CN103534235A - 用于有机分子修饰的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使靶分子中的巯基(R-S-H)或硒基(R-Se-H)烷基化的方法，其中所述方法包括：使包含至少一个巯基的靶分子与通式(I)或(II)的化合物反应：其中R为乙酰基或任一其它的酰基或包含以下任一的基团：

Description

用于有机分子修饰的方法
发明领域
本发明涉及用于有机分子烷基化的方法。
发明背景
翻译后修饰(PTM)为用于调节蛋白功能的基本机制。日益认识到其重要性的一个此类PTM为蛋白赖氨酸(Lys)乙酰化。与酪氨酸(Tyr)/丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)磷酸化类似，Lys乙酰化为可逆的生化过程，其中赖氨酸乙酰转移酶将乙酰基添加至赖氨酸残基的ε氨基。脱乙酰酶以相反的方式起作用从而将它移除。最初在组蛋白中发现，最近也在许多其它的蛋白中观察到赖氨酸乙酰化，表明它在细胞中多样的调节功能。越来越多的证据表明异常的赖氨酸乙酰化与许多疾病状态有关，诸如癌症和神经系统病症。因此，赖氨酸乙酰化生物学的研究是非常重要的并且将引起连续的治疗创新。
尽管多年的深入研究已牢固地确定了赖氨酸乙酰化作为组蛋白遗传外标记在影响核染色质结构和功能中发挥了广泛的作用，大多数单独的乙酰化事件-特别是最近所鉴定的那些事件-的效应仍待阐明。遗传学、细胞生物学以及特别是蛋白组学中最近的研究已在大量非组蛋白蛋白中鉴定了赖氨酸乙酰化。这些修饰中大多数的功能是未知的。作为主要的限制因素，包含感兴趣的乙酰化的赖氨酸(“Lys-Ac”)残基的均质蛋白样品的缺乏经常阻碍了蛋白赖氨酸乙酰化的研究。此类均质乙酰化的蛋白为用于经由生物物理学和生物化学的方法辨别具体的Lys-Ac PTM的结构和功能效应的非常宝贵的试剂。
一些方法用于制备位点特异修饰的蛋白，诸如利用琥珀终止密码子/tRNA对抑制剂的非天然的氨基酸突变和蛋白化学合成，但是对这些方法广泛应用在整个生物科学研究领域而言，仍存在显著的技术壁垒。然而，非天然的氨基酸突变不是广泛地可用，因为它是专利技术；而蛋白化学合成需要训练有素的化学家的丰富的专业知识，并且在技术上非常有挑战性以及劳动密集型的。
另一个已知的方法是基于非天然的氨基酸突变和化学修饰的组合应用，从而产生乙酰基赖氨酸类似物但是修饰的氨基酸丢失了光学纯度。重组蛋白的酶促赖氨酸乙酰化好像是一有吸引力的方法。然而，考虑到赖氨酸乙酰基转移酶的混乱和不完整的酶促反应性质，如果不可能分离出来或表征期望的乙酰化产物的话，它难以用于结构和功能研究。
对其它确实提供了必要的特异性的酶促反应而言，它们经常必须在大的高分子复合物的情况下起作用，诸如借助于其它接合体分子，这使得它们几乎没有实际价值。
因此高度期望用于在重组蛋白中选择性装配乙酰化的Lys残基的化学方法。显然，在正常蛋白中许多可能的赖氨酸残基存在下，具体的赖氨酸残基的直接乙酰化在化学上是不可行的。
已经广泛地利用了作为软亲核试剂的半胱氨酸(Cys)的巯基的独特反应性用于选择性蛋白修饰。以前，研发化学方法用于将接近等量的N-甲基-赖氨酸的类似物装配在重组蛋白上(参见下文的方案I)。方法基于Cys残基的巯基与溴化氨乙基或氯化氨乙基的传统的烷基化反应，这产生了氨乙基半胱氨酸，其为已知的赖氨酸等价物。
当烷化剂更改为N-甲基氨乙基卤化物时，产生了N-甲基化的氨乙基半胱氨酸残基或N-甲基硫代Lys(“硫醛Lys(Me)”)，其已经显示了与天然的Lys(Me)功能性相似。
方案I
Figure BDA0000415461900000021
同样地，提出相似的策略以通过利用半胱氨酸巯基的独特的反应性制备天然的Lys(Ac)残基的近似模拟物。然而，使Cys巯基与相似的N-乙酰基-氨乙基溴化物和N-乙酰基-氮杂环丙烷烷基化的尝试未能产生期望的产物(参见方案IIa)。
在现有技术下进一步的努力引起甲基硫代羰基-氮杂环丙烷作为烷化剂的发展，从而提供作为N-乙酰基-Lys模拟物的甲基硫代羰基-硫代Lys(参见方案IIb)。尽管烷基化反应是成功的而且合成的甲基硫代羰基-硫代Lys被证明是公认的含有溴结构域的蛋白和抗-乙酰基-Lys抗体，在硫代氨基甲酸酯部分中羰基和甲基之间大的硫原子的存在使得它只是Lys(Ac)中乙酰胺部分的远亲类似物。从空间位阻和电化学的观点来看，乙酰基和甲基硫代羰基之间存在着明显的相当大的差异(参见方案IIb中的结构)，这可以解释了为什么硫代氨基甲酸酯修饰对组蛋白脱乙酰酶裂解有抵抗力。
方案II
Figure BDA0000415461900000031
显然，类似于2-氨乙基-半胱氨酸(即硫代赖氨酸)和N-甲基-硫代赖氨酸，各自为理想的赖氨酸和N-甲基-赖氨酸模拟物，最好的Lys(Ac)模拟物仍然为N-乙酰基-4-硫代赖氨酸或sLys(Ac)，其中硫醚键为天然的Lys(Ac)中γ-亚甲基的近似电子等排取代。由于这一取代的位置离乙酰胺相当的远-2个碳原子，因此预计这一Lys(Ac)模拟物和它的天然的配对物在它们展示的物理化学特征和生物化学特征之间差异不大。不幸地，目前利用N-乙酰基-氨乙基溴化物或碘化物和N-乙酰基-氮杂环丙烷相似的烷基化反应的尝试在产生具有可接受的产率和选择性的乙酰基-硫代赖氨酸方面不成功。
而且，在蛋白可以接受的条件下，用卤代烷或等价的氮杂环丙烷的亲核取代(方案IIa)不能用于选择性使巯基烷基化，所以必须提供不同的烷基化方法。
因此，需要提供克服或改善了上文所公开的一个或多个劣势的用于使Cys的巯基烷基化从而获得Lys(Ac)模拟物的方法。此外，此类方法也可用于将其它的修饰(例如聚乙二醇化和泛素化)装配在含有巯基的化合物上，诸如肽或蛋白。
发明概述
在第一方面，提供了使靶分子中的巯基(R-S-H)或硒基(R-Se-H)烷基化的方法，其中所述方法包括：使包含至少一个巯基的靶分子与通式(I)或(II)的化合物反应：
Figure BDA0000415461900000041
其中R为乙酰基或任一其它的酰基或包含以下任一的基团：
Figure BDA0000415461900000042
或
其中通式(II)中R也可以为烷基；以及其中R’选自氢、甲基和乙基。
在一实施方案中，靶分子为有机化合物。在一实施方案中，有机化合物为肽或蛋白分子。仍然在另一实施方案中，肽选自寡肽、多肽或合成肽。还在另一实施方案中，蛋白分子选自重组蛋白和蛋白复合物。所公开的方法的一个重要的方面存在于在不会使蛋白变性或平衡其结构完整性的条件下，它在蛋白分子上进行的能力。
在一实施方案中，所公开的方法有利地提供了简单的、一步的过程用于修饰存在于靶分子上的一个或多个氨基酸残基，诸如生物素、组蛋白或泛素蛋白。在一实施方案中，所公开的方法能够修饰特异的氨基酸残基从而形成乙酰化的赖氨酸的理想模拟物。在一实施方案中，所公开的方法选择性地修饰靶分子上的一个或多个半胱氨酸残基从而形成乙酰化的赖氨酸的理想模拟物。更具体地，所公开的方法涉及经由与适当的烷化剂反应一个或多个半胱氨酸残基的烷基化，从而形成乙酰化的赖氨酸类似物。形成的乙酰化的赖氨酸类似物的类型取决于反应中所使用的特异的烷化剂。
在一实施方案中，烷化剂为上文所述的通式(I)或(II)的化合物。有利地，本发明人已发现烷化剂能够与半胱氨酸残基上存在的巯基反应，从而形成N-乙酰基-4-硫代赖氨酸，其中硫醚键为天然的乙酰化的赖氨酸中4-亚甲基的近似电子等排取代。由于这一取代的位置在空间上远离乙酰胺(2个碳原子)，因此这一模拟物和天然的乙酰化的赖氨酸在物理化学特征和生物化学特征之间几乎检测不到差异。
有利地，所公开的方法克服了困扰现有技术方法的低产率和低选择性可行性的技术难题。相比之下，所公开的方法是很强劲的，在相当短的30分钟-2小时或更少的反应时间内提供了Lys-Ac模拟物(例如N-乙酰基-4-硫代赖氨酸)接近100%的产率。
在另一方面，提供了如上文定义的通式(I)的化合物作为用于使靶分子烷基化的烷化剂的用途。
还在另一方面，提供了如上文定义的通式(II)的化合物作为用于使含巯基(R-S-H)或硒基(R-Se-H)靶分子烷基化的烷化剂的用途。
仍然在另一方面，提供了通式(I)的化合物用于将乙酰化的赖氨酸残基类似物装配在靶分子中的用途。
在另一方面，提供了药物组合物，其包含根据上文所定义的方法修饰的靶分子。
定义
下列本文所用的词语和术语具有所示的意义：
词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中删掉。
除非有特定说明，术语“包含着”和“包含”，及其语法上的变体，意图是代表“开放的”或“相容的”语言，从而使得它们包括列举的元素，而且还允许额外的未列举的元素包括在内。
如本文所用的，术语“约”，在制剂组分浓度的上下文中，通常意为+/-5%的设定值，更通常为+/-4%的设定值，更通常为+/-3%的设定值，更通常为+/-2%的设定值，甚至更通常为+/-1%的设定值，并且甚至更通常为+/-0.5%的设定值。
贯穿本公开内容始终，某些实施方案可以值域格式公开。应理解的是值域格式的描述只是为了方便和简洁，并且不应该理解为所公开值域的范围的僵化限制。因此，应认为值域的描述具有明确公开的所有可能的亚值域以及在那一值域内的单独的数值。例如，应认为诸如1-6的值域的描述具有明确公开的亚值域，诸如1-3，1-4，1-5，2-4，2-6，3-6等，以及值域内单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论值域幅度，这均适用。
