CN106177986A - 一种脂质体‑聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脂质体‑聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用，所述脂质体‑聚合物载药纳米粒子包括三层结构，最内层为以两亲性阳离子聚合物作为载体包裹化疗药物形成的载药纳米粒子，中间层为吸附在所述载药纳米粒子表面的血小板抑制剂层，最外层为连接有肿瘤微环境响应性多肽的脂质双分子层。本发明的脂质体‑聚合物载药纳米粒子能够特异性靶向肿瘤组织，具有肿瘤微环境响应性，可以实现肿瘤血管通透性增加，而不影响正常组织或细胞部位的血管的功能，增强载药纳米粒子向肿瘤细胞的渗透和滞留，增强EPR效应，提高载药纳米粒子在肿瘤部位的富集，实现对肿瘤的更强杀伤性。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物技术领域，涉及一种脂质体-聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
临床癌症治疗的主要手段是手术治疗、放疗、化疗以及一些其他的辅助治疗，而根据近年来的数据显示，不超过30％的癌症病人有进行手术治疗的机会，因此，对于大部分癌症病人来说放化疗成为主要的治疗手段。由于放化疗过程中给病人带来的毒副作用特别大，因此寻求新的肿瘤治疗手段成为科研工作者的首要任务。随着纳米医学的飞快发展，纳米药物由于其特有的小尺寸效应，在肿瘤治疗方面显现出独特的优势，它能够在肿瘤部位大量富集，高效杀死肿瘤细胞，大大降低给药剂量的同时，降低非特异性释放，从而降低化疗药物的毒副作用。纳米药物是指药物与纳米载体形成的尺寸介于1-200nm的药物输送系统，包括聚合物纳米药物、无机纳米药物、纳米脂质体药物，及其它一些特殊纳米化药物如核酸纳米药物等。其具有以下几个方面的优势：1)改善药物水溶性，提高药物的透膜能力和生物利用度。2)提高药物的稳定性，实现可控释放，延长药物在体内的半衰期。3)引入具有不同刺激敏感的生物材料，例如pH、温度、酶等，实现药物在肿瘤部位的可控释放，减轻药物的副作用。4)实现药物在肿瘤部位的富集：由于肿瘤部位新生血管的不完整性，以及缺乏淋巴管的清除作用，导致纳米载体具有被动肿瘤靶向效应，即EPR(enhanced permeabilityand retention)效应；已经有多种纳米化药物被美国FDA批准上市，如阿霉素脂质体纳米颗粒，白蛋白紫杉醇等。
EPR(EnhancedPermeation Retention effect)效应是当代纳米医学的基础，但是有限的瘤内灌注和滞留是限制纳米医药发展的主要障碍。根据数据显示，药物纳米化对于提高药物在肿瘤部位的富集的程度不超过30％。与此同时，小尺寸纳米颗粒由于其有限的载药效率及复杂的制备工艺也在一定程度上限制了它在临床药物开发中的应用。
CN103893123A公开了一种脂质体-聚合物杂化纳米粒子，包括两亲性聚合物纳米粒子和包覆于所述两亲性聚合物纳米粒子表面的磷脂双分子层，以及包埋于两亲性聚合物纳米粒子与磷脂双分子层之间的水溶性不同的药物。虽然该发明的脂质体-聚合物杂化纳米粒子在血液中具有长循环时间，可以提高药物的疗效，降低毒副作用等，但是其最外层包覆的磷脂双分子层对于肿瘤组织的特异性识别作用较低，其靶向性仅仅是依靠纳米材料的纳米效应。
因此，在本领域中，期望得到一种具有特异性肿瘤组织识别作用并能够提高在肿瘤组织的渗透滞留效应的载药纳米粒子。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂质体-聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种脂质体-聚合物载药纳米粒子，所述脂质体-聚合物载药纳米粒子包括三层结构，最内层为以两亲性阳离子聚合物作为载体包裹化疗药物形成的载药纳米粒子，中间层为吸附在所述载药纳米粒子表面的血小板抑制剂层，最外层为连接有肿瘤微环境响应性多肽的脂质双分子层。
在本发明中，所述脂质体-聚合物载药纳米粒子能够在肿瘤微环境中特异性响应肿瘤局部高表达的酶，增强脂质体-聚合物载药纳米粒子的肿瘤靶向性，释放血小板抑制剂，诱导肿瘤血管通透性增加，同时使得释放出来的最内层即载药纳米粒子可以大量的穿透肿瘤血管内皮进入肿瘤组织，实现增强载药纳米粒子的抗肿瘤效应的目的。
优选地，所述两亲性阳离子聚合物为聚醚酰亚胺-聚乳酸共聚物(PEI-PLA)、聚醚酰亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PEI-PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)或聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)中的任意一种或至少两种的组合物。
