CN111529712A - 一种细胞外囊泡主动载药方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞外囊泡主动载药方法，其包括以下步骤：细胞外囊泡用硫酸铵溶液重悬后进行低频探头超声处理，并于4℃孵育1h；将孵育后的细胞外囊泡通过聚碳酸酯膜多次挤出处理，再用PBS透析过夜以建立硫酸铵梯度；将透析过夜后的细胞外囊泡与药物孵育，以便获得载药细胞外囊泡。根据本发明实施例，该方法基于低频探头超声和聚碳酸酯膜挤出的细胞外囊泡主动载药方法能有效地提高细胞外囊泡的载药率和药物稳定性，且应用范围广泛。

Description

一种细胞外囊泡主动载药方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡主动载药方法。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是具有双层脂膜结构和多种生物分子的生物纳米颗粒，是细胞间通讯的一种新机制，允许细胞交换蛋白质、脂质和遗传物质。细胞外囊泡凭借其相对较小的分子结构、天然的分子转运特性和良好的生物相容性等众多优势，在药物载体领域具有巨大的应用潜力。迄今为止，已有诸多研究通过细胞外囊泡输送蛋白、RNA或其他小分子药物以达到治疗疾病的目的。
目前，用于细胞外囊泡药物装载方法可以分为两类，一类是在其母源细胞上操作，即转染母代细胞，此方法操作繁琐费时，且只能用在培养细胞上，载药率低，难以用于血浆、牛奶、植物等特殊来源的细胞外囊泡；另一类是在提纯的细胞外囊泡上进行药物装载，具体包括电穿孔、共同孵育、反复冻融、挤压、涡旋振荡等，然而其载药率低，难以满足临床应用的需求。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种细胞外囊泡主动载药方法。，该方法可提高细胞外囊泡对水溶性药物的载药率。
为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种细胞外囊泡主动载药方法，其包括以下步骤：
(1)细胞外囊泡用硫酸铵溶液重悬后进行探头超声处理，并于4℃孵育1h；
(2)将孵育后的细胞外囊泡通过聚碳酸酯膜多次挤出处理，再用PBS透析过夜以建立硫酸铵梯度；
(3)将透析过夜后的细胞外囊泡与药物孵育，以便获得载药细胞外囊泡。
根据本发明实施例的一种细胞外囊泡主动载药方法，该方法采用低频探头超声处理细胞外囊泡，可瞬时改变细胞外囊泡的膜通透性，建立膜内外质子梯度；再通过聚碳酸酯膜多次挤出处理促进细胞外囊泡的膜融合及硫酸铵溶液内流，同时使细胞外囊泡的粒径减小；最后通过铵离子梯度的建立促进了药物的装载，并通过与硫酸根形成沉淀进一步提高了载药率。因此，基于低频探头超声和聚碳酸酯膜挤出的细胞外囊泡主动载药方法能有效地提高细胞外囊泡的载药率和药物稳定性，且应用范围广泛。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种细胞外囊泡主动载药方法，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，步骤(1)中，探头超声处理的条件为：功率26W，3mm尖端探头，30s开，30s关，4℃，时间为120s。由此，该超声的参数不会破坏细胞外囊泡的膜结构。
可选地，步骤(1)中，细胞外囊泡为牛奶外泌体。
具体地，所述牛奶外泌体通过差速离心法、超速离心法结合等电点沉淀法和膜分离法提取。
可选地，步骤(1)中，硫酸铵溶液的浓度为1M。
可选地，步骤(2)中，挤出处理的次数为5次。
可选地，步骤(2)中，聚碳酸酯膜为100nm。
可选地，步骤(3)中，药物为蒽环类药物。
进一步地，所述蒽环类药物包括阿霉素(DOX)和米托蒽醌(MXT)。
在本发明的另一个方面，本发明还提出了一种载药细胞外囊泡，其是由上述的方法获得。
根据本发明实施例的载药细胞外囊泡，其采用上述主动载药方法，相较于被动载药法，可将阿霉素的载药率从低于10％提高到接近60％，明显改善了细胞外囊泡载药率低的问题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的细胞外囊泡主动载药方法的示意图；
图2为根据本发明实施例的空mEVs与Dox-mEVs的电镜图；
图3为根据本发明实施例的细胞外囊泡主动载药方法对载药率提升的影响；
图4为根据本发明实施例的硫酸铵浓度及超声时间对Dox-mEVs荧光强度的影响；
图5为根据本发明实施例的不同挤出次数对荧光强度及粒径大小的影响；
图6为根据本发明实施例的不同阿霉素加入量对载药率及载药量的影响；
