CN111228222A - 纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用，所述纳米碗支撑载药脂质体的制备方法为：将纳米碗与脂质体通过孵育超声，并利用硫酸铵主动载药的方法，成功包载药物，得到纳米碗支撑载药脂质体。本发明还包括所述纳米碗支撑载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。其优点表现在：本发明的纳米碗(nanobowl)支撑的载药脂质体能抵抗血浆蛋白和血流剪切力对药物渗漏的影响，提高了药物在肿瘤部位的传递，提高了载体稳定性，提高了抗肿瘤的疗效。为全水纳米脂质体空腔设计了物理支撑，具有很好的应用前景。

Description

纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症，即恶性肿瘤，目前已成为世界第二大死因，严重威胁着人类的生命健康。2017年2月3日，世界卫生组织最新公布数据表明，全球每年有880万人死于癌症，占全球每年死亡总人数近六分之一，每年有1400多万新发癌症病例，而预计到2030年这一数字将增加到2100多万。如何攻破癌症这一世界难题，已成为生命科学领域迫切希望解决的热点问题。
然而对于癌症的治疗药物，由于其本身对于正常组织细胞的毒性和极快的清除速率，使其疗效受到了极大的限制。纳米载体技术的诞生，因其良好的生物相容性、理想的长循环时间以及准确的靶向性，使得其与癌症治疗的结合能够突破药物自身因素的限制，发挥更好的疗效。
而纳米药物之所以能够实现如此多单独药物无法完成的工作，其中一个重要的作用机制便是，增强的渗透性和保留效应(Enhanced Permeation andRetention，简称EPR效应)。EPR效应指的是指一些特定大小的大分子物质(如脂质体、纳米颗粒以及一些大分子药物)更容易渗透进入肿瘤组织并长期滞留(和正常组织相比)的现象。以EPR效应为理论基础的纳米药物治疗策略便是通过改变药物的药物动力学和生物分布，使得药物峰值浓度最大化(Cmax)，同时增加药物在血浆和肿瘤组织处的药物浓度-时间关系曲线下面积(AUC)，来提高药物疗效和机体耐受性，从而延长药物在靶标部位的药物治疗水平。
其中，脂质体作为第一种被批准上市用于抗肿瘤治疗的纳米颗粒，以及其余以脂质体为基础而设计的纳米颗粒一起，占据了临床纳米治疗中相当大的比例。然而，虽然将化疗药物包裹在脂质体中能够改善药物的代谢动力学和生物组织分布，但是与传统的化疗药物相比，目前已上市的脂质体药物制剂却并未能显著提高总的存活率。由此可见，脂质体给药系统仍旧面临着困难和挑战。
在众多挑战中，脂质体的稳定性显得至关重要，其决定了载药脂质体在制备、储存以及体内代谢过程中，药物的载药量、渗漏率以及释药速率等性质的改变。脂质体的主要成分为磷脂，而其中有一部分磷脂含有不饱和脂肪酸支链，此类磷脂易氧化水解，导致磷脂双分子层的流动性降低，通透性增加，团聚现象加剧，药物泄漏率上升，载药量下降等。研究表明，不同磷脂成分形成的脂质体，其性质会发生相应改变，从而影响脂质体的稳定性和释药速率。相变温度，作为另一重要因素，影响着脂质体储存的稳定性。当温度超过磷脂的相变温度后，磷脂将由凝胶态转变为液晶态，从而使得脂质双分子层结构松散，稳定性下降，药物释放，储存期缩短。此外，热敏脂质体也正是基于相变温度的原理，通过改变温度达到控制药物释放的目的。
而脂质体在体内的稳定性，无疑是决定药物疗效的关键之处。显然，单纯的EPR效应理论可能无法完全解释脂质体在机体中所发生的一系列改变。因为在纳米颗粒通过静脉注射后，到达肿瘤组织前，还需要经过很多的生物过程，如血液循环系统的流体力学作用、与各类蛋白质和细胞因子的相互作用、纳米颗粒的组织渗透作用等。血流中剪切力的改变，能够改变脂质体的形变程度，影响脂质体的稳定性；有研究指出，血清中的高密度脂蛋白能够与磷脂相互结合，形成孔洞缺口；脂质体能够激活补体系统，在脂质体表面形成亲水性通道，导致脂质体渗透性增加，内容物大量泄漏；血清白蛋白甚至能够与脂质体结合，形成“冠冕”结构，影响脂质体的稳定性；同时，循环系统中的单核吞噬细胞系统能够快速识别脂质体，并快速将其清除。为此，如何改进脂质体的组成成分、形态、尺寸、Zeta电位、表面特性，以克服上述困境，更好地发挥脂质体药物的疗效显得至关重要。
本发明旨在立足现阶段脂质体药物制剂面临的挑战，建立一种新型脂质体给药系统---纳米碗支撑阿霉素脂质体。纳米碗由于其独特的形貌构造，在给予脂质体足够刚性支撑作用的同时，又为阿霉素的成功装载预留了足够的内腔空间。阿霉素脂质体，作为最早上市的纳米药物，经过多年的临床应用，虽然对于肿瘤患者的治疗有一定改善，但也暴露了其自身的一些缺憾。纳米碗的加入，有望解决一些切实问题，具有极高的科学价值和潜在的临床转化意义。本发明通过考察纳米碗支撑阿霉素脂质体对于肿瘤组织和正常组织不同作用，从而，全面评价纳米碗支撑阿霉素脂质体的体内抗肿瘤疗效。
关于本发明纳米碗支撑载药脂质体及其制备方法和应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种纳米碗支撑载药脂质体。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述纳米碗支撑载药脂质体的制备方法。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述纳米碗支撑载药脂质体的用途。
本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供一种纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体。
本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
纳米碗支撑载药脂质体，其制备方法包括如下步骤：
(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑载药脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载药物，得到纳米碗支撑载药脂质体。
优选地，步骤(3)中所述的药物选自阿霉素、伊立替康、长春新碱中的任意一种。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的纳米碗支撑载药脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑载药脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载药物，得到纳米碗支撑载药脂质体。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的纳米碗支撑载药脂质体在制备抗肿瘤的药物中的应用。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体，其制备方法包括如下步骤：
(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载阿霉素/伊立替康/长春新碱，得到纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体。
优选地，其特征在于，步骤(1)中所述的聚苯乙烯纳米颗粒粒径为45-55nm；所述的花生状纳米颗粒是用苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒按照Vstyrene:VMPSNPs＝3:1制得；所述的二氧化硅改性花生状纳米颗粒是用0.3g的TEOS制得的。
优选地，其特征在于，所述的纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的平均粒径为140-150nm，Zeta电位为-18～-16mV。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备方法，包括如下步骤：(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载阿霉素/伊立替康/长春新碱，得到纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体。
优选地，步骤(1)中纳米碗的制备方法为：
1)制备聚苯乙烯纳米颗粒：以苯乙烯为单体，SDS为乳化剂，KPS为引发剂，采用乳液聚合法合成聚苯乙烯纳米颗粒；
2)制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒：在已合成的聚苯乙烯纳米颗粒的基础上，加入苯乙烯、MPS和AIBN，通过聚合反应合成MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒；
3)制备花生状纳米颗粒：将2)制备完毕的MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒与苯乙烯、VBS混合，共置于超纯水中搅拌，利用聚苯乙烯的溶胀作用，令MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒发生形变涨破，随后加入AIBN，再次引发聚合反应，最终形成花生状纳米颗粒；
4)制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒：将3)所得花生状纳米颗粒通过超速离心后再分散的方式，转移至无水乙醇之中，随后加入25％浓氨水，配置含有50％TEOS的乙醇溶液，缓慢滴加后得到二氧化硅改性的花生状纳米颗粒；
5)制备纳米碗：将4)得到的二氧化硅改性的花生状纳米颗粒转移至旋转蒸发仪上，挥去多余的乙醇后，加入四氢呋喃溶解，超速离心收集沉淀得到最终产物——纳米碗。
优选地，步骤(1)中所述的聚苯乙烯纳米颗粒粒径为50nm；所述的花生状纳米颗粒是用苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒按照Vstyrene:VMPSNPs＝3:1制得；所述的二氧化硅改性花生状纳米颗粒是用0.3g的TEOS制得的。
本发明制备的纳米碗支撑阿霉素脂质体中通过纳米碗的支撑作用，为脂质体提供了“坚硬”的内胆，令其能够承受在循环系统中各方面因素的冲击和破坏作用，在到达肿瘤部位之前，尽可能地减少了内容药物的泄漏，令更多的阿霉素随循环系统到达肿瘤部位，提高了主动载药的脂质体阿霉素(DOX)的稳定性，从而更好地发挥药物疗效。
