CN108421041A - 一种光动力治疗复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光动力治疗复合物及其制备方法与应用。该光动力复合物，由纳米粒子、血红蛋白和磷脂层组成；所述纳米粒子由式I和式II所示化合物自组装；所述血红蛋白修饰于所述纳米粒子表面；所述磷脂层包覆所述血红蛋白和纳米粒子。该复合物在化学小分子激活下能作为内部发光源并且提供充足的氧气，提高了活性氧产量。与传统的光动力疗法相比，本发明可对深层肿瘤组织进行治疗，在避免外部光源长时间照射对正常组织损伤的同时也解决了肿瘤内部缺氧而导致活性氧产量降低的问题，本发明在肿瘤的临床治疗方面具有应用价值。

Description

一种光动力治疗复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于光动力治疗领域，涉及一种光动力治疗复合物及其制备方法与应用。
背景技术
光动力疗法作为一种新型治疗方式已经被应用于临床治疗多种肿瘤、眼科以及皮肤相关的疾病。光动力疗法有三个重要的组成部分，即光敏剂、光源和氧分子。在合适波长的光源激发下，光敏剂可以将吸收的能量转移给周围的氧分子从而产生有细胞毒性的活性氧来杀死细胞。虽然光动力疗法是一种很有前景的治疗方法，但还是存在着一些因素限制了它在临床中的广泛应用。生物组织的吸收和散射效应使得外界光源不能到达深层肿瘤组织，而对外界光源的需求就限制了光动力疗法在深层肿瘤组织中的治疗效果。另外，肿瘤微环境常呈现缺氧状态，这显著降低了光动力疗法用于抗肿瘤治疗的效果。目前国内外研究者们只是单一解决了其中一个问题，但是能同时解决这两个问题以至充分发挥光动力疗法的抗肿瘤效果的研究工作还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种光动力治疗复合物及其制备方法与应用。
本发明提供的光动力复合物，由纳米粒子、血红蛋白和磷脂层组成；
所述纳米粒子由式I和式II所示化合物自组装而得；
所述血红蛋白修饰于所述纳米粒子表面；
所述磷脂层包覆所述血红蛋白和纳米粒子；
所述式I中，n为560-960。
上述复合物中，所述血红蛋白选自牛血红蛋白、猪血红蛋白和人血红蛋白中的至少一种；
所述血红蛋白的分子量为60-70kDa，具体为68kDa；
构成所述磷脂层的材料为POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇；
所述式I所示化合物与式II所示化合物的质量比为1-5：1，具体为2:1；
所述纳米粒子与所述血红蛋白的摩尔比为1：2-5；
所述纳米粒子与POPC的质量比为1：10-20；
所述POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇的质量比为5-6:3.5-4.5:0.2-0.3:0.2-0.3；具体为6:3.5:0.3:0.2。
所述自组装的方法具体包括：将所述式I和式II所示化合物溶解于溶剂中后于超纯水中进行超声分散后搅拌，过滤而得；
所述溶剂为四氢呋喃；
所述超声分散步骤中，超声功率为50-60W；超声时间为3-5min；具体为5min；
所述搅拌步骤中，温度为常温，如25℃；时间为8-20小时，具体为12小时；
所述过滤步骤中，滤膜孔径为0.2-0.22μm，具体为0.22μm；
本发明提供的制备所述复合物的方法，包括如下步骤：
1)将式I和式II所示化合物进行自组装，得到纳米粒子；
2)在酰胺缩合反应的条件下，将步骤1)所得纳米粒子与所述血红蛋白进行接触，得到中间产物；
3)将构成所述磷脂层的材料和胆固醇于溶剂中混合成膜后，加入步骤2)所得中间产物后摇动水化，将所得乳浊液用碳酸酯膜挤出，即得。
上述方法的步骤1)自组装步骤中，式I所示化合物与式II所示化合物的质量比为1-5：1，具体为2:1；所用溶剂为四氢呋喃；
所述自组装的方法具体包括：将所述式I和式II所示化合物溶解于所述溶剂中后于超纯水中进行超声分散后搅拌，过滤而得；
所述超声分散步骤中，超声功率为50-60W；超声时间为3-5min；具体为5min；
所述搅拌步骤中，温度为常温，如25℃；时间为8-20小时，具体为12小时；
所述过滤步骤中，滤膜孔径为0.2-0.22μm，具体为0.22μm；
所述步骤2)酰胺缩合反应步骤中，所用活化剂为NHS和EDC；
步骤1)所得纳米粒子与所述血红蛋白的摩尔比为1：2-5；
所述酰胺缩合反应在缓冲溶液中进行；所述缓冲溶液具体为pH值为7.4的PBS缓冲液；
反应温度为20-30℃，具体为25℃；
时间为12-36h，具体为24h；
