고, 이것은 표 5에 요약되어 있다.
Figure pct00046
광분해 조건 또는 열 조건의 사용은 소정의 실시형태에서 바람직하게 높은 수율로 원하는 생성물을 생성시킬 것이다.
3.4 아미노산 접합체의 커플링을 통한 펩타이드 접합체의 제조
펩타이드 접합체 110-116을 하기 기재되고 도시된 바대로 제조하였다(반응식 3).
반응식 3
Figure pct00047
(i) 반복적 Fmoc-SPPS; (ii) Fmoc-Cys(Pam-1)-OH(200), PyBOP, 콜리딘, DMF; (iii) Ac-Cys(Pam-1)-OH(120) 또는 Boc-Cys(Pam-1)-OH(121), PyBOP, 콜리딘, DMF; (iv) 20% 피페리딘/DMF; (v)Ac2O/NMM, DMF; (vi) TFA/EDT.
원하는 펩타이드 서열을 이전에 기재된 바대로 트리뷰트 펩타이드 합성장치를 사용하여 표준 반복적 Fmoc SPPS 기법을 이용하여 합성하였다. 끝에서 두번재 아미노산 잔기를 커플링 후, 수지 결합된 펩타이드 사슬을 이후 DMF 중의 PyBOP 및 콜리딘을 사용하여 아미노산 접합체 N-Fmoc-Cys(Pam-1)-OH 200에 의해 유도체화하였다. 이후, DMF 중의 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc기를 제거하였다.
이후, 보호기의 동반 제거와 함께 TFA/EDT를 사용하여 생성된 펩타이드를 수지로부터 제거하여, 펩타이드 접합체 111, 113 및 115를 얻었다.
대안적으로, 생성된 펩타이드를 DMF(2㎖) 중의 20% 아세트산 무수물 및 4-메틸몰폴린(1m㏖)의 혼합물에 의한 처리에 의해 상응하는 아세트아마이드로 전환시키고 이후 수지로부터 절단하여 펩타이드 접합체 110, 112, 114 및 116을 얻었다.
대안적으로, 수지 결합된 펩타이드를 아미노산 접합체 N-Boc-Cys(Pam-1)-OH 121 또는 N-Ac-Cys(Pam-1)-OH 120에 의해 유도체화하였다. 수지로부터의 절단 시, 이것은 Fmoc기로 인해 필요한 추가의 조작 없이 펩타이드 접합체 110 내지 116을 직접적으로 제공하였다.
아미노산 접합체의 커플링을 위한 조건은 유리하게는 활성화 시 라세미화하는 아미노산의 α-탄소의 경향을 감소시켰다. 아미노산 접합체(0.075m㏖) 및 PyBOP(벤조트라이아졸-1-일-옥시트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)(0.1m㏖)를 합하고 DMF(0.3㎖) 중에 용해시켰다. 니트 2,4,6-트리메틸피리딘(0.1m㏖)을 첨가하고, 30초 동안 혼합한 후, 용액을 0.025m㏖의 수지로 옮기고, 이것을 이후 90분 동안 교반하고 배수하고 세척하였다(DMF).
이후, 실온에서 3시간 동안 5%(v/v) 에탄다이티올을 함유하는 1㎖의 트라이플루오로아세트산 중에 0.015m㏖의 수지를 교반함으로써 펩타이드를 절단하였다. 이후, 상청액을 차가운 다이에틸 에터(10㎖)로 소결로 배수하고, 수지를 추가의 1㎖의 TFA에 의해 세척하고, 이것을 또한 에터에 첨가하였다.
침전된 재료를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 펠렛을 에터(5㎖)에 의해 1회 세척한 후, 1:1 MeCN/물(+0.1%tfa) 중에 용해시키고 동결건조시켰다. 펩타이드가 메티오닌 잔기를 함유하는 경우, 용액을 동결-건조 전에 1시간 동안 60℃에서 가열하였다. 이후, 펩타이드를 RP-HPLC에 의해 정제하고(95% 초과), 이의 정체성은 분석용 RP-HPLC 및 질량 분광광도법에 의해 확인되었다.
실시예 4. 펩타이드 LMP2 S1 및 LMP2 S2의 분석
1.1 일반적인 상세사항
펩타이드 LMP2 S1(DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL, 서열 번호 5) 및 LMP2 S2(SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA, 서열 번호 10)를 본질적으로 상기 기재된 바대로 합성하였다. 이후, 펩타이드를 RP-HPLC에 의해 정제하고(95% 초과), 이의 정체성은 분석용 RP-HPLC 및 질량 분광광도법에 의해 확인되었다.
결과
도 1은 하기 조건 하에 LMP2 S1의 RP-HPLC 트레이스를 보여준다: 칼럼: Phenomenex Gemini C18(5μ 110Å, 4.6x150㎜); 구배: 0-1분, 30분에 걸쳐 5%B 이후 5%B 내지 65%B, 1㎖/분으로 용리, Rt 14.4분.
ESI-MS 트레이스 m/z[M+2H]2+ = 1572.7
도 2는 하기 조건 하에 LMP2 S2의 RP-HPLC 트레이스를 보여준다: 칼럼: Phenomenex Gemini C18(5μ 110Å, 4.6x150㎜); 구배: 0-1분, 30분에 걸쳐 1%B 이후 1%B 내지 61%B, 1㎖/분으로 용리, Rt 16.0분.
ESI-MS 트레이스 m/z[M+2H]2+ = 1448.2
실시예 5. 접합된 LMP2 S4(SK4)의 분석
1.1 일반 상세내용
펩타이드 LMP2 S4(SK4)
(SKKKKSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA, 서열 번호 19)를 합성하고 아세틸화하고 본질적으로 상기 기재된 바대로 Pam1Cys에 접합하여 Pam1-C(Ac)SK4-LMP2 S4를 생성시켰다:
Figure pct00048
이후, 미정제 펩타이드의 정체성은 분석용 RP-HPLC 및 질량 분광광도법에 의해 확인되었다.
결과
도 3은 하기 조건 하에 Pam1-C(Ac)SK4-LMP2 S4의 RP-HPLC 트레이스를 보여준다: 칼럼: Phenomenex Gemini C18(5μ 110Å, 4.6x150㎜); 구배: 0-1분, 30분에 걸쳐 5%B 이후 5%B 내지 65%B, 1㎖/분으로 용리, Rt 21.6분.
ESI-MS 트레이스 m/z[M+3H]3+ = 1977.0
본 발명은 오직 상기 언급된 실시예로 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 당해 분야의 당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 변형이 가능하다.
산업적 이용 가능성
본 발명의 펩타이드, 및 아미노산 및 펩타이드 접합체 및 조성물 및 작제물은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법 및 대상체를 백신접종하는 방법에서의 적용을 포함하는 약제학적 및 의학 분야에서 적용을 발견한다. EBV 잠재 막 단백질 2(LMP2)로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함하는, 예를 들어 자가 아쥬번팅 백신을 포함하는, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 연관 질환, 예컨대 호지킨 질환(HD) 또는 비인두 암종(NPC)을 치료하는 것에 관한 펩타이드 또는 아미노산 및 펩타이드 접합체를 포함하는 약제가 특히 고려된다.
SEQUENCE LISTING <110> BRIMBLE, Margaret Anne DUNBAR, Peter Roderick WILLIAMS, Geoffrey Martyn VERDON, Daniel <120> AMINO ACID AND PEPTIDE CONJUGATES AND USES THEREOF <130> WO2016/103192 <140> PCT/IB2015/059901 <141> 2015-12-22 <150> US 62/096,106 <151> 2014-12-23 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa2 is absent or a hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa3 is absent or a hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln 1 5 10 15 Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence 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amino acid <400> 38 Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Ala <210> 39 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 39 Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro 1 5 10 15 Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu 20 25 30 Leu Leu Leu Ala 35 <210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 40 Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu 1 5 10 15 Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala 20 25 30 <210> 41 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 41 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu 1 5 10 15 Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro 20 25 30 Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu 35 40 45 Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile 50 55 60 <210> 42 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 42 Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp 1 5 10 15 Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu 20 25 30 Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu 35 40 45 Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile 50 55 60 <210> 43 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 43 Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr 1 5 10 15 Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser 20 25 30 Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 35 40 45 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49 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 49 Ser Lys Lys Lys Lys Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu 20 25 30 Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Ala <210> 50 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 50 Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser 1 5 10 15 Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe 20 25 30 Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala 35 40 <210> 51 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 51 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly 20 25 30 Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val 35 40 45 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Lys Lys Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys 20 25 30 Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala 35 40 45 Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu 50 55 <210> 55 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 55 Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe 20 25 30 Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser 35 40 45 Pro Leu Leu 50 <210> 56 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 56 Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr 20 25 30 Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe 35 40 45 Leu Ile Phe Leu Ile 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Lys Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met 1 5 10 15 Cys Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu 20 25 30 Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly 35 40 45 Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala 50 55 <210> 60 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 60 Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn 20 25 30 Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Gly Phe Ala 50 <210> 61 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 61 Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro 1 5 10 15 Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr 20 25 30 Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly 35 40 45 Leu Pro Pro 50 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misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 67 Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg 1 5 10 15 Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met 20 25 30 Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Ala Ala Ser 50 <210> 68 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 68 Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp 1 5 10 15 Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn 20 25 30 Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala 35 40 45 Ala Ile Ala Ala Ser 50 <210> 69 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 69 Ser Lys Lys Lys Lys Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser 1 5 10 15 Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly 20 25 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Synthetic peptide sequence <400> 80 Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 81 Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 82 Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 83 Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu 1 5 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 84 Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly 1 5 10 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 85 Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 86 Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 87 Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 88 Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr 1 5 10 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 89 Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro 1 5 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 90 Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 91 Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 92 Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 93 His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 94 Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr 1 5 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 95 Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile 1 5 10 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 96 Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 97 Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 98 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 99 Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 100 Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 101 Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu 1 5