图7为根据本发明实施例的不同mEVs浓度对载药率及载药量的影响；
图8为根据本发明实施例的不同载药方法制备的Dox-mEVs载药率及粒径大小的对比；
图9为根据本发明实施例的阿霉素释放率随时间变化曲线；
图10为根据本发明实施例的MXT溶液的标准曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
SEAL方法的建立：
采用差速离心法、超速离心法结合等电点沉淀法和膜分离提取牛奶外泌体(mEVs)。mEVs用硫酸铵溶液重悬，置于冰上进行探头超声处理，探头超声处理的条件为功率26W，3mm尖端探头，30s开，30s关。然后置于4℃孵育1h。将孵育后的mEVs通过100nm的聚碳酸酯膜(PC膜)多次挤出处理，再用PBS透析过夜，建立主动载药所需的铵离子梯度。将透析过夜后的mEVs在室温下与阿霉素孵育30min，以便获得载药牛奶外泌体(Dox-mEVs)。完成载药后用Sephadex G25尺寸排阻层析法除去Dox-mEVs中过量的药物。
透射电镜观察：
使用FEI Tecnai F20透射电子显微镜拍摄mEVs载药前后的电镜图。200kV电压下，将3μL mEVs或Dox-mEVs样品输送到FEI Vitbot样本柱塞的铜网上。结果如图2所示，透射电镜的图像中显示了mEVs的膜封闭球形结构，且存在其他非囊泡杂质(左)。载药后，在某些囊泡的腔中观察到阿霉素沉淀(右)，这与传统的阿霉素脂质体的特征结构一致。
载药性能的测定：
通过荧光分光光度计测定阿霉素的自发荧光强度来确定Dox-mEVs的载药性能。阿霉素标准溶液的浓度为0.25μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM和5.0μM。为了避免因阿霉素在mEVs内荧光猝灭导致的测量误差，每份样品都与乙醇混合以裂解脂膜释放阿霉素。将样品用PBS稀释40倍后放入比色皿，测量500nm至700nm的荧光强度，根据标准曲线计算阿霉素的浓度和载药率。结果由图3所示，通过SEAL方法制备的Dox-mEVs高效富集阿霉素，相较于被动孵育方法(阿霉素与mEVs混合后于4℃过夜)荧光强度提高了10.5倍。此外，通过SEAL方法制备的Dox-mEVs的荧光猝灭率(裂解后释放的阿霉素和EVs装载的阿霉素之间的荧光强度比)较高，进一步证实增加的载药量是由于阿霉素在单个囊泡中的大量积聚。
SEAL方法的优化：
为确定最佳使用条件以增加mEVs的载药能力，用不同浓度的硫酸铵溶液重悬mEVs后再进行不同时间的超声处理。结果如图4所示，SEAL方法的效果是高度依赖于硫酸铵浓度和超声时间的。在低硫酸铵浓度的情况下，超声同样的时间，随着硫酸铵浓度的增加，荧光强度(乙醇混合以裂解脂膜释放阿霉素)也随之增加；然而，在高硫酸铵浓度的情况下，mEVs受到强渗透压作用，对超声刺激更敏感，更易引起囊泡结构瓦解，特别是在2M的浓度下，荧光强度明显低于其他浓度。此外，当硫酸铵浓度低于1M时，随着超声时间的增加，荧光强度呈现先增强后不变的趋势。最终，本研究表明在1M的浓度下进行2分钟超声处理具有最佳效率。
此外，本研究进一步优化了聚碳酸酯膜挤出的次数。将超声后的mEVs挤出不同次数的PC膜后，采用动态光散射法测定mEVs(Dox-mEVs)的粒径大小：样品用PBS稀释后通过纳米粒度和ZETA电位分析仪(Malvern，UK)进行测量；同时使用荧光分光光度计测定阿霉素的自发荧光强度。结果如图5所示，超声处理后挤出3次足以减小mEVs的尺寸并增加载药能力。在挤出5次时荧光强度达到最高，同时该条件下mEVs的粒径最小。
阿霉素加入量对mEVs载药能力的影响：
对mEVs载药能力的量化包括载药量(mEVs装载的阿霉素浓度)和载药率(mEVs装载的阿霉素含量与初始加入的阿霉素含量的比)。结果如图6所示，在阿霉素加入量较低时，载药量与阿霉素加入量呈明显的正相关。随着阿霉素加入量的升高，由于无法装载额外的阿霉素(限于mEVs的最大装载能力)，载药量保持恒定。此外，在阿霉素加入量较低时载药率较高，随着阿霉素加入量的升高载药率开始下降，当加入的阿霉素浓度为200μM时载药率最高。
mEVs浓度对载药能力的影响：
除了阿霉素加入量的影响外，mEVs的浓度对载药效果也有影响。结果如图7所示，随着mEVs的浓度升高，样品中的可用于载药的囊泡含量增加，因此载药量(a)和载药率(b)均有提高。因此在200μM的阿霉素载药浓度下，加入10mg/mL的mEVs时载药率最高。
SEAL方法与传统方法的对比：
