CN106414397B - 用于肽和蛋白质中半胱氨酸的选择性修饰的作为正交手柄的丙二烯酰胺 - Google Patents

用于肽和蛋白质中半胱氨酸的选择性修饰的作为正交手柄的丙二烯酰胺 Download PDF

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Abstract

提供了式I的化合物，具有以下结构：其中，R1至R5具有说明书中给出的含义。

Description

用于肽和蛋白质中半胱氨酸的选择性修饰的作为正交手柄的 丙二烯酰胺
背景
在生物化学家和化学生物学家中，一直在探寻能够潜在地在生物体系中进行的化学反应。这些化学反应可以在生命科学的各个分支中具有巨大应用。然而，极少有反应可以符合复杂的生物体系的严苛要求，即水性介质、近中性pH、环境温度、无金属催化、无毒性副产物以及对于靶官能团具有优异的选择性。
蛋白质及其周围环境是一种这样的复杂体系，其中，以生物相容性方式进行目标化学反应仍然是一种挑战。蛋白质结构中的许多位点已成为该目的的目标，其中，半胱氨酸残基的巯基是最常见的基团之一，主要是因为其高度亲核性和相对低的天然丰度(参见Chalker,J.M.等,Chemistry–An Asian Journal 4,630-640,doi:10.1002/asia.200800427(2009)和Fodje,M.N.等,Protein Engineering 15,353-358,doi:10.1093/protein/15.5.353(2002))。然而，符合所有上述要求的蛋白质的通用反应仍然难以捉摸。
最常见的方法学，其缺点和挑战可归类如下：
(a)经典反应试剂，例如马来酰亚胺、丙烯酰胺、α-卤代羰基化合物主要存在以下缺陷：缺乏选择性、其自身稳定性和毒性副产物；
(b)修饰半胱氨酸残基的金属催化反应显示优异的选择性(例如，B.G.Davis研究组采用钌催化剂的烯丙基硫醚的交叉置换(Lin,Y.A.等,Journal of the AmericanChemical Society 130,9642-9643,doi:10.1021/ja8026168(2008))和C.M.Che研究组采用金催化剂的巯基-丙二烯偶联(On-Yee Chan,A.等,Chemical Communications 49,1428-1430,doi:10.1039/C2CC38214H(2013))。然而，必须使用金属络合物导致这些反应不适合许多生物学应用；
(c)采用缺电子炔类(Shiu,H.-Y.等,Chemistry–A European Journal 15,3839-3850,doi:10.1002/chem.200800669(2009))，或溴代马来酰亚胺(Tedaldi,L.M.等,Chemical Communications,6583-6585,doi:10.1039/B915136B(2009)和Smith,M.E.B.等,Journal of the American Chemical Society 132,1960-1965,doi:10.1021/ja908610s(2010))和二硫代马来酰亚胺衍生物(Robin,M.P.等,Journal of the American ChemicalSociety 135,2875-2878,doi:10.1021/ja3105494(2013))。这些反应显示优异的选择性并且在过量硫基存在下具有可逆性的优点。然而，因为细胞内环境中大量谷胱甘肽的存在，所述可逆性在体内应用时导致限制。
两个研究组(Ovaa和Mootz)近来同时且独立地发现，通过原位巯基-炔偶联，可利用末端炔(修饰的泛激素中)不可逆地抑制半胱氨酸蛋白酶(Ekkebus,R.等,Journal ofthe American Chemical Society 135,2867-2870,doi:10.1021/ja309802n(2013)和Sommer,S.等,Bioorganic&Medicinal Chemistry 21,2511-2517,(2013))，这非常令人印象深刻而意外，因为大多认为炔在生物学条件下是惰性的。然而，所述偶联并不通用，因为已提出带正电荷的蛋白袋(氧代阴离子)是该意外反应所必需的(Arkona,C.等,AngewandteChemie International Edition,doi:10.1002/anie.201303544(2013))。
长期以来的目标是通过其化学修饰来理解和调节蛋白质功能，我们研究组过去报道了采用Mukaiyama醛醇缩合的肽和蛋白质的N-末端的修饰(Alam,J.等,Journal of theAmerican Chemical Society 132,9546-9548,doi:10.1021/ja102733a(2010))。
然而，仍然急迫地需要找到一种选择性地和不可逆地结合半胱氨酸的有希望的正交手柄和相关标记策略，而不需要特殊的局部条件(例如，带正电荷的蛋白袋)。
附图的简要说明
图1显示了蛋白质中半胱氨酸残基的选择性修饰。
图2描绘了丙二烯酰胺1a与半胱氨酸甲酯的反应(A)和与谷胱甘肽(B)的反应。
图3是显示修饰的谷胱甘肽的MS/MS的MS图谱。
图4是显示用丙二烯酰胺1a修饰的肽CGKSRF的MS/MS的MS图谱。
图5是显示用丙二烯酰胺1a修饰的肽KSCGRF的MS/MS的MS图谱。
图6是显示用丙二烯酰胺1a修饰的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS图谱。
图7是显示用丙二烯酰胺1b修饰的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS图谱。
图8是显示用丙二烯酰胺1c修饰的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS图谱。
图9是显示用丙二烯酰胺1d修饰的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS图谱。
图10显示了用丙二烯酰胺1a的牛胰岛素的修饰。
图11是显示用丙二烯酰胺1a修饰的牛胰岛素链A的MS/MS的MS图谱。
图12是显示用丙二烯酰胺1a修饰的牛胰岛素链B的MS/MS的MS图谱。
图13描绘了用丙二烯酰胺1a修饰的牛血清白蛋白的MS/MS结果。
图14描绘了BSA(A)和TEM1β-内酰胺酶(B)的标记。
发明描述
在本发明的第一方面，提供了式I的化合物，
其中:
R1,R2和R3独立地代表H、卤素、CN、C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、＝O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR6a、S(O)qR6b、S(O)2NR6cR6d、NR6eS(O)2R6f、NR6gR6h、芳基和Het1)、Cy1(其中Cy1基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、＝O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR7a、S(O)qR7b、S(O)2NR7cR7d、NR7eS(O)2R7f、NR7gR7h、芳基和Het2)、Heta(其中Heta基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR8a、S(O)qR8b、S(O)2NR8cR8d、NR8eS(O)2R8f、NR8gR8h、芳基和Het3)、OR9a、S(O)qR9b、S(O)2NR9cR9d、NR9eS(O)2R9f和NR9gR9h；
R4和R5独立地代表H、C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、＝O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、＝O、OR10a、S(O)qR10b、S(O)2NR10cR10d、NR10eS(O)2R10f、NR10gR10h、芳基和Het4或荧光基团)、芳基、Cy2(其中后两组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR11a、S(O)qR11b、S(O)2NR11cR11d、NR11eS(O)2R11f、NR11gR11h、芳基和Het5)、Hetb(其中Hetb基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR12a、S(O)qR12b、S(O)2NR12cR12d、NR12eS(O)2R12f、NR12gR12h、芳基和Het6)、OR13a和S(O)qR13b，或者R4和R5可以和它们所连接的碳原子一起代表3至10元杂环，所述杂环可以是芳族、完全饱和或者部分不饱和并且可以额外地包含一个或多个选自O、S和N的杂原子，所述杂环任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)；