优选地，所述化疗药物为亲水性化疗药物和/或疏水性化疗药物。
优选地，所述亲水性化疗药物为阿霉素盐酸盐和/或奥沙利铂。
优选地，所述疏水性化疗药物为阿霉素和/或紫杉醇。
在本发明中所述化疗药物包裹在两亲性阳离子聚合物中，例如亲水性化疗药物可以在包裹在两亲性阳离子聚合物形成的亲水内核中，而疏水性药物可以包裹在两亲性阳离子聚合物形成的疏水层中。
优选地，所述血小板抑制剂为但不限于氯吡格雷和/或血小板去除抗体R300，即也可以应用其他能够对血小板起到抑制或去除作用，提高肿瘤部位血管通透性的血小板抑制剂。
优选地，所述脂质双分子层为由磷脂和/或聚乙二醇修饰的磷脂与胆固醇构成的脂质双分子层。在本发明中脂质双分子层模拟细胞膜，增强脂质体-聚合物载药纳米粒子的生物相容性，减少被机体清除的概率。
优选地，所述磷脂为大豆卵磷脂和/或脑磷脂。
优选地，所述肿瘤微环境响应性多肽为肿瘤部位酶响应性多肽。
在本发明中，所述肿瘤微环境响应性多肽特异性地响应肿瘤部位微环境，例如响应于肿瘤部位高表达的酶，从而释放血小板抑制剂，提高肿瘤部位血管通透性，而对于正常组织或细胞部位的血管的功能不产生影响。
优选地，所述酶响应性多肽为基质金属蛋白酶-2(MMP-2)响应性多肽和/或基质金属蛋白酶-9(MMP-9)响应性多肽。
优选地，所述酶响应性多肽为DSK[C18]DSGPLGIAGQDSK[C18]DS。该酶响应性多肽具有C18链构成的疏水片段和DSGPLGIAGQDSK的多肽片段构成的亲水片段，其中[C18]为链长为18个碳原子的脂肪烃链。
酶响应性多肽在肿瘤微环境中特异性响应肿瘤局部高表达的酶，增强脂质体-聚合物载药纳米粒子的肿瘤靶向性，并且可以在响应肿瘤局部高表达的酶后，使脂质体-聚合物载药纳米粒子释放出血小板抑制剂，诱导肿瘤血管通透性增加，同时使得释放出来的最内层即载药纳米粒子可以大量的穿透肿瘤血管内皮进入肿瘤组织，提高载药纳米粒子的抗肿瘤效果。
此外，还可以对本发明中所用的磷脂材料进行特定选择使其具备pH响应性，以使得得到pH响应性的脂质体-聚合物载药纳米粒子，以响应于肿瘤部位的微酸性pH环境。
优选地，所述脂质体-聚合物载药纳米粒子的粒径为80-120nm，例如80nm、83nm、85nm、88nm、90nm、93nm、95nm、98nm、100nm、105nm、108nm、110nm、115nm、118nm或120nm。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将两亲性阳离子聚合物溶于有机溶剂中，向有机相中加入水，任选地加入亲水性化疗药物的水溶液，超声，形成初乳；
(2)向步骤(1)得到的初乳中加入表面活性剂水溶液，任选地加入疏水性化疗药物溶液，超声，形成复乳；
(3)在搅拌下，将步骤(2)得到的复乳加入到表面活性剂水溶液中，继续搅拌，而后除去有机溶剂，得到纳米粒子悬液；
(4)将步骤(3)得到的纳米粒子悬液与血小板抑制剂混合搅拌，然后离心得到表面吸附有血小板抑制剂的载药纳米粒子；
(5)将磷脂和/或聚乙二醇修饰的磷脂、环境响应性多肽和胆固醇溶于有机溶剂中，而后去除有机溶剂，在容器底部自组装得到脂质双分子层薄膜，向该容器中加入步骤(4)得到的表面吸附有血小板抑制剂的载药纳米粒子悬液，水化，超声得到脂质体-聚合物载药纳米粒子溶液体系，离心得到脂质体-聚合物载药纳米粒子；
其中，步骤(1)和步骤(2)所述任选地操作步骤不能同时选择不进行。
由于所述脂质体-聚合物载药纳米粒子包裹化疗药物分为三种情况，分别为包裹疏水性化疗药物的脂质体-聚合物载药纳米粒子、包裹疏水性化疗药物和亲水性化疗药物的脂质体-聚合物载药纳米粒子以及包裹亲水性化疗药物的脂质体-聚合物载药纳米粒子，因此所述制备方法分为三种情况，当步骤(1)中不进行任选地操作步骤，即不加入亲水性化疗药物的水溶液，而进行步骤(2)中任选地操作步骤，即加入疏水性化疗药物溶液，此时制备得到的是包裹有疏水性化疗药物的脂质体-聚合物载药纳米粒子；当步骤(1)中进行任选地操作步骤，即加入亲水性化疗药物的水溶液，而步骤(2)中不进行任选地操作步骤，即不加入疏水性化疗药物溶液，此时制备得到的是包裹有亲水性化疗药物的脂质体-聚合物载药纳米粒子；当步骤(1)和步骤(2)中均进行任选地操作步骤时，制备得到的是包裹有疏水性化疗药物和亲水性化疗药物的脂质体-聚合物载药纳米粒子。在上述制备方法中，如果步骤(1)和步骤(2)所述任选地操作步骤均选择不进行的话，那么制备得到的是不包裹化疗药物的脂质体-聚合物纳米粒子，因此步骤(1)和步骤(2)所述任选地操作步骤不能同时选择不进行。
