CN110448541B - 双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用 - Google Patents

双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110448541B
CN110448541B CN201910713267.8A CN201910713267A CN110448541B CN 110448541 B CN110448541 B CN 110448541B CN 201910713267 A CN201910713267 A CN 201910713267A CN 110448541 B CN110448541 B CN 110448541B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
nanoparticle
nanoparticles
icg
functionalized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910713267.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110448541A (zh
Inventor
吴传斌
黄瑶
彭婷婷
俸小芊
潘昕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN201910713267.8A priority Critical patent/CN110448541B/zh
Publication of CN110448541A publication Critical patent/CN110448541A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110448541B publication Critical patent/CN110448541B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0004—Osmotic delivery systems; Sustained release driven by osmosis, thermal energy or gas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
    • A61M37/0015—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin by using microneedles
    • A61M2037/0046—Solid microneedles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种双功能化纳米粒以及载有该双功能化纳米粒的可溶性微针及制备方法和应用。所述双功能化纳米粒通过加入阳离子磷脂以及透明质酸修饰，制备载药量更高的且具有双重靶向性。本发明的功能化纳米粒由聚乳酸‑羟基乙酸共聚物，维生素E琥珀酸酯，阳离子磷脂，光敏剂，化疗药物组成。本发明的可溶性微针由载纳米粒针尖和基底组成，所述针尖材料为聚乙烯醇和聚维酮，所述基底材料为聚乙烯吡咯烷酮。本发明通过分步离心法制备的载双功能化纳米粒可溶性微针与传统的瘤内注射以及尾静脉注射相比，具有更强的光热以及肿瘤抑制效果，为光热与化疗联合治疗浅表肿瘤提供了一个有效的方案。

Description

双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体地，涉及一种双功能化纳米粒、以及相应的可溶性微针及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤已成为危害人类健康和导致人类死亡的主要疾病。浅表肿瘤(Superficialtumor,ST)是最为常见的一类肿瘤。而乳腺癌是临床上最常见的女性恶性肿瘤之一，发病率高，且近年来呈现年轻化的趋势。化疗，手术和放疗是肿瘤治疗的三大传统治疗方式，随着科学技术的发展和对肿瘤研究的深入，一些新的治疗手段如光疗也显现出了良好的抗肿瘤效果。但是，单一的治疗方式往往存在如系统毒性，耐药性，作用效果不显著等缺陷，因此采用两种及以上的疗法联合治疗，从多途径诱导肿瘤细胞凋亡，具有广阔的应用前景。其中光热治疗利用聚集在肿瘤内的光敏剂作为外源性能量吸收剂，将近红外光能转化为热能以杀死肿瘤细胞，因其可控以及精准治疗性获得了广泛的关注。在众多已报道的光敏剂中，吲哚菁绿ICG凭借其良好的荧光成像性能、光热转化能力和生物相容性，是唯一被FDA批准用于临床的近红外荧光造影剂。但ICG在血浆中的半衰期短，易被光或热降解，易失活等问题，尤其是ICG在水溶液中的聚集和不可逆降解极大地降低了它的荧光量子效率，从而影响其光热效率。这些问题严重限制了ICG在医学影像和PTT中的应用。虽然目前已有多种体系包括如共价连接，物理包封等致力于解决此类问题，但由于ICG为亲水性的带负电化合物，其包封率往往较低。
在众多的纳米给药系统中，PLGA纳米给药系统因PLGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，已被FDA批准用于人体。然而单纯的PLGA纳米粒往往因其表面疏水性而存在诸多问题，例如载药量低，靶向性差等。因此越来越多的研究开始聚集于混合PLGA纳米给药系统的设计，以结合不同材料的优势来提高制剂的稳定性和达到更好的疗效。
微针经皮给药系统结合了传统注射给药以及局部给药治疗的优势，并且能够将药物突破角质层较均匀的分散在浅表肿瘤组织内，实现了1+1>2的效果。常见的微针分为固体实心微针、涂层微针、空心微针和可溶性微针四种。可溶性微针一般由生物溶解或降解的高分子材料制备而成，结构分为起支撑微针阵列作用的基底层和装载药物的针尖层。在微针阵列刺入皮肤后，药物随着针尖溶解而释放到皮肤中。不同于固体微针由金属或硅组成，可溶性微针的聚合物不仅可以充当基质，还可以包裹药物，增加了微针的载药量。可溶性微针(Dissolving micrneedle,DMN)具有较高的载药量，可在生理环境下快速溶解，患者顺应性较高，目前，MNs已被用来传递抗体、疫苗、化疗药物和光敏剂等以发挥抗肿瘤的作用成为当前的研究热点。但现有的研究还存在以下问题：(1)所用的光敏剂或纳米载体材料为不可降解的材料，生物相容性差；(2)采用单纯的化疗药物需要频繁给药才能达到有效的肿瘤治疗效果；(3)将化疗药物以游离形式包载于MNs，药物在MNs溶解后快速大量释放，存在药物倾泻的风险。因此，设计一种将化疗药物和光敏剂共载的可生物降解纳米给药系统，再将其装载于 DMNs中，用于ST的治疗，对于减少给药次数，提高治疗效果和使用安全性具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种双功能化纳米粒及其制备方法，该双功能化纳米粒能够实现对光敏剂的高包封率。