优选实施方案的公开
现在公开根据第一方面的方法的示例的、非限制实施方案。
在一实施方案中，所公开的方法包括使靶分子的巯基烷基化，其中巯基为半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸残基的巯基。在一实施方案中，巯基为半胱氨酸残基的巯基。
在一实施方案中，通式(I)或(II)的化合物的R基可为酰基，其中酰基为脂族酰基，或脂环族酰基，或芳族酰基，或氨酰基，或肽酰基，或蛋白酰基。
在一实施方案中，通式(I)或(II)的R基为脂族酰基，并且其选自直链脂族酰基，支链脂族酰基，叔丁氧羰基，叔丁氧羰基衍生物、苄氧羰基和苄氧羰基衍生物。
在一实施方案中，酰基选自具有1个-20个或1个-7个碳原子的直链脂族酰基，具有1个-7个碳原子的支链脂族酰基，以及聚(乙二醇)部分。
在另一实施方案中，酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、2-丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、烯丙基羰基、环己甲基羰基、以及诸如环丙基羰基、环戊基羰基、环己基羰基和1-环己烯基羰基的C3-C6环烷基羰基。
还在另一实施方案中，通式(I)或(II)的R基为芳族酰基，并且其选自苯甲酰基、4-甲基苯甲酰基和4-甲氧基苯甲酰基。
在另一实施方案中，通式(II)的R基为烷基，其中烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十八烷基、聚(乙二醇)乙基和聚(乙二醇)丙基。示例性烷基可以包括但不限于HO(CH2CH2O)n-CH2CH2-，CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2-，和CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2-。
在一实施方案中，烷化剂为通式(I)的化合物，其中R为乙酰基并且R’为氢，n为0(即N-乙烯基乙酰胺或“NVA”)。
还在另一实施方案中，烷化剂为通式(I)的化合物，其中R为丙酰基(CH3CH2C(O)-)，R’为氢并且n为0(即烷化剂为N-乙烯丙酰胺)。
仍然在另一实施方案中，烷化剂为通式(I)的化合物，其中R为丁酰基(CH3CH2CH2C(O)-)，R’为氢并且n为0(即烷化剂为N-乙烯丁基酰胺)。
在另一实施方案中，烷化剂为通式(II)的化合物，其中R为CH3C(O)-，即乙酸乙烯酯。
另一实施方案中，烷化剂为通式(I)的化合物，其中R为CH3C(O)-，R’为H并且n为1，即烷化剂为N-烯丙基乙酰胺。
仍然在另一实施方案中，烷化剂为通式(I)的化合物，其中R为CH3C(O)-，R’为CH3并且n为0，即N-甲基-N-乙烯乙酰胺。
还在另一实施方案中，烷化剂为通式(I)的化合物，其中R为选自肽酰基或蛋白酰基的酰基，R’为H并且n为0。
在一实施方案中，NVA和巯基之间的烷化反应可通过下文所示的方案III所代表。
方案III
Figure BDA0000415461900000081
如从方案III可以见到的是，半胱氨酸巯基和N-乙烯乙酰胺之间的巯基-烯连接直接地在一步反应中产生期望的乙酰基-硫代赖氨酸。
在一实施方案中，以下方案IV中所示的三个一般步骤可描述方案III中反应的反应机制：
方案IV
所公开的方法还可包括用紫外线(UV)放射辐照反应混合物的步骤。辐照步骤还可包括将光引发剂添加至反应混合物。光引发剂可以为水溶性的光引发剂。光引发剂可以为偶氮型引发剂。在一实施方案中，光引发剂为化合物2,2’-偶氮二异丁腈[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二氢氯化物(“VA-044”)。在另一实施方案中，光引发剂为化合物苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(“LAP”)。
所公开的方法还可包括在额外的巯基化合物存在时进行烷基化反应。有利地，额外的巯基化合物可用来抑制不期望的游离基链调聚反应的副反应。在一实施方案中，出于额外的巯基化合物与游离基中间型反应的能力选择额外的巯基化合物从而防止中间型与另一NVA分子反应，所述游离基中间型通过将含硫游离基添加至NVA乙烯双键形成。在一实施方案中，额外的巯基化合物为谷胱甘肽。在一实施方案中，谷胱甘肽以其还原型使用。
在一实施方案中，可在pH4-7在乙酸盐缓冲液中并且在处于365nm的UV辐照下作为引发剂的VA-044存在时进行烷基化反应。
在一实施方案中，额外的巯基化合物与NVA的摩尔比率为约3:10。在一实施方案中，额外的化合物与NVA与光引发剂的摩尔比率为约3:10:1。
在另一实施方案中，额外的巯基化合物与NVA的摩尔比率可选自1:10、2:10、3:10、4:10、5:10、6:10、7:10、8:10、9:10和1:1。
所公开的摩尔比率也可应用在其中烷化剂不是NVA的本发明的实施方案。
附图简要说明
附图示例了公开的实施方案并且用于解释公开的实施方案的原理。然而应理解的是，设计附图仅出于示例的目的，而不作为本发明限制的定义。
图1A为C18分析高压液相色谱(“HPLC”)，其监测在pH4.0，苄巯醇(BM)和N-乙烯基-乙酰胺(“NVA”)之间的巯基-烯连接反应，其中峰a对应BM；峰b对应产物；峰c对应副产物1，即结合到BM的NVA二聚体；以及峰d对应副产物2，结合到BM的NVA三聚体。
图1B显示了图1A峰b的电喷雾离子化-质谱仪(“ESI-MS”)谱。
图1C显示了图1A峰c的ESI-MS谱。
图1D显示了图1A峰d的ESI-MS谱。
图2显示了图1的巯基-烯反应的反应产物的1H NMR谱。
图3显示了图1的巯基-烯反应的副产物的1H NMR谱。
图4A显示了在pH4.0，肽1和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:肽1；峰b:产物。
图4B显示了峰a的ESI-MS谱。
图4C显示了峰b的ESI-MS谱。
图5A显示了在pH6.0，肽1和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:产物；峰b:肽1和谷胱甘肽之间二硫键连接的副产物。
图5B显示了峰a的ESI-MS谱。
图5C显示了峰b的ESI-MS谱。
图6A显示了在pH4.0，肽2和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:肽2；峰b:产物。
图6B显示了峰a的ESI-MS谱。
图6C显示了峰b的ESI-MS谱。
图7A显示了在pH4.0，肽3和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:肽3；峰b:期望产物；峰c:氧化产物。
图7B显示了峰a的ESI-MS谱。
图7C显示了峰b的ESI-MS谱。
图7D显示了峰c的ESI-MS谱。
图8A显示了在pH4.0，肽4和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:肽4；峰b:产物。
图8B显示了峰a的基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱仪(“MALDI-TOF MS”)谱。
图8C显示了峰b的MALDI-TOF MS谱。
图9A显示了在非标准条件下肽底物4和NVA之间巯基-烯连接反应的MALDI-TOF MS谱，所述非标准条件即没有添加谷胱甘肽(其它条件是相同的)。
图9B显示了如果添加15mM三(2-羧乙基)三氢化磷(“TCEP”)以取代谷胱甘肽MALDI-TOF MS谱。
图10A显示了在pH4.0，肽底物5和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:肽5；峰b:期望产物；峰c:氧化产物。
图10B显示了峰a的MALDI-TOF MS谱。
图10C显示了峰b的MALDI-TOF MS谱。
图10D显示了峰c的MALDI-TOF MS谱。
图11A显示了在pH4.0，泛素K48C和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:泛素K48C；峰b:产物。
图11B显示了峰a的MALDI-TOF MS谱。
图11C显示了峰b的MALDI-TOF MS谱。
图12A显示了在pH7.0，泛素K48C和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。
图12B显示了原始的和解卷积的产物质量的ESI-MS谱。
图13A显示了在pH4.0，在二甲基硫的存在和不存在下H4K16C和NVA之间巯基-烯连接反应的C4半制备型HPLC谱。峰a:H4K16C；峰b:期望产物；峰c:氧化产物。
图13B为原始的和解卷积的起始材料H4K16C(峰a中显示)的质量的ESI-MS谱。
图13C为原始的和解卷积的峰b质量的ESI-MS谱。
图13D为峰c的MALDI-TOF MS谱。
图14A显示了在pH7.0，H4K16C和NVA之间巯基-烯连接反应的C4半制备型HPLC谱。峰a:期望产物；峰b:氧化产物。
图14B为原始的和解卷积的峰a质量的ESI-MS谱。