Het1至Het6独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的4至14元杂环基团，所述杂环基团可以包含一个、两个或三个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基(其中后两组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素和Het7)和OR14；
Het7独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的4至14元杂环基团，所述杂环基团可以包含一个、两个或三个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基、C2-6烯基(其中后两组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素)、S(O)qR15a和OR15b；
Cy1和Cy2每次出现时独立地代表3至6元芳族、完全饱和或部分不饱和的碳环；
R6a至R6h、R7a至R7h、R8a至R8h、R9a至R9h、R10a至R10h、R11a至R11h、R12a至R12h、R13a至R13h每次出现时独立地代表H、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基(其中后四组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR16a、S(O)qR16b、S(O)2NR16cR16d、NR16eS(O)2R16f、NR16gR16h、芳基和Het8)、C3-10环烷基、C4-10环烯基(其中后两组基团未取代或者任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、OH、═O、C1-6烷基和C1-6烷氧基)或Hetc，或
R6-12c和R6-12d，R6-12g和R6-12h可以与它们所连接的氮原子一起代表3至14元杂环，所述杂环可以是芳族、完全饱和或部分不饱和并且可以额外地含有一个或多个选自O、S和N的杂原子，所述杂环任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)；或者R10g代表H并且R10h代表C(S)NR17aR17b；
Heta至Hetc独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的4至14元杂环；
Het8独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的4至14元杂环，所述杂环可以含有一个、两个或三个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基，其中后一组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、-OR18a和-NR18bR18c；
R14、R15a、R15b、R16a至R16h、R18a至R18c每次出现时独立地代表H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基,其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、C3-6环烷基、或C4-6环烯基(其中后两组基团未取代或者任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、OH、═O、C1-4烷基和C1-4烷氧基),
R17a代表H；
R17b代表Het9或荧光基团；
Het9代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的4至22元杂环，所述杂环可以含有1至5个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、C1-6烷基(其中后一组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、OR19a和NR19bR19c)、＝O、OR20a和NR20bR20c；
R19a至R19c以及R20a至R20c每次出现时独立地代表H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、硝基、CN、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：OH、═O、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、C3-6环烷基、或C4-6环烯基(其中后两组基团未取代或者任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素、OH、═O、C1-4烷基和C1-4烷氧基)；
q每次出现时代表0、1或2，或者
上述化合物药学上可接受的盐、溶剂合物或药物功能衍生物，前提是式I的化合物不是4,4-二氯-N-(丙-2-基)丁-2,3-二烯酰胺、N-叔丁基-4,4-二氯丁-2,3-二烯酰胺或4,4-二氯-N-(4-甲基苯基)丁-2,3-二烯酰胺。
可以涉及的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。这些盐可以通过常规方式形成，例如通过式I的化合物的游离酸或游离碱形式与一个或多个当量的合适的酸或碱反应，任选地在溶剂中，或者在所述盐不溶的介质中，然后采用标准技术去除所述溶剂、或者所述介质(例如，抽真空，冷冻干燥或者过滤)。盐也可以通过盐形式的式I的化合物的抗衡离子与另一种抗衡离子的交换来制备，例如采用合适的离子交换树脂。
药学上可接受的盐的例子包括衍生自矿物酸和有机酸的酸加成盐以及衍生自金属如钠、镁或优选钾和钙的盐。
酸加成盐的例子包括与乙酸、2、2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1、5-二磺酸和对甲苯磺酸)、坏血酸(例如L-坏血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1、2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、延胡索酸、粘酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-L-苹果酸)、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、偏磷酸、甲烷磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、单宁酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一碳烯酸和戊酸形成的酸加成盐。
盐的具体例子是衍生自矿物酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸的盐；衍生自有机酸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸的盐；和衍生自金属如钠、镁或者优选钾和钙的盐。
如上所述，式I的化合物还涵盖了化合物及其盐的任意溶剂合物。优选的溶剂合物是在本发明化合物的固态结构中引入非毒性药学上可接受的溶剂分子(下文中称为溶剂化溶剂)的溶剂合物。这种溶剂的例子包括水、醇(例如乙醇、异丙醇和丁醇)和二甲基亚砜。溶剂合物可以采用溶剂或者含有溶剂化溶剂的溶剂的混合物重结晶本发明的化合物来制备。在任意给定情况下是否形成溶剂合物可以采用公知的标准技术如热重分析(TGE)、差示扫描量热法(DSC)和X-射线结晶学对化合物的结晶进行分析。
溶剂合物可以是化学计量或非化学计量的溶剂合物。尤其优选的溶剂合物是水合物，水合物的例子包括半水合物、一水合物和二水合物。
对于溶剂合物以及制备和表征它们的方法的更详细讨论可以参见Bryn等,《药物的固态化学》(Solid-State Chemistry of Drugs),第二版,SSCI出版,美国印地安那州西拉斐特公司(Inc of West Lafayette,IN,USA),1999,ISBN 0-967-06710-3。