具体技术方案如下：
一种双功能化纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将油相溶液与化疗药物混合得到溶液A，所述油相溶液为聚羟基乙酸聚乳酸共聚物PLGA及阳离子磷脂DOTAP的易挥发性有机溶剂溶液；
(2)在水浴条件和磁力搅拌的条件下，将水相溶液与光敏剂溶液混合得到溶液B，所述水相溶液为维生素E琥珀酸酯的醇溶液；
(3)将溶液A缓慢滴入溶液B中，滴加完成后继续搅拌，以形成均一纳米粒溶液；
(4)将制备好的纳米粒溶液离心，洗涤，重悬，得到单功能化纳米粒溶液；
(5)将透明质酸溶液在搅拌下滴入制备好的所述单功能化纳米粒溶液中，持续搅拌均匀，即得双功能化纳米粒。
优选的，所述化疗药物为难溶性抗肿瘤药物，所述光敏剂为带负电的花菁染料溶液。优选的，所述难溶性抗肿瘤药物为PTX；优选的，所述光敏剂为ICG。
优选的，所述油相溶液中PLGA的浓度为2.8～3.6mg/ml，所述PLGA与DOTAP 的用量比：(7～9)∶(1～3)。
优选的，所述维生素E琥珀酸酯在醇溶液中的浓度为1.5～2.5mg/ml，更优选地，溶度为2mg/ml。
优选的，步骤(2)所述水浴温度为60～70℃。优选的，所述透明质酸(HA)溶液浓度为1mg/ml时，所述透明质酸溶液与所述单功能纳米粒溶液的体积比为 1～5∶6，优选的，所述透明质酸溶液与所述单功能纳米粒溶液的体积比为2∶3。
本发明的另一目的是还提供一种载双功能化纳米粒微针及其制备方法。该载双功能化纳米粒微针可利用近红外光照射从而发挥光热与化疗协同治疗作用用于抑制浅表肿瘤的生长。
实现上述目的的技术方案如下。
一种载双功能化纳米粒微针的制备方法，包括以下步骤：
a.配置聚乙烯醇PVA和聚乙烯吡咯烷酮PVP混合溶液；
b.制备纳米粒混悬液：将所述双功能化纳米粒溶液与所述聚乙烯醇PVA和聚乙烯吡咯烷酮PVPK30混合溶液按优选体积比(7～9)∶(1～3)混合而成；
c.制备基底溶液；
d.将所述纳米粒混悬液与MNs阴模，在加入基底溶液下制备成载有双功能化纳米粒的微针阵列。
优选地，所述聚乙烯醇PVA浓度为140～160mg/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP的浓度为240～260mg/ml mg/ml；更优选地，所述PVA的浓度为150mg/ml，所述PVP的浓度为250mg/ml。
本发明还提供了上述载有双功能化纳米粒的可溶性微针利用近红外光照射从而发挥光热与化疗协同治疗作用用于抑制浅表肿瘤的生长，优选的，所述浅表肿瘤为乳腺癌。
与背景技术相比，本发明的技术方案的优点和积极效果如下。
1.能够显著增加光敏剂的包封率
本发明所述的双功能化纳米粒的制备中通过在油相中加入合适量的阳离子磷脂DOTAP能够显著增加带负电的光敏剂的包封率，经过优化方法制备得到的载双功能化纳米粒微针的给药方式能够通过角质层屏障穿刺进入皮肤，提高了制剂在人体的光热效率。
2.能够实现肿瘤细胞与线粒体的双靶向性
本发明提供的双功能化纳米粒能够实现通过HA以及TPGS靶向大多数肿瘤细胞表面的CD44受体和能量代谢器线粒体，从而提高药物的靶向性与治疗效率。
3.实现光热与化疗相结合的双模式联合治疗
本发明提供的双功能化纳米粒能够同时包封光敏剂与化疗药物，实现同时空光热化疗双模式治疗的目的。
4.微针结合了注射及局部给药的优势，实现了1+1>2的效果
本发明提供的载双功能化纳米粒微针能够突破角质层屏障将药物均匀的递送到肿瘤组织内，能够避免药物泄漏到正常组织所带来的毒副作用，与肿瘤内注射以及尾静脉注射相比，起到了最大的抑瘤效果。
附图说明
图1是DOTAP含量对ICG包封率的影响。
图2是功能化PLGA纳米粒的荧光稳定性。
图3是功能化PLGA纳米粒的体外光热转换能力。
图4是实施例1和2制备的双功能化纳米粒激光照射前后透射电镜图。
图5是实施例1中的纳米粒载入微针后的形态及纳米粒在微针的分布。
图6是载有双功能化纳米粒的微针扎皮后皮肤组织切片图。
图7是不同给药方式的活体光热升温效率。
图8是相同给药剂量下不同给药方式抑瘤效果图。
具体实施方式
除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、药剂学、细胞生物学、其属于本领域技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/ 或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一个实施例中，提供了一种双功能化纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将油相溶液与化疗药物混合得到溶液A，所述油相溶液为聚羟基乙酸聚乳酸共聚物PLGA及阳离子磷脂DOTAP的易挥发性有机溶剂溶液；
(2)在水浴条件和磁力搅拌的条件下，将水相溶液与光敏剂溶液混合得到溶液B，所述水相溶液为维生素E琥珀酸酯的醇溶液；
(3)将溶液A缓慢滴入溶液B中，滴加完成后继续搅拌，以形成均一纳米粒溶液；
(4)将制备好的纳米粒溶液离心，洗涤，PBS重悬，得到单功能化纳米粒溶液；
(5)将透明质酸溶液在搅拌下滴入制备好的所述单功能化纳米粒溶液中，持续搅拌均匀，即得双功能化纳米粒溶液。
在其中一些实施例中，所述油相溶液中PLGA的浓度为2.8～3.6mg/ml，更优选为3.2～3.6mg/ml，在其中一些实施例中，分别为2.8mg/ml，3.2mg/ml， 3.3mg/ml，3.4mg/ml，3.5mg/ml，3.6mg/ml；所述阳离子磷脂DOTAP的用量，与聚羟基乙酸聚乳酸共聚物相比为(7～9)：(1～3)，在其中一个实施例中，分别为9:1，8:2，7:3，或者是在作为油相材料中，所述阳离子磷脂DOTAP占10％～ 30％。
在其中一些实施例中，所述易挥发性有机溶剂可溶解油相材料，可为乙腈，二氯甲烷、或丙酮，优选为丙酮。
在其中一些实施例中，所述维生素E琥珀酸酯在醇溶液中的浓度为1.5～ 2.5mg/ml，优选地，所述水相溶液为2mg/ml的TPGS在65℃水浴条件下溶于 4％(w/v)的乙醇溶液。
在其中一些实施例中，所述化疗药物为难溶性化疗药物。化疗药物是一种杀灭肿瘤细胞、治疗肿瘤的药物，可分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类、激素类和杂类等，在本发明中，可以选择难溶性化疗药物，例如抗肿瘤动植物成分药，例如长春碱、榄香烯、长春地辛、羟基喜树碱、紫杉醇等。在其中一个实施例中，所述难溶性抗肿瘤药物为PTX。在其中一个实施例中，所述化疗药物与油相材料(聚羟基乙酸聚乳酸共聚物PLGA及阳离子磷脂DOTAP)的用量比为：0.2：3-5，更优选为0.2：4。