图15A为在pH4.0，H3K27C和NVA之间巯基-烯连接反应的C4半制备型HPLC谱。峰a:H3K27C；峰b:产物。
图15B为原始的和解卷积的峰a质量的ESI-MS谱。
图15C为原始的和解卷积的峰b质量的ESI-MS谱。
图16显示了SIRT2介导的脱乙酰测定的结果。
图16A显示了在SIRT2测定中肽1与装配的乙酰基-赖氨酸类似物的C18分析型HPLC谱。峰a:解卷积的产物；峰b:Ac-FQPKKS(Ac)G-NH2。
图16B为SIRT2测定中天然的K(Ac)-肽底物的C18分析型HPLC谱。峰c:解卷积的产物；峰b:天然的肽底物。
图16C为峰a的ESI-MS谱。
图16D为峰b的ESI-MS谱。
图16E为峰c的ESI-MS谱。
图16F为峰d的ESI-MS谱。
图17为原始的和解卷积的烷基化的产物H4KS16的质量的ESI-MS谱。
图18A显示了抗-H4K16Ac抗体在H4蛋白:H4K16C和H4KS16Ac.上的蛋白印迹。
图18B显示了Ac-FQPKKs(Ac)G通过SIRT216小时后的脱乙酰测定。
图18C显示了H4K16脱乙酰作用对核小体阵列的影响，如从Mg2+-诱导折叠之前(没有Mg2+，空心符号)和Mg2+-诱导折叠之后(1.0mMMgCl2，实心符号)核小体阵列的沉降分布中可见的折叠。
图19A显示了肽1和N-乙烯基丙酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:产物；峰b:肽1。
图19B显示了峰a的ESI-MS。
图20A显示了肽1和N-乙烯基丁酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:产物；峰b:肽1；峰*:未鉴定的峰。
图20B显示了峰a的ESI-MS。
图21A显示了肽1和N-甲基-N-乙烯基乙酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:产物；峰b:肽1。
图21B显示了峰a的ESI-MS。
图22A显示了肽1和乙酸乙烯酯之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:产物；峰b:肽1；峰*:未鉴定的峰。
图22B显示了峰a的ESI-MS。
图23A显示了肽1和N-烯丙基乙酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。峰a:产物；峰b:肽1。
图23B显示了峰a的ESI-MS。
图24显示了分离产物的ESI-MS，所述分离产物形成于RLYRAG-乙烯基酰胺和巯基乙酸甲酯之间巯基-烯连接反应。
实施例
本发明的非限制实施例将参考特定的实施例进一步地详尽描述，其不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。
在下列的方法中，所用的氨基酸和连接剂商购于GL Biochem(中国上海)和Novabiochem(德国)。人去乙酰化2(SIRT2)酶、NAD+和测定缓冲液商购于Enzo Life Sciences(美国纽约)。组蛋白H4K16Ac抗体来自于Active Motif(美国加利福尼亚)。所有其它的化学试剂都商购于商业供应商。
分析和半制备型HPLC在装有SPD-M20A突出的二极管阵列检测器的Shimadzu HPLC系统上进行。C18反相柱(Jupiter5μm300A,250*4.6mm)用于分析型HPLC。C18反相柱(Jupiter5μm300A,250*10mm)和C4反相柱(Vydac5μm300A,250*10mm)用于半制备型HPLC。使用两种溶剂的梯度混合物洗脱分析物：溶剂A为含有0.05%三氟乙酸(TFA)的去离子水并且溶剂B为含有0.05%TFA和90%乙腈(CAN)的去离子水。对分析型HPLC而言移动相流速为1mL/分钟，对半制备型HPLC而言移动相流速为2.5mL/分钟。
使用装有电喷雾离子化(ESI)离子源的Thermo FINNIGAN LCQ DecaXP MAX或利用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质的4800MALDI TOF/TOF分析仪测量肽或蛋白质量。
实施例1：NVA和苄巯醇之间巯基-烯连接反应的模型研究
为演示巯基-烯连接机制，将不同浓度的N-乙烯基-乙酰胺(NVA)和苄巯醇(BM)混合在0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.0，从乙酸和乙酸钠制备)中。其后，将5mM引发剂VA-044(2,2’-偶氮二异丁腈[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二氢氯化物)添加在0.5ml薄壁透明管(Axygen,Inc.,旧金山,美国)中。将含有反应混合物的管置于Cole Parmer9818-系列暗室UV光箱中灯(365nm)下约10cm在室温下30分钟以获得反应产物，小的有机巯基化合物苄巯醇(BzSH)。
通过C18分析型HPLC监测反应并且结果显示在图1A中。还通过电喷雾离子化质谱仪(ESI-MS)确认结果并且显示在图1B、1C和1D中。HPLC条件为50分钟内含0%-50%缓冲液B的缓冲液A。
如图1A(i)中所见，当NVA和BM各自处于1mM浓度时，只检测到BM峰(峰a所示)。检测不到BzSH峰(峰b所示)。在图1A(ii)和1A(iii)中，当NVA和BM各自处于5mM和10mM浓度时，随着辐照时间延长BzSH转换没有改善，如由峰a的存在所证明。如图1A(iv)、1A(v)和1A(vi)中所见，其中与BM比较添加过量的NVA，获得完全的BzSH转换，如BM峰a的存在所证明的。
然而，在图1A(iv)、1A(v)和1A(vi)中，观察到额外的峰c和d。峰c的存在是由于与BM结合的NVA二聚体的副产物并且峰d的存在是由于与BM结合的NVA三聚体的副产物。
还通过ESI-MS表征峰b。在图1B中，显示了BzSH的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有210.02的m/z值并且分子量209.09。
还通过ESI-MS表征峰c。在图1C中，显示了NVA二聚体副产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有295.08的m/z值并且分子量294.14。
还通过ESI-MS表征峰d。在图1D中，显示了NVA三聚体副产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有380.12的m/z值并且分子量379.19。
反应产物BzSH(在氘代氯仿(CDCL3)溶剂中)的分子结构和1H NMR谱显示在图2中。NVA二聚体副产物(在CDCL3溶剂中)的分子结构和1HNMR谱显示在图3中。
这一实施例展示了经典的游离基巯基加成反应的机制并且帮助解释了副产物的形成。在游离基链转移的关键的限速步骤(方案IV，步骤3)中，在方案IV第2步骤形成的碳游离基通常更可能与巯基分子反应，产生另一个含硫游离基。然而，在过量的烯化合物(NVA)存在时，有时碳游离基也可以与其它的NVA分子反应，这种现象称为调聚反应(参见上文的方案IV)。因此，谷胱甘肽的添加能够抑制这种副反应，因为它可以担当游离基链转移剂并且参与方案IV第3步骤。
实施例2-6和可比较的实施例
用于烷基化的肽底物的合成
为获得含有Cys的肽，利用标准的芴甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成技术合成作为C末端羧基酰胺的五种模型肽。Rink-amide4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂用于合成。通过用含20%哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)处理两次(第一次2分钟并且第二次20分钟)除去Fmoc保护基。
所有氨基酸与4摩尔当量(当量的)的树脂混合，使用4当量的苯并三唑-1-基-三氧吡咯烷磷六氟磷酸盐(PyBOP)和8当量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)进行连接2小时。
在实施例4和5中，在最后的连接步骤使用D-生物素用来合成肽底物3和4，如以下的表1详细显示。序列组装之后，通过使用TFA:H2O:三异丙基硅烷:2-巯基乙醇混合物以94:2.5:2.5:1的比率在室温下3小时进行最终的脱保护和裂解。然后用二乙醚沉淀肽并且冻干。通过C18半制备型HPLC纯化粗产物肽。
实施例2-6中获得的含有Cys的肽的序列列举在下列的表1中。
表1
Figure BDA0000415461900000151
而且，合成了两种没有Cys残基的对照的肽底物：Ac-Phe-Gln-Pro-Lys-Ser-Gly-NH2和Ac-Phe-Gln-Pro-Lys-Lys(Ac)-Gly-NH2。
肽底物的烷基化
在反应管中在pH40.2M乙酸盐缓冲液中混合15mM谷胱甘肽、50mM N-乙烯基-乙酰胺(NVA)和2,2’-偶氮二异丁腈[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二氢氯化物(VA-044)以获得反应混合物。将反应混合物以下列表2中详尽描述的量添加至每一合成的肽底物。