本文所述式I化合物的“药物功能衍生物”包括酯衍生物和/或具有、或者提供与本发明相关化合物相同的生物学功能和/或活性的衍生物。因此，在本发明中，该术语也可包括式I化合物的前药。
式I化合物的术语“前药”包括口服或胃肠外给予后，并且在预定的时间内(例如，在6-24小时的给药间隔内(即每天给予一至四次))，在体内代谢形成实验可检测量所述化合物的任意化合物。
式I化合物的前药可以通过修饰化合物上存在的官能团来制备，这样，当所述前药给予哺乳动物对象时在体内切去所述修饰。修饰通常通过用前药取代基处理母体化合物来实现。前药包括式I化合物中的羟基、氨基、巯基、羧基或羰基基团键合至可以在体内被切去的任意基团以分别再生所述游离巯基、氨基、巯基、羧基或羰基的式I的化合物。
前药的例子包括但不限于：羟基官能团的酯和氨基甲酸酯，羧基官能团的酯，N-酰基衍生物和N-曼尼希碱。关于前药的一般信息可以参见例如Bundegaard,H.《前药的设计》(“Design of Prodrugs”)，p.I-92,Elsevier,New York-Oxford(1985)。
为了简便起见，在下文中将式I的化合物以及所述化合物药学上可接受的盐、溶剂合物和药物功能衍生物统称为“式I的化合物”。
式I的化合物可包含双键，因此可以是围绕每个单独的双键的E(异侧(entgegen))和Z(同侧(zusammen))几何异构体。所有这些异构体及其混合物包括在本发明的范围内。
式I的混合物可以含有一个或多个不对称碳原子，因此可以是光学和/或非对映异构体。非对映异构体可以采用常规技术，例如色谱法或分步结晶法进行分离。各种立体异构体可以通过采用常规技术(例如分步结晶或HPLC技术)分离外消旋或其他化合物的混合物来分离。或者，所需的光学异构体可以通过以下方式制备：合适的光学活性原料在不会导致外消旋化或差向异构化的条件下的反应(即“手性池”方法)，合适的原料与“手性助剂”的反应(所述手性助剂可以在后续合适的阶段去除)，通过衍生化(即拆分，包括动态拆分)，例如用纯手性酸，然后通过常规方式如色谱法分离非对映异构衍生物，或者通过与合适的手性试剂或手性催化剂的反应，所有均在本领域技术人员已知的条件下。所有立体异构体及其混合物包括在本发明的范围内。
在本发明的第二方面，提供了使用式I的化合物作为游离巯基的不可逆结合剂的应用。
在本发明的某些实施方式中：
(i)游离巯基是肽或蛋白质的一部分；
(ii)所述应用为体外或体内；
(iii)所述应用是在水性介质中或者在生理学条件下或其等价形式。
在本发明的第三方面，提供了式I的化合物作为药物的应用。
本发明的上述方面提及的化合物的应用可以在医学治疗方法中采用。因此，根据本发明的另一方面，提供了：
(i)式I的化合物在制备用于治疗通过抑制半胱氨酸蛋白酶得到缓解的病症或疾病的药物中应用；
(ii)治疗通过拮抗半胱氨酸蛋白质得到缓解的病症或疾病的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物；和
(iii)式I的化合物在治疗通过抑制半胱氨酸蛋白质得到缓解的病症或疾病中的应用。
本领域技术人员应理解，术语“通过抑制半胱氨酸蛋白酶得到缓解的病症或疾病”包括：寄生虫病(牙周炎；疟疾；锥虫心脏病(chagasheart))；神经系统疾病(阿尔茨海默病；传染性海绵状脑病)、癌症、炎症和免疫系统疾病(如多发性硬化症)；动脉粥样硬化；肺气肿；肌营养不良症；骨质疏松症；和类风湿性关节炎。
为了避免疑问，在本发明的上下文中，术语“治疗”包括在需要这种治疗的患者中的治愈性和姑息性治疗，以及对相关疾病状态易感的患者的预防性治疗和/或诊断。
术语“患者”包括哺乳动物(例如人)患者。在本文中，术语“对象”或“患者”是本领域公知的，在这里可互换使用，用于表示哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，最优选人。在一些实施方式中，对象是需要治疗或者患有疾病或病症的对象。然而，在其他实施方式中，对象可以是正常对象。该术语不表示特定年龄或性别。因此，不论是成人还是新生儿，不论是男性还是女性，都包括在内。
术语“有效量”是指对治疗的患者产生疗效(例如足以治疗或预防疾病)的化合物的量。所述疗效可以是客观的(即通过测试或标记物可测量的)或主观的(即治疗对象表示出迹象或感觉到效果)。
在本文所用术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
除非另有说明，术语“芳基”在本文中使用时包括C6-14(例如C6-10)芳基基团。该基团可以是单环、双环或三环，具有6-14个环碳原子，其中至少一个环是芳族的。芳基基团的连接点可以通过环体系的任意原子。然而，当芳基基团是双环或三环时，它们通过芳族环连接至分子的其他部分。C6-14芳基基团包括：苯基、萘基等，例如1,2,3,4-四氢萘基、茚满基、茚基和芴基。可能提及的本发明的实施方式包括芳基是苯基的那些。
杂环(Het1至Het9和Heta至Hetc)基团可以是完全饱和的、部分饱和的、完全芳族或部分芳族的。可能提及的Het1至Het9和Heta至Hetc基团的例子包括：吖啶基,1-氮杂双环[2.2.2]辛烷基,吖丁啶基,苯并咪唑基,苯并异噻唑基,苯并异噁唑基,苯并二噁烷基,苯并二氧杂环庚烷基,苯并二氧杂环庚烯基(benzodioxepinyl),苯并间二氧杂环戊烯基,苯并呋喃基,苯并呋吖基,苯并[c]异噁唑烷基,苯并吗啉基,2,1,3-苯并噁二唑基,苯并噁嗪基(包括3,4-二氢-2H-1,4-苯并噁嗪基),苯并噁唑烷基,苯并噁唑基,苯并吡唑基,苯并[e]嘧啶,2,1,3-苯并噻二唑基,苯并噻唑基,苯并噻吩基,苯并三唑基,咔唑基,色满基,色烯基,噌啉基,2,3-二氢苯并咪唑基,2,3-二氢苯并[b]呋喃基,1,3-二氢苯并[c]呋喃基,1,3-二氢-2,1-苯并异噁唑基,2,3-二氢吡咯并[2,3-6]吡啶基,二噁烷基,呋喃基,呋咱基,六氢嘧啶基,乙内酰脲基,咪唑基,咪唑并[1,2-a]吡啶基,咪唑并[2,3-b]噻唑基,吲唑基,吲哚啉基,吲哚基,异苯并呋喃基,异色满基,异吲哚啉基,异吲哚基,异喹啉基,异噻唑基,异硫代色满基,异噁唑烷基,异噁唑基,马来酰亚胺,吗啉基,萘并[1,2-b]呋喃基,萘啶基(包括1,6-萘啶基，或者尤其是1,5-萘啶基和1,8-萘啶基),噁二唑基,1,2-或1,3-噁嗪烷基,噁唑基,氧杂环丁基,吩嗪基,吩噻嗪基,酞嗪基,哌嗪基,哌啶基,蝶啶基,嘌呤基,吡喃基,吡嗪基,吡唑基,哒嗪基,吡啶基,嘧啶基,吡咯烷酮基,吡咯烷基,吡咯啉基,吡咯并[2,3-b]吡啶基,吡咯并[5,1-b]吡啶基,吡咯并[2,3-c]吡啶基,吡咯基,喹唑啉基,喹啉基,喹嗪基,喹喔啉基,二氧噻吩烷基,3-二氧噻吩烯基,4,5,6,7-四氢苯并咪唑基,4,5,6,7-四氢苯并吡唑基,5,6,7,8-四氢苯并[e]嘧啶,四氢呋喃基,四氢异喹啉基(包括1,2,3,4-四氢异喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基),四氢吡喃基,3,4,5,6-四氢吡啶基,1,2,3,4-四氢嘧啶基,3,4,5,6-四氢嘧啶基,四氢喹啉基(包括1,2,3,4-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢喹啉基),四唑基,噻二唑基,噻唑烷基,噻唑基,噻吩基,噻吩并[5,1-c]吡啶基,硫代色满基,硫代乙氧苯基(thiophenetyl),三唑基,1,3,4-三唑并[2,3-b]嘧啶基,呫吨基等。
杂环(Het1至Het9和Heta至Hetc)基团上的取代基(合适的话)可以位于环体系中的任意原子上，包括杂原子。杂环(Het1至Het9和Heta至Hetc)基团的连接点可以通过包括(合适的话)杂原子(例如氮原子)在内的环体系中的任意原子，或者作为环体系的一部分存在的任意稠合碳环上的原子。杂环(Het1至Het9和Heta至Hetc)基团也可以是N-或S-氧化形式。
为了避免疑问，在式I的化合物中的两个或更多个取代基的身份相同的情况下，各个取代基的实际身份无论如何不是相互独立的。为了避免疑问，本文中采用术语如“R19a至R19c”时，本领域技术人员应理解表示R19a,R19b和R19c中的任一种(即适用的话，一些或所有)，包括本数。
可以采用的本发明的实施方式包括取代基为以下形式的式I化合物：