在本发明中，本发明所述两亲性阳离子聚合物经过双乳化法进行自组装，在首次乳化自组装时形成亲水内核，亲水内核外为疏水链段形成的疏水部分，而后在第二次乳化自组装过程中，未进行自组装的部分两亲性阳离子聚合物的疏水端在疏水作用下与首次乳化形成的粒子的疏水端相聚集，而亲水端裸露在外层，因此两亲性阳离子聚合物经过双乳化形成了具有亲水内核，亲水内核外为疏水部分，疏水部分之外为亲水外壳的纳米粒子。在首次乳化自组装和第二次乳化自组装过程中可以分别实现亲水性化疗药物和疏水性化疗药物的包载。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷。
优选地，在步骤(1)中，相对于1mL有机溶剂，两亲性阳离子聚合物的用量为10-40mg，例如10mg、13mg、15mg、18mg、20mg、23mg、25mg、28mg、30mg、33mg、35mg、38mg或40mg。
优选地，在步骤(1)中，相对于1mL有机溶剂，水的加入量为100-250μL，例如100μL、130μL、150μL、180μL、200μL、220μL、240μL或250μL。
优选地，在步骤(1)中，所述亲水性化疗药物与两亲性阳离子聚合物的质量比为1:(5-20)，例如1:5、1:7、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20，优选1:10。
优选地，在步骤(1)中，相对于1mL有机溶剂，所述亲水性化疗药物的水溶液的加入量为100-200μL，例如100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL或200μL。
优选地，在步骤(1)中，所述超声为利用超声细细胞破碎仪在35％功率下超声3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min或8min。
优选地，在步骤(2)中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、吐温或胆酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，在步骤(2)中，所述表面活性剂水溶液的浓度为1-4％，例如1％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％或4％。
优选地，相对于步骤(1)中1mL有机溶剂，步骤(2)所述表面活性剂水溶液的加入量为2-5mL，例如2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL。
优选地，在步骤(2)中，所述疏水性化疗药物溶液为将疏水性化疗药物溶于有机溶剂中得到的溶液。
优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷。
优选地，在步骤(2)中，相对于1mL表面活性剂水溶液，疏水性化疗药物溶液的加入量为80-150μL，例如80μL、90μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL或150μL。
优选地，步骤(2)所述疏水性化疗药物与步骤(1)所述两亲性阳离子聚合物的质量比为1：(5-20)，例如1:5、1:7、1:9、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20，优选1:10。
优选地，在步骤(2)中，所述超声为利用超声细细胞破碎仪在40％功率下超声3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min或8min。
优选地，在步骤(3)中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、吐温或胆酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，在步骤(3)中，所述表面活性剂水溶液的浓度为0.6-1.0％，例如0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、或1.0％。
优选地，相对于步骤(1)中1mL有机溶剂，步骤(3)所述表面活性剂水溶液的加入量为8-15mL，例如8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL或15mL。
优选地，步骤(3)所述继续搅拌的时间为3-10min，例如3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。
在本发明中，步骤(3)所述除去有机溶剂利用旋转蒸发仪实现。
