CN102362861B - 一种空心核壳结构复合纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种空心核壳结构复合纳米粒子及其制备方法，所述纳米粒子由内到外依次为阳离子脂质体、PLGA、中性脂质体以及最外层的可生物降解聚合物。其制备通过先两步乳化、再对粒子进行固化、清洗等后处理，最终将制得的纳米粒子收集于缓冲溶液中储存。该方法新颖简单且易操作，属于物理包埋方法，因此对包埋的siRNA基本不产生任何损害，粒子尺寸能保持恒定。该方法制备的载体包埋量大且包埋率高(78-82％)，在药物释放领域具有很广泛的应用前景。

Description

一种空心核壳结构复合纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物可降解高分子材料领域和药物释放领域，特别是涉及一种生物相容具有空心核壳结构的复合纳米粒子的制备。

背景技术

自从人们发现通过RNA干扰可以有效的抑制某些特定基因的活动以后，合成小片段的干扰RNA(siRNA)-干扰RNAi已经成为治疗很多疾病的希望所在。然而，siRNA到达靶向细胞是否安全和有效严重阻碍了它的广泛应用。由于聚阴离子性和大分子特性，未经修饰的siRNA不能很便利的穿过细胞膜因此需要特定的释放载体去促进细胞吸收并实现细胞间的活性传递。研究者也希望利用这些载体来提高siRNA的药理学特性，如降低其血清核酸的感应性、减少肾吸收、降低被单核巨噬吸收的机会。

在大部分已发展的RNAi释放载体中，阳离子脂质体与聚合物能高效的与siRNA自组装形成纳米复合体(脂质体或聚阳离子体)，而且表现出很好的释放siRNA的潜能。然而，这些材料中的大部分都会引起很多问题，例如毒性、免疫或炎症反应及血浆不稳定性。在体内环境中，为了更好的保护siRNA和复合体，最理想的方法是将siRNA包裹到一种具有中性表面的纳米粒子中。为此，已经实施了几种方法，包括纳米复合物的聚乙二醇化(例如键合聚乙二醇)和聚阳离子的脂质体包封(形成聚脂质体)。

发明内容

本发明针对现有技术的问题，开发出一种简单且强有效的用于释放siRNA的纳米粒子，同时具有聚乙醇化脂质体和PLGA纳米粒子的特性。不同于之前报道的杂化脂质体-聚合物体系，本发明提出一种具有四种不同组分的带有区域化电荷的空心核/壳脂质体-聚合物-脂质体杂化纳米结构及其制备方法。

本发明的目的之一在于提供一种空心核壳结构复合纳米粒子，所述纳米粒子由内到外依次为阳离子脂质体、PLGA、中性脂质体以及最外层的可生物降解聚合物。所述纳米粒子包埋有siRNA。

带有正电荷的脂质体层形成内层空的核，中间层是疏水的PLGA层，再外面一层是相对中性的脂质体，最外面一层是PEG。最外面一层连接脂质体的PEG层的目的是使得粒子可避开免疫系统，提高粒子在整个过程中的稳定性，减慢聚合物降解速率和药物释放速率。中间的PLGA聚合物层是为了形成一个屏障使得siRNA可以持久释放同时还可以装载一些不溶水的药物。最里层由阳离子脂质体组成的正电荷核，能够比单独使用PLGA具有更高的装载siRNA的效率。

本发明所述的脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。生物学定义：当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡，称为脂质体。药剂学定义：系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。本发明所述阳离子脂质体优选1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸。所述中性脂质体优选卵磷脂、DPPC、DPPE中的一种或几种，优选卵磷脂。

本发明所述PLGA是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。乳酸比乙醇酸疏水性强，相对而言，乳酸含量较大的PLGA亲水性弱，吸水少，降解更加缓慢。PLGA的降解速度很大程度上取决于乳酸和乙醇酸的摩尔比。本发明PLGA特性粘度0.20-0.74dL/g，链段摩尔比L∶G＝90∶10～40∶60。