在365nm紫外线(UV)下辐照反应管30分钟或1小时以获得反应产物。通过C18分析型HPLC分析反应产物并且通过ESI或基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析法(MALDI-TOF MS)确认反应产物。质谱显示于图4-8中。在每一脱盐的样品或HPLC纯化的部分上进行MS分析(使用C18zip-tip)。
表2
实施例2的反应的C18分析型HPLC谱显示在图4A中。在图4A中，实施例2中的肽底物1为峰a所示，而反应产物为峰b所示。
还通过ESI-MS表征峰a。在图4B中，显示了肽底物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有720.29的m/z值并且分子量719.34。
还通过ESI-MS表征峰b。在图4B中，显示了反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有805.28的m/z值并且分子量804.39。
实施例2中所用的HPLC条件40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
以pH6代替，其他条件保持相同进行肽底物1可比较的实施例。可比较的实施例的反应的C18分析型HPLC谱显示于图5A中。在图5A中，反应产物由峰a所示，而肽底物1和谷胱甘肽之间的二硫键连接的副产物由峰b所示。
还通过ESI-MS表征峰a。在图4B中，显示了反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有805.37的m/z值并且分子量804.39。
还通过ESI-MS表征峰b。在图5C中，显示了副产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有1025.36的m/z值并且分子量1024.66。
在这一可比较的实施例中，检测到肽底物和谷胱甘肽之间的二硫键交联的副产物的微量形成(即小于3%)。这看起来是由于谷胱甘肽样品中少量谷胱甘肽氧化型的存在，其在高pH值pH6下与肽底物中的Cys巯基发生了二硫键交换。在低pH值(例如pH4)下，此类交换反应被抑制。因此，可以得出结论应该使用新的纯谷胱甘肽(还原型)样品。而且，应该对缓冲液进行脱气从而避免谷胱甘肽的氧化。
可比较的实施例中所用的HPLC条件为40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
实施例3的反应的C18分析型HPLC谱显示于图6A中。在图6A中，实施例3中的肽底物2由峰a所示，而反应产物由峰b所示。
还通过ESI-MS表征峰a。在图6B中，显示了肽底物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有805.26的m/z值并且分子量804.42。
还通过ESI-MS表征峰b。在图4B中，显示了反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有890.32的m/z值并且分子量889.47。
实施例3中所用的HPLC条件为30分钟内含0%-30%缓冲液B的缓冲液A。
实施例4的反应的C18分析型HPLC谱显示于图7A中。在图7A中，实施例4中的肽底物3由峰a所示，期望的反应产物由峰b所示并且氧化产物由峰c所示。
还通过ESI-MS表征峰a。在图7B中，显示了肽底物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有869.34的m/z值并且分子量869.04。
还通过ESI-MS表征峰b。在图7C中，显示了期望的反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有954.41的m/z值并且分子量954.09。
还通过ESI-MS表征峰c。在图7D中，显示了氧化反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有970.39的m/z值并且分子量980.08。
实施例4中所用的HPLC条件为30分钟内含0%-30%缓冲液B的缓冲液A。
实施例5的反应的C18分析型HPLC谱显示于图8A中。在图8A中，实施例5中的肽底物4由峰a所示，并且反应产物由峰b所示。
还通过MALDI-TOF MS表征峰a。在图8B中，显示了肽底物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有1892.68的m/z值并且分子量1890.99。
还通过MALDI-TOF MS表征峰b。在图8C中，显示了反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有1977.93的m/z值并且分子量1976.04。
实施例5中所用的HPLC条件为30分钟内含0%-30%缓冲液B的缓冲液A。
在非标准的条件下进行肽底物4的可比较的实施例。当不添加谷胱甘肽并且保持所有其它条件相同时，反应产物的MALDI-TOF MS显示于图9A中。如图9A中所见，除了期望的巯基-烯连接产物之外还检测到额外的副产物。副产物是由于Cys残基被二、三和四聚体的NVA烷基化所致。而且，当谷胱甘肽被15mM三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)代替，保持所有其它条件相同时，反应产物的MALDI-TOF MS显示于图9B中。如图9B中所见，发生了脱硫反应从而产生了-32MW的产物。因此，还原剂TCEP的添加实际上对反应是不利的，因为它导致了肽底物的脱硫化。
因此，可以得到结论是谷胱甘肽与肽底物4一起参与了关键的限速链转移步骤，从而有效地拦截(或淬火)形成于含硫游离基加成至NVA乙烯双键的步骤的碳自由基中间体，从而避免了它与另一个NVA分子反应。正如预期的，所有的谷胱甘肽也在反应中被NVA烷基化。
实施例6的反应的C18分析型HPLC谱显示于图10A中。在图10A中，实施例6中的肽底物5由峰a所示，期望的反应产物由峰b所示并且氧化的巯基产物由峰c所示。
还通过MALDI-TOF MS表征峰a。在图10B中，显示了肽底物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有1395.74的m/z值并且分子量1394.52。
还通过MALDI-TOF MS表征峰b。在图10C中，显示了期望的反应产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有1735.89的m/z值并且分子量1734.72。
还通过MALDI-TOF MS表征峰c。在图10D中，显示了氧化的巯基产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有1751.96的m/z值并且分子量1750.71。
实施例6中所用的HPLC条件为30分钟内含0%-30%缓冲液B的缓冲液A。
因此可以从实施例6得出结论的是因为肽底物5在其序列中包含4个Cys残基，1.25mM肽5足以在干净的四-烷基化反应中获得期望的反应产物，产率95%，如上文表2所示。
用对照的没有Cys残基的肽Ac-Phe-Gln-Pro-Lys-Ser-Gly-NH2进行可比较的实施例。没有检测到反应产物。
而且，在不存在UV辐照的情况下进行可比较的实施例。检测不到反应产物。
实施例7-9
用于烷基化作用的蛋白底物的合成
泛素K48C的制备
通过QuikChangeTM定点突变试剂盒(Stratagene)将K48C点突变导入到泛素基因，引物为：Ubi K48C F:5’-GTCTGATATTTGCCGGCTGTCAGCTGGAGGATGGCCG-3’；和Ubi K48C R:5’-CGGCCATCCTCCAGCTGACAGCCGGCAAATATCAGAC-3’。
将含有泛素K48C基因的质粒转化到BL21(DE3)细胞。细胞生长在含有氨苄青霉素的1L LB培养基中直到0.6OD600并且被最终浓度0.5mM IPTG在37℃下诱导4小时。在4℃下以6000rpm离心10分钟后，将细胞再悬浮在50ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1mMDTT,pH7.5)中并且通过微射流(Microfluidics,Newton,USA)打碎。在4℃下以25,000g离心30分钟后，以比例为350μl-50ml裂解缓冲液添加70%高氯酸至上清液。搅拌混合物10分钟并且在4℃下以25,000g离心30分钟。用0.2μm过滤器过滤上清液并且用3.5kDa临界透析管相对50mM乙酸铵缓冲液(pH4.5,1mM DTT)透析。
过滤后，用HiTrapTM SP FF5ml FPLC柱(GE Healthcare Life Sciences)纯化蛋白。用含线性梯度0%-100%FPLC缓冲液B(50mM乙酸铵,pH4.5,1mM DTT,0.5M NaCl)的缓冲液A(50mM乙酸铵,pH4.5,1mMDTT)在120分钟内以0.5ml/分钟的流速将其洗脱。通常在约240mMNaCl将泛素洗脱。FPLC纯化后，相对重蒸水透析蛋白随后将其冻干。
H4K16C的制备