在其中一些实施例中，所述光敏剂为带负电的花菁染料溶液，在其中一个实施例中，所述光敏剂为ICG。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述水浴温度为60～70℃，在其中一个实施例中，步骤(2)所述水浴温度为60～70℃，进一步，水浴温度优选为65℃。
在其中一个实施例中，步骤(3)滴加完成后继续搅拌是在温度为30～37℃的水浴进行，进一步，优选水浴温度优选为35℃。
在其中一些实施例中，当所述透明质酸溶液浓度为1mg/ml时，所述透明质酸溶液与所述单功能纳米粒溶液的体积比为1～5：6，优选的，所述透明质酸与纳米粒的体积比为2：3。所述单功能纳米粒中其所含药物与光敏剂的浓度分别为紫杉醇1.12±0.02mg/ml，ICG含量为0.896±0.003mg/ml。
由上述制备方法得到的双功能化纳米粒，对PTX的包封率在85％以上，而且还能够实现对光敏剂的高包封率，可达75％～80％。
本发明的另一实施例还提供一种载双功能化纳米粒的可溶性微针和其制备方法。
所述可溶性微针由载双功能纳米粒的针尖和基底组成，所述针尖的制备材料为聚乙烯醇PVA和聚乙烯吡咯烷酮PVPK30，所述基底的制备材料为聚乙烯吡咯烷酮K90。
所述制备方法，包括以下步骤：
a.制备针尖基础材料：配置聚乙烯醇PVA和聚乙烯吡咯烷酮PVP混合溶液；
b.制备纳米粒混悬液：将所述双功能化纳米粒溶液与所述聚乙烯醇PVA和聚乙烯吡咯烷酮PVP混合溶液按体积比混合而成；在其中一些实施例中，所述双功能纳米粒中其所含药物与光敏剂的浓度分别为紫杉醇1.12±0.02mg/ml，ICG 含量为0.896±0.003mg/ml；
c.制备基底溶液；
d.将所述纳米粒混悬液加入MNs阴模，再加入基底溶液下制备成载有双功能化纳米粒的微针阵列。
在其中一些实施例中，所述聚乙烯醇PVA浓度为140～160mg/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP的浓度为240～260mg/ml；在其中一个实施例中，所述PVA的浓度为150mg/ml，PVP的浓度为250mg/ml。
所述基底溶液可以按照可溶性微针的常规方法进行制备，本发明所述的基底溶液为聚乙烯吡咯烷酮K90溶液，在其中一个实施例中，制备基底溶液包括：将称重好的PVPK90按1:3～4(mg/ml)，优选为1:3.2(mg/ml)的比例溶于乙醇中，搅拌均匀后继续溶胀过夜，即可制得基底溶液。
所述微针阵列也可以按照常规方法进行制备。本发明的一个实施例中，采用分步离心法制备，包括：a.取一定体积的纳米混悬液加入每一小片MNs阴模，离心，使双功能化纳米粒沉积于针尖；b.将离心后剩余的纳米粒混悬液收集至 EP管中，再将MNs模具置于离心机中再继续离心，以使双功能化纳米粒充分地被压缩在针尖并使水分挥干；c.将步骤b中收集的纳米粒混悬液再次加入MNs 模具中，重复上述操作；d.将150μl上述浓度的PVA和PVPK30的的混合溶液加入MNs阴模中真空脱气，再将MNs模具置于离心机中离心；e.刮去阴模表面残留溶液，每片加入一定体积基底溶液，离心以制备MNs的背衬层；f.将离心好的MNs模具置于干燥器中室温干燥，用镊子轻轻取出干燥好的MNs，置于干燥器中备用，即得载有双功能化纳米粒的微针阵列。
本发明所述制备方法中，根据本领域技术人员的常规理解，步骤可以根据制备溶液从先后次序进行任意调整，例如所述载双功能化纳米粒微针的制备方法中，基底溶液的制备可先以制备纳米粒混悬液之前。
本发明还提供了上述载有双功能化纳米粒的可溶性微针利用近红外光照射从而发挥光热与化疗协同治疗作用用于抑制浅表肿瘤的生长，优选的，所述浅表肿瘤为乳腺癌。
本申请实施例中的一些化合物的购买厂家如下：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物：PLGA(LA:GA＝50:50，Mw＝5000～15000)山东岱罡生物技术有限公司
维生素E琥珀酸酯TPGS(阿拉丁试剂，批号T110277)
阳离子磷脂DOTAP(上海艾伟特医药科技有限公司，批号RD-01173)
紫杉醇PTX(阿拉丁试剂，批号E1822047)
吲哚菁绿ICG(激光级，Acros Organics公司，批号A0384859)
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)103(阿拉丁试剂，批号11806032)
聚乙烯比咯烷酮(polyvinyl pyrrolidine,PVP)K30(德国巴斯夫公司，批号G40147PT0)
聚乙烯比咯烷酮(polyvinyl pyrrolidine,PVP)K90(德国巴斯夫公司，批号09951956P0)
以下将结合具体实施例和附图对本发明的载双功能化纳米粒微针及其制备与应用做进一步详细的说明，本领域技术人员应当理解，下面所描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1双功能化纳米粒的制备
PTX(在丙酮中的浓度为0.2mg/ml)、PLGA(在丙酮中的浓度为3.6mg/ml)和DOTAP(在丙酮中的浓度为0.4mg/ml)溶于丙酮溶液中，作为油相，PLGA: DOTAP的用量比为9：1(相当于所述油相材料中，DOTAP在溶液中含量为 10％)。
将TPGS(在乙醇溶液中的浓度2mg/ml)在65℃水浴条件下溶于4％(w/v)的乙醇溶液中，作为水相；将ICG(在甲醇中的浓度1mg/ml)溶于20％(v/v)的甲醇溶液中。
将100μl的ICG的甲醇溶液在磁力搅拌下逐滴滴入在65℃水浴条件下预热的TPGS的乙醇溶液(2.5ml)中，随后，将500μl的油相溶液逐滴滴入上述 TPGS乙醇溶液中，继续在35℃水浴条件下搅拌20min，以形成均一的纳米粒。
将制备好的纳米粒溶液置于超滤离心管中(分子截留量为10KDa)，于转速4000rpm，4℃条件下离心20min，弃去下层液体，再在上层纳米粒浓缩溶液中加入3ml超纯水离心15分钟，重复用水洗三次，以除去残留的有机溶剂。最后用pH 7.4的PBS重悬，浓缩的纳米粒置于4℃冰箱避光保存，所述单功能化纳米粒所含药物与光敏剂的浓度分别为紫杉醇1.12mg/ml,ICG含量为 0.896mg/ml，标记为D10。
按透明质酸HA溶液和纳米粒溶液的体积比为2：3，将1mg/ml的HA溶液在磁力搅拌的作用下逐滴加入新制备(浓缩前)的D10纳米粒溶液中，再持续搅拌10min即可制备HA和TPGS双功能化的纳米粒，将制备好的纳米粒按照上述同样的方法浓缩之后，置于4℃冰箱避光保存，其所含药物与光敏剂的浓度分别为紫杉醇1.12mg/ml,ICG含量为0.896mg/ml，标记为HAD10。