所述可生物降解聚合物为PEO、PVA、PVAc、PLA、PCL、PEG、DSPE-PEGm中的一种或几种，其重均分子量为10万～150万。所述DSPE-PEGm中PEG的重均分子量为500～5000。

本发明的另一目的在于提供一种空心核壳结构复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)第一步乳化：首先将PLGA和阳离子脂质体分别按质量体积比1～10％、0.5～5％溶解到挥发性有机溶剂中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为0.5～5％的水溶液B；按体积比1∶5～1∶15将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行乳化形成乳液；

(2)第二步乳化：将可生物降解聚合物和中性脂质体分别按质量体积比1～5％、0.5～4％制成水溶液C；按体积比1∶10～5∶2将(1)中得到的乳液加入水溶液C中，进行乳化形成双乳液D；

(3)粒子固化：按体积比1∶1～1∶25将双乳液D与水溶液C混合搅拌至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

所述的步骤(3)后任选进行：(4)粒子的后处理和收集：对得到的粒子进行清洗，清洗后将粒子收集到缓冲溶液中；所述的缓冲溶液优选磷酸盐缓冲溶液。清洗过程可以将未挥发完全的溶剂和游离分子清洗彻底。

本发明所述的清洗采用离心式过滤器进行，截留分子量设为100KDa。

本发明所述步骤(3)中至少搅拌3小时。

本发明所述的挥发性有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、氯仿、四氢呋喃、乙醚中的一种或几种，优选为二氯甲烷。

超声乳化是利用强超声波作用使液体中的不溶固体(或其他液体)粉碎成微粒并与周围液体充分混合形成乳化液的技术。本发明所述的乳化优选超声乳化。

本发明所述的质量体积比是指溶质质量(g)与溶剂体积(mL)的比值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

该方法新颖简单且易操作，属于物理包埋方法，因此对包埋的siRNA基本不产生任何损害。得到的纳米粒子在磷酸盐缓冲溶液中直径为(225±8)nm，而细胞培养液中的纳米粒子尺寸增加到(262±10)nm，粒子在两种溶液中尺寸都能保持恒定。制备该方法制备的载体包埋量大(每毫克PLGA大约为364-383pmolsiRNA)且包埋率高(78-82％)，在药物释放领域具有很广泛的应用前景。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。

具体实施方式

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例一：

(1)第一步乳化：首先将PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸分别按质量体积比2％、1.5％溶解到二氯甲烷中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为2％的水溶液B；按体积比1∶5～1∶10将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行超声乳化形成乳液；

(2)第二步乳化：将DSPE-PEGm和卵磷脂分别按质量体积比3％、1.5％制成水溶液C；按体积比3∶5将(1)中得到的乳液加入水溶液C中，进行超声乳化形成双乳液D；所述DSPE-PEGm中PEG的重均分子量为500～5000。

(3)粒子固化：按体积比1∶5将双乳液D与水溶液C混合搅拌3小时至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

实施例二：

(1)第一步乳化：首先将PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸分别按质量体积比1％、5％溶解到丙酮中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为3％的水溶液B；按体积比1∶5将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行超声乳化形成乳液；

(2)第二步乳化：将PCL和DPPC分别按质量体积比5％、4％制成水溶液C；按体积比1∶10将(1)中得到的乳液加入水溶液C中，进行超声乳化形成双乳液D；

(3)粒子固化：按体积比1∶25将双乳液D与水溶液C混合搅拌10小时至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

(4)粒子的后处理和收集：对得到的粒子进行清洗，清洗后将粒子收集到磷酸盐缓冲溶液中。

实施例三：

(1)第一步乳化：首先将PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸分别按质量体积比10％、0.5％溶解到四氢呋喃中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为0.5％的水溶液B；按体积比1∶15将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行超声乳化形成乳液；

(2)第二步乳化：将PVAc和卵磷脂分别按质量体积比1％、2.5％制成水溶液C；按体积比5∶2将(1)中得到的乳液加入水溶液C中，进行超声乳化形成双乳液D；

(3)粒子固化：按体积比1∶1将双乳液D与水溶液C混合搅拌5小时至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

(4)粒子的后处理和收集：对得到的粒子进行清洗，清洗后将粒子收集到磷酸盐缓冲溶液中。

实施例四：

(1)第一步乳化：首先将PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸分别按质量体积比6％、1％溶解到乙醚中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为5％的水溶液B；按体积比1∶12将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行超声乳化形成乳液；

(2)第二步乳化：将PEO和DPPE分别按质量体积比3.2％、0.5％制成水溶液C；按体积比1∶1将(1)中得到的乳液加入水溶液C中，进行超声乳化形成双乳液D；

(3)粒子固化：按体积比1∶13将双乳液D与水溶液C混合搅拌15小时至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

实施例五：

(1)第一步乳化：首先将PLGA和1，2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸分别按质量体积比5.5％、4％溶解到氯仿中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为3％的水溶液B；按体积比1∶7将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行超声乳化形成乳液；

(2)第二步乳化：将PEG和卵磷脂分别按质量体积比1.5％、3％制成水溶液C；按体积比3∶2将(1)中得到的乳液加入水溶液C中，进行超声乳化形成双乳液D；

(3)粒子固化：按体积比1∶15将双乳液D与水溶液C混合搅拌8小时至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

(4)粒子的后处理和收集：对得到的粒子进行清洗，清洗后将粒子收集到磷酸盐缓冲溶液中。

本发明所述可生物降解聚合物的重均分子量为10万～150万，所述PLGA特性粘度0.20-0.74dL/g，链段摩尔比L∶G＝90∶10～40∶60，均可实现其相应功能。

申请人声明，所属技术领域的技术人员在上述实施例的基础上，将上述实施例某组分的具体含量点值，与发明内容部分的技术方案相组合，从而产生的新的数值范围，也是本发明的记载范围之一，本申请为使说明书简明，不再罗列这些数值范围。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的制备方法，但本发明并不局限于上述制备方法，即不意味着本发明必须依赖上述制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用的具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种空心核壳结构复合纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子由内到外依次为阳离子脂质体、PLGA、中性脂质体以及最外层的可生物降解聚合物；所述纳米粒子包埋有siRNA；

所述阳离子脂质体为1,2-二(十四酸)甘油酯-sn-丙三氧基-乙基胆碱磷酸；所述PLGA特性粘度0.20-0.74dL/g，链段摩尔比L:G=90:10～40:60。

2.如权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述中性脂质体为卵磷脂、DPPC、DPPE中的一种或几种。

3.如权利要求2所述的纳米粒子，其特征在于，所述中性脂质体为卵磷脂。

4.如权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述可生物降解聚合物为PEO、PVA、PVAc、PLA、PCL、PEG、DSPE-PEGm中的一种或几种，其重均分子量为10万～150万。

5.如权利要求4所述的纳米粒子，其特征在于，所述DSPE-PEGm中PEG的重均分子量为500～5000。

6.一种如权利要求2-5之一所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）第一步乳化：首先将PLGA和阳离子脂质体分别按质量体积比1～10%、0.5～5%溶解到挥发性有机溶剂中形成有机溶液A；同时制备siRNA质量体积比为0.5～5%的水溶液B；按体积比1:5～1:15将水溶液B逐滴加入有机溶液A中，进行乳化形成乳液；

（2）第二步乳化：将可生物降解聚合物和中性脂质体分别按质量体积比1～5%、0.5～4%制成水溶液C；按体积比1:10～5:2将（1）中得到的乳液加入水溶液C中，进行乳化形成双乳液D；

（3）粒子固化：按体积比1:1～1:25将双乳液D与水溶液C混合搅拌至二氯甲烷挥发完全，固化得到复合纳米粒子。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）后任选进行：

（4）粒子的后处理和收集：对得到的粒子进行清洗，清洗后将粒子收集到缓冲溶液中。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中至少搅拌3小时。