Claims (95)

  1. 펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로서,
    지질화 아미노산 또는 펩타이드를 제공하는 단계, 및
    상기 지질화 아미노산 또는 펩타이드를 하나 이상의 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 포함하되,
    상기 펩타이드 접합체는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 함유 접합 파트너는 펩타이드 함유 접합 파트너인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 함유 접합 파트너는 에피토프를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 아미노산 접합체의 상기 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하여 펩타이드 접합체를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 펩타이드 에피토프를 포함하는 펩타이드 접합체를 제공하도록 상기 아미노산 접합체의 상기 아미노산 또는 상기 펩타이드 접합체의 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하는 단계를 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 방법은 에피토프를 상기 아미노산 접합체의 상기 아미노산 또는 상기 펩타이드 접합체의 아미노산에 커플링하는 단계를 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  7. 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프는 펩타이드 에피토프인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 에피토프는 링커기를 통해 커플링되거나 결합된, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 함유 접합체가 접합된 상기 펩타이드 접합체의 상기 아미노산은 N 말단 아미노산 잔기인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산은 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 상기 아미노산은 N 말단 아미노산 잔기인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 탄소-탄소 이중 결합 또는 티올을 포함하는 아미노산의 아미노기는 아실화된, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 지질 함유 접합 파트너가 접합된 상기 아미노산 접합체의 상기 아미노산 또는 상기 펩타이드 접합체의 아미노산 잔기의 아미노기를 아실화하는 단계를 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 함유 접합 파트너의 아미노산은 티올을 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 티올은 시스테인 잔기의 티올인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 시스테인 잔기의 아미노기는 C2-20 지방산에 의해 아실화된, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 C2-20 지방산은 아세틸인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 접합체 또는 아미노산 함유 접합 파트너는 하나 이상의 가용화 기를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 가용화 기는 상기 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 연속적 친수성 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 아미노산 서열인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 접합체 또는 아미노산 함유 접합 파트너는 상기 지질 함유 접합 파트너가 접합된 상기 아미노산 잔기에 인접한 세린 잔기를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 펩타이드는 상기 세린 잔기에 인접한 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기의 연속적 서열을 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  22. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 포함 접합 파트너의 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 반응성 작용기는 비보호된, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  23. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 함유 접합 파트너는 펩타이드로 이루어진, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  24. 제1항, 제4항 내지 제10항 및 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 함유 접합 파트너는 아미노산으로 이루어진, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 아미노산의 카복실기는 카복실 보호기에 의해 보호되고/되거나, 상기 아미노산의 아미노기는 아미노 보호기에 의해 보호된, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 함유 접합 파트너는 적어도 4개 또는 적어도 6개의 사슬 연결 원자를 각각 함유하는 하나 이상의 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 지방족 또는 헤테로지방족 사슬을 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 사슬은 이종원자 함유 작용기에 의해 상기 탄소-탄소 이중 결합 또는 상기 티올을 포함하는 모이어티에 공유로 결합된, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 함유 접합 파트너는 하기 화학식 (A1)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00049