通过相同的突变试剂盒将K16C点突变导入到H4基因，引物为：H4K16C F:5’-GGTAAAGGTGGTGCTTGCCGTCACCGTAAAGTTC-3’和H4K16C R:5’-GAACTTTACGGTGACGGCAAGCACCACCTTTACC-3’。
将含有H4K16C基因的质粒转化到BL21(DE3)pLysS细胞。细胞生长在含有氨苄青霉素和氯霉素的1L LB培养基中直到0.6OD600并且被0.4mM IPTG在37℃下诱导3小时。在以6000rpm离心10分钟后，将细胞再悬浮在洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1mM DTT,pH7.5)中并且通过微射流打碎。
通过在4℃下以20,000g离心30分钟除去细胞碎片。用含1%TritonX-100的洗涤缓冲液洗涤小球两次以及用不含Triton X-100的洗涤缓冲液洗涤小球一次。然后将1ml DMSO添加至球团并且搅拌小球30分钟。在此之后添加10ml展开缓冲液(6M盐酸胍,10mM Tris-HCl,10mMDTT,pH7.5)。离心后，将上清液装载到26/60Sephacryl S-200柱并且用凝胶过滤缓冲液(7M去离子尿素,20mM乙酸钠,1M氯化钠,5mMβ-巯基乙醇,0.5M EDTA,pH5.2)纯化。HPLC纯化后，通过C4半制备型HPLC再次纯化蛋白随后将其冻干。
H3K27C的制备
通过突变试剂盒将C110A点突变导入到H3基因，引物为：H3C110A F:5’-GAGGACACCAACCTGGCCGCCATCCACGCCAAG-3’和H3C110A R:5’-CTTGGCGTGGATGGCGGCCAGGTTGGTGTCCTC-3’。
通过突变试剂盒将K27C点突变导入到H3C110A基因，引物为：H3K27C F:5’-AAGGCAGCCAGGTGCTCCGCTCCTGCTACC-3’；H3K27C R:5’-AGCAGGAGCGGAGCACCTGGCTGCCTTGGTG-3’。
H3K27C蛋白的表达与H4K16C的表达相同。
蛋白底物的烷基化
sLys(Ac)导入到泛素：Ub K S 48Ac的制备
将冻干的泛素K48C溶解于0.2mM乙酸盐缓冲液(pH4.0或pH7.0)中。反应物的最终浓度如下：
泛素K48C:0.5mM。
NVA:50mM。
VA-044:5mM。
谷胱甘肽:15mM。
在365nm UV下辐照反应管2小时。通过C18分析型HPLC分析反应产物并且通过ESI或MALDI-TOF MS确认(参见图11和12)。反应期间蛋白仍然为可溶的，表明它处于其折叠状态。
图11A显示了在pH4.0，泛素K48C和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱，其中峰a对应泛素K48C，峰b对应乙酰化的产物。
峰a的MALDI-TOF MS谱显示在图11B中，其中发现的[M+H]+为8541.78并且计算的分子量为8539.88。
峰b的MALDI-TOF MS谱显示在图11C中，其中发现的[M+H]+为8626.58并且计算的分子量为8624.93。HPLC在以下的条件下进行：15分钟内含0%-30%的缓冲液B的缓冲液A，然后20分钟内含50%的缓冲液B的缓冲液A。
图12A显示了在pH7.0，泛素K48C和NVA之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱。
通过ESI测定的粗的和解卷积的产物质量显示在图12B中，其中发现的分子量为8624.0，计算的分子量为8624.93。
HPLC在以下的条件下进行：15分钟内含0%-30%的缓冲液B的缓冲液A，然后20分钟内含50%的缓冲液B的缓冲液A。
这一泛素突变体包含位置48上的Cys残基。使用处于天然的折叠状态的蛋白(0.5mM)用于烷基化，在相同的反应混合物中，pH4或7。上文的MS分析清楚地显示了2小时内Cys残基几乎等量的转换为sLys(Ac)，烷基化产物预期+85Da MW。反应期间蛋白仍然为可溶的，这说明没有变性发生并且50mM NVA和5mM VA-044的存在没有影响折叠的蛋白的结构。值得注意的是难以使用半合成的方法用于制备此类修饰的蛋白，因为修饰位点位于序列的中间。
两种其它的蛋白，组蛋白H4K16C和H3K27C，也具有极好的修饰结果(下文可见)。在这些情况下，6M Gdn.HCl包括在烷基化反应混合物中。有趣的是，对pH4或7下H4K16C的烷基化而言，除了期望的产物之外，还形成了大量副产物(下文可见)。副产物为更亲水的，MW比期望的乙酰基-硫代赖氨酸的分子量高16Da。看起来硫醚键氧化为亚砜的结果和反应混合物包含二甲基硫使得这一副产物的形成最小化至约5%(参见图13和14)。
当野生型H4受到相同的处理时，检测不到烷基化。从这些结果可以看出的是这种巯基自由基反应可以接受各种反应条件，例如天然的或变性的缓冲液，从而修饰蛋白。
sLys(Ac)导入到组蛋白H4:H4K S 16Ac的制备
在含有6M盐酸胍的0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.0或pH7.0)中进行反应。添加二甲基硫以使该产物中的硫醚键的氧化最小化。
反应物的最终浓度如下：
H4K16C:1mM，
NVA:50mM，
VA-044:5mM，
谷胱甘肽:15mM，
二甲基硫:100mM。
在365nm UV下辐照反应管2小时。通过C4-半制备型HPLC分析反应和ESI或MALDI-TOF MS分析反应产物(参见图13和14)。
图13A为pH4.0下，在二甲基硫的存在和不存在下H4K16C和NVA之间巯基-烯连接反应的C4-半制备型HPLC谱。图13A中所示的峰a对应H4K16C，峰b对应期望产物，以及峰c对应氧化产物。
通过ESI-MS检测的峰a中粗的和解卷积的起始物质H4K16C质量显示在图13B中，其中发现的MW为11210.4并且计算的分子量为11211.16。
通过ESI-MS检测的粗的和解卷积的峰b质量显示在图13C中，其中发现的MW为11295.5并且计算的分子量为11296.21。
峰c的MALDI-TOF MS谱显示在图13D中，其中发现的[M+H]+为11311.56并且计算的分子量为11312.2。HPLC在以下的条件下进行：20分钟内含0%-40%的缓冲液B的缓冲液A，然后20分钟内含60%的缓冲液B的缓冲液A。
图14A为pH7.0下H4K16C和NVA之间巯基-烯连接反应的C4-半制备型HPLC谱，其中峰a对应期望的产物，峰b对应氧化产物。
通过ESI-MS检测的粗的和解卷积的峰a质量显示在图14B中，其中发现的MW为11296.5并且计算的分子量为11296.21。HPLC在以下的条件下进行：20分钟内含0%-40%的缓冲液B的缓冲液A，然后20分钟内含60%的缓冲液B的缓冲液A。
sLys(Ac)导入到组蛋白H3:H3K S 27Ac的制备
在含有6M盐酸胍的0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.0)中进行反应。反应物的最终浓度如下：
H3K27C:1mM。
NVA:50mM。
VA-044:5mM。
谷胱甘肽:15mM。
在365nm UV下辐照反应管2小时。通过C4半制备型HPLC分析结果并且通过ESI-MS确认结果(参见图15)。
图15A中C4-半制备型HPLC谱显示了两个峰，其中峰a对应蛋白底物H3K27C，峰b对应乙酰化产物。
在图15B中提供了粗的和解卷积的峰a质量的ESI-MS谱，其中发现的MW为15213.7并且计算的分子量为15213.92。
在图15C中提供了粗的和解卷积的峰b质量的ESI-MS谱，其中发现的MW为15298.7并且计算的分子量为15298.97。HPLC在以下的条件下进行：20分钟内含0%-40%的缓冲液B的缓冲液A，然后20分钟内含60%的缓冲液B的缓冲液A。
以下的表3总结了实施例7-9中上文所述的蛋白烷基化反应的反应产率。
Figure BDA0000415461900000241
从以上可以看出，除了对肽底物有效之外，巯基-烯连接反应对蛋白底物也是高度有效的。
实施例10
在这一实施例中，利用蛋白印迹，显示产生的sLys(Ac)为天然的Lys(Ac)的优异功能类似物。
将3μg对照蛋白(H4K16C)和H4KS16Ac各自溶解于装载缓冲液中并且在15%SDS-PAGE上跑胶，然后将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。在此之后，添加含有5%脱脂乳的20ml TBST(50mM Tris.HCl,150mMNaCl,0.1%Tween20,pH7.4)1小时。然后在4℃下将膜在含有5%脱脂乳和组蛋白H4K16Ac抗体的20ml TBST(1:1000稀释)中孵育过夜。然后用TBST洗涤膜4次并且在室温下在含有5%脱脂乳和抗兔IgG过氧化物酶缀合物的的20ml TBST(1:5000稀释)中孵育1小时。用TBST洗涤4次后，通过化学发光法显现蛋白。
如图18A中所示，组蛋白H4KS16Ac被特异性抗-H4KS16Ac抗体所识别，如通过膜上得到的更深的染色所证明的。在另一方面，未修饰的H4K16C根本不被相同的抗体所识别，如通过膜上染色缺失所证明的。
实施例11
在这一实施例中，进行酶促测试以研究sLys(Ac)是否能够被组蛋白脱乙酰化酶所识别并且用作脱乙酰作用的底物。