(a)R1至R3独立地代表H,卤素,CN,C1-6烷基(后一组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR6a和NR6gR6h),Cy1(其中Cy1基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR7a和NR7gR7h),Heta(其中Heta基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR8a和NR8gR8h),OR9a和NR9gR9h(例如，R1至R3独立地代表H)；
(b)R4和R5独立地代表H,C1-6烷基,C2-6烯基,C2-6炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),＝O,OR10a,S(O)qR10b,NR10gR10h,芳基和Het4或荧光基团),芳基,Cy2(其中后两组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR11a和NR11gR11h),Hetb(其中Hetb基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR12a和NR12gR12h),OR13a和S(O)qR13b,或者R4和R5可以与它们所连接的氮原子一起形成3至10元杂环，所述杂环可以是芳族、完全饱和或者部分不饱和并且可以额外地包含一个或多个选自O、S和N的杂原子，所述杂环任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-6烷基,C2-6烯基,C2-6炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基)。例如，R4表示H，R5表示H,C1-6烷基(其中后一组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,＝O,OR10a和Het4或荧光基团),芳基,Cy2(其中后两组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基(其中后一组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR11a和NR11gR11h),Hetb(其中Hetb基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,OR12a和NR12gR12h)和OR13a；
(c)Het1至Het6独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的6至10元杂环，所述杂环可以包含一个、两个或三个环，可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,C3-5烷基,C3-5烯基(其中后两组基团未取代或者任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素和Het7),和OR14。例如，Het4表示含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的6至10元杂环，所述杂环可以包含一个或两个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,C3-5烯基(后一组基团被Het7取代基取代),和OR14；
(d)Het7独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的6至10元杂环，所述杂环可包含一个或两个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,C1-6烷基,S(O)qR15a和OR15b；
(e)Cy1和Cy2每次出现时独立地表示5至6元芳族、完全饱和或部分不饱和的碳环；
(f)R6a至R6h,R7a至R7h,R8a至R8h,R9a至R9h,R10a至R10h,R11a至R11h,R12a至R12h,R13a至R13h,每次出现时独立地表示H,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基(其中后一组基团未取代或者被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR16a,NR16gR16h,芳基和Het8),或者R10g表示H，R10h表示C(S)NR17aR17b；
(g)Heta至Hetc独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的6至10元杂环；和/或
Het8独立地代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的6至10元杂环,所述杂环可包含一个或两个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,C1-6烷基，后一组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,OR18a和NR18bR18c；
(h)R14,R15a,R15b,R16a至R16h，R18a至R18c每次出现时独立地代表H,C1-4烷基,C2-4烯基,C2-4炔基其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-4烯基,C2-4炔基(其中后三组基团任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：OH,═O,卤素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),C3-6环烷基,or C4-6环烯基(其中后两组基团未取代或者任选地被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,OH,═O,C1-4烷基和C1-4烷氧基)；
(i)Het9代表含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的10至22元杂环，所述杂环可包含三个、四个或五个环并且可以被一种或多种选自以下的取代基取代：卤素,C1-6烷基,＝O,OR20a,NR20bR20c。
在本发明的另一些实施方式中，式I的化合物可选自下组：
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
和
i)
或者所述化合物药学上可接受的盐或溶剂合物，或者药物功能衍生物。
可能提及的本发明的另一些实施方式包括式I的化合物被同位素标记的那些。然而，其他，尤其是可能提及的本发明的具体实施方式包括式I的化合物没有被同位素标记的那些。
本文中使用的术语“同位素标记”包括在化合物中的一个或多个位置存在非天然同位素(或者非天然同位素的分布)的式I的化合物。本领域技术人员应理解，“化合物中的一个或多个位置”是指式I的化合物的一个或多个原子。因此，术语“同位素标记”包括在化合物中的一个或多个位置富含同位素的式I的化合物。式I化合物的同位素标记或富含可以用氢、碳、氮、氧、硫、氟、氯、溴和/或碘中的任一种的放射性或非放射性同位素进行。该方面可能涉及的具体同位素包括：2H,3H,11C,13C,14C,13N,15N,15O,17O,18O,35S,18F,37CI,77Br,82Br和125l)。
用放射性或非放射性同位素标记或富集的式I化合物时，可能涉及的式I的化合物包括化合物中至少一个原子显示相关原子的放射性或非放射性同位素的同位素分布水平比放射性或非放射性同位素的天然水平高至少10％(例如，10％至5000％,具体是50％至1000％，更具体是100％至500％)。
式I的化合物可以以包含药学上可接受的剂量形式的化合物的药物制剂的形式，通过任意合适的途径给予，但优选通过以下途径给予：口服，静脉内，肌内，皮肤，皮下，经粘膜(如舌下或口颊)，直肠，透皮，鼻，肺(如气管或支气管)，局部，通过任意其他胃肠外途径。可能涉及的具体的给药方式包括口服、静脉内、皮肤、皮下、鼻、肌内或腹膜内给予。
式I的化合物通常以与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的药物制剂的形式给予，可以根据指定的给药途径和标准药物实践进行选择。这些药学上可接受的载体可以是对活性化合物化学惰性的并且在使用条件下没有有害的副作用或毒性。合适的药物制剂参见例如《雷明登药物科学与实践》(Remington The Science and Practice ofPharmacy)，第19版,宾西马尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Printing Company,Easton,Pennsylvania)(1995)。对于胃肠外给药，可采用胃肠外可接受的水性乳液，无热源并且具有必要的pH、等张性和稳定性。合适的溶液是本领域技术人员公知的，文献中描述了大量方法。药物递送方法的简要综述也可参见例如Langer,Science(1990)249,1527。