    식 중,
    Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 상기 알킬 또는 상기 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    단:
    R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
    m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    임의의 R1, R2, R3, R4, R5, L1 및 L2에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 함유 접합 파트너는 하기 화학식 (B1)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00050

    식 중,
    Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 상기 알킬 또는 상기 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
    p는 0 내지 4의 정수이고;
    R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    R33 및 R44는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    단:
    R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
    p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    임의의 R11, R22, R33, R44, L1 및 L2에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 또는 펩타이드 접합체는 하기 화학식 (A)의 구조를 포함하거나, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00051

    식 중,
    Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 상기 알킬 또는 상기 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R3은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
    R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
    R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬, 또는 C3-6사이클로알킬이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고;
    단:
    R3이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
    m이 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R1은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
  31. 제1항 내지 제27항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 또는 펩타이드 접합체는 하기 화학식 (B)의 구조를 포함하거나, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00052

    식 중,
    Z는 -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NR-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR- 및 -NRC(O)NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R은 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고, 상기 알킬 또는 상기 사이클로알킬은 임의로 치환되고;
    p는 0 내지 4의 정수이고;
    q는 0 내지 2의 정수이고;
    R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    R33, R44, R55, R66, R77, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R33은 L2-C(O)-OC1-6알킬이거나;
    R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
    Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
    단:
    R33이 L2-C(O)-OC1-6알킬일 때, R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이 아니고;
    p가 2 내지 4의 정수일 때, 1개 이하의 R11은 L2-C(O)-OC1-6알킬이고;
    임의의 R11, R22, R33, R44, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb, L1, L2 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, R9는 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나;
    R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고;
    단:
    R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  33. 제1항 내지 제28항, 제30항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 또는 펩타이드 접합체는 하기 화학식 (I)의 구조를 포함하거나, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이며:
    Figure pct00053

    (식 중, m, n, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1 및 A1은 제30항에 정의된 바와 같음);
    상기 방법은, 화학식 (III)의 화합물 내의 티올에 의한 하기 화학식 (II)의 화합물 내의 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 하기 화학식 (III)의 화합물에 의해 상기 화학식 (II)의 화합물을 접합시키기에 효과적인 조건 하에, 상기 화학식 (II)의 지질 함유 접합 파트너와 상기 화학식 (III)의 구조를 포함하는 펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00054

    Figure pct00055
    .
  34. 제1항 내지 제27항, 제29항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 또는 펩타이드 접합체는 하기 화학식 (IA)의 구조를 포함하거나, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이며:
    Figure pct00056

    (식 중, p, q, R11, R22, R33, R44, R55, R66, R77, R8, R9, Ra, Rb, L1 및 A1은 제31항에 정의된 바와 같음);
    상기 방법은, 하기 화학식 (IIA)의 화합물 내의 티올에 의한 하기 화학식 (IIIA)의 화합물 내의 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 상기 화학식 (IIIA)의 화합물에 의해 상기 화학식 (IIA)의 화합물을 접합시키기에 효과적인 조건 하에, 상기 화학식 (IIA)의 화합물과 상기 화학식 (IIIA)의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00057