实施例2双功能化纳米粒的制备
PTX(0.2mg/ml)、PLGA(3.2mg/ml)和DOTAP(0.8mg/ml)溶于丙酮溶液中，作为油相，PLGA：DOTAP用量比为8：2，(相当于所述油相材料中， DOTAP在溶液中含量为20％)。
将TPGS(2mg/ml)在65℃水浴条件下溶于4％(w/v)的乙醇溶液中，作为水相。将ICG(1mg/ml)溶于20％(v/v)的甲醇溶液中；
首先，将100μl的ICG溶液在磁力搅拌下逐滴滴入在65℃水浴条件下预热的TPGS溶液(2.5ml)中。随后，将500μl的油相溶液逐滴滴入TPGS溶液中，继续在35℃水浴条件下搅拌20min，以形成均一的纳米粒；将制备好的纳米粒溶液置于超滤离心管中(分子截留量为10KDa)，于转速4000rpm，4℃条件下离心20min，弃去下层液体，再在上层纳米粒浓缩溶液中加入3ml超纯水离心 15分钟，重复用水洗三次，以除去残留的有机溶剂，最后用pH 7.4的PBS重悬，浓缩的纳米粒置于4℃冰箱避光保存，标记为D20。
按HA溶液和纳米粒的体积比为2：3，将1mg/ml的HA溶液在磁力搅拌的作用下逐滴加入新制备(浓缩前)的D10纳米粒溶液中，再持续搅拌10min, 按照实施例1所述方法，即可制备HA和TPGS双功能化的纳米粒，标记为HA D20。
利用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察D10 NPs、 HD10NPs、D20 NPs和HD20 NPs激光照射前后的形态。样品制备方法为：(1)将纳米粒用PBS稀释至合适的浓度；(2)取10μl样品置于封口膜上，再把300 目的铜网覆盖在样品上吸附2min后用滤纸吸干；(3)将铜网覆盖在3％的磷钨酸溶液上，吸附1.5min后用滤纸吸干；(4)将样品置于样品杆中进行拍照。
本发明实施例1和2制备的双功能化纳米粒激光照射前后透射电镜图如图4所示。
从图4中可以看出，D10 NPs和D20 NPs均为球形，具有核-壳结构；HD10 NPs和HD20NPs也均为球形，具有核-壳-壳结构，进一步证明HA对TPGS功能化的PLGA纳米粒成功进行了包裹。使用激光照射后，纳米粒依然呈球形， PLGA内核发生了少许融蚀，而TPGS的外壳可见明显的融蚀，这主要是由于 TPGS的熔点较低(41.6℃)，而PLGA熔点较高，纳米粒在激光照射过程上升的温度不足以使PLGA内核发生融蚀而裂解。
实施例3.功能化PLGA纳米粒的粒径，电位和药物包封率的测定
采用马尔文粒径仪测定D10 NPs、HD10 NPs、D20 NPs和HD20 NPs的粒径和表面电位。
采用超滤离心法测定D10 NPs、HD10 NPs、D20 NPs和HD20 NPs的包封率，具体方法为：将制备好的纳米粒加入50ml超滤离心管(分子截留量为10KD)中，在4000rpm/4℃条件下离心15min。离心完成后，取出超滤管中的上层溶液并定容至10ml，再稀释至适当倍数后分别采用HPLC法测定PTX的含量和 UV法测定ICG的含量
Figure BDA0002154492590000131
结果如表1所示：
PTX和ICG共载的PLGA纳米粒(D10 NPs、HD10 NPs、D20 NPs和HD20 NPs)的粒径(Z-average)、电位(Zetapotential)和药物包封率(Encapsulation efficiency)如表1所示。
TPGS功能化的PLGA纳米粒(D10 NPs和D20 NPs)在水溶液中的分散粒径为140nm左右，D10 NPs和D20 NPs的电荷分别为9.20mV和16.0mV，表明DOTAP的加入可以使单纯的TPGS/PLGA纳米粒由负电荷翻转为正电荷，且电荷的数值随DOTAP含量的增加而增大；而HA/TPGS双功能化的PLGA纳米粒(HD10 NPs和HD20 NPs)为160～165nm，HD10 NPs和HD20 NPs的电荷分别为-19.40mV和-23.50mV。总之，TPGS功能化的PLGA纳米粒进一步采用 HA滴定后，其粒径增大约20nm，且电荷也发生了翻转，由正电荷转为负电荷，表明HA对TPGS功能化的PLGA纳米粒成功进行了包裹。
D10 NPs和D20 NPs的PTX包封率在85％以上，具有较高的包封率，这主要是由于PTX为亲脂性药物，TPGS对PTX良好的增溶能力，及PTX可与PLGA 发生疏水相互作用而能有效包载进PLGA内核。HD10 NPs和HD20 NPs的PTX 包封率也在85％以上，与HA包裹前相应纳米粒的包封率相当，表明HA滴定过程对PTX的包封率无影响。
各纳米粒中，ICG的包封率均在75％～80％，显著高于文献中报道的PLGA 纳米粒对ICG的包封率(20％～40％)，可能的原因主要基于以下几点：(1)ICG 为两亲性的化合物，可与PLGA自组装形成纳米粒，而本发明中所用的水相为两亲性的TPGS溶液]；(2)在PLGA油相中加入带正电荷的DOTAP，使得纳米粒带正电，可进一步吸附ICG，提高ICG的包封率；(3)ICG与PTX可发生静电和π-π堆积相互作用，进一步提高ICG的包封率。
每次制备的纳米粒内包封的PTX以及ICG的浓度比都约等于1：1.3。
表1
Figure BDA0002154492590000141
按照实施例1所述方法，研究DOTAP含量对ICG包封率的影响。
DOTAP含量对ICG的包封率如图1所示。随着DOTAP的加入，ICG的包封率显著提高，由DOTAP加入前的29.75％随10％、20％和30％DOTAP的加入量依次变为51.56％、50.72％和40.37％。兼顾DOTAP含量对纳米粒的电位和包封率的影响，后续选择10％和20％的DOTAP含量来制备PTX和ICG共载的 PLGA纳米粒。
实施例4.功能化PLGA纳米粒的荧光稳定性
将ICG浓度为300μg/ml的游离ICG水溶液、D10 NPs、HD10 NPs、D20 NPs 和HD20NPs置于37℃恒温培养箱中，于0d、1d、3d、5d和7d取样，稀释 200倍测定ICG的荧光强度，以研究游离ICG溶液和ICG纳米粒的荧光稳定性。采用荧光光谱仪测定ICG的荧光强度，激发波长为763nm，记录相应溶液在发射波长为820nm处的荧光强度，并按以下公式计算溶液的相对荧光强度：
Figure BDA0002154492590000151
游离ICG溶液和载ICG的纳米粒在37℃放置7d的荧光强度变化如图2所示；。游离ICG在放置1d后，荧光强度已降为初始荧光强度的27.8％，到第3d 时荧光强度只有初始荧光强度的4.0％，弱眼可见溶液颜色发生明显的变化，表明游离ICG水溶液的稳定性差。这主要是由于当ICG水溶液的浓度超过2μg/ml 时，ICG会通过范德华力和疏水相互作用力形成纳米聚集颗粒而发生自我淬灭。载ICG纳米粒在放置过程中，相对荧光强度均在90％以上，或基本维持在100％，表明ICG被包封进纳米粒后可避免ICG在水溶液中快速聚集和降解而导致其荧光淬灭，从而显著增强ICG在水溶液中的荧光稳定性。