脱乙酰化酶2(SIRT2)，III类NAD-依赖的脱乙酰化酶，用于烷基化的肽1的乙酰基-赖氨酸类似物(Ac-FQPKKS(Ac)G-NH2)和天然的肽1(Ac-FQPKK(Ac)G-NH2)的脱乙酰化反应。肽1的序列基于蛋白p53的残基317-320(即Gln-Pro-Lys-Lys(Ac))，其为SIRT2酶的最佳脱乙酰化酶底物并且N-末端被乙酰基加帽从而增加了疏水性。
将0.5mM肽和0.1mM NAD+混合在SIRT2测定缓冲液中(50mMTris,137mM NaCl,2.7mM KCl,1mM MgCl2,1mg/ml BSA)并且在37℃下平衡10分钟。通过在37℃下添加0.1mM SIRT2酶((0.1U/μl)启动反应并且通过C18分析型HPLC监测。值得注意的是脱乙酰化酶不能非常有效地使合成的肽底物脱乙酰化并且需要相对大量的酶和长的反应时间来进行脱乙酰化反应。结果显示烷基化的N-乙酰基-硫代赖氨酸肽的脱乙酰化速率为含有天然的N-乙酰基-赖氨酸的对照肽的脱乙酰化速率的1/3。
实施例11的C18分析型HPLC谱显示在图16A和16B(或图18B)中。特别是在图16A中，显示了在SIRT2测定中具有装配的乙酰基-赖氨酸类似物的肽1脱乙酰化的产物C18分析型HPLC谱。在图16A中，峰a表示脱乙酰化的产物，而峰b表示乙酰基-赖氨酸类似物(Ac-FQPKKS(Ac)G-NH2)。在图16B中，显示了在SIRT2测定中天然的K(Ac)-肽底物的脱乙酰化产物的C18分析型HPLC谱。在图16B中，峰c表示脱乙酰化产物，而峰d表示天然的肽底物。
图16C中还通过ESI-MS表征峰a。在图16C中，显示了乙酰基-赖氨酸类似物的脱乙酰化产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有763.30的m/z值并且分子量762.38。
图16D中还通过ESI-MS表征峰b。在图16D中，显示了乙酰基-赖氨酸的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有805.28的m/z值并且分子量804.39。
图16E中还通过ESI-MS表征峰c。在图16E中，显示了天然的K(Ac)肽底物的脱乙酰化产物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有745.28的m/z值并且分子量744.43。
图16F中还通过ESI-MS表征峰d。在图16F中，显示了天然的K(Ac)肽底物的强度对质荷比(m/z)的质谱。发现的[M+H]+具有787.33的m/z值并且分子量786.44。
实施例11中所用的HPLC条件为30分钟内含0%-30%缓冲液B的缓冲液A。
因此可以得出结论的是烷基化的肽1中的sLys(Ac)残基易于被酶解脱乙酰化，虽然与它的天然的对应物相比程度较小。这可通过峰a与峰c相比较小所证明。
实施例12
H4K S 16的制备
在这一实施例中，利用经典的氨酰化反应合成H4KS16。
将H4K16C(0.5mM)溶解于含2-溴乙胺氢溴酸盐(160mM)的1MHEPES[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]缓冲液(pH7.8,6M Gdn.HCl,5mMD/L蛋氨酸,20mM二硫苏糖醇(DTT))中。在室温下暗处反应11小时后，相对重蒸水透析烷基化的蛋白并且随后冻干。通过ESI-MS分析反应产物并且显示在图17中。
在图17中，如通过ESI-MS所测定的粗的和解卷积的烷化产物(H4KS16)的质量具有11253.4分子量而计算的分子量为11254.2。
实施例13
已知组蛋白H4中的Lys16的乙酰化抑制核小体阵列的折叠并因此影响紧密的30-nm核染色质纤维的形成。将H4KS16Ac和三种其它对照H4蛋白(H4K16Ac,H4KS16和H4-WT,下文所述)各自与H3,H2A和H2B整合为组蛋白八聚体。
利用半合成的方法制备H4K16Ac并且在实施例12中通过使用2-溴乙基胺烷基化H4C16来合成H4KS16。然后将4个不同的八聚体单独地与12-177-601DNA组合以装配到12-核小体阵列中。
利用分析型超速离心，证明了在取消Mg2+-诱导的重组的核小体阵列的折叠方面，KS16Ac产生了与天然的K16Ac一致的效应，如图18C中所见。
AUC数据清楚地显示，在1mM MgCl2存在时，含有野生型H4或它的等价物H4KS16的核小体阵列折叠成比K16Ac和KS16Ac阵列(S20℃,w=44-45S)所折叠的显著地更加紧密的状态(沉降系数S20℃,w=52-53S)。显然，这些结果不仅证明了sLys(Ac)和Lys(Ac)之间的功能等价性，而且还证明了sLys和Lys之间的功能等价性。
核小体阵列重构：
将含有12-177-601DNA的质粒转化进HB101细胞中并扩增。如Korolev等,Biophys.J.2010,99,1865-1905中所述的提取质粒。
通过在Sepharose6柱，使用TES2000缓冲液凝胶过滤，除去RNA和蛋白杂质。用EcoRV切除后，通过聚乙二醇(PEG6000)将12-177-601DNA与短的质粒片段分离。最终在Sephacryl SF1000柱上使用TES100缓冲液纯化12-177-601DNA。
在氨苄青霉素和氯霉素存在时，野生型爪蟾(Xenopus laevis)组蛋白H2A H2B,H3和H4在BL21(DE3)pLysS细胞中单独地过表达。每一组蛋白通过凝胶过滤在Sephacryl S-200柱及随后的Resource S阳离子交换柱上纯化。通过Allahverdi等,Nucleic Acids.Res.,2011,39,1680-1691中所述的化学半合成制备H4K16Ac。
利用对H2A,H2B,H3和H4而言摩尔比率1:1:1.2:1.2形成组蛋白八聚体。在Sephacryl S-200凝胶过滤柱上纯化组蛋白八聚体。
通过步进式透析，利用组蛋白八聚体和12-177-601DNA，如Rorigo etal,J.Mol.Biol.,2003,327,85-96和T.Schalch,The30-nm chromatin fiber.In vitro reconstitution and structural analysis.PhD Thesis.2004,SwissFederal Institute of Technology,Zurich.http://e-collection.library.ethz.ch/eserv/eth:27516/eth-27516-02.pdf中所述重构核小体阵列。
为避免组蛋白与DNA过度结合，按每一阵列0.5分子将竞争者核心长度DNA(150-bp)添加至重构混合物。利用不同比例的组蛋白八聚体与DNA模板，在小规模制备中经验性地检测组蛋白八聚体与12-177-601DNA的精确量从而得到12:1的化学计量。如上文所述的纯化重构阵列。在5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上核实纯化的阵列物质以及通过ScaI各自的消化产物从而验证核小体阵列的质量。
分析型超速离心
在具有AN-50T转子和单色扫描仪的Beckman XL-I分析型超速离心仪器上进行沉降速率试验。在TEK缓冲液中稀释阵列的储备液从而得到A259=0.8cm-1(DNA浓度Cp=121μM)。
样品和参照物(TEK缓冲液+如样品中相同浓度的盐)装载到12mm双通道单元格中并且在真空中在20℃下以3000rpm平衡30分钟。按照上文所述的Korolev等和Allahverdi等中的方法进行数据测量和分析。
表4提供了在不同浓度的Mg2+存在时核小体阵列的S20℃,w±SD值。
表4
Figure BDA0000415461900000281
实施例14
与乙酸乙烯酯的反应也是成功的。与甲基乙烯基醚和二(乙二醇)乙烯醚的反应获得相似的结果。靶分子的Cys残基与乙酸乙烯酯反应的产物也为Lys(Ac)的模拟物。但是更为重要的是，与聚(乙二醇)乙烯醚的反应对肽和蛋白的聚乙二醇化而言是非常有用的方法。
作为延长治疗肽和蛋白的半衰期的方式，聚乙二醇化日益有用于肽/蛋白修饰。几种聚乙二醇化的肽和蛋白(例如聚乙二醇-干扰素α、聚乙二醇-G-CSF)已经出现在市场上。
在一示例性肽(上文表1中的肽1：Ac-Phe-Gln-Pro-Lys-Cys-Gly-酰胺)上进行试验。在含有5mM肽1,100mM乙酸乙烯酯,5mM VA-044和15mM谷胱甘肽的乙酸盐缓冲液(pH4)中进行反应。室温下2小时UV(365nm)辐照后，获得>90%烷基化产物(发现的[M+H]+805.2)。
实施例15
用N-乙烯丙基酰胺或N-乙烯丁基酰胺烷基化
用N-乙烯丙基酰胺或N-乙烯丁基酰胺烷基化Cys残基各自产生了N-丙基-Lys或N-丁基-Lys残基。以下的方案V提供了反应机制：
方案V
Figure BDA0000415461900000291
方法
来自表1的肽1用作底物。所有反应物都溶解于如上文所示0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.0)中并且最终浓度如下：
肽1:5mM。
N-乙烯丙基酰胺或N-乙烯丁基酰胺:50mM。
VA-044:5mM。
谷胱甘肽(还原型):15mM。
在室温下365nm UV下辐照反应管1小时。通过C18分析型HPLC分析反应产物并且通过ESI或MALDI-TOF MS确认。在脱盐的样品(使用C18zip-tip)或HPLC纯化的部分上进行MS分析。