    Figure pct00058
    .
  35. 제29항, 제31항, 제32항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, p는 0 내지 2의 정수인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, p는 0 또는 1인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  37. 제29항, 제31항, 제32항 및 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R11 및 R22는 p의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  38. 제29항, 제31항, 제32항 및 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, R33 및 R44는 각각 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  39. 제31항, 제32항 및 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, q는 0 또는 1인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  40. 제31항, 제32항 및 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, R55, R66, 및 R77은 각각 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  41. 제31항, 제32항 및 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, Ra 및 Rb는 q의 각각의 경우에 각각 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  42. 제28항, 제30항, 제32항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, m은 0 내지 2의 정수인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, m은 0 또는 1인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  44. 제28항, 제30항, 제32항, 제33항, 제42항 및 제43항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  45. 제28항, 제30항, 제32항, 제33항 및 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, R4 및 R5는 각각 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  46. 제30항, 제32항, 제33항 및 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, R6 및 R7은 각각 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  47. 제30항, 제32항, 제33항 및 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (IV)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    Figure pct00059

    식 중,
    R3은 수소 또는 L2-C(O)-OCH2이고;
    R9는 수소, 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    L3은 C1-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함한다.
  48. 제47항에 있어서, R9는 수소, L3-C(O) 또는 A2이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고;
    단:
    R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  49. 제28항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, L1은 C5-21알킬인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, L1은 선형 C15알킬인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  51. 제28항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, L2는 C5-21알킬인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  52. 제28항, 제30항, 제32항, 제33항 및 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 수소인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  53. 제30항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  54. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, R9는 수소 또는 아미노 보호기이고, 상기 방법은 L3-C(O)에 의해 R9에서 상기 수소 또는 아미노 보호기를 대체하도록 상기 아미노산 접합체 또는 상기 펩타이드 접합체를 아실화하는 단계를 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  55. 제30항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, L3은 메틸 또는 선형 C15알킬인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, L3은 메틸인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  57. 제25항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노 보호기는 Boc 또는 Fmoc인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  58. 제30항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, A1 및/또는 A2는 아미노산 또는 펩타이드인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  59. 제30항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, A1은 OP1 또는 OH이고, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 방법은 아미노산 또는 펩타이드에 의해 A1 및/또는 R9를 대체하도록 아미노산 또는 펩타이드를 커플링하는 단계를 추가로 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  61. 제58항 또는 제60항에 있어서, 상기 펩타이드는 EBV LMP2 에피토프를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  62. 제3항 및 제5항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법:
    a. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    b. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    c. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    d. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    e. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    f. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열;
    g. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    h. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    i. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    j. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    k. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    l. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열;
    m. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    n. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    o. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    p. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    q. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    r. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열, 또는
    s. 상기 (a) 내지 (r)의 2개 이상의 임의의 조합.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 함유 접합 파트너를 상기 아미노산 함유 접합 파트너에 접합시키기에 효과적인 조건은 열 개시제의 열 분해 또는 광화학 개시제의 광화학 분해에 의해 개시된 하나 이상의 유리 라디칼의 생성을 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 열 개시제는 AIBN인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 광개시제는 DMPA인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  66. 제63항 또는 제65항에 있어서, 상기 유리 라디칼 개시제의 광화학 분해는 약 365㎚의 파장을 가지는 자외선에 의한 조사를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 용매를 포함하는 액체 매질 중에 수행되고, 상기 용매는 NMP, DMSO, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 이합체화, 텔로머화 또는 중합을 저해하는 하나 이상의 첨가제의 존재 하에 수행되는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 첨가제는 DTT 또는 tert-뷰틸 머캅탄인, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 아미노산 또는 펩타이드 접합체.
  71. 하기 화학식 (V)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물:
    Figure pct00060