所述步骤3)中，构成所述磷脂层的材料为POPC、DOPE和DOTAP；
所述纳米粒子与POPC的质量比为1：10-20；
所述POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇的质量比为5-6:3.5-4.5:0.2-0.3:0.2-0.3；具体为6:3.5:0.3:0.2；
所述溶剂为氯仿；
所述POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇在所述溶剂中的浓度均为8-12，具体为10mg/mL；
所述成膜步骤中，成膜方法为旋转蒸发除溶剂；
所述摇动水化步骤中，温度为25-37℃，具体为37℃；时间为1-2h，具体为2h；
所述挤出步骤中，所述聚碳酸酯膜的孔径为150-250nm，具体为200nm；
挤出次数为8-10次，具体为10次。
所述方法还可包括：在所述步骤3)挤出步骤之后，用葡聚糖凝胶G-200除去未包封的复合物。
另外，上述本发明提供的所述复合物在制备治疗肿瘤药物或治疗肿瘤药物制品或光动力治疗肿瘤药物或光动力治疗肿瘤药物制品中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种治疗肿瘤药物或治疗肿瘤药物制品或光动力治疗肿瘤药物或光动力治疗肿瘤药物制品，该光动力治疗肿瘤药物或光动力治疗肿瘤药物制品包括前述本发明提供的复合物。
所述治疗肿瘤药物或治疗肿瘤药物制品或光动力治疗肿瘤药物或光动力治疗肿瘤药物制品中，对各种肿瘤细胞均具有治疗作用，如肺癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、肝癌、肾癌和甲状腺癌等癌症肿瘤细胞均具有治疗作用。
所述治疗肿瘤药物或治疗肿瘤药物制品或光动力治疗肿瘤药物或光动力治疗肿瘤药物制品中还可包括化学激活剂。
具体的，所述化学激活剂可由鲁米诺和过氧化氢水溶液组成。
更具体的，所述过氧化氢水溶液的浓度为15-25mM，具体为20mM。
所述鲁米诺与所述复合物的用量比为0.015-0.025mmol：6750mg，具体可为0.02mmol：6750mg；
所述鲁米诺和过氧化氢的摩尔比为1:1-1.5，具体可为1：1.25。
本发明提供的复合物用于光动力治疗肿瘤的原理为：复合物中的牛血红蛋白催化过氧化氢分解生成氧气，氧气又将鲁米诺氧化生成带负电的活性中间体，该活性中间体可发出蓝色的光(最大发射425nm)，此波长范围的光可被复合物中式I所示的化合物MEH-PPV吸收，两者发生能量共振转移并发出最大发射为595nm的荧光，同时MEH-PPV可以敏化牛血红蛋白负载的氧气产生活性氧，活性氧可杀死肿瘤细胞。
本发明克服了现有技术中对于深层肿瘤组织治疗效果不佳的缺陷，一方面生物组织的吸收和散射效应使得外界光源不能到达深层肿瘤组织；另一方面肿瘤微环境常呈现缺氧状态，导致活性氧产量降低，提供了一种光动力治疗复合物及其制备方法和应用，该复合物在化学小分子激活下能作为内部发光源并且提供充足的氧气，提高了活性氧产量。与传统的光动力疗法相比，本发明可对深层肿瘤组织进行治疗，在避免外部光源长时间照射对正常组织损伤的同时也解决了肿瘤内部缺氧而导致活性氧产量降低的问题，本发明在肿瘤的临床治疗方面具有应用价值。
附图说明
图1为纳米粒子NPs的水合半径及透射电镜图。
图2为牛血红蛋白修饰的纳米粒子Hb-NPs在牛血红蛋白修饰前后表面电荷的变化图。
图3为光动力治疗复合物Hb-NPs@liposome的水合半径及透射电镜图。
图4为载氧光动力治疗复合物oxy-Hb-NPs@liposome和oxy-Hb-NPs的氧气释放曲线。
图5为鲁米诺与Hb-NPs的生物发光能量转移图。
图6为oxy-Hb-NPs和deoxy-Hb-NPs活性氧产量的差别图。
图7为光动力治疗复合物在化学激活剂激活下对HeLa细胞存活率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、光动力治疗复合物的制备
(一)、式I和式II所示化合物构成的纳米粒子的制备
将0.5mg式I所示化合物(n为560-960)与0.25mg式II所示化合物溶解在5mL的四氢呋喃中并利用超声使其完全溶解，然后将上述四氢呋喃溶液滴入15mL的超纯水中并进行超声分散。50W功率超声分散5min后继续在通风橱中25℃搅拌过夜得到式I和式II所示化合物构成的纳米粒子，然后利用0.22μm滤膜过滤，在滤液中得到上述目标纳米粒子NPs。
(二)、牛血红蛋白修饰的纳米粒子的制备
将上述得到的滤液中添加0.3mg的NHS和0.6mg的EDC，在pH＝7.4的PBS缓冲液中37℃反应6h，随后加入180mg的牛血红蛋白，步骤1)所得纳米粒子与牛血红蛋白的摩尔比为1：2，在pH＝7.4的PBS缓冲液中25℃反应24h。待反应完成后，采用100kDa超滤管进行超滤离心分离未反应的NHS、EDC和牛血红蛋白。得到牛血红蛋白修饰的纳米粒子Hb-NPs。牛血红蛋白修饰的纳米粒子置于4℃保存以备后续使用。
所用牛血红蛋白购自上海源聚生物科技有限公司，分子量约为68kDa。
(三)、磷脂包封Hb-NPs的脂质体的制备
将实验中使用的POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇分别溶解在氯仿中，制备浓度为10mg/mL的储备液待进一步使用。
将POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇以质量比为6:3.5:0.3:0.2混合在50mL茄形烧瓶中，通过旋转蒸发除去溶剂后，得到脂质薄膜。
然后在37℃下加入上述得到的Hb-NPs溶液摇动水化2h，得到的乳浊液用孔径为200nm的聚碳酸酯膜挤出10次。最后，用葡聚糖凝胶G-200除去未包封的Hb-NPs。得到磷脂包封Hb-NPs的脂质体即光动力治疗复合物Hb-NPs@liposome。得到的脂质体为融合脂质体，即遇到细胞后，脂质体会和细胞膜融合，释放出包封的Hb-NPs。采用100kDa超滤管对Hb-NPs@liposome进行浓缩，使得最终浓度为80mg/mL。
实施例2、光动力治疗复合物的表征
(一)、粒径及zeta电位表征
采用动态光散射仪和透射电子显微镜对得到的纳米粒子NPs(图1)和光动力治疗复合物Hb-NPs@liposome(图3)的结构进行表征。将上述牛血红蛋白修饰的纳米粒子Hb-NPs使用动态光散射仪表征表面电荷变化(图2)。
从图1中可以看出，纳米粒子NPs分布均一，呈球状粒子，水合半径在20nm左右。
从图2中可以看出，修饰了牛血红蛋白后，纳米粒子的表面电荷由原来的-40mV变为-17mV，说明修饰成功。
从图3中可以看出，光动力治疗复合物Hb-NPs@liposome呈均匀球状，水合半径在160nm左右。
(二)、氧气结合能力表征
向所述光动力治疗复合物Hb-NPs@liposome溶液中加入抗坏血酸钠(两倍于Hb的摩尔比)，并持续通入氩气4h，得到除氧光动力治疗复合物deoxy-Hb-NPs@liposome。然后在可见光照射下，向其中持续通入氧气2h，将其转化为载氧光动力治疗复合物oxy-Hb-NPs@liposome。
将得到的oxy-Hb-NPs@liposome利用液相氧测定系统进行氧气释放测试。向2mLpH＝7.4的除氧PBS缓冲液中快速加入0.2mL oxy-Hb-NPs@liposome溶液，用液相氧测定系统记录溶解氧的量。oxy-Hb-NPs@liposome的放氧量与时间的关系如图4所示。
从图4中可以看出，光动力治疗复合物具备载氧能力，用磷脂包封后，氧气释放速率显著降低，说明磷脂包封更有利于复合物保持稳定。
实施例3、光动力治疗复合物在化学激活剂激活下用于肿瘤细胞杀伤
(一)、鲁米诺与Hb-NPs的生物发光能量转移光谱测定
在805μL pH9.0碳酸钠缓冲液中加入20μL 20mM鲁米诺和150μL 45mg/mLHb-NPs，涡旋5s后加入25μL 20mM过氧化氢水溶液涡旋2s立即测发光光谱，光谱范围是300nm～700nm。见图5。
从图5中可以看出，鲁米诺与Hb-NPs之间可以发生有效的能量转移。
(二)、活性氧的测定
还原态2,7-二氯荧光素(DCFH)的活化：在500μL 2,7-二氯荧光素二乙酯(DCFH-DA)中加入2mL 0.01M NaOH后室温放置30min，再加入10mL磷酸缓冲液(25mM，pH＝7.4)，混匀冰上暗处储存待用。
向100μL活化后的DCFH溶液(40mM)加入90μL Hb-NPs(15mg/mL)，4μL鲁米诺(20mM)和5μL过氧化氢(20mM)，立即用酶标仪每隔1min测一次524nm的荧光光谱(图6)，激发波长为488nm。
从图6中可以看出，Hb-NPs在化学激活剂激活下能产生活性氧，且oxy-Hb-NPs的活性氧产量要高于deoxy-Hb-NPs。
(三)、HeLa细胞的培养和传代
HeLa细胞培养条件：在60mm细胞培养皿中，加入3mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。HeLa为贴壁细胞，待细胞长到80％时，用1mL0.25％的胰蛋白酶液消化3min(可在显微镜下动态观察来调节消化时间)，用2mL含10％胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶作用，反复吹打皿底细胞使其充分分散。1000rpm离心5min，弃去上清液，在细胞沉淀中加入新鲜培养基，吹打均匀后以1:3的比例传到新培养皿中继续培养待用。
(四)、HeLa细胞存活率分析
本实验采用MTT法进行细胞活力分析。取对数生长期的HeLa细胞利用细胞计数板计数后种于96孔U型细胞培养板，HeLa细胞密度为6×103个/孔，放入5％CO2、37℃恒温培养箱培养过夜使其贴壁，然后加入不同浓度的Hb-NPs@liposome(1-8mg/mL)，每个浓度做平行6个孔，每孔终体积为100μL，然后放入37℃恒温培养箱作用12h。取出96孔板，向其中加入化学激活剂(终浓度分别为0.4mM鲁米诺和0.5mM过氧化氢)，室温暗处作用5min。继续将96孔板放入5％CO2、37℃恒温培养箱培养24h后，弃去培养基，向每孔加入100μL 1mg/mL MTT(溶于PBS中)，37℃继续培养4h，弃去上清液，每孔加入100μL DMSO，将96孔板放入酶标仪中，先振荡10min使生成的蓝紫色颗粒甲瓒充分溶解，测定570nm处的吸光度值。根据以下公式计算细胞存活率CR，并绘制细胞存活曲线，见图7。
其中A为实验组吸光度值，A0为不做任何处理控制组的吸光度值。
从图7中可以看出，在Hb-NPs@liposome浓度相同时，加入化学激活剂的细胞存活率显著下降，且载氧光动力治疗复合物oxy-Hb-NPs@liposome作用后的细胞存活率要低于除氧光动力治疗复合物deoxy-Hb-NPs@liposome，即光动力治疗复合物oxy-Hb-NPs@liposome有抗肿瘤细胞作用。

Claims (10)

1.一种复合物，由纳米粒子、血红蛋白和磷脂层组成；
所述纳米粒子由式I和式II所示化合物自组装而得；
所述血红蛋白修饰于所述纳米粒子表面；
所述磷脂层包覆所述血红蛋白和纳米粒子；
所述式I中，n为560-960。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述血红蛋白选自牛血红蛋白、猪血红蛋白和人血红蛋白中的至少一种；
所述血红蛋白的分子量为60-70kDa或68kDa；
构成所述磷脂层的材料为POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇；
所述式I所示化合物与式II所示化合物的质量比为1-5：1或2:1；
所述纳米粒子与所述血红蛋白的摩尔比为1：2-5；
所述纳米粒子与POPC的质量比为1：10-20；
所述POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇的质量比为5-6:3.5-4.5:0.2-0.3:0.2-0.3或6:3.5:0.3:0.2。
3.一种制备权利要求1或2所述复合物的方法，包括如下步骤：
1)将式I和式II所示化合物进行自组装，得到纳米粒子；
2)在酰胺缩合反应的条件下，将步骤1)所得纳米粒子与所述血红蛋白进行反应，得到中间产物；
3)将构成所述磷脂层的材料和胆固醇于溶剂中混合成膜后，加入步骤2)所得中间产物后水化，将所得乳浊液用碳酸酯膜挤出，即得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)自组装步骤中，式I所示化合物与式II所示化合物的质量比为1-5：1，具体为2:1；所用溶剂为四氢呋喃；
所述自组装的方法具体包括：将所述式I和式II所示化合物溶解于所述溶剂中后于超纯水中进行超声分散后搅拌，过滤而得；
所述超声分散步骤中，超声功率为50-60W；超声时间为3-5min；具体为5min；
所述搅拌步骤中，温度为常温；时间为8-20小时，具体为12小时；
所述过滤步骤中，滤膜孔径为0.2-0.22μm，具体为0.22μm；
所述步骤2)酰胺缩合反应步骤中，所用活化剂为NHS和EDC；
步骤1)所得纳米粒子与所述血红蛋白的摩尔比为1：2-5；
所述酰胺缩合反应在缓冲溶液中进行；所述缓冲溶液具体为pH值为7.4的PBS缓冲液；
反应温度为20-30℃或25℃；
反应时间为12-36h或24h。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，构成所述磷脂层的材料为POPC、DOPE和DOTAP；
所述纳米粒子与POPC的质量比为1：10-20；
所述POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇的质量比为5-6:3.5-4.5:0.2-0.3:0.2-0.3或6:3.5:0.3:0.2；
所述溶剂为氯仿；
所述POPC、DOPE、DOTAP和胆固醇在所述溶剂中的浓度均为8-12mg/mL或10mg/mL；