否则，合适的制剂的制备可以由本领域技术人员采用常规技术和/或根据标准和/或可接受的药物实践常规实现。
本发明中使用的任意药物制剂中式I的化合物的量将取决于各种因素，例如需要治疗的病症的严重性，需要治疗的具体患者，以及采用的化合物。在任意情况下，制剂中式I的化合物的量将由本领域技术人员常规确定。
例如，诸如片剂或胶囊的固态口服组合物可包含1-99％(w/w)活性成分；0-99％(w/w)稀释剂或填充剂；0-20％(w/w)崩解剂；0-5％(w/w)润滑剂；0-5％(w/w)流动助剂；0-50％(w/w)造粒剂或粘合剂；0-5％(w/w)抗氧化剂；和0-5％(w/w)色素。控释片剂可额外地包含0-90％(w/w)的控释聚合物。
胃肠外制剂(例如用于注射的溶液或悬浮液或者用于输注的溶液)可包含1-50％(w/w)活性成分；50-99％(w/w)液体或半固体载体或运载体(例如，诸如水的溶剂)；和0-20％(w/w)的一种或多种其他赋形剂，例如缓冲剂、抗氧化剂、悬浮液稳定剂、张力调节剂和防腐剂。
根据需要治疗的病症和患者以及给药途径，式I的化合物可以以各种治疗有效剂量给予需要的患者。
然而，在本发明的内容中，给予哺乳动物(尤其是人类)的剂量应足以造成所述哺乳动物中持续合理时间长度的治疗性响应。本领域技术人员将理解，准确剂量和组成以及最合适的递送方案的选择也将受到以下因素的影响：制剂的药理学性质、需要治疗的病症的性质和严重性、接受者的身体状况和精神敏度、具体化合物的效力、需要治疗的患者的年龄、体重、性别和响应、疾病的阶段/严重性等等。
给药可以是连续或间断的(例如推注)。剂型可以根据给药周期和频率确定。对于口服或胃肠外给药来说，剂量可以约为，每天给予0.01-1000毫克式I的化合物。
在任意情况下，医疗实践者或其他本领域技术人员将能够常规确定对于个体患者而言是最合适的实际剂量。上述剂量是平均情况的示例，当然，也存在应使用更高或更低剂量范围的单独情况，这类剂量也在本发明的范围内。
如上所述，式I的化合物可以选择性结合游离巯基，因而可以用作确定游离巯基(即在半胱氨酸蛋白酶中)的存在和/或位置(体内或体外)的诊断试剂。
因此，根据本发明的又一方面，提供了一种确定组织样品中游离巯基的存在和/或位置的方法(例如体内，或者具体是离体方法)，所述方法包括使所述组织样品与式I的化合物接触，然后通过视觉化方法检测样品中式I的化合物的位置。
可能涉及的视觉化方法包括分光光度检测法(例如荧光检测、磁共振成像等)，或者，当式I的化合物是同位素标记或者富含放射性同位素(例如3H,11C,35S,18F或125I)时，放射性检测法(例如，通过本领域技术人员已知的标准放射自显影、磷光体或闪烁方法的α-、β-或γ-检测，或正电子发射断层扫描法(后一种方法可以例如当式I的化合物存在11C或具体是18F同位素标记或富集时采用))。
本文所述的本发明的方面(例如上述化合物、组合、方法和应用)在本文所述病症的治疗中具有优势，与现有技术已知的用于这些疾病或其他的治疗的类似化合物、组合、方法(治疗)或应用相比，它们对于医师和/或患者而言更加方便，更加有效，毒性较小，具有更好的选择性，具有更宽的活性范围，效力更高，产生的副作用较少，或者具有其他有用的药理学性质。
式I的化合物可以根据本领域技术人员已知的技术进行制备，例如如下所述。
本发明的化合物可以采用常规技术(例如重结晶、柱色谱、制备型HPLC等)从其反应混合物分离。
在上述和后文描述的方法中，中间化合物的官能团可能需要由保护基团进行保护。
官能团的保护和脱保护可以在上述方案反应之前或之后进行。
保护基团可以根据本领域技术人员公知的技术去除，如下所述。例如，可以采用标准脱保护技术将本文所述保护的化合物/中间体化学转化为未保护的化合物。
涉及的化学类型将指导保护基团的需要和类型以及完成合成的顺序。
保护基团的使用参见《有机化学中的保护基团》(Protective Groups in OrganicChemistry),J W F McOmie编,Plenum Press(1973),和《有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis),第3版,T.W.Greene&P.G.M.Wutz,Wiley-Interscience(1999)。
本文所用术语“官能团”在未保护的官能团的情况下表示羟基、巯基、氨基官能、羧酸，在保护的官能团的情况下表示低级烷氧基、N-、O-、S-乙酰基、羧酸酯。
在本发明的又一方面，提供了式I的化合物作为成像或诊断试剂的应用。例如，式I的化合物可以同位素标记和/或选自下组：
i)
ii)
和
iii)
或所述化合物药学上可接受的盐或溶剂合物，或者药物功能衍生物。
在本发明的又一方面，提供了包含(任选地通过连接基团的方式)共价连接至具有诊断或成像性质的生物分子或者材料的丙二烯酰胺的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂合物或药物功能衍生物。在本发明的其他相关方面，本文所述的化合物用作诊断或成像试剂。
实施例
一般描述
所有化学物质购自供应商(Sigma Aldrich,Merck,Alfa Aesar和TCI)，无需进一步纯化。用于肽合成的氨基酸购自GL Biochem公司。NMR谱采用Bruker 300或400MHz分光光度计记录。质谱在Thermo LCQ FLEET设备上记录。化合物14和15的HPLC纯化在反相Shimadzu HPLC系统上进行，采用Alltima C-18(250X10mm)柱，流速3毫升/分钟。荧光发射光谱记录在Typhoon TRIO可变模式成像仪上。LC-MS/MS谱记录在具有Dionexpepmap C-18柱的Dionex UHPLC和LTQ-轨道阱设备上。BSA蛋白的MS/MS之后产生的数据通过gpm软件进行分析。
制备
制备1:合成3-丁炔酸
氧化3-丁炔-1-醇并根据报道的过程(Schmieder-van de Vondervoort,L.等,P.L.Synlett2002,2002,0243)制备3-丁炔酸。水(45mL)加入配备有磁力搅拌棒的150mL单颈RBF中。相继加入65％HNO3(0.17mL,5mol％,2.5mmol),Na2Cr2O7(0.15g,1mol％,0.5mmol)和NaIO4(23.53g,2.2当量,110mmol)至RBF中，混合液在冰浴上剧烈搅拌15分钟。将溶解在45mL的冷水中的3.78mL的3-丁炔-1-醇(1当量,50mmol)缓慢加入该混合液中，反应混合液静置18-24小时(未除去冰浴以允许冰融化并且反应混合液的温度缓慢上升至室温)。然后，产物用乙醚(80mL X 6)萃取。合并所有馏分，在无水硫酸镁上干燥。采用旋转蒸发仪除去溶剂，得到橙色/淡黄色的粘稠液体。然后加入二氯甲烷，在旋转蒸发仪上除去溶剂(真空下)4-5次，得到3.20g灰白色/淡黄色固体(38mmol,产率76％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.38(d,2H,J＝2.7Hz),2,25(t,1H,J＝2.7Hz)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ173.8,74.8,72.4,25.6
制备2:合成(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(N-Boc-乙二胺)
采用Liu,F.等,Bioconjugate Chemistry2012,23,1639报道的过程合成标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(s,1H),3.15(t,2H,J＝5.7Hz),2.79(t,2H,J＝5.9Hz),1.45(s,9H)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ156.1,78.7,53.2,43.2,41.6,28.2
合成化合物和肽
合成丙二烯酰胺的一般过程