优选地，在步骤(4)中，所述纳米粒子悬液中与血小板抑制剂所述纳米粒子悬液中所含纳米粒子与血小板抑制剂的质量比为(50-100):1，例如50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1，优选80:1。
优选地，在步骤(4)中，所述离心为在1000-1500rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm)下离心3-8min(例如3min、4min、5min、6min、7min或8min)。
优选地，在步骤(5)中，所述磷脂和/或聚乙二醇修饰的磷脂与胆固醇的质量比为(50-70):1，例如50:1、55:1、60:1、65:1或70:1，优选60:1。
优选地，当同时使用磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂时，磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂的质量比为(45-65):1，例如45:1、48:1、50:1、53:1、55:1、58:1、60:1、63:1或65:1，优选60:1。
优选地，所述环境响应性多肽与胆固醇的质量比为1:(8-15)，例如1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:10.5、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15，优选1:10。
优选地，在步骤(5)中，所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷。
优选地，在步骤(5)中，所述水化的温度为30-37℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。
优选地，在步骤(5)中，所述水化的时间为5-20min，例如5min、8min、10min、12min、14min、16min、18min或20min。
优选地，在步骤(5)中，所述离心为在1000-1500rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm)下离心5-10min(例如5min、6min、7min、8min、9min或10min)。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子在制备抗肿瘤药物的纳米载药体系中的应用。本发明的脂质体-聚合物载药纳米粒子通过干扰肿瘤局部血小板的功能，增强肿瘤血管通透性，使得载药纳米粒子可以大量的穿透肿瘤血管内皮进入肿瘤组织，提高肿瘤部位靶向性以及对肿瘤的治疗效果。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的脂质体-聚合物载药纳米粒子能够特异性靶向肿瘤组织，具有肿瘤微环境响应性，可以实现肿瘤血管通透性增加，而不影响正常组织或细胞部位的血管的功能，增强载药纳米粒子向肿瘤细胞的渗透和滞留，增强EPR效应，提高载药纳米粒子在肿瘤部位的富集，所述脂质体-聚合物载药纳米粒子中各成分协同作用，实现对肿瘤的更强杀伤性。本发明的脂质体-聚合物载药纳米粒子采用双乳化法和薄膜超声法制备得到，制备方法简单高效，既适合实验室研究应用，又适合于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中脂质体-聚合物载药纳米粒子制备过程示意图；
图2为实施例1制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子的透射电镜图，其标尺为100nm；
图3为实施例1制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子的粒度分布图；
图4为本发明制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子通过尾静脉注入裸鼠乳腺癌肿瘤模型24小时后，肿瘤部位阿霉素富集情况的结果图；
图5为本发明制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子的抗肿瘤效果测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法制备脂质体-聚合物载药纳米粒子，具体包括以下步骤：
(1)将20mg的两亲性阳离子聚合物PEI-PLGA溶于1mL二氯甲烷中，向有机相中加入200μL水，利用超声细胞破碎仪在35％功率下超声5min，形成初乳；