所述成膜步骤中，成膜方法为旋转蒸发除溶剂；
所述水化步骤中，温度为25-37℃或37℃；时间为1-2h；
所述挤出步骤中，所述聚碳酸酯膜的孔径为150-250nm或200nm；
挤出次数为8-10次。
6.权利要求1或2任一所述复合物在制备治疗肿瘤药物或治疗肿瘤药物制品或光动力治疗肿瘤药物或光动力治疗肿瘤药物制品中的应用。
7.一种治疗肿瘤药物或药物制品，包括权利要求1或2所述复合物；或者，
一种光动力治疗肿瘤药物或药物制品，包括权利要求1或2所述复合物。
8.根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的药物或药物制品，其特征在于：所述药物或药物制品中还包括化学激活剂。
9.根据权利要求6-8中任一所述的应用或药物或药物制品，其特征在于：所述化学激活剂由鲁米诺和过氧化氢水溶液组成。
10.根据权利要求9所述的药物或药物制品，其特征在于：所述过氧化氢水溶液的浓度为15-25mM或20mM；
所述鲁米诺与权利要求1或2所述复合物的用量比为0.015-0.025mmol：6750mg或0.02mmol：6750mg；
所述鲁米诺和过氧化氢的摩尔比为1:1-1.5或1：1.25。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110974959A (zh) * 2019-07-09 2020-04-10 北京工商大学 双模式共轭聚合物纳米颗粒、其制备方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106177986A (zh) * 2016-08-16 2016-12-07 国家纳米科学中心 一种脂质体‑聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用
CN106519588A (zh) * 2009-11-09 2017-03-22 华盛顿大学商业化中心 官能化发色聚合物点及其生物共轭体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106519588A (zh) * 2009-11-09 2017-03-22 华盛顿大学商业化中心 官能化发色聚合物点及其生物共轭体
CN106177986A (zh) * 2016-08-16 2016-12-07 国家纳米科学中心 一种脂质体‑聚合物载药纳米粒子及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIQIN XIONG: "Recent Advances on Near-Infrared-Emitting Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] Polymer Dots for in vivo Imaging", 《GEN. CHEM.》 *
MONA DOSHI等: "Development and characterization of conducting polymer nanoparticles for photodynamic therapy in vitro", 《PHOTODIAGNOSIS AND PHOTODYNAMIC THERAPY》 *
YANRONG ZHANG等: "Small Molecule-Initiated Light-Activated Semiconducting Polymer Dots: An Integrated Nanoplatform for Targeted Photodynamic Therapy and Imaging of Cancer Cells", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
ZHENYU LUO等: "Self-Monitoring Artificial Red Cells with Sufficient Oxygen Supply for Enhanced Photodynamic Therapy", 《SCIENCE REPORTS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110974959A (zh) * 2019-07-09 2020-04-10 北京工商大学 双模式共轭聚合物纳米颗粒、其制备方法及其应用

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