室温下，3-丁炔酸用1.5当量的Mukaiyama反应试剂(2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物)在无水二氯甲烷中搅拌1小时，没有任何碱。1小时之后，将无水二氯甲烷中的所需胺(1.1当量)和三乙胺(1.5当量)的溶液逐滴加入3-丁炔酸混合液中。该步骤期间观察到少量放热，然后反应混合液再搅拌半小时。然后，采用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，将乙酸乙酯加入固体残留物中，然后转移至分液漏斗。有机层用水洗涤2次，在无水硫酸钠上干燥。蒸发溶剂得到粗产物，然后柱色谱纯化。发现产率对三乙胺的量敏感，过量的TEA导致较低的产率。
合成N-苄基丁-2,3-二烯酰胺(1a)
3-丁炔酸(制备1,0.23g,1当量,2.76mmol)和1.05g 2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5当量,4.13mmol)加入配备有磁力搅拌棒的25mL双颈烘干RBF中。加入10mL无水二氯甲烷，混合液在氮气下搅拌1小时。逐滴加入0.33mL苄基胺(1.1当量,3.03mmol)和0.6mL三乙胺(1.5当量,4.55mmol)在5mL无水二氯甲烷中的溶液，然后将反应混合液再搅拌半小时。在上文所述后处理之后，产物通过快速柱色谱纯化(20-30％EA在己烷中)，得到0.3212g的1(1.86mmol；产率67％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.25(m,5H),6.31(s,1H),5.67(t,1H,J＝6.6Hz),5.19(d,2H,J＝6.7Hz),4.46(d,2H,J＝5.9Hz)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ212.0,164.5,138.2,128.7,127.8,127.5,90.8,80.6,43.7；ESI-MS C11H11NO[M+H]+m/z计算值174.09,实际值174.02
合成2-(丁-2,3-二烯酰胺)乙酸乙酯(1b)
3-丁炔酸(制备1,0.34g,1当量,4.04mmol)和1.55g 2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5当量,6.06mmol)加入配备有磁力搅拌棒的25mL双颈烘干RBF中。加入15mL无水二氯甲烷，混合液在氮气下搅拌1小时。逐滴加入0.62g甘氨酸乙酯盐酸盐(1.1当量,4.45mmol)和1.6mL三乙胺(2.5当量,11.25mmol)在5mL无水二氯甲烷中的溶液，然后将反应混合液再搅拌半小时。在上文所述后处理之后，产物通过快速柱色谱纯化(20％EA在己烷中)，得到0.4321g的6(2.56mmol；产率63％)。(收集产物，rf值稍许变化的两个馏分。第一馏分(0.19g)含有20％同型丙炔基异构体(homopropargylic isomer)，第二馏分(0.24g)含有纯的丙二烯异构体(allenic isomer)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.71(s,1H),5.71(t,1H,J＝6.59Hz),5.26(d,2H,J＝6.64Hz),4.21(q,2H,J＝7.16Hz),4.06(d,2H,J＝5.44Hz),1.29(t,3H,J＝7.15)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ212.3,169.9,164.8,90.2,80.6,61.4,41.4,14.1；ESI-MS C8H11NO3[M+H]+m/z计算值169.07,实际值169.09
合成N-环己基丁-2,3-二烯酰胺(1c)
3-丁炔酸(制备1,0.10g,1当量,1.21mmol)和0.46g 2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5当量,1.82mmol)加入配备有磁力搅拌棒的25mL双颈烘干RBF中。加入6mL无水二氯甲烷，混合夜在氮气下搅拌1小时。逐滴加入0.15mL环己基胺(1.1当量,1.33mmol)和0.28mL三乙胺(1.5当量,2.00mmol)在4mL无水二氯甲烷中的溶液，然后将反应混合液再搅拌半小时。在上文所述后处理之后，产物通过快速柱色谱纯化(20％EA在己烷中)，得到0.1143g的7((28％同型丙炔基和72％丙二烯异构体作为单独馏分)(0.69mmol；产率57％)。
同型丙炔基异构体：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.38(s,1H)3.81-3.72(m,1H)3.19(d,2H,J＝2.68Hz),2.37(t,1H,J＝2.7Hz),1.94-1.89(m,2H),1.72(td,2H,J＝3.7,13.5Hz),1.62(td,1H,J＝3.7,13.0Hz),1.44-1.33(m,2H),1.24-1.15(m,3H)；13C NMR(300MHz,CDCl3)δ165.0,77.7,74.0,48.4,32.8,27.5,25.5,24.7；ESI-MS C10H15NO[M+H]+m/z计算值165.12,实际值165.09
丙二烯异构体(1c):1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.74(s,1H),5.61(t,1H,J＝6.7Hz),5.21(d,2H,J＝6.7Hz),3.83-3.75(m,1H),1.95-1.92(m,2H),1.72-1.60(m,3H),1.42-1.33(m,2H),1.22-1.10(m,3H)；13C NMR(300MHz,CDCl3)δ211.5,163.5,91.2,80.3,48.3,33.1,25.5,24.8；ESI-MS C10H15NO[M+H]+m/z计算值165.12,实际值165.10
合成N-(萘-1-基)丁-2,3-二烯酰胺(1d)
3-丁炔酸(制备1,0.11g,1当量,1.27mmol)和0.48g 2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5当量,1.90mmol)加入配备有磁力搅拌棒的15mL双颈烘干RBF中。加入6mL无水二氯甲烷，混合夜在氮气下搅拌1小时。逐滴加入0.16g 1-萘基胺(0.9当量,1.14mmol)和0.24mL三乙胺(相对于萘基胺1.5当量,1.71mmol)在4mL无水二氯甲烷中的溶液，然后将反应混合液再搅拌半小时。如上所述后处理之后，产物通过快速柱色谱纯化(25％EA在己烷中)，得到0.067g浅棕色固体，发现是8的同型丙炔基异构体。然而，用1eq.三乙胺的无水二氯甲烷(1mL)溶液处理可容易地异构化为8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H),7.87(dd,1H,J＝6.9,2.4Hz),7.80(d,1H,J＝6.8Hz),7.70(d,1H,J＝8.3Hz),7.55-7.46(m,4H),5.89(t,1H),5.45(d,2H,J＝4.8Hz；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ211.8,162.8,134.1,132.1,128.9,126.9,126.4,126.0,125.9,120.2,92.0,81.4；ESI-MS C14H11NO[M+H]+m/z计算值209.08,实际值209.06
合成N-(2-氧代-4-(三氟甲基)-2H-色烯-7-基)丁-2,3-二烯酰胺(1e)
3-丁炔酸(制备1,0.27g,1当量,3.2mmol)和1.22g 2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5当量,4.8mmol)加入配备有磁力搅拌棒的25mL双颈烘干RBF中。加入10mL无水二氯甲烷，混合液在氮气下搅拌1小时。0.66g胺(7-氨基-4-(三氟甲基)-2H-色烯-2-酮)分批加入(0.9当量2.9mmol)(固体)，然后加入在5mL无水二氯甲烷中的0.60mL三乙胺(相对于胺1.5当量,4.3mmol)，然后将反应混合液再搅拌半小时。到时间之后，蒸发二氯甲烷，产物通过快速柱色谱纯化(30-40％EA在己烷中)，得到黄色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(s,1H),7.81(d,1H,J＝2.1Hz),7.66(dd,1H,J＝1.7,8.9Hz),7.49(dd,1H,J＝2.1,8.8Hz),6.70(s,1H),5.82(t,1H,J＝6.6Hz),5.46(d,2H,J＝6.6Hz)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ212.2,162.6,159.1,155.3,142.1,126.1,126.0,115.9,113.9,113.8,109.5,107.2,91.7,82.1；ESI-MS C14H8F3NO3[M+H]+m/z计算值296.05,实际值296.16