实施例5.功能化PLGA纳米粒的体外光热转化能力
将2ml PBS和含20μg/ml的游离ICG溶液、D10 NPs和HD10 NPs分别加至24孔板中，使用近红外激光(808nm,1W/cm2)对样品持续照射5min。在照射过程中，采用红外热成像系统(TiS75，美国Fluke公司)实时记录溶液的温度变化，最后绘制温度曲线。
PBS、游离ICG、D10 NPs和HD10 NPs水溶液使用近红外激光持续照射5 min过程的红外热像图和温度变化如图3所示。各溶液温度随照射时间增加而增大，PBS、游离ICG、D10NPs和HD10 NPs水溶液在照射5min过程中的最高温度分别为26.7℃、46.6℃、52.5℃和50℃。这一结果表明ICG被包封进纳米粒后较游离ICG光热转换效率增强，其原因主要有以下几点：(1)纳米粒对ICG 的包封作用提高了ICG的光热稳定性[79]，(2)局部ICG浓度提高使其具有更好的产热效果[75]；(3)ICG纳米粒较单纯的ICG溶液其最大吸收峰红移，即在808nm处的吸收更强，因此在808nm激光照射下产热能力更强。
实施例6.游离药物与双功能化纳米粒的细胞毒性
将细胞融合度为80％-90％的MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)以5×103/ 孔的密度接种于96孔板中，在5％CO2、37℃培养箱中培养24h至细胞贴壁完全。吸去旧的培养基，再加入100μl的含药新鲜培养基，其中含游离PTX以及含PTX浓度均为1.0μg/ml的D10 NPs、HD10 NPs(每次做的纳米粒测定包封率后，稀释成含PTX浓度为1ug/ml的培养基溶液加入细胞孔内)。未加药的正常细胞更换新鲜完全培养基进行培养，作为空白对照组。待细胞培养24h后，将培养基吸去，再每孔加入含10μl CCK 8溶液的100μl完全培养基后，继续在培养箱中培养1-2h，用酶标仪测定溶液在450nm处的吸光度。细胞存活率按公式2-3计算：
Figure BDA0002154492590000161
为了进一步研究PTT和化疗联用对肿瘤细胞的杀伤作用，将含PTX浓度为 1.0μg/ml(ICG浓度为1.3μg/ml)的D10 NPs和HD10 NPs，加入贴壁好的细胞中培养细胞4h后，采用近红外激光(808nm,1W/cm2)持续照射细胞5min后继续培养细胞至24h，再照上述方法测定细胞的存活率。
MDA-MB-231细胞接受不同制剂处理24h和48h后的细胞存活率结果如表2所示。游离PTX的细胞毒性明显低于包封PTX的纳米粒，这主要是由于以下两点：(1)纳米粒增加了细胞对PTX的摄取；(2)TPGS可以诱导肿瘤细胞通过线粒体途径凋亡，协同PTX发挥化疗作用；TPGS功能化纳米粒和HA/TPGS 双功能化纳米粒的24h细胞毒性整体上无明显差异,当给予近红外激光照射时即化疗与光热治疗(photothermal therapy,PTT)协同治疗时，癌细胞的存活率明显低于单纯的化疗组，表明PTT可以增强化疗抑制癌细胞增殖作用。PTT法增强化疗法抑制癌细胞增殖能力的机理主要有以下几点：(1)光热转换过程产生 ROS，如羟基、单线氧等自由基可以杀死肿瘤细胞；(2)光照过程产生的过高热会使溶酶体裂解，从而诱导细胞程序性凋亡。此外，纳米粒组较游离药物组，其协同抑制细胞增殖的能力更强，表明将ICG载入纳米粒较游离ICG可以发挥更好的光热效应，这可能得益于纳米粒既能增强ICG的稳定性，又能提高ICG 的细胞摄取量。
表2：具有光热效应的双功能化的纳米粒在24h对细胞的毒性
Figure BDA0002154492590000171
实施例7.载双功能化纳米粒微针的制备
为了让纳米粒负载在针尖，提高微针的载药量，采用分步离心法制备DMNs，具体步骤为：
1、可溶性微针材料的制备
针尖材料的制备分为两部分：a.聚乙烯醇PVA/聚乙烯吡咯烷酮PVP混合溶液的配制，先将PVA在90℃水浴和磁力搅拌作用下溶解，再将PVP K30称取至已溶解好的PVA水溶液中，继续在磁力搅拌作用下搅拌2h或以上至聚合物充分溶解完全，所述PVA的浓度为150mg/ml，PVP的浓度为250mg/ml；
b.纳米粒混悬液的制备，将实施例1所述纳米粒溶液与PVA和PVP的混合液按体积比混合而成，所述纳米粒与PVA/PVA的体积比为4：1；
c.基底溶液的制备：将称重好的PVP K90按1:3.2(w/v)的比例溶于乙醇中，搅拌均匀后继续溶胀过夜，即可制得基底溶液；
2、载有双功能化纳米粒的微针阵列的制备
(1)取100μl纳米混悬液加入每一小片微针阴模，在温度为4℃和转速为 4000rpm的条件下离心10min，使纳米粒沉积于针尖；(2)将剩余的溶液收集至EP管中，再将MNs模具置于离心机中在4000rpm的条件下继续离心30min，以使纳米粒充分地被压缩在针尖并使水分挥干；(3)将收集的纳米混悬液再次加入MNs模具中，每片MNs阴模的加入量为80μl，重复上述操作；(4)将 PVA/PVP的针尖复合物加入MNs阴模中，每片加入150μl溶液后铺平进行真空脱气10min，再将MNs模具置于离心机中在4000rpm的转速下离心5min；(5)刮去阴模表面残留溶液，每片加入250μl的基底溶液，在4000rpm的转速下离心5min以制备MNs的背衬层；(6)将离心好的MNs模具置于干燥器中室温干燥36h，用镊子轻轻取出干燥好的MNs，置于干燥器中备用。
采用分布离心法制备纳米粒负载的DMNs，DMNs的形态和纳米粒分布如图5所示；从体式荧光显微镜图(图5-A)中可以观察到针尖呈绿色，激光共聚焦图(图5-B)也显示只有针尖呈现绿色荧光。由于载ICG的HD10 NPs溶液呈绿色，在激发波长为675nm下发射绿色荧光，因此这些结果均表明纳米粒被成功富集在针尖，有利于DMNs在给药过程中药物被递送到真皮层发挥药效，避免药物残留在皮肤表面造成浪费。
实施例8.微针穿刺皮肤的能力
大鼠皮肤制备：取体重为180-220g的雄性SD大鼠，给予安乐死。用宠物电动剃毛刀剔除大鼠腹部毛发，再涂抹脱毛膏脱去剩余的毛根，剥离大鼠腹部皮肤。将剥离的皮肤用生理盐水洗净后，再用滤纸吸干水分固定在鼠板上；用大拇指将实施例7所述DMNs垂直按压在皮肤上1min，迅速用手术剪将穿刺后的皮肤部位剪下置于EP管中，加入4％的多聚甲醛固定液浸泡，对皮肤组织固定 24h以上，石蜡包埋切片后进行H&E染色
从皮肤的H&E染色图6，可以观察到皮肤上有明显的微孔道，针尖可刺入皮肤的深度为250～350μm，至真皮层，表明所制备的DMNs具有良好的皮肤穿刺能力，可以保证其在给药时穿透角质层，将药物递送到真皮发挥疗效。
实施例9.纳米粒和微针的活体光热升温效率