    식 중,
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    n은 1 또는 2이고;
    R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
    R3, R4, R5, R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R9는 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2이고;
    R6 및 R7은 n의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
    L1은 C5-21알킬 또는 C4-20헤테로알킬이고;
    L3은 C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 아미노산 또는 펩타이드이거나; A1은 OH 또는 OP1이고, P1은 카복실 보호기이고, A1 또는 A2는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하거나, A1, A2 또는 A1 및 A2 둘 다는 서열 번호 1 내지 101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드를 포함하고;
    임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, L1 및 L3에 존재하는 임의의 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로알킬은 임의로 치환된다.
  72. 제72항에 있어서, R9는 독립적으로 수소, C1-6알킬 또는 C3-6사이클로알킬이거나; R9는 L3-C(O) 또는 A2이고;
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 펩타이드이거나; A1은 OH이고;
    단:
    A1 및 A2 중 적어도 하나는 EBV LMP2 에피토프를 포함하고;
    R9가 A2가 아닐 때, A1은 펩타이드인, 화합물.
  73. 제72항 또는 제73항에 있어서, L1은 제49항 또는 제50항에 정의된 바와 같은, 화합물.
  74. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, m은 제42항 또는 제43항에 정의된 바와 같은, 화합물.
  75. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, m은 0인, 화합물.
  76. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2는 m의 각각의 경우에 각각 독립적으로 수소인, 화합물.
  77. 제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 수소인, 화합물.
  78. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, R4 및 R5는 각각 수소인, 화합물.
  79. 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, R6 및 R7은 각각 수소인, 화합물.
  80. 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, R8은 수소이고, R9는 수소, 아미노 보호기, L3-C(O) 또는 A2인, 화합물.
  81. 제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, A1은 OP1 또는 OH이고, R9는 수소, 아미노 보호기 또는 L3-C(O)인, 화합물.
  82. 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, L3은 Me인, 화합물.
  83. 제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, A1 및/또는 A2는 아미노산 또는 펩타이드인, 화합물.
  84. 제72항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열 번호 76 내지 101 중 임의의 하나의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프를 포함하는, 화합물.
  85. 제72항 내지 제81항 및 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, A1은 세린이거나, 또는 상기 제1 N 말단 아미노산 잔기로서 세린을 포함하는 펩타이드인, 화합물.
  86. 제72항 내지 제81항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, A1 및/또는 A2는 상기 펩타이드 사슬 내에 2개 이상의 친수성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 가용화 기를 포함하는 펩타이드인, 화합물.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지거나 이들로 이루어진, 화합물:
    a. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    b. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    c. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    d. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    e. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    f. 서열 번호 1 내지 101 중 임의의 하나의 서열;
    g. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    h. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    i. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    j. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    k. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    l. 서열 번호 1 내지 93 중 임의의 하나의 서열,
    m. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 8개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    n. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 10개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    o. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 12개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    p. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 15개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    q. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열로부터의 20개 이상의 인접한 아미노산 잔기;
    r. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나의 서열, 또는
    s. 상기 (a) 내지 (r)의 2개 이상의 임의의 조합.
  88. 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지거나 본질적으로 이것으로 이루어진, 단리된, 정제된 또는 재조합 펩타이드.
  89. 제88항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열 번호 1 내지 75 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진, 펩타이드.
  90. 유효량의 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 펩타이드 접합체 또는 제88항 또는 제89항의 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물, 또는 이들의 임의의 조합, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 유효량의 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 2종 이상의 펩타이드 접합체, 또는 제88항 또는 제89항의 2종 이상의 펩타이드, 또는 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 1종 이상의 펩타이드 접합체 및 제88항 또는 제89항의 1종 이상의 펩타이드의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  92. 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 펩타이드 접합체 또는 제88항 또는 제89항의 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법.
  93. 대상체에서 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 제90항 또는 제91항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 백신접종하거나 면역 반응을 유도하는 방법.
  94. 펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로서, 티올에 의한 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 지질 함유 접합 파트너를 아미노산 함유 접합 파트너에 접합시키기에 효과적인 조건 하에,
    지질 함유 접합 파트너, 및
    아미노산 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 펩타이드 접합체를 제공하도록 상기 아미노산 접합체의 상기 아미노산을 아미노산 또는 펩타이드에 커플링하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 펩타이드 접합체는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
  95. 펩타이드 접합체를 제조하는 방법으로서, 티올에 의한 탄소-탄소 이중 결합의 하이드로티올화에 의해, 지질 함유 접합 파트너를 펩타이드 함유 접합 파트너에 접합시키기에 효과적인 조건 하에,
    지질 함유 접합 파트너, 및
    펩타이드 함유 접합 파트너를 반응시키는 단계를 포함하고,
    상기 펩타이드 함유 파트너는 하나 이상의 EBV LMP2 에피토프를 포함하는, 펩타이드 접합체를 제조하는 방법.
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