合成(2-(丁-2,3-二烯酰胺)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1f)
采用上文所述的过程，采用0.38g 3-丁炔酸(制备1,4.5mmol),1.74g Mukaiyama反应试剂(1.5当量,6.8mmol),0.8727g N-Boc-乙二胺(如上所述；1.2当量,5.4mmol)和0.6mL三乙胺。得到0.3833g产物(1.7mmol,产率38％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.79(s,1H),5.64(t,1H,J＝6.6Hz),5.31(s,1H),5.22(d,2H,J＝6.6Hz),3.42-3.38(m,2H),3.29(t,2H,J＝5.5Hz),1.44(s,9H)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ211.9,165.3,156.8,90.5,80.3,79.4,73.9,40.8,40.1,28.2,27.2
合成N-(2-氨基乙基)丁-2,3-二烯酰胺(1g)
根据Liu,F.等,Bioconjugate Chemistry2012,23,1639的方法由1f合成化合物。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.10(s,1H),5.75(t,1H,J＝6.6Hz),5.32(d,2H,J＝6.6Hz),3.55(t,2H,J＝5.8Hz),3.12(t,2H,J＝5.8Hz)；13C NMR(400MHz,MeOD)δ213.0,167.2,89.0,79.2,39.4,37.1；ESI-MS C6H10N2O[M+H]+m/z计算值127.08,实际值126.99
表1列举了由相应的胺合成的C-取代的丙二烯酰胺1a至1f
a有时观察到少量同型丙炔基酰胺，过量TEA可异构化为丙二烯异构体
合成具有丙二烯酰胺手柄(6)的荧光异构体
在1.5mL玻璃试管中，50mg FITC(异硫氰酸荧光素)异构体I(1当量，0.13mmol)溶解在0.5mL DMF中。加入溶解在0.5mL DMF中的1g(1.5当量,0.19mmol)的24mg，然后是34μLDIPEA(N,N-二异丙基乙基胺)，反应混合液在黑暗中搅拌2小时。2小时后LCMS显示形成所需的化合物。反应混合液直接加载到硅胶柱上，产物用25％MeOH的二氯甲烷溶液洗脱。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.02(d,2H,J＝1.7Hz),7.70(dd,1H,J＝2.0,8.2Hz),7.24-7.14(m,4H),6.64(m,6H),5.71(t,1H,J＝6.6Hz),5.28(d,2H,J＝6.6Hz),3.81(t,2H,J＝5.7Hz),3.57-3.47(m,4H)；ESI-MS C27H21N3O6S[M+H]+m/z计算值516.12,实际值516.23
合成具有丙二烯酰胺手柄(7)的Cy3(花青3)
在1.5mL玻璃试管中，5.0mg Cy3-NHS酯(1当量,8.5μmol)溶解在250μL DMF中。加入溶解在250μL DMF中的1g(2当量,17μmol)的2.1mg，然后是3μL DIPEA(2当量,17μmol)。反应混合液在黑暗中搅拌2小时，然后LCMS显示形成所需的产物，产物在反相HPLC上纯化，采用C-18制备柱以及含有0.1％TFA的水/ACN溶剂系统。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.58(t,3H,J＝13.6),8.04(s,1H),7.57(d,2H,J＝7.3Hz),7.50-7.46(m,2H),7.39-7.28(m,4H),7.14-7.04(m,1H),6.47(dd,2H,J＝2.9,13.5Hz),5.68(t,1H,J＝6.6Hz),5.26(d,2H,J＝6.6Hz),4.18(t,2H,J＝7.5Hz),3.78(t,1H,J＝7.1),3.71(s,2H),2.24(t,2H,J＝7.2Hz),1.92-1.84(m,2H),1.79(s,6H),1.73(t,2H,J＝7.5),1.60(s,1H),1.54-1.47(m,3H),1.40-1.27(m,6H)；ESI-MS C36H45ClN4O2[M-Cl+H]+m/z计算值565.35,实际值565.62
合成具有丙二烯酰胺手柄(8)的磺基-Cy5(花青素5)
在1.5mL玻璃试管中，2.5mg磺基-Cy5-NHS酯(1当量,3.8μmol)溶解在200μL DMF中。加入溶解在100μL DMF中的1g(2当量,7.6μmol)的0.9mg，然后是1.3μL DIPEA(2当量,7.6μmol)。反应混合液在黑暗中搅拌2小时。产物在反相HPLC上纯化，采用含有0.1％TFA的C-18制备柱和水/ACN溶剂系统。
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.99(t,2H,J＝13.0Hz),7.80–7.73(m,4H),7.27(dd,2H,J＝8.6,11.4Hz),6.51(t,1H,J＝12.9),6.27–6.19(m,2H),5.58(t,1H,J＝6.6Hz),5.11(d,2H,J＝6.6Hz),4.03(m,4H),3.16–3.11(m,4H),2.15(s,1H),2.13–2.11(m,2H),1.76(m,2H),1.61(s,12H),1.53(m,2H),1.29(t,3H,J＝7.3Hz),1.25(m,2H).ESI-MS C38H45N4NaO8S2[M-Na+2H]+m/z计算值751.28,实际值751.47
肽合成
采用预先加载的Wang树脂并根据标准操作，在配备有UV检测器的自动化Liberty1CEM微波肽合成仪上合成肽CGKSRF(3),KSCGRF(4)和YDSQCFHRW(5)。肽通过LCMS表征，无需进一步纯化即可使用。
实施例1
采用1a修饰半胱氨酸甲酯得到1aa
向丙二烯酰胺1a(0.122mmol；21.2mg在0.4mL THF中)的溶液中加入半胱氨酸甲酯盐酸盐(0.122mmol；21.0mg)和碳酸钾(0.125mmol；17.3mg)在1.6mL水中的混合液。反应混合物搅拌30分钟，然后TLC验证1a完全消耗。在旋转蒸发仪上蒸发THF，产物在二氯甲烷中萃取两次(每次2.5mL)。蒸发溶剂，产物通过柱色谱纯化(5％MeOH的二氯甲烷溶液)，得到32.8mg(产率76％)白色固体(修饰的半胱氨酸)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.25(m,5H),6.69(s,1H),5.33(s,1H),5.11(s,1H),4.51-4.40(m,2H),3.70(s,3H),3.69(t,1H,J＝4.5Hz),3.23(d,2H,J＝2.5Hz),3.17(dd,1H,J＝4.7,13.7Hz),2.94(dd,1H,J＝7.7,13.8Hz),1.65(s,2H)；13C NMR(400MHz,CDCl3)δ174.13,168.85,138.25,137.83,128.64,127.68,127.43,112.76,53.44,52.40,45.16,43.62,36.12；ESI-MS C15H20N2O3S[M+H]+m/z计算值309.13,实际值309.10
苄基丙二烯酰胺1a与含有游离巯基和氨基基团的半胱氨酸甲酯的反应显示在图2A中。即使使用过量的1a，没有观察到游离氨基的反应。发现仅游离巯基参与反应，得到产物1aa。同时，在类似的条件下，当1a与赖氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸反应时没有获得产物，证实在采用的条件下丙二烯酰胺与巯基的反应是选择性的。
实施例2
采用丙二烯酰胺1a修饰谷胱甘肽(2)得到2a
在4mL玻璃试管中，6.5mg谷胱甘肽(0.021mmol)溶解在0.5mL碳酸铵缓冲液(pH8.0)中。向溶液中加入7.3mg丙二烯酰胺1a(0.042mmol；2当量)在0.5mL THF中的溶液，所得溶液用移液管充分混合。15分钟后LCMS显示谷胱甘肽完全转化，然后将3mL THF加入试管中，导致产物2a沉淀。混合液在8000rpm离心5分钟。小心倾滗掉液体，沉淀的固体用THF洗涤两次。最终洗涤后的沉淀真空干燥，得到9.9mg(产率97％)白色固体(修饰的谷胱甘肽)。