将50μl鼠乳腺癌4T1细胞(4×107个/ml)种植在小鼠背部皮下，待瘤体积长大到100～150mm3,将荷瘤小鼠随机分成5组，每组3只：不给药组，尾静脉注射HD10 NPs组(每只鼠按5mg/kg的PTX或4mg/kg的ICG剂量给药)，瘤内注射HD10 NPs组(每只鼠按27.6μg PTX和22.1μg ICG的剂量给药)，单片 DMNs扎皮组(含PTX 13.8μg和ICG 4.1μg)，两片DMNs扎皮组(含PTX 27.6 μg和ICG 8.2μg)。各组均采用近红外激光器(808nm,1W/cm2)对肿瘤部位进行照射，瘤内注射组给药完之后直接照射，尾静脉注射组在给药4h后进行照射，单片DMNs组在扎皮30min后进行照射，两片DMNs组在扎皮1h后进行照射，每片DMNs在扎皮后溶解30min。照射过程中采用红外热像仪(TiS75，美国 Fluke公司)实时记录肿瘤组织局部的温度变化，绘制温度随时间的变化曲线。
不给药的小鼠作为空白对照，不同给药组小鼠的红外热成像图和升温曲线如图7所示。采用不同方式处理的小鼠，肿瘤最高温度大小为纳米粒瘤内注射组>两片DMNs扎皮组>单片DMNs扎皮组>尾静脉注射组>未处理组，其平均最高温度依次为56.0℃、53.7℃、50.5℃、48.9℃和40.4℃。瘤内注射组ICG总量分别为单片DMNS和两片DMNs的5.4倍和2.7倍，由此可认为DMNs组虽然最高温度低于瘤内注射组，但具有更高的升温效率。未处理小鼠在激光照射过程中的平均最高温度不超过41℃，表明当未使用光敏剂而单纯使用激光照射未表现出潜在的促进肿瘤细胞凋亡作用。瘤内注射和DMNs给药组的平均最高温度均有超过50℃，有望对肿瘤细胞产生不可逆损伤。尾静脉注射的平均最高温度在45～50℃，有望对肿瘤细胞产生一定的促凋亡作用，但存在潜在肿瘤细胞生长复发的风险。瘤内注射组平均温度高于DMNs组平均温度的原因主要是瘤内注射为单点注射，局部ICG浓度更高，可以产生更多的热量，而DMNs为点阵式注射，ICG在肿瘤部位的分布区域更大，其浓度相对更小，产热效果也相对更低。
实施例10.药效学研究
待小鼠乳腺癌4T1肿瘤体积生长至100～150mm3时，将小鼠随机分成8组，每组5只，除特别说明外均当天(记为第0天)给药一次，具体分组和给药方案如下：
(1)不处理对照组；
(2)HD10NPs(PTX/ICG)尾静脉注射组(PTX 5mg/kg/只，ICG 4mg/kg/只)；
(3)HD10NPs(PTX/ICG)尾静脉注射+激光照射组(PTX 5mg/kg/只，ICG 4mg/kg/只)，在给药后4h进行照射；
(4)HD10NPs(PTX/ICG)瘤内注射组(PTX 27.6μg/只，ICG 22.1μg/只)；
(5)HD10NPs(PTX/ICG)瘤内注射+激光照射组(PTX 27.6μg/只，ICG 22.1μg/只)，给药后直接进行照射；
(6)HD10NPs(PTX/ICG)负载的DMNs扎皮组(2片DMNs/只，每片DMNs 含PTX 13.8μg，ICG 4.1μg)；
(7)HD10NPs(PTX/ICG)负载的DMNs扎皮+激光照射组(2片DMNs/只，每片DMNs含PTX13.8μg，ICG 4.1μg)，在给药后30min进行照射；
(8)HD10NPs(PTX/ICG)负载的DMNs扎皮+激光照射组(1片微针/只，每片DMNs含PTX13.8μg，ICG 4.1μg)，在给药后1h进行照射。
图8为小鼠在给予不同治疗处理后20d内的肿瘤体积生长状况。与未进行任何处理的小鼠相比，瘤内注射肿瘤体积生长速率与之相当，小鼠在第20d的肿瘤平均体积约为733mm3，表明单纯瘤内注射含低剂量PTX的HD10 NPs没有抑制肿瘤生长的作用，可能由于肿瘤细胞间隙容纳的药物体积少，大部分药物泄漏到周围皮下组织而没有发挥抑制肿瘤生长的作用；尾静脉注射HD10 NPs 对肿瘤的生长具有一定的抑制作用，小鼠在第20d的肿瘤平均体积约为602mm3这可能是由于纳米粒可富集在肿瘤组织，前期发挥了抑瘤作用，而随着PTX的代谢抑瘤作用消失，肿瘤继续生长，表明通过尾静脉注射给予乳腺癌化疗需要多次给药才能达到有效的抑瘤作用；以DMNs形式予以化疗，可显著抑制肿瘤的生长，小鼠在第20d的肿瘤平均体积约为266mm3，可能是由于药物能够均匀分散在肿瘤组织间隙而发挥了较好的抗肿瘤效果。这些结果表明不同给药方式的抑瘤能力大小为DMNs>尾静脉注射>瘤内注射。当同时予以化疗和PTT时，三种给药方式均可以进一步抑制肿瘤生长，其中DMNs(两片)和瘤内注射组大部分小鼠肿瘤甚至完全消融，这主要是由于PTT可通过产生局部过高热和ROS诱导肿瘤细胞凋亡而增强化疗的效果。此外值得一提的是，单片DMNs+LS 组虽然可以抑制肿瘤的生长，使肿瘤体积减小，但在第10d后肿瘤生长开始复发和持续生长，这主要是由于在激光照射过程中产生的温度不足以完全杀死肿瘤细胞。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种双功能化纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将油相溶液与化疗药物混合得到溶液A，所述油相溶液为聚羟基乙酸聚乳酸共聚物及阳离子磷脂DOTAP的易挥发性有机溶剂溶液；
(2)在水浴条件和磁力搅拌的条件下，将水相溶液与光敏剂溶液混合得到溶液B，所述水相溶液为维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的醇溶液；
(3)将溶液A缓慢滴入溶液B中，滴加完成后继续搅拌，以形成均一的纳米粒溶液；
(4)将制备好的纳米粒溶液离心，洗涤，重悬，得到单功能化纳米粒溶液；
(5)将透明质酸溶液在搅拌下滴入制备好的所述单功能化纳米粒溶液中，持续搅拌均匀，即得双功能化纳米粒。
2.根据权利要求1所述的双功能化纳米粒的制备方法，其特征在于，
所述油相溶液中PLGA的浓度为2.8-3.6mg/ml；和/或所述聚羟基乙酸聚乳酸共聚物与阳离子磷脂DOTAP的用量比：(7～9)：(1～3)；所述易挥发性有机溶剂为丙酮；
和/或维生素E聚乙二醇琥珀酸酯在醇溶液中的浓度为1.5～2.5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的双功能化纳米粒的制备方法，其特征在于，
所述化疗药物为难溶性化疗药物。
4.根据权利要求1所述的双功能化纳米粒的制备方法，其特征在于，
所述光敏剂为带负电的花菁染料。
5.根据权利要求1至4任一项所述的双功能化纳米粒的制备方法，其特征在于，
所述透明质酸溶液浓度为1mg/ml时，所述透明质酸溶液与所述单功能纳米粒溶液的体积比为1～5：6，所述单功能纳米粒溶液中纳米粒所含药物与光敏剂的浓度分别为紫杉醇1.12±0.02mg/ml，ICG含量为0.896±0.003mg/ml。