结果
参照图19和20，可以看到的是肽1与N-乙烯丙基酰胺或N-乙烯丁基酰胺的反应和它与NVA的反应相似。反应是干净的并且有效率的，1小时后产率超过85%。没有检测到调聚反应副产物。
特别是图19A显示了肽1与N-乙烯丙基酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱，其中峰a对应产物，峰b对应肽1。图19B显示了峰a的ESI-MS，其中发现的[M+H]+为820.26,计算的MW为819.52。HPLC在下列条件下进行：40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
图20A显示了显示了肽1与N-乙烯丁基酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱，其中峰a对应产物，峰b对应肽1。图20B显示了峰a的ESI-MS，其中发现的[M+H]+为834.55,计算的MW为833.67。HPLC在下列条件下进行：40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
实施例16
用NVA、乙酸乙烯酯、N-烯丙基乙酰胺或N-甲基-N-乙酸乙烯酯的烷基化反应的可比较的研究
若干烯试剂(烷化试剂)、乙酸乙烯酯、N-烯丙基乙酰胺或N-甲基-N-乙酸乙烯酯与Cys反应与NVA与Cys反应是可比较的，以产生其它N-乙酰基-赖氨酸类似物，通过巯基-烯连接方法。以下的方案VI中提供了它们各自的反应机制。
尽管这些类似物在结构上相似，但是它们彼此在电空间特征上不同，其可导致功能上的细微差异并且因此可用于更好地理解通过乙酰基修饰蛋白的效应。
方案VI
Figure BDA0000415461900000311
方法
对方案VI中所示的乙酰基-赖氨酸类似物的位点特异性装配而言，通过巯基-烯连接反应修饰模型肽(肽1)。所有的反应物都溶解于所示的0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.0)中并且最终浓度如下：
肽1:5mM。
乙酸乙烯酯、N-烯丙基乙酰胺或N-甲基-N-乙酸乙烯酯:50mM。
VA-044:5mM。
谷胱甘肽(还原型):15mM。
在室温下365nm UV下辐照反应管1小时。通过C18分析型HPLC分析反应产物并且通过ESI或MALDI-TOF MS确认。在脱盐的样品(使用C18zip-tip)或HPLC纯化的部分上进行MS分析。
以相似的方式用乙酸乙烯酯、N-烯丙基乙酰胺和N-甲基-N-乙酸乙烯酯各自处理肽1从而产生不同的乙酰基-赖氨酸类似物。图21-23中提供了试验结果。
与NVA反应的显著的差异为没有检测到调聚反应副产物。尽管所有这些烷化剂都包含C=C双键，但是它们的反应性似乎不同。特别是这些烷化剂表现出比NVA小的反应性。
表5列举了与这一实施例中所用的不同烷化剂反应1小时的产率。如表5中可见，反应性顺序为：N-乙酸乙烯酯>N-甲基-N-乙酸乙烯酯>乙酸乙烯酯>N-烯丙基乙酰胺。具体地，NVA在1小时获得产率>95%，而N-甲基-N-乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和N-烯丙基乙酰胺各自获得的产率为约79%、51%和38%。这可能源于游离基中间体的不同稳定性或这些烷化剂的不同空间效应。值得注意的是，所有反应都非常干净(图21-23)并且延长时间内继续完成(数据未显示)。
特别地，图21A显示了显示了肽1与N-甲基-N-乙酸乙烯酯之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱，其中峰a对应产物，峰b对应肽1。图21B显示了峰a的ESI-MS，其中发现的[M+H]+为819.36,计算的MW为818.40。HPLC在下列条件下进行：40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
图22A显示了显示了肽1与乙酸乙烯酯之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱，其中峰a对应产物，峰b对应肽1。图22B显示了峰a的ESI-MS，其中发现的[M+H]+为806.30,计算的MW为805.37。HPLC在下列条件下进行：40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
图23A显示了显示了肽1与N-烯丙基乙酰胺之间巯基-烯连接反应的C18分析型HPLC谱，其中峰a对应产物，峰b对应肽1。图23B显示了峰a的ESI-MS，其中发现的[M+H]+为819.30,计算的MW为818.40。HPLC在下列条件下进行：40分钟内含0%-40%缓冲液B的缓冲液A。
表5
Figure BDA0000415461900000331
实施例17
用N-乙烯基-肽酰胺或N-乙烯基-蛋白酰胺的烷基化
在这一实施例中，用肽酰胺和蛋白酰胺烷化剂进行相同的巯基-烯连接反应。在这两种情况下，烯化合物具有大的酰基，即肽酰基或蛋白酰基(参见以下的方案VII)。巯基化合物可以为小的有机巯基化合物，包含Cys残基的肽/蛋白或巯基官能化的聚合物(例如聚乙二醇)。
方案VII
初始步骤为制备具有C-末端乙烯基(或烯丙基)酰胺的肽或蛋白。本本发明人已经研发了用于这一合成的间接的方法。
首先用化学方法或生物合成方法制备肽或蛋白硫酯，然后在银离子存在的情况下将其与N-乙烯基-甘氨酰胺(即2-氨基-N-乙酸乙烯酯)反应(参见以下的方案VIII)。这允许N-乙烯基导入到肽的C末端，有一个氨基酸的延长(在这种情况下为Gly)。可以通过固相肽合成技术制备肽硫酯并且可以通过利用内含肽-催化的蛋白剪接技术制备蛋白硫酯。
方案VIII
Figure BDA0000415461900000342
利用这种方法，制备小的肽(RLYRAG)和蛋白(泛素)，每一个都含有C-末端N-乙烯基酰胺(参见以下的方案IX)。特别地，从RLYRA-COSR制备肽N-乙烯基酰胺并且从Ub(1-75)-COSR制备泛素N-乙烯基酰胺。
方案IX
Figure BDA0000415461900000343
小的巯基化合物，巯基乙酸甲酯用于在巯基-烯连接反应中与肽RLYRAG-乙烯基酰胺反应。已发现肽的C末端酰胺上的乙烯基比NVA中的酰胺反应性显著较小。当VA-044用作自由基引发剂时，反应只发生在高温(60℃或更高)时，并且仅中等产率。
还发现在这种情况下，另一光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂(LAP)在促进巯基自由基反应方面比VA-044好。50℃时，LAP作为光引发剂，2小时反应后获得了超过70%的反应产物。
图24显示了RLYRAG-乙烯基酰胺与巯基乙酸甲酯之间巯基-烯连接反应所形成的分离的产物的ESI-MS，其中发现的[M+H]+为972.82(+113TFA加合物，由于肽的高碱性)，并且计算的MW为894.88。
这种引发剂(LAP)也用于泛素-乙烯基酰胺反应。使用相对大的巯基底物Ubi-K48C，其为单泛素化的，其中Lys48突变为Cys。50℃下反应1小时后，所形成的双泛素化产物约35-40%，如SDS-PAGE凝胶分析的。
方法
用于肽RLYRAG-乙烯基酰胺的试验程序
肽RLYRAG-乙烯基酰胺的制备
室温下在银离子存在的情况下将硫酯肽RLYRA-COSR与2-氨基-N-乙酸乙烯酯反应。所有试剂溶解于DMSO中并且反应条件如下：
RLYRA-COSR:5mM
2-氨基-N-乙酸乙烯酯:100mM
AgNO3:100mM。
16小时后，通过C18半HPLC纯化产物并且随后将其冻干。
RLYRAG-乙烯基酰胺与巯基乙酸甲酯之间的巯基-烯连接反应
在此之后将纯化的RLYRAG-乙烯基酰胺与巯基乙酸甲酯通过巯基-烯连接反应进行反应。反应在0.2mM乙酸盐缓冲液(pH4或5)中进行。
反应物最终的浓度如下：
RLYRAG-乙烯基酰胺:10mM
巯基乙酸甲酯:40mM
LAP:5mM。
50℃下365nm UV下辐照反应管2小时。通过HPLC纯化反应产物并且通过ESI-MS确认(参见图24)。
2)用于N-乙烯基-泛素基酰胺(泛素-乙烯基酰胺)的试验程序
泛素(1-75)-COSR的制备
利用引物，通过PCR扩增人泛素基因，所述引物为：Ubi75_F:5’-GGTGGTCATATGCAGATCTTTGTGAAG-3’和Ubi75_R:5’-CTGGTCAGGTGGGATACCCTCCTTGTCTTGAATTTTG-3’。
纯化PCR产物并且将其连接在T易化载体(Promega)上。用NdeI和SapI限制性内切酶消化后，纯化产物并且将其连接在同样消化的pTYB1载体(New England Biolabs)上。然后通过测序确认正确的插入。
将质粒pUbi75aa-TYB1转化到E.coli BL21(DE3)细胞中。在37℃下细胞生长在LB培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中直到0.6-0.8的OD600。通过50μM IPTG在15℃下诱导期望的蛋白18小时。以6000rpm离心10分钟后，将来自于1L细胞的细胞团块再悬浮在50ml裂解缓冲液(50mM HEPES,500mM NaCl,1mMβ-巯基乙醇,pH7.5)中。然后通过声波降解法将细胞打碎并且通过以20,000g离心30分钟去除碎片。然后将上清液与预平衡的3ml几丁质珠(New England Biolabs)在4℃下混合2小时。然后将珠倒入柱中并且用40ml裂解缓冲液洗涤。通过添加含有100mM2-巯基乙磺酸(MESNA)的4ml裂解缓冲液裂解融合蛋白并且在37℃下孵育过夜。通过10ml裂解缓冲液洗脱Ubi(1-75)硫酯。通过SDS-PAGE和HPLC监测亲和结合、裂解和纯化。通过冻干法干燥纯化的Ubi(1-75)-COSR。
Ubi-乙烯基酰胺的制备
纯化的Ubi(1-75)-COSR与2-氨基-N-乙酸乙烯酯反应从而产生Ubi-乙烯基酰胺。所有试剂都溶解于DMSO中并且反应条件如下：
Ubi(1-75)-COSR:2mM
2-氨基-N-乙酸乙烯酯:100mM
AgNO3:100mM。
16小时后，通过C4半HPLC纯化产物并且随后将其冻干。
Ubi-K48C的制备
通过QuikChangeTM定点突变试剂盒(Stratagene)将K48C点突变导入到泛素基因，引物为：Ubi K48C F:5’-GTCTGATATTTGCCGGCTGTCAGCTGGAGGATGGCCG-3’；和Ubi K48C R:5’-CGGCCATCCTCCAGCTGACAGCCGGCAAATATCAGAC-3’。
将含有泛素K48C基因的质粒转化到BL21(DE3)细胞中。在37℃下细胞生长在含有氨苄青霉素的LB培养基中直到0.6的OD600并且通过0.5mM IPTG诱导18小时。在4℃下以6000rpm离心10分钟后，将细胞再悬浮在50ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1mM DTT,pH7.5)中并且通过微射流(Microfluidics,Newton,USA)将其打碎。在4℃下以25,000g离心30分钟后，以350μl-50ml裂解缓冲液的比例添加70%高氯酸到上清液。用0.2μm过滤器过滤上清液并且用3.5KDa阈值的透析管相对50mM乙酸铵缓冲液(pH4.5，含1mM DTT)透析。
过滤后，用HiTrapTM SP FF5ml FPLC柱(GE Healthcare Life Sciences)纯化蛋白。用含线性梯度0%-100%FPLC缓冲液B(50mM乙酸铵,pH4.5,1mM DTT,0.5M NaCl)的缓冲液A(50mM乙酸铵,pH4.5,1mMDTT)在120分钟内以0.5ml/分钟的流速将其洗脱。
通常在约240mM NaCl将泛素洗脱。FPLC纯化后，相对重蒸水透析蛋白随后将其冻干。
通过巯基-烯连接反应，双泛素的合成
将纯化的Ubi-乙烯基酰胺与Ubi-K48C通过巯基-烯连接反应进行反应从而产生双泛素。反应在含有6M盐酸胍的0.2M乙酸盐缓冲液(pH5.0)中进行。反应物的最终浓度如下：
Ubi-乙烯基酰胺：2mM
Ubi-K48C：2mM
LAP：4mM。
50℃下365nm UV下辐照反应管2小时。通过SDS-PAGE分析反应产物。
应用
位点特异性修饰的蛋白对于研究蛋白赖氨酸乙酰化的生物学-目前生物医学界研究集中的领域-非常宝贵。然而，如上文所公开的，这些蛋白难于得到并且它们都不能商购获得。目前所公开的方法将使得此类蛋白易于获取并且迅即应用将产生这些修饰的蛋白，作为商业产品用于生物医学研究界。
从长远来看，因为许多蛋白需要在它们的结构上修饰从而获得期望的活性和/或改善药代动力学特性，这项技术可以用于规模生产修饰的蛋白，例如具有对治疗应用而言更长的半衰期。
因此，总之，本公开内容提供了巯基-烯自由基加成反应，涉及，例如商购可获得的NVA非常适用于合成的肽和重组蛋白中半胱氨酸残基的S-乙酰氨基乙基化。合成的N-乙酰基-硫代赖氨酸与天然的乙酰基赖氨酸仅仅在氨基酸结构的γ位置处电子等排不同，并且与天然的乙酰基赖氨酸在功能性上等同或相似。
所公开的反应和方法具有许多潜在的应用，诸如组蛋白表观遗传学研究。所公开的反应系统为强劲的并且产生了几乎定量产量的位点特异性乙酰化蛋白，其可以在简单色谱或透析步骤中纯化。这种方法简便易行也使得它易于被来自生物科学研究界的研究者们采用。同样地，这种自由基反应方法为赖氨酸乙酰化生物学研究提供了方便的可用工具并且在这一重要领域内将辅助向前推进研究。
应明确的是，在阅读了前述的公开内容之后，本发明的各种其它修改和适应对本领域中的技术人员是显而易见的而没有背离本发明的精神和范围，并且意图将所有此类修改和适应都包含在所附权利要求的范围内。

Claims (23)

1.使靶分子中的巯基(R-S-H)或硒基(R-Se-H)烷基化的方法，其中所述方法包括：
使包含至少一个巯基的靶分子与通式(I)或(II)的化合物反应：
Figure FDA0000415461890000011
其中R为乙酰基或任一其它的酰基或包含以下任一的基团：
Figure FDA0000415461890000012
或
其中通式(II)中R也可以为烷基；以及
其中R’选自氢、甲基和乙基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶分子为有机分子。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述有机分子为肽或蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述肽选自寡肽、多肽和合成肽。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述蛋白选自重组蛋白和蛋白复合物。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述靶分子为组蛋白或泛素。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述巯基为半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸的巯基。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述巯基为半胱氨酸的巯基。
9.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述酰基为脂族酰基，或脂环族酰基，或芳族酰基，或氨酰基，或肽酰基，或蛋白酰基。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述脂族酰基选自直链脂族酰基，支链脂族酰基，叔丁氧羰基，叔丁氧羰基衍生物、苄氧羰基和苄氧羰基衍生物。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述酰基选自具有1个-20个或1个-7个碳原子的直链脂族酰基，具有1个-7个碳原子的支链脂族酰基，以及聚(乙二醇)部分。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、2-丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、烯丙基羰基、环己甲基羰基、以及诸如环丙基羰基、环戊基羰基、环己基羰基和1-环己烯基羰基的C3-C6环烷基羰基。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述芳族酰基选自苯甲酰基、4-甲基苯甲酰基和4-甲氧基苯甲酰基。
14.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十八烷基、聚(乙二醇)乙基和聚(乙二醇)丙基[例如HO(CH2CH2O)n-CH2CH2-，CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2-，和CH3O(CH2CH2O)n-CH2CH2CH2-]。
15.权利要求1-14中任一项所定义的通式(I)的化合物作为用于使靶分子烷基化的烷化剂的用途。
16.权利要求1-14中任一项所定义的通式(II)的化合物作为用于使靶分子烷基化的烷化剂的用途，所述靶分子包含巯基(R-S-H)或硒基(R-Se-H)。
17.通式(I)的化合物用于在靶分子中装配乙酰化的赖氨酸残基类似物的用途。
18.如权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述靶分子为有机分子。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述有机分子为肽或蛋白。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述肽选自寡肽、多肽和合成肽。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述蛋白选自重组蛋白和蛋白复合物。
22.药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的方法修饰的靶分子。
23.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述通式(I)的化合物为N-乙烯基乙酰胺。
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