对照实验分为三组，被动孵育组中mEVs用PBS重悬后与阿霉素溶液在4℃、37℃下孵育1h或24h。直接超声组中mEVs与阿霉素溶液混合后在室温下超声2min，超声参数为功率26W，3mm尖端探头，30s开，30s关。冻融组中mEVs与阿霉素溶液于4℃孵育30min后在-80℃和37℃的水浴中进行三次冻融循环。结果如图8所示，与传统方法相比，SEAL方法制备的Dox-mEVs载药能力较强。基于传统方法所得到的Dox-mEVs的载药率低于10％，而SEAL方法制备的Dox-mEVs的载药率接近60％。此外，按照此方法得到的Dox-mEVs粒径小于传统方法处理得到的Dox-mEVs。
药物稳定性的测定：
采用常规透析袋法测定释药曲线来评价体外药物的稳定性。透析袋((Float-A-Lyzer G2，MWCO：8to 10kD，Spectrum，USA)中装入1mL Dox-mEVs(SEAL方法制备或被动孵育法制备)或游离的阿霉素，4℃下悬浮于500mL PBS中并置于磁力搅拌器上。结果如图9所示，相较于被动孵育法(阿霉素与mEVs混合后于4℃过夜)装载的阿霉素和游离的阿霉素，SEAL方法装载的阿霉素稳定性最强，在体外的释放速度缓慢，且随着时间的增加这种差异越来越显著。
综上，经SEAL方法制备的Dox-mEVs除了载药率提高之外，药物的稳定性也有所提高。
实施例2
mEVs用硫酸铵溶液重悬，置于冰上进行探头超声处理，探头超声处理的条件为功率26W，3mm尖端探头，30s开，30s关，4℃，时间为120s。然后置于4℃孵育1h。将孵育后的mEVs通过100nm的聚碳酸酯膜(PC膜)挤出5次，再用PBS透析过夜，建立主动载药所需的铵离子梯度。将透析过夜后的mEVs在室温下与米托蒽醌(MXT)孵育30min，以便获得载药牛奶外泌体(MXT-mEVs)。完成载药后用Sephadex G25尺寸排阻层析法除去MXT-mEVs中过量的药物。
通过紫外可见吸光光度法测定MXT的含量及载药率。首先配置浓度分别为5μM、10μM、20μM、50μM、100μM和200μM的MXT标准溶液。并将纯化后的MXT-mEVs样品加入96孔板，通过酶标仪测量400nm至800nm的吸收强度。根据图10的标准曲线计算出mEVs的载药率为47％。
综上，本发明以牛奶外泌体为模型，发展了一种细胞外囊泡的高效载药策略。采用低频探头超声及聚碳酸酯膜挤出的方法处理细胞外囊泡，可瞬时改变细胞外囊泡的膜通透性，促进主体溶液中硫酸铵向囊泡内腔流动，建立膜内外质子梯度，从而实现药物的主动装载，并通过与硫酸根形成沉淀提高进一步载药率和药物稳定性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)细胞外囊泡用硫酸铵溶液重悬后进行探头超声处理，并于4℃下孵育1h；
(2)将孵育后的细胞外囊泡通过聚碳酸酯膜进行多次挤出处理，再用PBS透析过夜以建立硫酸铵梯度；
(3)将透析过夜后的细胞外囊泡与药物孵育，以便获得载药细胞外囊泡。
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，步骤(1)中，探头超声处理的条件为：功率26W，3mm尖端探头，30s开，30s关，4℃，时间为120s。
3.如权利要求1所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，步骤(1)中，细胞外囊泡为牛奶外泌体。
4.如权利要求3所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，所述牛奶外泌体通过差速离心法、超速离心法结合等电点沉淀法和膜分离法提取。
5.如权利要求1所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，步骤(1)中，硫酸铵溶液的浓度为1M。
6.如权利要求1所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，步骤(2)中，挤出处理的次数为5次。
7.如权利要求1所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，步骤(2)中，聚碳酸酯膜为100nm。
8.如权利要求1所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，步骤(3)中，药物为蒽环类药物。
9.如权利要求8所述的细胞外囊泡主动载药方法，其特征在于，所述蒽环类药物包括阿霉素和米托蒽醌。
10.一种载药细胞外囊泡，其特征在于，通过权利要求1～9中任一项所述的方法获得。
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