(2)向步骤(1)得到的初乳中加入2mL浓度为2％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并逐滴加入200μL阿霉素药物的二氯甲烷溶液(含有阿霉素2mg)，利用超声细胞破碎仪在40％功率下超声用5min，形成复乳；
(3)在搅拌下，将步骤(2)得到的复乳加入到10mL浓度为0.6％的PVA水溶液中，继续搅拌3min，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到纳米粒子悬液；
(4)将步骤(3)得到的纳米粒子悬液(含200μg纳米粒子)与血小板去除抗体R300(2.5μg)混合搅拌，然后离心得到表面吸附有抗体R300的载药纳米粒子；
(5)将质量比为60:1:1:10的卵磷脂和聚乙二醇修饰的卵磷脂、MMP-2响应性多肽和胆固醇溶于有机溶剂中，而后去除有机溶剂，在容器底部自组装得到脂质双分子层薄膜，向该容器中加入步骤(4)得到的表面吸附有抗体R300的载药纳米粒子悬液，在37℃下水化10min，超声得到脂质体-聚合物载药纳米粒子溶液体系，1200rpm下离心5min得到脂质体-聚合物载药纳米粒子。
用醋酸双氧铀对本实施例制备得到的脂质体-聚合物载药纳米粒子的电镜样进行负染，利用透射电镜(美国FEI-Tecnai G2 20S-TWIN(200kV))对纳米颗粒的形貌进行表征，结果如图1所示，粒径约90nm左右。
利用激光粒度仪(英国Malvern-Zetasizer Nano ZS90)测得纳米粒子的平均粒径为156.3±10.3nm(图2)，分散度为0.21，zeta电位为-19.4±0.9，表明该溶液稳定性较好。
实施例2
在本实施例中，通过以下方法制备脂质体-聚合物载药纳米粒子，具体包括以下步骤：
(1)将10mg的两亲性阳离子聚合物PEI-PLGA溶于1mL二氯甲烷中，向有机相中加入100μL水，利用超声细胞破碎仪在35％功率下超声3min，形成初乳；
(2)向步骤(1)得到的初乳中加入5mL浓度为3％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并逐滴加入400μL阿霉素药物的二氯甲烷溶液(含有阿霉素2mg)，利用超声细胞破碎仪在40％功率下超声用8min，形成复乳；
(3)在搅拌下，将步骤(2)得到的复乳加入到8mL浓度为1％的PVA水溶液中，继续搅拌5min，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到纳米粒子悬液；
(4)将步骤(3)得到的纳米粒子悬液(含200μg纳米粒子)与血小板抑制剂氯吡格雷(2.5μg)混合搅拌，然后离心得到表面吸附有血小板抑制剂的载药纳米粒子；
(5)将质量比为50:1:1:10的卵磷脂和聚乙二醇修饰的卵磷脂、MMP-9酶响应性多肽和胆固醇溶于有机溶剂中，其中而后去除有机溶剂，在容器底部自组装得到脂质双分子层薄膜，向该容器中加入步骤(4)得到的表面吸附有血小板抑制剂的载药纳米粒子悬液，在37℃下水化5min，超声得到脂质体-聚合物载药纳米粒子溶液体系，1000rpm下离心10min得到脂质体-聚合物载药纳米粒子。
用醋酸双氧铀对本实施例制备得到的脂质体-聚合物载药纳米粒子的电镜样进行负染，利用透射电镜对纳米颗粒的形貌进行表征，粒径约120nm左右。
利用激光粒度仪测得纳米粒子的粒径为138.2±4.3nm，分散度为0.22，zeta电位为-18.1±0.4，表明该溶液稳定性较好。
实施例3
在本实施例中，通过以下方法制备脂质体-聚合物载药纳米粒子，具体包括以下步骤：
(1)将40mg的两亲性阳离子聚合物PEI-PLGA溶于1mL二氯甲烷中，向有机相中加入250μL水，加入100μL阿霉素盐酸盐的水溶液(含有阿霉素盐酸盐2mg)，利用超声细胞破碎仪在35％功率下超声8min，形成初乳；
(2)向步骤(1)得到的初乳中加入2mL浓度为1％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并逐滴加入200μL紫杉醇的二氯甲烷溶液(含有紫杉醇2mg)，利用超声细胞破碎仪在40％功率下超声用3min，形成复乳；
(3)在搅拌下，将步骤(2)得到的复乳加入到15mL浓度为0.8％的PVA水溶液中，继续搅拌10min，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到纳米粒子悬液；
(4)将步骤(3)得到的纳米粒子悬液(含200μg纳米粒子)与血小板去除抗体R300(4μg)混合搅拌，然后离心得到表面吸附有抗体R300的载药纳米粒子；
(5)将质量比为50:1:1:8的卵磷脂和聚乙二醇修饰的卵磷脂、MMP-2响应性多肽和胆固醇溶于有机溶剂中，而后去除有机溶剂，在容器底部自组装得到脂质双分子层薄膜，向该容器中加入步骤(4)得到的表面吸附有抗体R300的载药纳米粒子悬液，在37℃下水化20min，超声得到脂质体-聚合物载药纳米粒子溶液体系，1500rpm下离心5min得到脂质体-聚合物载药纳米粒子。
用醋酸双氧铀对本实施例制备得到的脂质体-聚合物载药纳米粒子的电镜样进行负染，利用透射电镜对纳米颗粒的形貌进行表征，平均粒径约80nm左右。
利用激光粒度仪测得纳米粒子的粒径为120.3±7.3nm，分散度为0.25，zeta电位为-18.7±0.5，表明该溶液稳定性较好。
实施例4
在本实施例中，考察脂质体-聚合物载药纳米粒子在肿瘤部位是富集情况，方法如下：
将实施例1制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子的生理盐水纳米体系通过尾静脉注入裸鼠乳腺癌肿瘤模型，24小时后观察肿瘤部位阿霉素富集情况。实验分为四组：生理盐水组(Saline)，阿霉素组(Dox)，聚合物纳米颗粒载阿霉素组(PLP-D)，本发明制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子组(PLP-D-R)。
由图4的结果可以看出，与生理盐水组相比，阿霉素组有少量的药物富集，而纳米化的阿霉素在肿瘤组织的富集量进一步增加，而本发明的脂质体-聚合物载药纳米粒子组中阿霉素的富集量远远超过其它各组，说明在本发明的载药纳米粒子各成分的相互配合下，可以显著提高纳米药物在肿瘤部位的富集，同时也说明肿瘤血管的通透性显著增加。
实施例5
在本实施例中，考察脂质体-聚合物载药纳米粒子的抗肿瘤效果，方法如下：
将实施例1制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子的缓冲溶液体系通过尾静脉注入裸鼠乳腺癌肿瘤模型MCF7中，每三天给药一次，设置7个实验组，即生理盐水组(Saline)，阿霉素组(Dox)，PEI-PLGA聚合物纳米颗粒组(PLPNP)，PEI-PLGA聚合物纳米颗粒载阿霉素组(PLP-D)，本发明制备的脂质体-聚合物载药纳米粒子组(PLP-D-R，其中R代表R300)。除生理盐水组和PEI-PLGA聚合物纳米颗粒组之外，其他组中给药标准为Dox：4mg/kg，R300：0.25mg/kg，每三天测一次肿瘤大小，结果如图5所示。
由图5的结果可知，与实施例4结果类似，与生理盐水组比，阿霉素组对肿瘤具有一定的抑制效果，纳米化的阿霉素组比单阿霉素组的治疗效果好一些，而本发明的脂质体-聚合物载药纳米粒子的治疗效果大大高于其它各组，说明本发明的载药纳米粒子可以大大提高纳米药物的抗肿瘤效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的脂质体-聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种脂质体-聚合物载药纳米粒子，其特征在于，所述脂质体-聚合物载药纳米粒子包括三层结构，最内层为以两亲性阳离子聚合物作为载体包裹化疗药物形成的载药纳米粒子，中间层为吸附在所述载药纳米粒子表面的血小板抑制剂层，最外层为连接有肿瘤微环境响应性多肽的脂质双分子层。
2.根据权利要求1所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子，其特征在于，所述两亲性阳离子聚合物为聚醚酰亚胺-聚乳酸共聚物、聚醚酰亚胺-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇-聚乳酸或聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的任意一种或至少两种的组合物；
优选地，所述化疗药物为亲水性化疗药物和/或疏水性化疗药物；
优选地，所述亲水性化疗药物为阿霉素盐酸盐和/或奥沙利铂；
优选地，所述疏水性化疗药物为阿霉素和/或紫杉醇。
3.根据权利要求1或2所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子，其特征在于，所述血小板抑制剂为氯吡格雷和/或血小板去除抗体R300；
优选地，所述脂质双分子层为由磷脂和/或聚乙二醇修饰的磷脂与胆固醇构成的脂质双分子层；
优选地，所述磷脂为大豆卵磷脂和/或脑磷脂；
优选地，所述肿瘤微环境响应性多肽为肿瘤部位酶响应性多肽；
优选地，所述酶响应性多肽为基质金属蛋白酶-2响应性多肽和/或基质金属蛋白酶-9响应性多肽；
优选地，所述酶响应性多肽为DSK[C18]DSGPLG-IAGQDSK[C18]DS。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子，其特征在于，所述脂质体-聚合物载药纳米粒子的粒径为80-120nm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将两亲性阳离子聚合物溶于有机溶剂中，向有机相中加入水，任选地加入亲水性化疗药物的水溶液，超声，形成初乳；
(2)向步骤(1)得到的初乳中加入表面活性剂水溶液，任选地加入疏水性化疗药物溶液，超声，形成复乳；
(3)在搅拌下，将步骤(2)得到的复乳加入到表面活性剂水溶液中，继续搅拌，而后除去有机溶剂，得到纳米粒子悬液；
(4)将步骤(3)得到的纳米粒子悬液与血小板抑制剂混合搅拌，然后离心得到表面吸附有血小板抑制剂的载药纳米粒子；
(5)将磷脂和/或聚乙二醇修饰的磷脂、环境响应性多肽和胆固醇溶于有机溶剂中，而后去除有机溶剂，在容器底部自组装得到脂质双分子层薄膜，向该容器中加入步骤(4)得到的表面吸附有血小板抑制剂的载药纳米粒子悬液，水化，超声得到脂质体-聚合物载药纳米粒子溶液体系，离心得到脂质体-聚合物载药纳米粒子；
其中，步骤(1)和步骤(2)所述任选地操作步骤不能同时选择不进行。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷；
优选地，在步骤(1)中，相对于1mL有机溶剂，两亲性阳离子聚合物的用量为10-40mg；
优选地，在步骤(1)中，相对于1mL有机溶剂，水的加入量为100-250μL；
优选地，在步骤(1)中，所述亲水性化疗药物与两亲性阳离子聚合物的质量比为1:(5-20)，优选1:10；
优选地，在步骤(1)中，相对于1mL有机溶剂，所述亲水性化疗药物的水溶液的加入量为100-200μL；
优选地，在步骤(1)中，所述超声为利用超声细细胞破碎仪在35％功率下超声3-8min。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、吐温或胆酸钠中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，在步骤(2)中，所述表面活性剂水溶液的浓度为1-4％；
优选地，相对于步骤(1)中1mL有机溶剂，步骤(2)所述表面活性剂水溶液的加入量为2-5mL；
优选地，在步骤(2)中，所述疏水性化疗药物溶液为将疏水性化疗药物溶于有机溶剂中得到的溶液；
优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷；
优选地，在步骤(2)中，相对于1mL表面活性剂水溶液，疏水性化疗药物溶液的加入量为80-150μL；
优选地，步骤(2)所述疏水性化疗药物与步骤(1)所述两亲性阳离子聚合物的质量比为1:(5-20)，优选1:10；
优选地，在步骤(2)中，所述超声为利用超声细细胞破碎仪在40％功率下超声3-8min。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、吐温或胆酸钠中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，在步骤(3)中，所述表面活性剂水溶液的浓度为0.6-1.0％；
优选地，相对于步骤(1)中1mL有机溶剂，步骤(3)所述表面活性剂水溶液的加入量为8-15mL；
优选地，步骤(3)所述继续搅拌的时间为3-10min；
优选地，在步骤(4)中，所述纳米粒子悬液中所含纳米粒子与血小板抑制剂的质量比为(50-100):1，优选80:1；
优选地，在步骤(4)中，所述离心为在1000-1500rpm下离心3-8min。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述磷脂和/或聚乙二醇修饰的磷脂与环境响应性多肽的质量比为(50-70):1，优选60:1；
优选地，当同时使用磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂时，磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂的质量比为(45-65):1，优选60:1；
优选地，所述环境响应性多肽与胆固醇的质量比为1:(8-15)，优选1:10；
优选地，在步骤(5)中，所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷；
优选地，在步骤(5)中，所述水化的温度为30-37℃；
优选地，在步骤(5)中，所述水化的时间为5-20min；
优选地，在步骤(5)中，所述离心为在1000-1500rpm下离心3-8min。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的脂质体-聚合物载药纳米粒子在制备抗肿瘤药物的纳米载药体系中的应用。
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