6.由权利要求1至5任一项所述制备方法得到的双功能化纳米粒。
7.一种载双功能化纳米粒的可溶性微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.配置聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮K30的混合溶液；
b.制备纳米粒混悬液：将权利要求6所述双功能化纳米粒溶液与所述聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液按体积比混合而成；
c.制备基底溶液；
d.将所述纳米粒混悬液加入可溶性微针阴模，再加入所述基底溶液，制备成载有双功能化纳米粒的微针阵列。
8.根据权利要求7所述载双功能化纳米粒的可溶性微针的制备方法，其特征在于，
所述聚乙烯醇浓度为140～160mg/ml，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的浓度为240～260mg/ml；
和/或
将权利要求6所述双功能化纳米粒溶液与所述聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液按体积比为3～5:1混合而成；所述双功能化纳米粒溶液中的纳米粒所含药物与光敏剂的浓度分别为紫杉醇1.12±0.02mg/ml，ICG含量为0.896±0.003mg/ml。
9.根据权利要求7-8任一项所述制备方法得到的载双功能化纳米粒的可溶性微针。
10.权利要求9所述载双功能化纳米粒的可溶性微针在制备防治浅表肿瘤的药物中的应用。
CN201910713267.8A 2019-08-02 2019-08-02 双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用 Active CN110448541B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910713267.8A CN110448541B (zh) 2019-08-02 2019-08-02 双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910713267.8A CN110448541B (zh) 2019-08-02 2019-08-02 双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110448541A CN110448541A (zh) 2019-11-15
CN110448541B true CN110448541B (zh) 2021-10-01

Family

ID=68484794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910713267.8A Active CN110448541B (zh) 2019-08-02 2019-08-02 双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110448541B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111529920B (zh) * 2020-04-09 2022-04-29 四川大学 微针释药装置及制造方法、皮肤疾病治疗装置
CN113827544B (zh) * 2020-06-04 2024-08-09 中国科学院理化技术研究所 一种耐热型可植入式聚合物微针及其制备方法和应用
CN112842989B (zh) * 2021-01-20 2023-04-11 浙江理工大学 一种负载铜离子掺杂聚多巴胺的微针贴片及其制备方法、应用
CN114668710B (zh) * 2022-03-09 2024-05-28 广州新济生物医药研究院有限公司 一种双相释药可溶性微针贴片及其制备方法
CN114668712B (zh) * 2022-03-24 2023-09-26 深圳大学 一种缓释微针贴片及其制备方法
CN114870011B (zh) * 2022-03-24 2023-06-06 深圳大学 一种增强实体瘤内原卟啉ix蓄积的微针贴片及其制备方法
CN115025038A (zh) * 2022-06-20 2022-09-09 吴力波 基于熔融沉积制备聚乳酸微针的方法和聚乳酸微针

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102362861A (zh) * 2011-11-04 2012-02-29 无锡中科光远生物材料有限公司 一种空心核壳结构复合纳米粒子及其制备方法
WO2013012891A1 (en) * 2011-07-19 2013-01-24 Stc. Unm Intraperitoneally-administered nanocarriers that release their therapeutic load based on the inflammatory environment of cancers
CN104159572A (zh) * 2011-09-21 2014-11-19 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 纳米递送系统
CN109528686A (zh) * 2017-09-22 2019-03-29 杭州景杰生物科技有限公司 利用微混合和卡培他滨两亲性质的卡培他滨的聚合物-脂质混合纳米颗粒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013012891A1 (en) * 2011-07-19 2013-01-24 Stc. Unm Intraperitoneally-administered nanocarriers that release their therapeutic load based on the inflammatory environment of cancers
CN104159572A (zh) * 2011-09-21 2014-11-19 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 纳米递送系统
CN102362861A (zh) * 2011-11-04 2012-02-29 无锡中科光远生物材料有限公司 一种空心核壳结构复合纳米粒子及其制备方法