本发明优点在于：
1、本发明制备的纳米碗(nanobowl)支撑的载药脂质体能抵抗血浆蛋白和血流剪切力对药物渗漏的影响。这种方法提高了药物在肿瘤部位的传递，提高了抗肿瘤的疗效。与改变脂质体双层、组成成分等增强稳定性的其他方法相比，该方法为全水纳米脂质体空腔设计了物理支撑。纳米碗稳定脂质体提高了载体稳定性和药物释放。
2、本发明克服了现有技术的缺陷(由于药物在血液循环中的泄漏，用于癌症治疗的脂质体药物传递可能受到限制)，通过在脂质体水腔中嵌入一个坚硬的纳米碗来提高主动载药的脂质体药物的稳定性，优化各原材料种类及其之间的配比和工艺参数，得到了疗效最佳的纳米碗支撑载药脂质体，纳米碗(nanobowl)支撑的载药脂质体能抵抗血浆蛋白和血流剪切力对药物渗漏的影响，提高了药物在肿瘤部位的传递，提高了抗肿瘤的疗效且无毒副作用，与改变脂质体双层、组成成分等增强稳定性的其他方法相比，该方法为全水纳米脂质体空腔设计了物理支撑，提高了乳腺癌患者的生存率，减轻了该类患者的经济负担，具有很好的应用前景。
附图说明
附图1是纳米碗合成线路示意图。
附图2是：(A-E)分别为聚苯乙烯纳米颗粒、MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒、花生状纳米颗粒、二氧化硅改性花生状纳米颗粒及纳米碗的DLS粒径分布图；(F-J)分别为对应于聚苯乙烯纳米颗粒、MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒、花生状纳米颗粒、二氧化硅改性花生状纳米颗粒及纳米碗的Zeta电位分布图。
附图3是：(A)聚苯乙烯纳米颗粒、(B)花生状纳米颗粒及(C)二氧化硅改性花生状纳米颗粒的透射电镜图。
附图4是：(A,B)为纳米碗透射电镜图，(C)为根据半径及长宽比估算得到的纳米碗开口角大小，(D-G)分别为透射电镜下不同角度的纳米碗。
附图5是：(A)为小尺寸聚苯乙烯纳米颗粒透射电镜图，(B,C)分别为小尺寸聚苯乙烯纳米颗粒粒径分布与Zeta电位图。
附图6是：(A)为以3:1的投料比合成的花生状纳米颗粒透射电镜图，(B)为以9:1的投料比合成的花生状纳米颗粒透射电镜图。
附图7是：(A)为以0.3g的TEOS合成的纳米碗透射电镜图，(B)为以0.5g的TEOS合成的纳米碗透射电镜图。
附图8是纳米碗支撑阿霉素脂质体合成线路示意图。
附图9是：(A)为氨基化纳米碗透射电镜图，(B,C)分别为氨基化纳米碗粒径分布与Zeta电位图。
附图10是：(A)为纳米碗支撑脂质体模式图，(B)为纳米碗支撑脂质体的透射电镜图，(C,D,E,F)分别为纳米碗支撑脂质体及普通脂质体粒径分布与Zeta电位图。
附图11是：(A)为盐酸阿霉素紫外吸收及荧光光谱，(B)为DiR探针紫外吸收及荧光光谱。
附图12是：(A)为纳米碗支撑阿霉素脂质体紫外吸收及荧光光谱，(B)为普通阿霉素脂质体紫外吸收及荧光光谱。
附图13是硫酸铵主动载药示意图。
附图14是：(A)普通阿霉素脂质体与纳米碗支撑阿霉素脂质体在全血清中的药物泄漏率；(B)纳米碗支撑脂质体在血清中24h内粒径及Zeta电位变化，n＝3。
附图15是：(A,D)分别为纳米碗支撑阿霉素脂质体及普通阿霉素脂质体冷冻干燥后再分散的状态，(B,C,E,F)分别为纳米碗支撑阿霉素脂质体及普通阿霉素脂质体冷冻干燥前后的粒径分布对比图。
附图16是纳米碗支撑阿霉素脂质体在4℃环境下储存过程中的粒径分布和Zeta电位变化图，n＝3。
附图17是：(A)激光共聚焦显微镜下拍摄的肿瘤细胞摄取纳米颗粒情况，Bar＝25m；(B)细胞摄取纳米颗粒荧光强度定量分析图，结果用“mean±SD”表示，n＝5。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
附图18是：(A)游离盐酸阿霉素、普通阿霉素脂质体、纳米碗支撑阿霉素脂质体对4T1乳腺癌细胞活力的影响，(B)未载药的空白纳米碗支撑脂质体对4T1细胞活力的影响，结果用mean±SD表示，n＝4。**P<0.01，***P<0.001。
附图19是纳米碗支撑阿霉素脂质体具有良好的治疗BALB/c雌性小鼠荷4T1乳腺癌效果图；(A)给药示意图；(B,C)分别为各给药组的荷瘤小鼠肿瘤体积和小鼠体重，n＝8；B图中，a为游离阿霉素与生理盐水和空白载体组小鼠肿瘤体积之间的统计学差异，b为普通阿霉素脂质体与生理盐水和空白载体组小鼠肿瘤体积之间的统计学差异，c为纳米碗支撑阿霉素脂质体与其余四组实验组小鼠肿瘤体积之间的统计学差异；(D)各给药组的荷瘤小鼠的生存曲线，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
附图20是(A)4T1荷瘤小鼠肿瘤组织病理切片和免疫组化染色分析，Bar＝100m，(B,C)分别为各实验组治疗后肿瘤组织TUNEL和PCNA阳性率统计图；实验结果用mean±SD表示，n＝5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
附图21是4T1荷瘤小鼠重要脏器组织免疫组化染色分析，Bar＝100m。
附图22是：(A)普通伊立替康脂质体和纳米碗支撑伊立替康脂质体以及(B)普通长春新碱脂质体以及纳米碗支撑长春新碱脂质体在FBS中的药物泄露稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中所述的缩略词见表1。
表1、缩略词表
Figure BDA0002398812330000081
Figure BDA0002398812330000091
实施例1纳米碗的构建和表征
一、纳米碗的构建
1仪器与材料
1.1仪器设备
表2
Figure BDA0002398812330000092
Figure BDA0002398812330000101
1.2材料和试剂
表3
苯乙烯 美国Sigma公司
SDS 生工生物工程(上海)股份有限公司
KPS 上海阿拉丁化学试剂有限公司
MPS 美国Sigma公司
AIBN 上海阿拉丁化学试剂有限公司
VBS(90％) 美国Sigma公司
TEOS 美国Sigma公司
无水乙醇 国药化学试剂有限公司
25％浓氨水 上海阿拉丁化学试剂有限公司
四氢呋喃 国药化学试剂有限公司
2实验方法
2.1聚苯乙烯纳米颗粒合成
采用乳液聚合的方法合成50nm大小的聚苯乙烯纳米颗粒。具体步骤如下：
1)精密称取1.00g十二烷基磺酸钠置于干净的250mL三颈烧瓶中；
2)用100mL量筒精密量取85mL的超纯水，并将其倒入装有十二烷基磺酸钠的250mL三颈烧瓶之中；
3)在三颈烧瓶的三个瓶口分别连接一个球形冷凝管及两个胶塞；
4)在三颈烧瓶其中一个瓶口的胶塞中插入针头，使针头处完全淹没至液面下，同时在针头另一端连接上一根导管，导管另一头连通氩气；
5)打开氩气钢瓶阀门，向三颈烧瓶中通入氩气，调节阀门，控制氩气流速，观察到三颈烧瓶液面中均匀地冒泡即可；
6)同时，通过HS-70型恒温磁力搅拌器以250rpm的转速保持搅拌1h；
7)将三颈烧瓶上的针头取下，并将通有氩气的导管转接与球形冷凝管之上继续保持通气；
8)精密移取20.00g苯乙烯单体，利用50mL注射器插入胶塞，注射加入至三颈烧瓶之中，并继续保持磁力搅拌30min；
9)打开恒温磁力搅拌器的升温开关，调节温度令反应体系加热至70℃；
10)精密称取0.10g的过硫酸钾，加入至10mL的超纯水之中，利用MS2型漩涡混合器涡旋1min，令其充分溶解；
11)等到反应瓶温度平衡后，利用10mL注射器逐滴缓慢滴加事先配制的过硫酸钾溶液；
12)在氩气保护下，反应体系持续搅拌18h后停止反应，得到聚苯乙烯纳米颗粒乳液；
13)反应过程中，三颈烧瓶内的液体应由较为稀薄且泛蓝光的乳液逐渐转变为较为浓稠的乳白色液体；
14)停止反应后，搜集产物的白色乳液，转移至截留分子量为10KD的透析袋，以超纯水为透析介质，进行透析，至少更换3次透析介质，以除去残留的苯乙烯及十二烷基磺酸钠；
15)透析结束后，移取1.00g液体放入烘箱恒重，测定聚苯乙烯纳米颗粒乳液质量浓度。
2.2苯乙烯与3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的共聚合反应
通过苯乙烯与3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的共聚合反应，在疏水性的聚苯乙烯纳米颗粒表面覆盖较为亲水的聚合物层。实验步骤如下：
1)用超纯水将上述乳白色乳液稀释至质量浓度为10％；
2)将稀释后的乳液转移至新的100mL三颈烧瓶中，在三个瓶口分别连接球形冷凝管、HD2010W恒速电动搅拌器以及一个胶塞；
3)在三颈烧瓶的胶塞中插入针头，同2.1中4-5)所述向三颈烧瓶中通入氩气；
4)同时，通过HD2010W恒速电动搅拌器以400rpm的转速保持机械搅拌1h；
5)将三颈烧瓶上的针头取下，并将通有氩气的导管转接与球形冷凝管之上继续保持通气；
6)以4:1的体积比，将苯乙烯与3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯均匀混合，MS2型漩涡混合器充分涡旋，得到混合单体溶液，并使得混合单体溶液的总质量与上述乳液中聚苯乙烯纳米颗粒的质量相当；
7)将所得混合单体溶液通过10mL注射器加入至反应瓶中，继续搅拌1h；
8)随后，加入相当于混合单体溶液质量3％的偶氮二异丁腈作为反应引发剂，继续搅拌混合1h；
9)打开HS-70型恒温磁力搅拌器，加热至70℃，反应18h后停止反应，得到MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒；
10)反应结束后，同2.1中13-14)所述，进行透析并进行恒重，测定MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒乳液的质量浓度；
11)根据测定的乳液质量浓度，用超纯水将其稀释至质量浓度5％以防止聚集。
2.3花生状纳米颗粒的合成
将改性后的纳米颗粒乳液进一步稀释至质量浓度3.5％，并通过与苯乙烯单体的进一步溶胀作用，得到花生状纳米颗粒。具体步骤如下：
1)称取相当于0.8％纳米颗粒质量的对苯乙烯磺酸钠，加入装有纳米颗粒乳液的100mL三颈烧瓶中，搅拌15min以使其均匀溶解；
2)随后在烧瓶瓶口分别连接球形冷凝管、HD2010W恒速电动搅拌器以及一个胶塞；
3)在三颈烧瓶的胶塞中插入针头，同2.1中4-5)所述向三颈烧瓶中通入氩气；
4)同时，将HD2010W恒速电动搅拌器转速调整至250rpm，并保持机械搅拌1h；
5)取相当于纳米颗粒三倍体积的苯乙烯单体与3％质量浓度的偶氮二异丁腈均匀混合，MS2型漩涡混合器充分涡旋溶解，作为溶胀溶液待用；
6)通过10mL注射器将上述溶胀液体加入反应体系之中，继续搅拌1h以达到充分溶胀；
7)随后，打开HS-70型恒温磁力搅拌器，加热至70℃，反应18h后停止反应，得到花生状纳米颗粒乳液；
8)反应结束后，通过超速离心机(30000g，30min)收集沉淀，并通过水浴超声再分散于等体积的无水乙醇之中，此过程重复三次以去除残余未反应的单体和引发剂。
2.4二氧化硅改性的花生状纳米颗粒合成
利用上一步合成的花生状纳米颗粒两个半球不同的亲水性，使得硅烷水解缩合反应仅仅发生于含有3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的半球之上。主要步骤如下：
1)量取4mL上述反应得到的纳米颗粒乙醇分散液，置于100mL圆底烧瓶之中；
2)向圆底烧瓶中加入无水乙醇6mL进一步稀释至10mL，并加入0.5mL的25％浓氨水；
3)调节HS-70型恒温磁力搅拌器，以500rpm的转速保持搅拌；
4)精密称取0.30g正硅酸乙酯，并与等质量的无水乙醇混合均匀，MS2型漩涡混合器充分涡旋后待用；
5)利用蠕动泵设置以1mL/h的流速，将正硅酸乙酯与无水乙醇的混合液缓慢注入反应液中，直至混合液注射完毕后，继续保持搅拌1h；
2.5纳米碗的合成
最后，利用聚苯乙烯溶于四氢呋喃的特性，将聚合物模板去除，得到具有碗状结构的纳米颗粒。具体实验步骤如下：
1)打开R-200旋转蒸发仪的水浴锅，设置水温至45℃；
2)将上述反应结束后装有纳米颗粒乙醇分散液的圆底烧瓶连接于旋转蒸发仪上，调节旋转速度至中速，保持旋转蒸发1h，以确保乙醇完全挥发；
3)除去乙醇后，取下圆底烧瓶，加入适量四氢呋喃；
4)将圆底烧瓶放入水浴超声5min，令旋蒸后的干粉均匀分散；
5)将圆底烧瓶放于HS-70型恒温磁力搅拌器之上，并保持高速搅拌(1200rpm)24h；
6)收集反应液，通过超速离心机(30000g，30min)收集沉淀，并通过水浴超声再分散于三蒸水之中，此过程重复三次。
二、各步反应所得纳米颗粒乳液质量浓度及合成产率计算
通过对各步反应所得纳米颗粒乳液进行恒重操作:
1)选取3只干净的1.5mL的EP空管，烘箱恒重记录初始管重；
2)精密称取三份1.00g各纳米颗粒乳液加入恒重后的EP管之中，放入烘箱；
3)定时取出EP管称重并记录后继续放回烘箱，待最终两次质量无变化后，即到达恒重终点；
4)通过差减称量法，计算得到纳米颗粒质量，并计算质量浓度，计算公式如下：
Figure BDA0002398812330000131
5)根据计算所得的质量浓度，计算各合成步骤的产率，计算公式如下：
Figure BDA0002398812330000141
三、纳米颗粒表征方法
1、纳米颗粒DLS及Zeta表征：将纳米颗粒加超纯分散并稀释至适当的浓度后，通过Malvern ZetasizerNano ZS激光粒度仪测定光散射粒径和Zeta电位。
2、将前述方法关键步骤所制备得到的纳米颗粒溶液稀释后滴加于加强型铜网上，通过CM-120透射电镜对纳米颗粒形态进行观察。
3、纳米碗开口角估算
1)通过透射电镜测量花生状纳米颗粒两个半球的半径比(r1:r2)以及纳米颗粒整体的长宽比(L:W)，其中W＝2*r2。
2)根据半径比与长宽比，计算当聚苯乙烯被溶解后，纳米碗的开口角，计算公式如下：
Figure BDA0002398812330000142
四、结果
1、纳米颗粒乳液质量浓度
根据质量浓度计算公式计算得到各纳米颗粒乳液浓度结果如表4所示，合成产率均保持在85％以上，合成效率较高。
表4、各纳米颗粒乳液质量浓度及合成产率
Figure BDA0002398812330000143
2、纳米颗粒粒径分布及Zeta电位
各纳米颗粒粒径分布及Zeta电位情况如图2所示：通过乳液聚合法成功合成聚苯乙烯纳米颗粒，其尺寸均值在50.8nm，PDI为0.068，提示纳米颗粒粒径均一性良好，Zeta电位在-40.7mV。通过苯乙烯与3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的共聚合反应，最终所得MPS改性后的聚苯乙烯纳米颗粒尺寸均值在68.5nm，同时由于3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的作用，使得其呈现更强的负电性，Zeta电位在-49.2mV。将改性后的纳米颗粒与苯乙烯单体进一步搅拌，利用溶胀作用和聚合反应，得到花生状纳米颗粒，其尺寸均值在137.8nm左右，由于苯乙烯的含量增加，使得Zeta电位有一定程度的回升，在-31.6mV。在上述基础上，利用蠕动泵滴加缓慢正硅酸乙酯，发生水解缩合反应后，纳米颗粒尺寸进一步增大至154.7nm，Zeta电位在-39.5mV。最后，由于四氢呋喃的加入，使得聚苯乙烯模板溶解，终产物尺寸在126.7nm，与之前的二氧化硅改性花生状纳米颗粒尺寸有显著减少。同时，Zeta电位保持在-30.2mV上下。
上述各个步骤的纳米颗粒DLS检测得到的粒径及Zeta电位具体数值汇总见表5：
表5、各纳米颗粒DLS检测的粒径及表面电势数据(n＝3)
Figure BDA0002398812330000151
3、纳米颗粒透射电镜图
将关键反应步骤纳米颗粒稀释至适当浓度，并将纳米颗粒分散液滴加在碳支持膜铜网上，自然晾干后，使用透射电镜对样品进行观察，结果如图3和图4所示。
从图3.A可以看到，所合成的聚苯乙烯纳米颗粒单分散性良好，尺寸均一，大小在50nm上下，与DLS检测结果相符。由于MPSNPs合成过程对于纳米颗粒的形态无明显改变，且纳米颗粒尺寸无显著性增加，透射电镜的手段并无法准确证明其合成的成功与否。因此，本实施例不再添加对应的透射电镜图片，而是通过DLS对于粒径和Zeta电位的检测及后续纳米颗粒的透射电镜图像观察，以验证MPSNPs的合成结果。
随着反应的进行，在MPSNPs的基础上，苯乙烯的溶胀作用导致纳米颗粒形态出现了明显的变化，如图3.B所示，纳米颗粒由之前规则圆整的球体，转变为由两个半球体连接而成的，类似花生状的纳米颗粒结构。同时，可以发现，由于纳米颗粒由球体转变为类棒状的不规则体，其粒径的检测应通过其纵向的长度与横向的宽度同时衡量。而结合DLS中对于其粒径的检测结果，不难发现，其数值更接近于透射电镜中纳米颗粒的纵向长度。而通过透射电镜的图像可以推断纳米颗粒的横向宽度与最开始的聚苯乙烯纳米颗粒相比，增长甚微。花生状纳米颗粒的成功合成及其宽度与聚苯乙烯纳米颗粒的近似现象均从侧面对MPSNPs的成功制备做出了验证。
在引入TEOS之后，在花生状纳米颗粒含有MPS基团的半球上覆盖了二氧化硅。同时，由于该反应环境下，会有微小的二氧化硅纳米颗粒产生，虽然通过蠕动泵降低TEOS加入速度的方法，能够有效降低二氧化硅纳米颗粒的产生，但仍无法完全避免。当微小的二氧化硅纳米颗粒再与花生状纳米颗粒反应，便导致了二氧化硅改性花生状纳米颗粒表面的不光滑状，正如图3.C中所示，相较于图3.B，更为毛糙，并能观察到表面的微小凸起。
最后，在四氢呋喃的作用下，聚苯乙烯被溶解后，透射电镜下能够清晰的看到原本的花生状纳米颗粒中一个半球消失了，纳米颗粒又转变为一个球体。值得注意的是，剩余的半个球体的中心相较于外围，其电子密度明显降低，呈现较外围浅的灰白色，提示球体的中心也已被挖空，仅剩下TEOS水解缩合而成的二氧化硅外壳。而且，从透射电镜的图像中，能够清晰观察到不同开口朝向的纳米碗(图4)。以上的证据，均证明了纳米碗的成功合成。
4、花生状纳米颗粒的半径比、长宽比和纳米碗开口角
1)花生状纳米颗粒的半径比与长宽比
通过测量透射电镜中花生状纳米颗粒的长度、宽度、两个半球的半径长度，计算后得到r1:r2≈9:10，L:W≈3:2。
2)纳米碗开口角
根据上述测量所得花生状纳米颗粒的长度、宽度、两个半球的半径长度，利用开口角计算公式，计算得到纳米碗的开口角(θ)的范围为90°-110°。
五、讨论
1、聚苯乙烯纳米颗粒尺寸的选择和控制
作为制备中的种子模板，后续的反应均要在完成聚苯乙烯纳米颗粒的基础上进行，因此，聚苯乙烯纳米颗粒的制备将会直接影响到后续反应的成功开展，合成高质量的聚苯乙烯纳米颗粒显得格外重要。由于后续反应需要以单一的聚苯乙烯纳米颗粒为模板，因此，对于聚苯乙烯纳米颗粒的均一性和单分散性有较高要求。任何粘连或团聚，均有可能影响后续各步反应的进行，导致最终纳米颗粒性质改变、形态改变甚至是合成失败。同时，聚苯乙烯纳米颗粒的尺寸选择也将影响最终纳米碗的整体大小和内水腔体的体积。根据EPR效应理论，最终选取合成30-50nm范围内的聚苯乙烯纳米颗粒作为种子模板，并通过多步反应后，得到最终的纳米碗整体大小在100nm左右，同时拥有30-50nm直径的内水腔。根据乳液聚合的特点，通过改变乳化剂SDS的投料量，可以改变反应体系中乳滴的体积大小，从而影响被包覆于乳滴内的苯乙烯体积，最终决定聚苯乙烯纳米颗粒的尺寸大小。本文曾尝试选用两种不同的SDS的投料量(1g，2g)，以合成不同大小的聚苯乙烯纳米颗粒。结果发现，当加大了SDS的投料量后，聚苯乙烯纳米颗粒的尺寸显著减少至30nm上下，DLS检测结果显示38.74±12.7nm，Zeta电位为-40.9±3.1mV，然而PDI结果显示0.372±0.008。同时，透射电镜观察到的聚苯乙烯纳米颗粒呈现较为明显的团聚和粘连(图5)。从PDI和透射电镜的结果均能证明，虽然加大SDS的投料量能够缩小聚苯乙烯纳米颗粒的尺寸，但由于尺寸的减少，纳米颗粒的表面能显著增加，导致纳米颗粒的稳定性显著降低，极易出现团聚的现象。因此，经过考虑，最终选取50nm大小的聚苯乙烯纳米颗粒作为后续反应的种子模板。
2、苯乙烯的溶胀作用和花生状纳米颗粒合成原理
在溶胀过中，苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒的提前混合搅拌时间至关重要。只有通过足够时间的搅拌，令苯乙烯单体渗透进入MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒之中，才能导致位于MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒中心的聚苯乙烯纳米颗粒体积膨胀。而体积膨胀的核心聚苯乙烯纳米颗粒逐渐将MPS与苯乙烯共聚物的包覆外壳涨破，形成一个缺口。随后，提高反应体系的温度，在AIBN的引发作用下，反应体系中其余的苯乙烯单体将迅速在缺口处发生爆发式的聚合反应，在缺口处形成花生状纳米颗粒的另一个半球。值得注意的是，在聚合反应的过程中，由于苯乙烯的疏水性以及MPS的亲水性导致苯乙烯单体无法充分与MPS接触反应，而缺口处的聚苯乙烯却具有与苯乙烯单体同样的疏水性，根据相似相溶原理，苯乙烯单体更倾向于在缺口处迅速发生聚合反应。
3、苯乙烯溶胀比例与花生状纳米颗粒半球大小控制
通过调节苯乙烯单体的加入量，能够调控花生状纳米颗粒其中一个通过溶胀产生的半球的大小。本文选取了两种不同苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒投料比，分别为3:1与9:1，来验证上述论证。结果如图6的透射电镜所示，当苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒的投料体积比(Vstyrene:VMPSNPs)为3:1时，合成的花生状纳米颗粒其两个半球尺寸相当(图6.A)。而当Vstyrene:VMPSNPs增加至9:1后，合成的花生状纳米颗粒其两个半球尺寸相差甚远(图6.B)，其中较小的半球为原本的MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒，而由于苯乙烯单体的增加，另一半球的尺寸显著增加，其直径已达200nm，是较小半球尺寸的4倍。鉴于后续的反应需要扣除聚苯乙烯，过多的聚苯乙烯比例可能导致最终溶解过程的不完全，从而影响最终纳米碗的合成。因此，选用Vstyrene:VMPSNPs＝3:1的投料比作为最终合成花生状纳米颗粒的方案。
4、TEOS的选择性水解缩合作用及流速的控制
在成功合成花生状纳米颗粒之后，加入TEOS进行水解缩合反应。由于合成的花生状纳米颗粒不仅形状特别，其两个半球的表面基团也完全不同。由于MPS的加入，使得花生状纳米颗粒一个半球上包含了硅醇基，而之后形成的另一个半球上是由单纯的苯乙烯单体聚合而成，其表面仅有苯乙烯的烯键，而并没有硅醇基。因此，在氨水的碱性条件下，TEOS通过
Figure BDA0002398812330000181
反应，与MPS上的硅醇基发生水解缩合反应。而另一半球上由于没有硅醇基，无法发生水解缩合反应，从而实现选择性地修饰二氧化硅与含有MPS的半球之上。需要注意的是，TEOS在氨水的催化作用下，其自身也能水解缩合，而形成二氧化硅纳米颗粒。为了减少TEOS自身水解缩合的概率，恰当的TEOS加入速度是非常关键的影响因素。通过尽可能地降低TEOS的加入速度，另加入的TEOS迅速与花生状纳米颗粒发生反应，从而减少由于其自身缩合所形成的二氧化硅纳米颗粒。然而，虽然此操作能够减少二氧化硅纳米产生的概率，但仍然不可避免形成微小的二氧化硅纳米颗粒，并以微小二氧化硅纳米颗粒的形态继续与花生状纳米颗粒发生缩合。因此，便有了如前文所述的现象，二氧化硅修饰的花生纳米颗粒其表面并非光滑平整。
5、TEOS的投料量与纳米碗的形态
最后，本实施例针对TEOS的投料量与纳米碗的形态的关系同样做了考察。分别选取0.3g与0.5g的TEOS投料量制备纳米颗粒，得到最终的纳米碗后，分别滴于铜网之上，通过透射电镜观察纳米碗的形态差异。如图7.A所示，当TEOS的投入量为0.3g时，能够清晰的观察到纳米颗粒表面的二氧化硅层，同时能够清晰地分辨碗口与碗壁的结构。然而，当TEOS的投料量增加至0.5g后，由于TEOS的增加，其自身水解缩合的概率也显著提高，在形成纳米碗的同时，二氧化硅纳米颗粒的产生也明显增多，如图7.B所示，其相较于图7.A，实心的二氧化硅纳米颗粒比例大幅升高。因此，为了得到更多的纳米碗，本文选用0.3g的TEOS作为最终制备二氧化硅修饰花生状纳米颗粒的方案。
六、小结
纳米碗的构建方法：以苯乙烯单体为原料，通过乳液聚合的方式合成聚苯乙烯纳米颗粒；随后加入以一定比例混合的MPS/苯乙烯混合溶液，通过共聚合反应制备得到MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒；在此基础上，再次加入苯乙烯单体，并利用苯乙烯的溶胀特性和聚合反应，得到花生状纳米颗粒；将制备得到的花生状纳米颗粒转移至无水乙醇中均匀分散后，加入TEOS，并在浓氨水的碱性环境下，选择性地与含有MPS基团的半球发生
Figure BDA0002398812330000192
反应，形成二氧化硅改性的花生状纳米颗粒；最后，利用聚苯乙烯溶于四氢呋喃的特性，将纳米颗粒中的聚苯乙烯成分溶解，仅留下含有二氧化硅的外壳，从而得到具有碗状结构的纳米颗粒。通过优化条件确定各个反应步骤的投料比，最终制备得到该纳米碗平均粒径为126.7nm，Zeta电位在-30.2mV，PDI为0.142，纳米颗粒尺寸均一，单分散性良好。透射电镜观察验证了纳米碗的形态结构；并通过纳米颗粒的半径比与长宽比，估算得到纳米碗的开口角的范围为90°-110°。
实施例2纳米碗支撑脂质体制备及载药方法建立
本实施例通过探头超声的方法，令脂质体与实施例1制备的纳米碗通过静电吸附的方式结合。随后采用硫酸铵梯度法主动式载药，完成弱碱性药物阿霉素高包封率装载，得到纳米碗支撑阿霉素脂质体。
具体合成线路示意图见图8。
一、制备纳米碗支撑脂质体
1仪器与材料
1.1仪器设备
表6
Figure BDA0002398812330000191
Figure BDA0002398812330000201
1.2材料和试剂
表7
Figure BDA0002398812330000202
Figure BDA0002398812330000211
2实验方法
2.1纳米碗的氨基化修饰
1)取20mg前文制备所得纳米碗超纯水分散液，通过超速离心(30000g，30min)，转移分散至10mL无水乙醇之中；
2)将含有纳米碗的无水乙醇分散液加入25mL圆底烧瓶之中，匀速搅拌；
3)移取200μL的APTES加入上述分散液中，保持150rpm搅拌过夜；
4)反应结束后，取出反应液，通过离心(24000g，30min)去除未反应的APTES，收集沉淀再分散于5mL超纯水之中，此过程重复3次；
5)DLS检测纳米颗粒粒径及电位。
2.2纳米碗支撑脂质体的制备
1)精密称取胆固醇、HSPC、DSPE-PEG2000各25mg，分别溶于1mL三氯甲烷，制得25mg/mL的脂质溶液；
2)将10mg的DiR充分溶解于1mL三氯甲烷中；
3)以HSPC:Chol:DSPE-PEG2000＝3:1:1的质量比(若制备含有DiR的脂质体时，按照HSPC:Chol:DSPE-PEG2000:DiR＝3:1:1:0.05的质量比)，移取适量上述溶液，使得脂质总质量为20mg，并加入适量三氯甲烷，稀释至5mL，通过MS2型漩涡混合器均匀混合溶液；
4)采用薄膜分散法制备脂质体：将混合均匀的脂质溶液加入500mL的圆底烧瓶之中，并将其连接于旋转蒸发仪之上，调节中等转速，水温40℃，旋转蒸发1h，除去三氯甲烷，令脂质均匀覆盖于圆底烧瓶底部；
5)取下圆底烧瓶，将其放入真空干燥箱中，干燥过夜；
6)配制300mM，pH 5.5的硫酸铵溶液：精密称取7.93g的硫酸铵，将其充分溶解于200mL超纯水中；通过1M的氢氧化钠溶液调节pH值至5.5；
7)将2.1中合成的氨基化纳米碗通过离心手段(24000g，30min)转移至配制好的硫酸铵溶液之中；
8)将含有氨基化纳米碗的硫酸铵溶液加入干燥过夜后的圆底烧瓶之中，放入ZQTY-70振荡培养箱中振荡(250rpm，60℃)1h，令脂质充分水化，形成包裹有纳米碗的囊泡；
9)将上述所得脂质体囊泡混悬液固定于JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机之上，以35W功率，15秒工作15秒暂停的模式，进行探头超声30min，制备得到分散均匀的纳米碗支撑的脂质体。
2.3普通脂质体的制备
1)脂质的薄膜分散参考2.2中1)-6)制得；
2)移取5mL配制好的硫酸铵溶液，加入干燥过夜后的圆底烧瓶之中，放入ZQTY-70振荡培养箱中振荡(250rpm，60℃)1h，令脂质充分水化，形成囊泡混悬液；
3)组装脂质体迷你挤出装置，安装200nm孔径的PC膜，将得到的囊泡混悬液通过挤出装置来回挤压20次，提高脂质体尺寸的均一性。
2.4盐酸阿霉素的包载
1)配制pH 6.5的含有10mM组氨酸的10％蔗糖透析液：称取500g的蔗糖，溶于5L的超纯水中，加入7.75g的组氨酸，充分溶解；通过1M的盐酸溶液调节pH值至6.5；
2)剪取两段3.5KD的透析膜，分别加入前述步骤制得的纳米碗支撑的脂质体及普通脂质体，并将两者放入含有蔗糖透析液的1L烧杯中，进行透析，期间4次换液；
3)精密称取2.0mg盐酸阿霉素，溶解于1mL的蔗糖透析液之中；
4)向透析完成的两组脂质体中，分别加入2mg/mL的盐酸阿霉素蔗糖溶液0.5mL，吹打数次以充分混匀；
5)将两组脂质体与盐酸阿霉素的混合液放入ZQTY-70振荡培养箱中振荡(250rpm，60℃)1h；
6)将纳米碗就支撑脂质体放入离心机，通过离心(24000g，30min)收集沉淀，用10％蔗糖透析液再分散，重复洗涤三次，去除游离的盐酸阿霉素及未包封纳米碗的脂质体；将普通阿霉素脂质体滴加于G-50葡聚糖凝胶之上，洗脱游离的盐酸阿霉素。
二、盐酸阿霉素荧光定量分析方法的建立
1、检测波长的选择
1)称取1mg盐酸阿霉素，将其溶解于10mL超纯水中；
2)移取200μL样品，滴加于96孔板之中；
3)利用SpectraMax M2生物分子酶标仪，于200-850nm范围内进行紫外吸收扫描，得到盐酸阿霉素的紫外吸收光谱；
4)通过紫外吸收光谱确定盐酸阿霉素的最大吸收波长Dox-max，并以此波长作为激发光波长，检测盐酸阿霉素荧光发射光谱，并得到盐酸阿霉素最大荧光发射波长Em Dox-max。
2、标准曲线的绘制
1)精密称取盐酸阿霉素适量，用超纯水配制成一定浓度的储备液，随后，继续用超纯水稀释储备液得0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000μg/mL的盐酸阿霉素对照品溶液；
2)根据上述方法得到的Dox-max与Em Dox-max，建立荧光定量分析检测方法：以Dox-max为激发光波长，在Em Dox-max波长处检测上述各浓度盐酸阿霉素对照品溶液的荧光发射强度；
3)以荧光发射强度对盐酸阿霉素浓度进行线性回归，得到盐酸阿霉素荧光定量标准曲线方程。
3、精密度
1)选取上述0.156、1.250、10.000μg/mL盐酸阿霉素对照品溶液，分别作为低浓度、中浓度和高浓度的样品；
2)分别于2、4、8h进行检测各浓度盐酸阿霉素荧光强度，以计算日内标准偏差(RSDIntra-day)；分别于1d、2d、3d进行检测，计算日间标准偏差(RSD Inter-day)。
4、回收率
1)选取上述0.156、1.250、10.000μg/mL盐酸阿霉素对照品溶液各3份，进行荧光强度的检测；
2)将所得荧光强度带入标准曲线公式，计算得到盐酸阿霉素测定浓度；
3)由测定浓度与实际浓度计算得到回收率。
三、纳米颗粒双荧光定性检测
1、DiR检测波长的选择
1)移取10mg/mL的DiR三氯甲烷溶液20μL，用甲醇稀释至1mL；
2)移取200μL样品，滴加于96孔板之中；
3)利用SpectraMax M2生物分子酶标仪，于200-850nm范围内进行紫外吸收扫描，得到DiR的紫外吸收光谱；
4)通过紫外吸收光谱确定DiR的最大吸收波长DiR-max，选取DiR紫外吸收区内对荧光光谱影响最小的波段为激发光波长，检测DiR的荧光发射光谱，并得到DiR最大荧光发射波长Em DiR-max。
2、纳米颗粒紫外吸收光谱及双荧光信号发射光谱
1)分别移取适量载有阿霉素并在脂质体磷脂双分子层中嵌入DiR的纳米碗支撑脂质体或普通阿霉素脂质体，加入相应96孔板中；
2)利用SpectraMax M2生物分子酶标仪，于200-850nm范围内进行紫外吸收扫描，得到纳米颗粒的紫外吸收光谱；
3)随后，根据前述方法，分别选取盐酸阿霉素的最大吸收波长Dox-max及DiR紫外吸收区内对荧光光谱影响最小的波段为激发光波长，检测纳米颗粒中盐酸阿霉素和DiR的荧光发射光谱。
四、脂质体包封率及载药量测定
1)精密移取50μL载有阿霉素的纳米碗支撑纳米碗支撑脂质体或普通阿霉素脂质体样品，通过超纯水稀释至1mL；
2)向样品中加入0.2％的Triton溶液，以使得脂质体裂解，释放内水腔中的阿霉素；
3)通过荧光定量分析方法，检测阿霉素的荧光强度；
4)将荧光强度带入标准曲线方程中，求得阿霉素浓度，并计算包封率，具体公式如下：
Figure BDA0002398812330000241
5)精密移取1mL的纳米碗支撑阿霉素脂质体或普通阿霉素脂质体样品，装于经过恒重处理的EP管中，放入-80℃冰箱过夜冷冻后，转移至RLPHR 2-4LD冷冻干燥机中冷冻干燥。
6)将冷冻干燥后的样品，称重，计算载药量：
Figure BDA0002398812330000242
五、结果
1、纳米碗的氨基化修饰表征
通过氨基化反应后，DLS结果显示纳米碗尺寸未发生显著变化，但其Zeta电位由原来的-30.2±1.1mV翻转为+34.5±1.5mV，如图9.C所示。电位的翻转证明了纳米碗的表面已成功修饰氨基，令其Zeta电位呈现正电性。同时，图9.A透射电镜结果显示，纳米颗粒形态未发生改变，碗状结构未受影响。
2、纳米碗支撑脂质体及普通脂质体表征
通过脂质体的加入，DLS检测显示纳米碗支撑脂质体尺寸增加至143.6±6.2nm，相较于纳米碗尺寸增加近20nm。同时，Zeta电位结果显示为-17.9±0.3mV。而经过200nm的PC膜挤出后的普通脂质体，其粒径尺寸为148.3±2.9nm，Zeta电位为-20.3±1.2mV。纳米碗支撑脂质体粒径的略微增加和Zeta电位的再度翻转并接近于普通脂质体。随后，通过醋酸双氧铀负染的纳米颗粒样品在透射电镜下观察，可以清晰的看到纳米碗周围一圈磷脂双分子层，同时，包裹于脂质体之中的纳米碗仍然清晰可见。上述现象都验证了脂质体的成功包裹。
3、紫外吸收光谱、荧光光谱
3.1盐酸阿霉素和DiR紫外吸收光谱及荧光光谱
根据酶标仪波长扫描结果分别绘制盐酸阿霉素及DiR的紫外吸收光谱，结果如图11所示，Dox-max＝480nm，DiR-max＝740nm。随后分别取480nm和700nm作为两者的激发光波长，利用酶标仪获取相应的荧光发射光谱，Em Dox-max＝580nm，Em DiR-max＝780nm。
3.2.纳米颗粒紫外吸收光谱及双荧光发射光谱
对所制备的两种脂质体进行紫外吸收及荧光信号进行测定，结果如图12所示，无论是紫外吸收光谱还是荧光发射光谱，均能找到盐酸阿霉素和DiR的特征吸收峰和发射峰，说明了体系中纳米颗粒中脂质体与阿霉素的同时存在，证明了阿霉素的成功包载。仔细比较NB@DLP组与DLP的紫外吸收谱，能够发现NB@DLP在300-400nm处吸收显著高于DLP，推测此波段范围正是纳米碗的非特征吸收区域。
4、纳米颗粒包封率及载药量测定
4.1.盐酸阿霉素荧光定量标准曲线
根据酶标仪检测结果，记录各浓度的盐酸阿霉素在580nm波长处荧光光强度值，以荧光强度RFU对浓度C(μg/mL)进行线性回归得RFUDox＝99.11C-9.871，R2＝0.998。同时，考察该方法的精密度及回收率，结果见表8、9。日内、日间精密度RSD均小于3％，表明该方法精密度良好。
表8、精密度实验
Figure BDA0002398812330000261
表9、回收率实验
Figure BDA0002398812330000262
4.2.纳米颗粒包封率及载药量测定
通过酶标仪测定得到纳米颗粒中盐酸阿霉素的荧光强度，代入盐酸阿霉素荧光定量分析标准曲线，得到相应纳米颗粒中盐酸阿霉素的浓度，计算得出载药量及包封率结果见表10。结果显示，有无纳米碗支撑对于脂质体的载药效率并无显著性影响，包封率均保持在90％上下。
表10、纳米颗粒包封率及载药量(n＝3)
Figure BDA0002398812330000263
六、讨论
1、纳米碗Zeta电位与粒径尺寸对于脂质体融合包载的影响
在纳米颗粒与脂质体的融合包载过程是由多方面因素影响所导致的结果。研究表明纳米颗粒的Zeta电位及尺寸大小均会影响最终的融合结果。纳米颗粒与脂质体的融合包覆过程中，静电吸附力起到了至关重要的作用。当脂质体Zeta电位呈现负电性时，若纳米颗粒Zeta电位呈现相反的正电性，脂质体与纳米颗粒将会在静电吸附力的作用下迅速接近，吸附，最后纳米颗粒与脂质体融合，进入脂质体内水腔；而当纳米颗粒Zeta电位同样呈现负电性时，由于纳米颗粒与脂质体之间的相同电性，两者靠近时迅速增加的静电排斥力会导致两者无法靠近，从而阻碍了纳米颗粒与脂质体的融合。同时，纳米颗粒的尺寸大小也将影响与脂质体的融合。当纳米颗粒尺寸远远小于脂质体时，虽然相反的电性能够促进纳米颗粒与脂质体的靠近和吸附，然而由于纳米颗粒尺寸过小，其表面电势不足以使得其与脂质体发生融合，相反，使得脂质体表面存在大量小纳米颗粒，同时这些小纳米颗粒可以继续吸附其他脂质体，从而形成交联而破坏纳米颗粒的分散平衡，最终导致沉降；而当纳米颗粒尺寸与脂质体相当时，其表面电势将足够引发纳米颗粒与脂质体融合，形成稳定的结合体。
2、模型药物盐酸阿霉素的选择
盐酸阿霉素作为一款抗肿瘤治疗的药物，属于蒽环类广谱抗肿瘤药物，具有强烈的细胞毒性。虽然盐酸阿霉素广泛用于各类抗肿瘤治疗，但由于其强烈的细胞毒性，也带来了很多不良反应。因此，多年来药学工作者一直在致力于寻找降低盐酸阿霉素毒性的有效手段，而将其制备成相应的制剂便是一种给药方案。此外，由于阿霉素特有的蒽环结构，令其自身带有很强的红色荧光特性，利于检测，便于各种实验的设计和开展。
3、盐酸阿霉素载药方式的选择
在最初设计该纳米碗支撑阿霉素脂质体时，曾希望采用被动式载药的方式，在脂质体水化过程中直接加入溶解有一定浓度盐酸阿霉素的水化液。但通过实验，发现通过此方法，阿霉素的包封率和装载效率非常低。究其原因，主要是由于脂质体的内水腔体积远远小于外水相的体积，从而导致，绝大多数的盐酸阿霉素滞留于外水相中，而无法被脂质体包载。因此，被动装载的方法不仅无法实现高浓度的药物装载，同时也造成了大量游离药物的浪费。为此，本文改用与FDA批准上市的Doxil处方相似的载药方法，采用硫酸铵梯度法实现盐酸阿霉素的主动装载。由于盐酸阿霉素是弱碱性药物，利用硫酸铵的弱酸性，能够实现较高的包封率。首先，通过含有硫酸铵的水化液进行水化，使得脂质体内水腔呈现弱酸性环境；随后，通过透析建立外水相与内水腔的pH梯度；将盐酸阿霉素加入外水相，由硫酸铵的电离平衡产生NH3小分子容易通过磷脂双分子层，与外水相中的盐酸阿霉素发生中和，导致阿霉素分子化，跨膜进入脂质体内水腔；进入脂质体内水腔后，阿霉素与内水腔中的H+结合，再次电离成盐；形成的硫酸阿霉素将在内水腔形成不溶的结晶，从而阻碍阿霉素的再次跨膜泄漏，实现较高包封率。详细原理见图13。
七、小结
通过将纳米碗与脂质体孵育超声，制备得到纳米碗支撑脂质体，并利用硫酸铵主动载药的方法，成功包载阿霉素。构建纳米颗粒表征评价体系：DLS检测尺寸和Zeta电位改变，透射电镜负染观察磷脂双分子层结构，酶标仪测定阿霉素和DiR双标记的纳米颗粒的荧光信号，并进行包封率和载药量测定。最终纳米颗粒平均粒径在143.6nm，Zeta电位为-17.9mV。透射电镜结果提示，纳米颗粒形态完整，结构清晰可见，与脂质体的成功融合包覆，能够清楚观察脂质体的磷脂双分子层。纳米颗粒在酶标仪中检测到阿霉素与DiR的紫外吸收和荧光信号，进一步证明纳米颗粒的成功构建。包封率和载药量分别为89.57％和2.34％。通过主动载药的方式，显著提高了阿霉素的包封率和载药量，为向临床转化提供了可行性和理论基础。
实施例3纳米碗支撑阿霉素脂质体稳定性考察及体外抗肿瘤治疗评价
一、仪器与材料
1、仪器设备
表11
Figure BDA0002398812330000281
Figure BDA0002398812330000291
2、材料与试剂
表12
Figure BDA0002398812330000292
3、细胞系及动物
4T1乳腺癌细胞，购自Caliper Life Sciences公司(Hopkinton，MA)，用于本实验的细胞代数为3-5代。
4、相关试剂配制
1)4T1细胞培养液：DMEM基础培养基，1青链霉素双抗，10％胎牛血清；
2)4％多聚甲醛溶液：以pH 7.4的PBS(0.01M)作为溶剂，称取40g多聚甲醛放入800mL PBS溶液中，于60℃恒温摇床中振荡溶解过夜，在多聚甲醛固体完全溶解后，停止加热，平衡至室温后，再次加入PBS定容至1L。
二、实验方法
1、纳米碗支撑阿霉素脂质体稳定性评价
1.1血清稳定性评价
1)移取完成阿霉素装载的纳米碗支撑脂质体与普通阿霉素脂质体适量，分别加入至100％FBS之中，吹打均匀后，放入37℃的恒温振荡培养箱中120rpm均匀振荡；
2)分别在0、2、4、6、8、12、24h，吸取等量上述混合液，通过酶标仪测定混合液中阿霉素的荧光强度Ft；
3)24h后，加入0.2％的Triton溶液，裂解破坏脂质体，令阿霉素完全释放后，酶标仪记录阿霉素荧光强度Ffinal；
4)根据荧光强度计算阿霉素在全血清中的泄漏率，详细公式如下：
Figure BDA0002398812330000301
5)通过离心(24000g，15min)，收集各时间点的纳米碗支撑阿霉素脂质体，再分散后DLS测定粒径与电位。
1.2.冻干稳定性评价
1)精密移取等量的纳米碗支撑阿霉素脂质体或普通阿霉素脂质体样品，装于ep管中，放入-80℃冰箱过夜冷冻后，转移至RLPHR 2-4LD冷冻干燥机中冷冻干燥过夜；
2)取冷冻干燥后的纳米碗支撑阿霉素脂质体或普通阿霉素脂质体，再次加入等量超纯水，涡旋令其充分分散；
3)观察并记录纳米颗粒的分散情况；
4)DLS测定经过冷冻干燥后再次分散后，纳米颗粒粒径的变化情况。
1.3储存稳定性评价
1)将制得的纳米碗支撑阿霉素脂质体分散液放置于4℃冰箱内冷藏；
2)分别在对应的日期进行DLS测定粒径与Zeta电位，记录纳米颗粒长期储存状态变化。
2、4T1细胞培养
2.14T1细胞复苏
1)从液氮罐中取出冻存的4T1细胞，于37℃水浴锅中孵育，解冻；
2)待冻存管内固体融化为液体后，转移至离心管之中，800g离心5min后，弃去上清冻存液；
3)加入5mL含10％胎牛血清的细胞培养液，用移液器吹打细胞令其均匀分散后，装入T-25培养瓶中；
4)将培养瓶置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中培养，次日于显微镜下观察细胞生长状态。
2.2.细胞培养与传代
1)用移液器吸除原T-25培养瓶中的细胞培养液，加入1mL的DPBS润洗1-2次以除去残留的培养液；
2)加入1mL 0.25％胰蛋白酶，来回晃动培养瓶，令胰酶均匀覆盖整个培养瓶底面，置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中孵育3min；
3)加入4mL含10％胎牛血清的细胞培养基，稀释胰酶，终止消化；
4)用移液器吹打细胞混悬液，使其均匀分散，得到单细胞悬液，将细胞悬液按1：4的比例分装至新的T-25培养瓶之中，补充新鲜细胞培养液至5mL；
5)将培养瓶放回37℃，含5％CO2的恒温培养箱中培养，次日于显微镜下观察细胞生长状态；
6)2天之后再次进行换液传代操作。
2.3细胞冻存
1)吸除原T-25培养瓶中的培养液，加入1mL的DPBS润洗1-2次以除去残留的培养液；
2)加入500μL 0.25％胰蛋白酶，来回晃动培养瓶，令胰酶均匀覆盖整个培养瓶底面，置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中孵育3min；
3)加入4mL含10％胎牛血清的细胞培养基，稀释胰酶，终止消化；
4)用移液器吹打细胞混悬液，使其均匀分散，得到单细胞悬液；
5)收集细胞悬液于无菌离心管中，800rpm离心5min，吸弃上清；
6)加入1mL细胞冻存液，再次吹打成单细胞混悬液；
7)将单细胞混悬液转移至冻存管中，做好标记，-80℃保存过夜，后转移至液氮罐中保存。
2.4 4T1乳腺癌细胞对纳米碗支撑阿霉素脂质体摄取实验
1)采用前述方法工艺制备得到纳米碗支撑阿霉素脂质体与普通阿霉素脂质体；
2)将4T1细胞消化后，以2×105个/mL的细胞浓度接种于放有盖玻片的小皿中，接种体积1mL，各纳米颗粒组接种3块小皿；
3)将接种细胞的小皿置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中培养12h；
4)向各小皿中分别加入阿霉素浓度为0.5mg/mL的相应脂质体分散液，37℃，5％CO2恒温培养箱继续孵育1h；
5)1h后吸出细胞培养基，用DPBS润洗3次，随后加入1mL4％多聚甲醛固定20min；
6)固定结束后，吸出多聚甲醛，再次用DPBS润洗3次，最后加入含有6μL DAPI的DPBS溶液1mL，孵育5min，DPBS冲洗3次；
7)将固定好的样品置于激光共聚焦显微镜下观察，选用Alexa
Figure BDA0002398812330000321
488通道观察细胞摄取纳米颗粒情况。
3、CCK-8法检测细胞活力
1)取对数生长期的4T1细胞，计数后用完全细胞培养基稀释至2×105个/mL密度，并接种96孔板，每孔加200μL。将培养板在37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中培养12h；
2)将不同的纳米颗粒结构以药物浓度梯度配制在无血清培养液中，制成含不同浓度药液的培养基，吸出培养板中的旧培养液，再向每孔中加入含有药液的200μL新配培养液；
3)将含细胞96孔板再次置于37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中培养适当时间；
4)将CCK-8液体按照1:10用不含血清的培养液稀释10倍，吸出培养板中的旧培养液，于每孔加入100μL含CCK-8的培养液；
5)将培养板置于37℃，5％CO2恒温细胞培养箱中孵育0.5-1h；
6)用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光值。
4、统计学处理
实验结果以“mean±SD”呈现，使用GraphPad Prism7.0医学绘图软件进行统计学分析并制作图表。两组间比较采用t检验；三组及以上比较采用多因素方差分析法进行统计分析，p<0.05时认为差别具有统计学意义。
三、结果
1、纳米颗粒血清稳定性
本研究通过将纳米颗粒分散于100％的胎牛血清，并置于37℃的恒温振荡培养箱中振荡培养，以近似模拟纳米颗粒在循环系统中的周围环境及所受到的血流冲击。通过测定不同时间内阿霉素的荧光强度，计算阿霉素的泄漏率。结果如图14.A所示，纳米碗支撑的阿霉素脂质体，其在血清中的泄漏率显著性降低，24h内泄漏率均值在3.34％，保持在5％以下，几乎未见泄漏。然而普通阿霉素脂质体其泄漏率均值在23.00％，两者相差近7倍。这一结果提示，通过纳米碗的支撑作用，能够有效减少脂质体内水腔药物的泄漏。同时，考察纳米碗支撑的脂质体在血清中24h内粒径与Zeta电位的改变情况，结果如图14.B显示，无论粒径还是Zeta电位均未发生明显变化。
2、纳米颗粒冻干稳定性
将两种脂质体分别进行冷冻干燥后，再次加入超纯水，涡旋搅拌令其能够充分。结果显示，经过足够时间的涡旋后，纳米碗支撑阿霉素脂质体组能够充分分散；然而普通阿霉素脂质体组分散不均，呈混悬液状态，待静置后能够在管底观察到肉眼可见的红色沉淀，如图15.A,D。随后，分别吸取等量样品上清进行DLS粒径检测，以Intensity参数作为考察权重，结果可以发现，普通阿霉素脂质体的粒径分布范围显著变宽，同时呈现多峰状分布；相较而言，有纳米碗支撑的阿霉素脂质体其粒径分布仍旧呈现单峰状分布，分散性较好，且粒径均值与冷冻干燥前相近(图15.B,C,E,F)。
3、纳米颗粒储存稳定性
通过定期对储存于4℃的纳米碗支撑阿霉素脂质体进行DLS测定粒径与Zeta电位，监测纳米颗粒的储存稳定性。结果如图16所示，在长达120天的时间内，纳米颗粒均保持稳定的粒径尺寸和Zeta电位，纳米颗粒分散性良好，无明显沉降和团聚现象，证明该纳米颗粒能够长期稳定保存。
4、4T1细胞纳米颗粒摄取
在激光共聚焦显微镜40放大倍数下，以同等强度的激发光进行观察4T1细胞对纳米颗粒的摄取情况。由图17.A可知，随着时间的推移，4T1细胞内阿霉素的荧光强度逐渐增加，由其推断4T1细胞对载药纳米颗粒的摄取数量同样随着时间的延长而增多；同时，当孵育4h后，细胞核区域中阿霉素的荧光信号相较于1h有明显增强，提示阿霉素开始释放入核；然而，无论摄取时间是1h还是4h，纳米碗支撑阿霉素脂质体与普通阿霉素脂质体在细胞内的荧光强度基本持平，无显著性差异，荧光定量统计如图17.B所示，与观察现象相符。
5、纳米药物对细胞活力的影响
选取阿霉素浓度范围0.01-10.00μg/mL为本次研究考察范围，分别制得0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μg/mL的含纳米颗粒药物或游离药物的无血清培养基。将上述药液分别加入相应96孔板，进行孵育。选取孵育时间48h为实验测试时间点，进行CCK-8法检测细胞活力。结果如图18.A所示，首先，在体外细胞水平上，游离药物组其对细胞活力的影响均显著强于普通阿霉素脂质体和纳米碗支撑阿霉素脂质体；其次，在孵育48h后，普通阿霉素脂质体组与纳米碗支撑阿霉素脂质体组对细胞活力的影响并无统计学差异。由此，我们得出在体外细胞水平上，普通阿霉素脂质体组与纳米碗支撑阿霉素脂质体组对于细胞活力的影响基本相当，而游离药物相较两组脂质体，具有更强的细胞毒性。此外，选取未载药的纳米碗支撑脂质体进行CCK-8检测，以0.01-3mg/mL为浓度范围，分别孵育48h，结果并未见显著细胞活力衰减，提示该纳米颗粒生物相容性良好，即使在较高剂量条件下对肿瘤细胞并未有毒性作用。
四、讨论
1、肿瘤细胞的选择
根据美国FDA批准上市的Doxil及在欧洲批准上市的Myocet适应症显示，阿霉素脂质体被批准用于转移性乳腺癌的治疗，生存时间有所延长，同时不良反应明显降低。而作为小鼠4T1细胞在BALB/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近。该肿瘤细胞已广泛作为人VI期乳腺癌的动物模型。因此，本实施例选取4T1细胞作为研究对象，开展后续实验。
2、体外模拟循环系统
循环系统是静脉注射药物后，最先到达的体内环境，在其中，纳米药物将受到各种蛋白、细胞因子和细胞的相互作用，并受到血流的冲击，从而产生一系列变化。而若在体外模拟循环系统，其最为理想的状态为采集小鼠全血进行相应实验，然而由于小鼠自身全血量少、全血易凝结等条件的限制，本文选择以100％胎牛血清的环境，以37℃恒温振荡近似模拟纳米药物在体内循环系统中与各种蛋白和细胞因子的相互作用及血流的冲击作用，而与血细胞的相互作用本文暂不涉及。
3、纳米碗对稳定性的作用
由前述结果可知，纳米碗的支撑成功地降低了脂质体在血清环境中的药物泄漏，并且显著提高了纳米制剂在经历冷冻干燥再分散能力。在循环系统中，纳米碗的支撑作用：①能够抵消部分血流对脂质体的冲击作用，减少脂质体的形变程度，从而减少由于过度形变而引起的脂质体破裂，内容物泄漏问题；②而血清中的各种蛋白和细胞因子与脂质体的结合作用，改变脂质体通透性也是导致脂质体内容物泄漏的另一重要原因，由于纳米碗的特殊开口结构，令泄漏范围大幅度缩小，仅仅当碗口范围内的磷脂双分子层通透性发生改变时，才会导致内容物的泄漏，从而降低泄漏的发生概率。
4、纳米碗内衬对于细胞毒性和被摄取能力的影响
纳米碗的加入，是否会使得细胞对纳米药物的摄取能力产生一定影响，这一问题在实验设计之初就引起了我们的关注。细胞对于纳米颗粒的摄取通常与纳米颗粒的表面特性有关，如纳米颗粒形态、表面基团及Zeta电位等。而虽然纳米碗的形态不规整，但脂质体的完全包覆，令其表面完全被磷脂所覆盖而仍然呈现一个囊泡状。因此，纳米颗粒形态、表面基团、Zeta电位与普通脂质体相差无几。而共聚焦显微镜统计结果也验证了纳米碗的内衬并不影响脂质体被细胞的摄取这一论证。
同样，纳米碗的内衬是否会影响纳米药物中药物释放行为，而对细胞毒性产生影响。带着这一疑问，本实施例设计了相应的CCK-8实验。结果显示，纳米碗并不会影响载药脂质体对细胞的毒性。此外，未载药的空白纳米碗支撑脂质体同样未显现明显的细胞毒性，证明载体良好的生物相容性。
五、小结
通过考察在模拟循环系统、冷冻干燥及4℃储存环境三种不同环境和操作下，纳米药物的粒径、Zeta电位及泄漏率的变化，全面评价纳米药物的稳定性。从上述试验中可知，制备得到的纳米碗支撑阿霉素脂质体，无论在体内循环系统、冷冻干燥及低温储存环境下，均能保持良好的分散性和极低的泄漏率。在体外细胞水平，考察了4T1细胞对于纳米药物的摄取情况和纳米药物细胞毒性。结果显示，纳米碗的支撑对于细胞并无产生显著影响，细胞对纳米碗支撑阿霉素脂质体与普通阿霉素脂质体的摄取及脂质体对细胞的毒性水平相当。
实施例4纳米碗支撑阿霉素脂质体抗肿瘤治疗体内评价
一、仪器与材料
1、仪器设备
表13
XS205s型电子天平 梅特勒特利多公司
JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司
HS-70型恒温磁力搅拌器 德国IKA公司
R-200旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司
真空干燥箱 上海一恒科技仪器有限公司
迷你挤出装置 美国Avanti公司
SorvallST16冷冻离心机 美国赛默飞公司
CM-120透射电镜 荷兰Philips公司
MalvernZetasizerNanoZS激光粒度仪 英国Malvern公司
SpectraMaxM2生物分子酶标仪 美国分子仪器有限公司
ZQTY-70振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司
MS2型漩涡混合器 德国IKA公司
实验室超纯水系统 美国Millipore公司
LSM5激光共聚焦显微镜 德国Zeiss
DP50正置显微镜 日本Olympus公司
二氧化碳细胞培养箱 美国赛默飞公司
Invitrogenlifecountess细胞计数仪 美国赛默飞公司
1300SeriesA2超净操作台 美国赛默飞公司
Olympus电子显微镜 日本Olympus公司
2、材料与试剂
表14
Figure BDA0002398812330000361
Figure BDA0002398812330000371
3、细胞系及动物
4T1乳腺癌细胞，购自Caliper Life Sciences公司(Hopkinton，MA)。4-6周龄BALB/c雌性小鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
4、相关试剂配制
1)4T1细胞培养液：DMEM基础培养基，1青链霉素双抗，10％胎牛血清；
2)4％多聚甲醛溶液：以pH 7.4的PBS(0.01M)作为溶剂，称取40g多聚甲醛放入800mLPBS溶液中，于60℃恒温摇床中振荡溶解过夜，在多聚甲醛固体完全溶解后，停止加热，平衡至室温后，再次加入PBS定容至1L；
3)1％戊巴比妥钠麻醉剂：称取100mg戊巴比妥钠，加入10mL超纯水中，涡旋直至充分溶解。
二、实验方法
1、4T1乳腺癌正位接种模型建立
1.1 4T1细胞悬液准备
1)取一瓶养有4T1细胞的T-75培养瓶，用移液器吸除培养瓶中的细胞培养液，加入5mL的DPBS润洗1-2次以除去残留的培养液；
2)加入2mL 0.25％胰蛋白酶，来回晃动培养瓶，令胰酶均匀覆盖整个培养瓶底面，置于37℃，含5％CO2的恒温培养箱中孵育3min；
3)加入10mL无血清细胞培养基，稀释胰酶，终止消化；
4)用移液器吹打细胞混悬液，使其均匀分散，得到单细胞悬液，取5μL细胞悬液并加入同体积胎盘蓝染液，使用Invitrogen life countess细胞计数仪对细胞悬液细胞计数；
5)4℃，800g离心5min，弃去上清液，根据之前计算得到的细胞内浓度，加入适量无血清细胞培养基，用移液器轻轻吹打细胞块使其充分分散，制得单细胞悬液，细胞悬液终浓度为：1.6×107个/mL；
6)将4T1细胞悬液分装至无菌2mL离心管中，4℃冷藏待用。
1.2BALB/c雌性小鼠正位接种4T1细胞
1)接种前一天，将小鼠右侧腹部毛发剔除，为次日手术做备皮准备；
2)次日，取备皮处理的小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥麻醉剂100μL；
3)待小鼠完全麻醉后固定四肢，用生理盐水润湿右侧腹部后，用手术刀在腹部轻划一口；
4)使用镊子夹出位于右侧大腿根部的第4只乳腺脂肪垫，注射前述制备的4T1单细胞悬液50μl；
5)松开镊子，将脂肪垫归位后，缝合腹部创面；
6)接种结束后将小鼠放回鼠笼，每只小鼠前腿部系上标签带。
2、动物分组与给药方案
1)接种4天后，利用游标卡尺测定肿瘤体积：每隔1日测定一次肿瘤最长直径与最短直径(L，W)，根据下式计算肿瘤体积：
Figure BDA0002398812330000381
2)待肿瘤体积生长至80mm3后，根据肿瘤体积大小，均匀分成以下5个实验组：
①生理盐水组(Saline)
②空白纳米碗支撑脂质体组(NB@LP)
③盐酸阿霉素组(Dox)
④普通阿霉素脂质体组(DLP)
⑤纳米碗支撑阿霉素脂质体组(NB@DLP)
3)在接种后第8、11、14天，分别向各实验组小鼠尾静脉注射等量的相应药物，各含药组按照阿霉素4mg/kg的剂量给予药物。
3、小鼠体重与肿瘤体积监测
1)在分组首针给药后，每2日进行一次小鼠体重和肿瘤长短径测定，计算肿瘤体积，所有结果记录汇总；
2)使用GraphPad Prism7.0医学绘图软件进行数据归纳整理、统计学分析并制作图表。
4、组织切片免疫组化染色
1)在最后一次静脉给药后，在各实验组中选择若干小鼠，处死后，解剖摘取小鼠肿瘤组织与重要脏器，并将其充分浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定；
2)固定期间，多次更换新鲜4％多聚甲醛溶液，以洗尽残留血液，待上清溶液澄清后，石蜡包埋、切片，免疫组化染色：TUNEL、PCNA及H&E染色；
3)显微镜下观察染色切片，并拍照收集图像，利用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，计算肿瘤细胞凋亡阳性率及增殖阳性率。
5、小鼠生存期观察
1)给药结束后，维持每2日进行一次小鼠体重和肿瘤长短径测定；
2)观察小鼠精神状况、生命体征和生存状态；
3)当小鼠出现死亡或其荷载肿瘤体积超过2000mm3时，记录死亡，同时对小鼠实施安乐死操作。
6、统计学处理
实验结果以“mean±SD”呈现，使用GraphPad Prism7.0医学绘图软件进行统计学分析并制作图表。两组间比较采用t检验；三组及以上比较采用多因素方差分析法进行统计分析，p<0.05时认为差别具有统计学意义。
三、结果
1、纳米碗支撑阿霉素脂质体治疗乳腺癌的药效学评价
为考察纳米碗支撑阿霉素脂质体对4T1乳腺癌的治疗效果，正位接种肿瘤细胞后的BALB/c雌性小鼠，在一周之后开始给药，分别于第0、3和6天尾静脉注射给予相应药物。从第一次给药(第0天)开始记录小鼠体重、肿瘤体积并观察小鼠生存状况，绘制生存曲线，结果如图19所示。由图19.B图可见，与对照组相比，游离阿霉素、普通阿霉素脂质体及纳米碗支撑阿霉素脂质体的肿瘤体积增速均有不同程度的放缓，说明阿霉素能够有效抑制肿瘤生长。但比较三组含药使用实验组，不难发现，按照抑瘤效果从好到差排序，纳米碗支撑阿霉素脂质疗效最为显著，肿瘤几乎不再生长；其次是普通阿霉素脂质体，虽然无法如纳米碗支撑阿霉素脂质体组完全抑制肿瘤生长，但总体增长速率较缓；而最差的则是游离阿霉素给药组，虽然体积增速放缓，但远远不能达到治疗肿瘤的预期，究其原因，可能与游离阿霉素过快的体内清除速率有关，无法在肿瘤部位有效蓄积。此外，通过小鼠体重的监测(图19.C)，发现游离阿霉素给药组在给药期间，体重出现显著的下降，身体较为瘦弱，精神状况也出现一定程度的萎靡，可见游离阿霉素本身对机体存在一定程度的毒副作用。
同样，图19.D与表15显示小鼠生存曲线，生理盐水组、空白纳米碗支撑脂质体、游离阿霉素、普通阿霉素脂质体与纳米碗支撑阿霉素脂质体组小鼠的中位生存期分别为24天，24天，27天，30天和50天。与生理盐水对照组相比，含药给药组均有不同程度延长荷瘤小鼠的生存期；其中，游离阿霉素与对照组相比，疗效甚微，中卫生存期仅延长3天(12.50％)；而普通阿霉素脂质体与对照组相比，延长了6天(25.00％)，疗效较游离阿霉素有所提高；在三组给药组中，纳米碗支撑阿霉素脂质体疗效最为显著，中位生存期延长时间最长，50天，与对照组相比延长了26天(108.33％)，与普通阿霉素脂质体相比，延长20天(66.67％)。并且，在72天的观测时间内，仍有1只未见死亡。
表15、不同实验组给药后4T1乳腺癌小鼠的中位生存期
Figure BDA0002398812330000401
2、纳米药物促进肿瘤凋亡与抑制肿瘤增殖作用
根据上述各实验组别对于4T1肿瘤的抑制作用，摘取荷瘤小鼠的肿组织，进行病理切片和免疫组化染色分析，分别进行TUNEL和PCNA染色，检测肿瘤细胞凋亡和增值情况。结果如图20.A所示，含药实验组对于肿瘤细胞的凋亡均有不同程度的抑制作用，同时也在不同程度上抑制了肿瘤细胞的增值；其中，纳米碗支撑阿霉素脂质体的促进凋亡与抑制增值作用最为显著，普通阿霉素脂质体效果次之，而游离阿霉素的作用最差，半定量结果如图20.B,C所示；而空白纳米载体组并未见显著疗效，与体外细胞实验结果相一致。
3、纳米药物对于重要脏器的毒性分析
同样，摘取荷瘤小鼠重要脏器组织，进行病理切片染色后进行观察，考察不同给药组对于小鼠脏器的影响。结果如图21所示，各实验组对于小鼠的肝脏、肾脏、脾脏和肺均未造成明显毒性；而游离阿霉素对心脏毒性较大，令心肌细胞出现溶解断裂；纳米碗支撑阿霉素脂质体和普通阿霉素脂质体能够显著性降低阿霉素对于心脏的毒副作用，病理切片未见明显病变；此外，空白纳米颗粒载体组对于心、肝、脾、肺、肾等组织均未见显著性毒性，提示该载体无毒性，生物相容性良好。
四、讨论
1、纳米碗支撑对在体乳腺癌整体治疗效果
根据前述实验结果，纳米碗的支撑能够在小鼠乳腺癌治疗中展现显著优于其他各实验组的疗效，无论是肿瘤体积的抑制作用还是小鼠生存曲线的延长，较其余各组均有明显提高，而这一结果恰恰与实施例3体外细胞水平的结果正好相反。在体外细胞水平中，细胞毒性最强的游离阿霉素疗效最差；而原本在体外与纳米碗支撑阿霉素脂质体不分伯仲的普通阿霉素脂质体，在小鼠体内的肿瘤抑制作用却并没有如纳米碗支撑阿霉素脂质体一样突出，但仍旧比游离阿霉素略胜一筹；而纳米碗支撑阿霉素脂质体却表现出了最好的抑瘤效果，肿瘤体积计划不再增长。究其原因，首先，游离阿霉素极差的长循环特性和极快的清除率，导致了大量的阿霉素并无法真正到达肿瘤部位，从而影响了阿霉素的疗效；而就阿霉素脂质体而言，虽然脂质体的包载，在一定程度上能够增加其在循环系统中的滞留时间，但实验证明仍然会有药物提早泄漏的现象发生，从而导致到达肿瘤部位的药物有一定程度减少；而纳米碗的支撑作用，为脂质体提供了“坚硬”的内胆，令其能够承受在循环系统中各方面因素的冲击和破坏作用，在到达肿瘤部位之前，尽可能地减少了内容药物的泄漏，令更多的阿霉素随循环系统到达肿瘤部位，从而更好地发挥药物疗效。
2、纳米碗支撑对肿瘤及重要脏器的影响
通过对小鼠肿瘤组织和重要脏器组织切片进行研究发现，纳米碗支撑阿霉素脂质体相较于普通阿霉素脂质体，能够更好地抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，同时减少阿霉素对于心脏的毒副作用。究其原因，可能与纳米碗的支撑作用有密切联系。纳米碗的支撑作用，能够减少阿霉素在体内循环过程中的提前泄漏，令其能够运载更多的药物到达肿瘤部位，从而提高疗效；同时由于游离药物泄漏的减少，使得脏器组织内药物浓度降低，从而减少对于其他脏器的毒性。
五、小结
本文在BALB/c雌性小鼠上成功构建正位接种4T1乳腺癌模型，并向荷瘤小鼠尾静脉注射不同药物，观察各组药物治疗效果。通过检测小鼠体重、肿瘤体积、小鼠生存曲线，对给药后的小鼠宏观疗效进行整体评价；通过对肿瘤组织及重要脏器的免疫组化染色分析，考察肿瘤组织凋亡、增值情况及脏器坏死情况，从微观角度进一步分析和评价抗肿瘤治疗效果。结果显示，纳米碗支撑阿霉素脂质体的整体抗肿瘤效果最佳，其次是普通阿霉素脂质体，而游离阿霉素组疗效较差，并且给药期间小鼠体重有明显下降趋势，H&E结果也显示其对心脏造成的毒性较大。
实施例5纳米碗支撑伊立替康/长春新碱脂质体的制备方法
其制备方法与实施例1-2基本相同，可参照实施例1-2，区别仅在于将其中的阿霉素替换为伊立替康或长春新碱即可。
实施例6纳米碗支撑伊立替康/长春新碱脂质体效果实验
一、实验方法：
为了检测血清引起的膜不稳定性和伊立替康或长春新碱泄露，将伊立替康(Irinotecan)或长春新碱(Vincristine)脂质体或纳米碗支撑脂质体在37℃下分散于纯FBS(胎牛血清)中，以200转/分的速度振荡，一定时间后，用Zebaspin脱盐柱(Thermo-Scientific)纯化脂质体，去除脂质体外的伊立替康或长春新碱。将保留药物的脂质体与9倍体积的0.75M HCL(含90％异丙醇)混合，离心。将含有伊立替康或长春新碱的上清液在SpeedVac浓缩器(Thermo Scientific)中挥发，剩余物在200微升的流动相中溶解，该流动相由甲醇、乙腈、水和三氟乙酸组成，在24:24:52:0.1(v/v，pH＝3.0)，流速为1mL/min，用diamonsil C18柱(4.6×150m m，5μm，Dikma，China)分离，254nm检测。计算脂质体在FBS中的泄露。
二、实验结果
结果表明，与普通伊立替康脂质体(Irinotecan-LP)和长春新碱脂质体(Vincristine-LP)相比，纳米碗支撑的伊立替康脂质体(NB@Irinotecan-LP)和长春新碱脂质体(NB@Vincristine-LP)的泄露率显著降低，表现出很高的血清稳定性。
本发明成功合成了具有碗状结构的纳米颗粒，并完善和优化了纳米颗粒合成处方，建立了一整套纳米碗的相关表征与鉴定方法。成功地构建了纳米碗支撑载药脂质体给药系统，探索并确立了盐酸阿霉素/伊立替康/长春新碱的装载方式，实现了阿霉素/伊立替康/长春新碱的高包封率。随后，本发明较为全面地探讨了纳米碗支撑载药脂质体的各项稳定性，并在体外细胞水平对其细胞摄取行为和细胞毒性进行了评价。稳定性试验结果表明，纳米碗支撑载药脂质体能够减少载药脂质体在循环系统中的泄漏率；同时，能够在冷冻干燥处理后，更好地再分散，便于制备冻干粉剂；此外，纳米碗支撑阿霉素脂质体分散液能够在4℃的环境下，储存长达120天，而未见沉降或团聚现象，分散性良好。细胞试验结果显示，纳米碗的加入，并不会对载药脂质体的细胞摄取行为和细胞毒性产生负面影响。最后，本发明成功构建了4T1乳腺癌正位接种模型，考察纳米碗支撑阿霉素脂质体对于乳腺癌的治疗效果。结果表明，纳米碗支撑阿霉素脂质体能够有效地抑制肿瘤生长，显著地延长了荷瘤小鼠的生存期；同时，与其他四组实验组相比，纳米碗支撑阿霉素脂质体能够显著减少肿瘤细胞的增值，促进肿瘤细胞的凋亡；而小鼠体重和脏器染色结果表明，纳米碗支撑阿霉素脂质体能够有效减小阿霉素的毒副作用，改善小鼠生存质量。本发明揭示了一种通过提高脂质体循环稳定性，减少药物泄漏，从而提高抗肿瘤疗效的新方法，为抗肿瘤治疗提供了新的思路和理论依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.纳米碗支撑载药脂质体，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑载药脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载药物，得到纳米碗支撑载药脂质体。
2.根据权利要求1所述的纳米碗支撑载药脂质体，其特征在于，步骤(3)中所述的药物选自阿霉素、伊立替康、长春新碱中的任意一种。
3.权利要求1所述的纳米碗支撑载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑载药脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载药物，得到纳米碗支撑载药脂质体。
4.纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载阿霉素/伊立替康/长春新碱，得到纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体。
5.根据权利要求4所述的纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体，其特征在于，步骤(1)中所述的聚苯乙烯纳米颗粒粒径为45-55nm；所述的花生状纳米颗粒是用苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒按照Vstyrene:VMPSNPs＝3:1制得；所述的二氧化硅改性花生状纳米颗粒是用0.3g的TEOS制得的。
6.根据权利要求4所述的纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体，其特征在于，所述的纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的平均粒径为140-150nm，Zeta电位为-18～-16mV。
7.权利要求4所述的纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)纳米碗的制备：制备聚苯乙烯纳米颗粒→制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒→制备花生状纳米颗粒→制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒→得到纳米碗；
(2)纳米碗支撑空载脂质体的制备：取APTES与步骤(1)制备的纳米碗进行纳米碗的氨基化修饰得到氨基化纳米碗→将氨基化纳米碗通过离心方法转移到配制好的硫酸铵溶液中得到氨基化纳米碗的硫酸铵溶液，对其振荡形成包裹有纳米碗的囊泡→对包裹有纳米碗的囊泡进行探头超声得到纳米碗支撑空载脂质体；
(3)纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体的制备：利用硫酸铵主动载药的方法，包载阿霉素/伊立替康/长春新碱，得到纳米碗支撑阿霉素/伊立替康/长春新碱脂质体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中纳米碗的制备方法为：
1)制备聚苯乙烯纳米颗粒：以苯乙烯为单体，SDS为乳化剂，KPS为引发剂，采用乳液聚合法合成聚苯乙烯纳米颗粒；
2)制备MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒：在已合成的聚苯乙烯纳米颗粒的基础上，加入苯乙烯、MPS和AIBN，通过聚合反应合成MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒；
3)制备花生状纳米颗粒：将2)制备完毕的MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒与苯乙烯、VBS混合，共置于超纯水中搅拌，利用聚苯乙烯的溶胀作用，令MPS包覆改性聚苯乙烯纳米颗粒发生形变涨破，随后加入AIBN，再次引发聚合反应，最终形成花生状纳米颗粒；
4)制备二氧化硅改性花生状纳米颗粒：将3)所得花生状纳米颗粒通过超速离心后再分散的方式，转移至无水乙醇之中，随后加入25％浓氨水，配置含有50％TEOS的乙醇溶液，缓慢滴加后得到二氧化硅改性的花生状纳米颗粒；
5)制备纳米碗：将4)得到的二氧化硅改性的花生状纳米颗粒转移至旋转蒸发仪上，挥去多余的乙醇后，加入四氢呋喃溶解，超速离心收集沉淀得到最终产物——纳米碗。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的聚苯乙烯纳米颗粒粒径为50nm；所述的花生状纳米颗粒是用苯乙烯单体与MPS改性聚苯乙烯纳米颗粒按照Vstyrene:VMPSNPs＝3:1制得；所述的二氧化硅改性花生状纳米颗粒是用0.3g的TEOS制得的。
10.权利要求1所述的纳米碗支撑载药脂质体在制备抗肿瘤的药物中的应用。
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