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.36-7.27(m,5H),5.36(s,1H),5.19(s,1H),4.57(dd,1H,J＝5.0,8.6),4.35(s,2H),3.70(d,2H,J＝8.0),3.67-3.65(m,1H),3.25(m,3H),3.02(dd,1H,J＝8.7,13.9),2.42(t,2H,J＝8.0),2.06(q,2H,J＝7.6)；13C NMR(400MHz,D2O)δ175.5,174.9,173.9,172.5,171.8,138.0,136.4,128.8,127.5,127.3,115.2,54.2,52.5,44.2,43.2,43.0,32.4,31.5,26.2；ESI-MS C21H28N4O7S[M+H]+m/z计算值481.18,实际值481.23
天然产生的三肽谷胱甘肽(GSH；2)与丙二烯酰胺1a的反应显示在图2B中。所得产物2a的分离产率为97％，通过NMR和LC-MS/MS表征证实，肽残基中在半胱氨酸残基(即巯基)而非氨基的修饰，提示C-取代的末端丙二烯酰胺对特定的半胱氨酸偶联具有优异的反应选择性(图3)。
实施例3
用丙二烯酰胺1a修饰肽3，4和5的一般过程
为了进一步阐述选择性，还研究了具有末端以及内部半胱氨酸残基的三种其他肽序列的半胱氨酸修饰，包括Cys-Gly-Lys-Ser-Arg-Phe(3),Lys-Ser-Cys-Gly-Arg-Phe(4)和Tyr-Asp-Ser-Gln-Cys-Phe-His-Arg-Trp(5)。
将100μL肽溶液(250μM，在pH 8.0的碳酸铵缓冲液中)与等量的1a溶液(2.5mM在含有5％THF的碳酸铵缓冲液中)混合。移液管混合之后，反应混合液于室温静置10-20分钟。进行LCMS以确保完全转化。位点选择性通过LC-MS/MS建立。
在所有情况下，在如上所述孵育肽上获得定量转化。LCMS和LC-MS/MS分析(图4-6)证实，修饰在半胱氨酸处选择性发生。应理解，其他氨基酸残基，包括组氨酸，赖氨酸，酪氨酸和其他反应性侧链不会与1a发生反应，即使静置过夜。偶联产物的不可逆性用肽5和GSH(2)测试。当5和1a的偶联产物与过量(100当量)谷胱甘肽37℃孵育过夜时，没有观察到转化为起始材料5。类似地，用过量(100当量)DTT处理2a不会产生2(LCMS)，清楚提示偶联产物的稳定性。因此，特定半胱氨酸标记的不可逆性使得细胞内环境中的蛋白质修饰成为可能。
实施例4
用化合物1b-1d修饰肽5
用1b-d修饰肽5，在每种情况下得到定量转化和优异的选择性(参见表2和图7-9)。
表2：用丙二烯酰胺1b-d修饰肽5中的半胱氨酸。
编号 丙二烯酰胺 肽序列 转化<sup>a</sup>
1 1b YDSQCFHRW 定量
2 1c YDSQCFHRW 定量
3 1d YDSQCFHRW 定量
a
LCMS测定
实施例5
用1a修饰胰岛素
在简单肽中获得有前景的结果之后，在更加复杂的肽序列中检测半胱氨酸残基的类似修饰。检测了由DTT处理的牛胰岛素产生的更加复杂的肽对(图10)。
将10当量的固体DTT加入2ml 10mM牛胰岛素在50mM pH8的碳酸铵缓冲液的溶液中。混合液用移液管混合之后，在氮气气氛下70℃静置10分钟。到时间之后进行LCMS，冷却至室温以证实二硫键完全还原。在对应于还原的链B和链A的色谱图中观察到两个独立的峰。对应于链B的m/z值为680,850,1133和1700，对应于链B上的+5,+4,+3和+2电荷(分子量3397.67)。类似地，对应于链A的m/z值为779,1169和2338，对应于链A上的+3,+2和+1电荷(分子量2337.97)。1ml还原的胰岛素化合物加入25当量溶解在500μL THF中的1a，移液管混合之后，反应混合液室温静置30分钟。30分钟后LCMS证实如预期修饰，显示具有不同rf值的两个峰，对应于修饰的链B和链A。m/z值与链B分子量的预期增量346相一致(173*2＝346,显示包含两个分子量为173的分子1)，链A分子量的预期增量692相一致((173*4＝692,显示包含四个分子1)，这与每条链中半胱氨酸残基的数量相一致。因此，修饰的链B的预期分子量为3743.67(3397.67+346)，链A为3029.97(2337.97+692)，修饰的链B的m/z值为750,937,1249和1873，对应于+5,+4,+3和+2电荷，修饰的链A的m/z值为1011和1515，对应于链上+3和+2电荷。位点选择性通过MS/MS进一步验证(分别是图11和12)。
实施例6
用化合物1a修饰(烷基化)BSA
6.6mg BSA(0.1μmol)溶解在1ml碳酸铵缓冲液中(pH 8.0)。加入2.3mg固体DTT(15μmol)，移液管混合之后，所得混合物在37℃孵育过夜。然后加入溶解在1ml碳酸铵缓冲液(5％THF)中的3.7mg 1a(21μmol)，37℃再次孵育30分钟。到时间之后，蛋白质通过纳米级分离过滤进行纯化。纯化的蛋白质进行胰蛋白酶消化和采用标准过程的LC-MS/MS(图13)。发现检测的肽中的所有半胱氨酸残基被对应于1a的分子量(173.0841)修饰。
实施例7
用6-8标记BSA的过程
在1ml的离心管中将0.1μmol/mL BSA的H2O(10μL,1nmol)溶液,1.0μmol/mL 6,7和8的H2O(10μLeach,10nmol)溶液以及80μL Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)混合，37℃孵育30分钟。然后，所得溶液进行SDS-PAGE分析，验证所需的标记是否成功发生(图14A)。
实施例8
用7标记β-内酰胺酶的过程
对于TEM1β-内酰胺酶,在1ml离心管中将0.1μmol/mLβ-内酰胺酶的H2O(10μL,1nmol)溶液,1.0μmol/mL 7的H2O(10μL,10nmol)溶液以及80μL Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)混合，37℃孵育30分钟。到时间之后，反应混合液进行SDS-PAGE分析以验证无标记。在本实验的第二部分，0.1μmol/mLβ-内酰胺酶(1mL)与1.0μmol/mL DTT(1mL)溶液于80℃加热10分钟。冷却至室温之后，10μL等分试样的混合物与10μL 7(2.0μmol/mL在H2O中)以及80μLTris-HCl缓冲液(pH 7.4)混合，37℃孵育30分钟。所得混合物的SDS-PAGE分析揭示成功标记。
为了显示标记是对巯基特异性的，选择仅具有二硫键合半胱氨酸(无游离半胱氨酸)的已建立的抗生素耐受性细菌酶TEM 1β-内酰胺酶(B1a)。化合物7与Bla混合而没有DTT处理，没有观察到标记(道5,图14B)，当Bla用DTT处理然后与7混合则观察到成功标记(道3，图14B)。这些结果表明，丙二烯酰胺能够作为在蛋白质环境的复杂情况下选择性靶向半胱氨酸残基的有效手柄，成为成像应用的可选择的手段。

Claims (11)

1.一种化合物，选自下组：
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
和
i)
或者所述化合物药学上可接受的盐或药物功能衍生物。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物经同位素标记。
3.如权利要求1所述的化合物作为游离巯基的不可逆结合剂的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述游离巯基是肽或蛋白质的一部分。
5.如权利要求3或4所述的应用，其中，所述应用是体外或体内的。
6.如权利要求3所述的应用，其中，所述应用是水性介质或生理学条件下，或者其等价条件下。
7.如权利要求1所述的化合物，用作药物。
8.如权利要求1所述的化合物，用于治疗通过抑制半胱氨酸蛋白酶得到缓解的病症或疾病。
9.如权利要求1所述的化合物在制备用于治疗通过抑制半胱氨酸蛋白酶得到缓解的病症或疾病的药物中的应用。
10.如权利要求1所述的化合物作为成像或诊断试剂的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其中，式I的化合物经同位素标记和/或选自下组：
i)
ii)
和
iii)
或其药学上可接受的盐或药物功能衍生物。
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