CN109528686A (zh) * 2017-09-22 2019-03-29 杭州景杰生物科技有限公司 利用微混合和卡培他滨两亲性质的卡培他滨的聚合物-脂质混合纳米颗粒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Skin Dendritic Cell Targeting via Microneedle Arrays Laden with Antigen-Encapsulated Poly‑D,L‑lactideco-Glycolide Nanoparticles Induces Efficient Antitumor and Antiviral Immune Responses;Marija Zaric et al;《ACS Nano》;20130202;第7卷(第3期);第2042-2055页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110448541A (zh) 2019-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110448541B (zh) 双功能化纳米粒、可溶性微针及其制备方法与应用
Chen et al. Nanoparticles-encapsulated polymeric microneedles for transdermal drug delivery
Zhi et al. Photothermal therapy
Abd-El-Azim et al. Hollow microneedle assisted intradermal delivery of hypericin lipid nanocapsules with light enabled photodynamic therapy against skin cancer
Xie et al. Functional long circulating single walled carbon nanotubes for fluorescent/photoacoustic imaging-guided enhanced phototherapy
Jiang et al. Nanomedicine potentiates mild photothermal therapy for tumor ablation
Chu et al. Pluronic-encapsulated natural chlorophyll nanocomposites for in vivo cancer imaging and photothermal/photodynamic therapies
Wei et al. Dissolving microneedles integrated with pH-responsive micelles containing AIEgen with ultra-photostability for enhancing melanoma photothermal therapy
Lee et al. Synergistic cancer therapeutic effects of locally delivered drug and heat using multifunctional nanoparticles
Ruan et al. Transdermal delivery of multifunctional CaO 2@ Mn-PDA nanoformulations by microneedles for NIR-induced synergistic therapy against skin melanoma
CN108159422A (zh) 一种自组装载药系统及其复合制剂的制备方法
Fang et al. Stimulus-responsive nanocarriers for targeted drug delivery
CN111956801B (zh) 光控释放co和阿霉素的纳米药物系统及其制备和应用
CN111135296B (zh) 一种白蛋白结合型吲哚菁绿抗肿瘤光热制剂及其制备方法
US20110318415A1 (en) Hollow Gold Nanospheres (HAuNSs) and HAuNSs-Loaded Microspheres Useful in Drug Delivery
CN108926714B (zh) 一种用于膀胱灌注靶向膀胱癌递送药理活性物质的高分子凝胶及其制备方法
Sun et al. Self-assembly nanomicelle-microneedle patches with enhanced tumor penetration for superior chemo-photothermal therapy
CN106551904A (zh) 靶向肿瘤的声、光动力载药纳米胶束及其制备方法和用途
Peng et al. Dissolving microneedles loading TPGS biphasic functionalized PLGA nanoparticles for efficient chemo‐photothermal combined therapy of melanoma
Huang et al. pH-activatable oxidative stress amplifying dissolving microneedles for combined chemo-photodynamic therapy of melanoma
Chen et al. Graphitic carbon nanocages as new photothermal agent and drug Carrier for 980-nm-laser-driven cancer therapy
Liu et al. Liposome-based multifunctional nanoplatform as effective therapeutics for the treatment of retinoblastoma
Yu et al. Build an implanted “arsenal”: detachable microneedles for NIR-triggered cancer photothermo-chemotherapy
CN110711250B (zh) 一种双靶向多模协同治疗纳米载药体系的构建方法
Wang et al. Dual-functional melanin-based nanoliposomes for combined chemotherapy and photothermal therapy of pancreatic cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant