CN114053225A - 一种高效低毒且稳定性良好的用于基因递送的阳离子脂质体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效低毒且稳定性良好的用于基因递送的空白脂质体及其应用。本发明利用植物甾醇类或人参皂苷类化合物替代胆固醇作为膜稳定剂，使其成为完整的膜结构中不可缺少的结构组成部分，而不是单纯地作为药物或药物增效剂，进而赋予了空白脂质体良好的稳定性、基因递送时高效低毒的特点以及特定疾病治疗时的应用潜力。本发明进一步提出了可有效提高该空白脂质体在较长时间内保持稳定性的步骤，为其进一步的应用提供了保证与便利。本发明中的空白脂质体为阳离子脂质体，具有制备工艺简单，膜表面带正电，细胞毒性低，递送效率高，稳定性良好等优点。

Description

一种高效低毒且稳定性良好的用于基因递送的阳离子脂质体 及其应用

技术领域

本发明涉及一种以植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物为膜稳定剂的阳离子脂质体的制备方法与其在基因治疗方面良好的应用潜力。

背景技术

脂质体系具有双分子层的封闭囊泡结构，其组成基础物质为磷脂与胆固醇，具有良好的细胞膜融合性。在生物医药技术领域，脂质体已被广泛用作药物递送载体。作为一种药物治疗媒介，脂质体可实现对疏水性药物的有效负载，降低药物在体内的降解度，经PEG-脂质修饰的脂质体还可以提高药物在体内的循环时间，进而提高生物利用度，减少药物的使用剂量以及潜在的毒副作用。

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。目前，基因治疗在治疗对人类健康威胁严重的疾病，如遗传病(血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(艾滋病、类风湿等)等显示出良好的前景。与传统治疗方法相比，基因治疗可特异性治疗目的细胞，并由于其在体内的稳定表达具有长期疗效。外源基因直接导入体内并进入细胞的过程中，极易承受被核酸酶降解的风险，致使其表达效率降低。因此，基因治疗的关键在于构建安全高效稳定的基因递送载体实现对基因的负载与递送至细胞。基因递送载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。虽然病毒载体具有较高的转染效率，但其免疫原性、致癌性等缺陷不容忽视，这限制了其在临床上的深入研究与应用。相较于病毒载体，非病毒载体具有安全性高、无免疫原性、基因负荷量大、可批量生产等优点，可以替代病毒载体进行临床应用和治疗。现阶段，如何构建安全高效稳定的非病毒基因递送载体为研发过程中的核心所在。

以阳离子脂质体介导的基因递送具有无免疫原性、可重复性、外源基因不易被降解等优点，是非病毒基因递送载体领域的研究热点。目前，市售的阳离子脂质体有Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent、Lipofectamine^TMLTX Reagent withPLUS^TMReagent等。尽管这些阳离子脂质体具有一定的基因递送能力，但它们往往存在较大的毒性。因此，如何在保持较高的基因递送效率的同时，提高脂质体储存过程中的稳定性并尽可能地降低细胞毒性是亟待解决的问题。

阳离子脂质体通常由一种阳离子脂质、一种中性辅助脂质和胆固醇在适当条件下复合而成，其递送基因的效率与阳离子脂质的组成密切相关。其中，阳离子脂质主要包括氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵。然而，这些材料往往具备毒性较大、成本较高、储存周期短等问题。辅助脂质主要有二油酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇等。胆固醇是环戊烷多氢菲的衍生物，是哺乳动物中主要的甾体类化合物，通常作为膜稳定剂掺入阳离子脂质体中，然而有研究表明阳离子脂质体中的胆固醇会引起毒性。

植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物，具有与胆固醇相似的母核结构。已有研究证明人参皂苷同样可以作为膜稳定剂，以取代胆固醇的作用。然而，其是否可以在保持阳离子脂质体膜稳定性能的同时，提高转染效率、降低毒性尚未被验证。另外，植物甾醇类化合物在降低体内胆固醇水平，促进伤口愈合方面具有良好的功效，而人参皂苷类化合物则具有优异的抗肿瘤效果。在将其作为膜稳定剂用于构建阳离子脂质体并进一步递送核酸类药物治疗动脉粥样硬化，高血压，创伤，肿瘤等疾病时，其本身的生物活性也会使该阳离子脂质体在某些应用场合具有普通阳离子脂质体无法比拟的优势。并且，提高阳离子脂质体长时间内的稳定性，改善其应用前景也是需要考虑的问题。因此，本发明旨在探讨与验证植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物替代胆固醇作为阳离子脂质体膜稳定剂并在提高转染效率与降低毒性方面的潜力以及开发一种有效的手段提高其在存储过程中的稳定性。

发明内容

本发明旨在解决的技术问题主要为目前阳离子脂质体用于核酸递送时，稳定性差、毒性较大、制备工艺复杂等问题，提供了一种以植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物为膜稳定剂的阳离子脂质体的制备方法与应用。此外，通过冻干法，本发明中的阳离子脂质体具有较好的稳定性，为其进一步的应用提供了保障。本发明制备的阳离子脂质体制备简单，用于核酸递送时，效率不亚于市售的脂质体2000，且稳定性好，毒性低。

本发明在解决技术问题时采用的技术方案为：

本发明首先提供了一种以植物甾醇类或人参皂苷类化合物为膜材的空白脂质体，所述的空白脂质体为阳离子脂质体，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含膜稳定剂，所述膜稳定剂为植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物中的一种或多种，

其中，植物甾醇类化合物如式I所示：

其中，R₁为

中的一种；

所述人参皂苷类化合物为人参皂苷PPT、人参皂苷PPD、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk2中的一种或多种

优选的，所述的阳离子脂质体中不含胆固醇，所述式Ⅰ所示的植物甾醇类化合物或式II所示的人参皂苷类化合物代替胆固醇作为膜稳定剂；所述植物甾醇类化合物为谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、燕麦甾醇中的一种或多种。

优选的，所述阳离子脂质体中，还包括阳离子脂质和助磷脂，所述阳离子脂质包括溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、双十烷基二甲基溴化铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、脂质多聚-L-赖氨酸中的一种或多种；助磷脂为二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；所述的阳离子脂质与膜稳定剂的质量比为0.1:1-50:1，较佳地为0.1:1-30:1。

优选的，所述阳离子脂质体中，所述的阳离子脂质与助磷脂的质量比为0.1:1-50:1，较佳地为0.1:1-30:1。

本发明中，所述的阳离子脂质体是一种粒径为50-600nm的阳离子脂质体，较优地为50-400nm，更优地为50-300nm，最优地为100-300nm。所述的阳离子脂质体具有10-60mv的表面电位，较优地为10-50mv，更优地为20-50mv，最优地为30-50mv。

优选的，所述阳离子脂质体可以采用薄膜分散法、真空干燥法、逆相蒸发法或冻融法制备。综合脂质体粒径、多分散指数与Zeta电位等因素，较优的制备方法为真空干燥法与薄膜分散法。

其中，薄膜分散法包括下列步骤：

将阳离子脂质、助磷脂和如式Ⅰ所述的植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物各自中的一种或多种溶解在乙醇当中，在旋转蒸发仪中形成一层薄膜，温度为30-75℃，较佳的为35-70℃，更佳的为40-65℃，最佳的为45-60℃。之后通过PBS水化得到脂质体悬液，水化过程的温度为30-75℃，较佳地的35-70℃，更佳的为40-65℃，最佳的为45-60℃，时间为5-40min,较佳的为10-35min。最后进行探头超声，探头超声的参数为1-20s超声时间，1-20s间歇时间，较佳的为1-15s超声时间，1-10s间歇时间，功率为300-800W，较佳的为350-700W，时间为1-30min，较佳的为1-20min。

薄膜分散法包括下列步骤：

将阳离子脂质、助磷脂和如式Ⅰ所述的植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物各自中的一种或多种溶解在乙醇当中，加入PBS形成油包水的乳液。利用旋转蒸发仪移除有机相，温度为30-75℃，较佳的为35-70℃，更佳的为40-65℃，最佳的为45-60℃。在这一过程中，会在瓶壁形成一层胶状物，继续旋蒸直至胶状物脱落并得到均一的脂质体悬液。之后进行探头超声，探头超声的参数为1-20s超声时间，1-20s间歇时间，较佳的为1-15s超声时间，1-10s间歇时间，功率为300-800W，较佳的为350-700W，时间为1-30min，较佳的为1-20min。

逆相蒸发法包括下列步骤：

将阳离子脂质、助磷脂和如式Ⅰ所述的植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物各自中的一种或多种溶解在乙醇当中，超声后在真空干燥箱中除去有机相，超声时间为10-120s，较佳的为10-100s，真空干燥的温度为30-75℃，较佳的为35-70℃，更佳地的40-65℃，最佳的为45-60℃。干燥后得到的物质用PBS进行水化后，用旋转蒸发仪进行旋蒸得到脂质体悬液，温度为30-75℃，较佳的为35-70℃，更佳的为40-65℃，最佳的为45-60℃，时间为20-120min，较佳的为30-100min。之后进行探头超声，探头超声过程的参数为1-20s超声时间，1-20s间歇时间，较佳的为1-15s超声时间，1-10s间歇时间，功率为300-800W，较佳的为350-700W，时间为1-30min，较佳的为1-20min。

冻融法包括下列步骤：

将阳离子脂质、助磷脂和如式Ⅰ所述的植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物各自中的一种或多种溶解在乙醇当中，利用旋转蒸发仪形成一层脂质薄膜，温度为30-75℃，较佳的为35-70℃，更佳的为40-65℃，最佳的为45-60℃。之后加入PBS进行水化，水化过程温度为30-75℃，较佳的为35-70℃，更佳的为40-65℃，最佳的为45-60℃，时间为20-120min，较佳的为30-100min。得到的脂质体悬液经探头超声并冻干后，室温解冻溶解，重复两次，探头超声过程的参数为1-20s超声时间，1-20s间歇时间，较佳的为1-15s超声时间，1-10s间歇时间超声时间，功率为300-800W，较佳的为350-700W，时间为1-30min，较佳的为1-20min。

本发明还公开了上述的阳离子脂质体在制备负载活性物质的脂质体中的应用，所述的负载活性物质的脂质体中的活性物质为核酸类药物，所述的核酸类药物为siRNA，mRNA、DNA中的一种或多种，所述的负载活性物质的脂质体是指将核酸类药物中的一种或多种包封于所述的空白脂质体中。

优选的，所述的阳离子脂质体与活性物质的质量比例为0.1:1-40:1，较佳地为0.5:1-30:1。

优选的，在负载所述活性物质之前，所述阳离子脂质体采用冻干法保持长时间的稳定性。冻干后的阳离子脂质体稳定性可延长至7-10周，即7-10周后的阳离子脂质体仍具有良好的粒径、PDI、Zeta电位和较高的核酸递送效率。

优选的，所述冻干法中采用的冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇中的一种或多种，所述的冻干保护剂与阳离子脂质体的质量比为0.1:1-20:1，较佳地为0.1:1-15:1。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

更为优先的，本发明提供一种上述的阳离子脂质体在制备治疗动脉粥样硬化、高血压、创伤或肿瘤的药物中的应用。即所制备的负载活性物质的脂质体作为治疗动脉粥样硬化、高血压、创伤或肿瘤的药物，此时，作为膜稳定剂的植物甾醇类化合物以及人参皂苷类化合物不仅可以保证阳离子脂质体在递送药物进行治疗时的高效性和低毒性，并且由于其本身的降低体内胆固醇水平，促进伤口愈合，抗肿瘤等生物活性，还可以进一步地增强治疗效果，达到协同作用。这种在疾病治疗时的潜在的双重性作用亦是普通阳离子脂质体无法胜任的。

本发明的有益之处在于：本发明制备的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、均一性好、制备工艺简单的优点，当将本发明的脂质体携载并递送核酸类药物时，与市售的脂质体2000相比，其中以最佳组分与处方制备的脂质体显示出更低的毒性与更高的递送效率。本发明所采用的膜稳定剂为植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物，赋予了阳离子脂质体高效低毒的特性。同时由于植物甾醇类化合物可以降低人体胆固醇水平，促进伤口愈合，以及人参皂苷类化合物在抗肿瘤方面的效果，以其为膜组分的的阳离子脂质体在递送核酸类药物治疗动脉粥样硬化，高血压，创伤，肿瘤等疾病时具有更加优秀的应用潜力。并且，植物甾醇类化合物及人参皂苷类化合物原料丰富，可从植物中提取，成本低。这将大大促进脂质体的临床应用和扩大转化，实现阳离子脂质体在基因治疗过程中的基因有效递送，对于基因治疗手段的开发具有关键的意义。

附图说明

图1-1、1-2分别为实施案例1得到的阳离子脂质体的粒径、电位分布图；

图2为实施案例1得到的阳离子脂质体的TEM图；

图3为实施案例1-4对应的制备方法得到的阳离子脂质体的粒径、PDI结果；

图4为实施案例1-4对应的制备方法得到的阳离子脂质体的电位结果；

图5为实施例5中阳离子脂质体载体与siRNA在不同比例下的凝胶电泳图，所述的siRNA为抗荧光素酶基因siRNA，1组为siRNA对照组，2组为脂质体2000/siRNA对照组，3-7组对应的本发明制得的阳离子脂质体与siRNA的比例依次为2.5:1、5:1、10:1、15:1、20:1；

图6为实施例6中本发明制得的阳离子脂质体在不同浓度(2.5、5、10、15μg/mL)时的细胞毒性，脂质体2000浓度为3.3μg/mL；

图7为实施例7空白对照组、siRNA组、脂质体2000/siRNA组、本发明制得的阳离子脂质体/siRNA组的抑制荧光素酶基因表达效率。A1、A2代表包含不同植物甾醇或人参皂苷的阳离子脂质体/siRNA组,其抗荧光素酶基因表达的效率要高于脂质体2000；

图8为空白对照组与在不同的冻干保护剂与脂质体比例(1:1、2:1、4:1、6:1、8:1)下，阳离子脂质体在冻干后8周内存储过程中粒径的变化情况；

图9为实施例8中8周内，对照组与在不同的冻干保护剂与脂质体比例下，经冻干后的脂质体复合siRNA后，对荧光素酶基因表达效率的影响情况。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明。

实验中所用的荧光素酶标记的人结直肠癌细胞是通过基因工程的方法构建的。细胞培养方法：将涉及的细胞株置于含5％CO₂的37℃培养箱中，用DMEM或RPMI1640完全培养基培养，每周传代2-3次。

实施例1薄膜分散法制备阳离子脂质体

称取3mg溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、3mg二油酰基磷脂酰乙醇胺和0.6mg人参皂苷Rh2(质量比为5:5:1)，加入3mL无水乙醇，溶解于25mL的茄形瓶中。原料溶解后，进行旋蒸，旋蒸时水浴的温度为55℃，直至茄形瓶内壁形成一层薄膜。加入1.5mL PBS进行水化，水化过程的温度为55℃，时间为20min，转速为200rpm。将水化后得到的脂质体悬液置于超声波细胞粉碎仪中进行冰浴超声，功率为500W，每次超声3s，间歇2s，总计5min。制得的脂质体于4℃下保存。

实施例2逆相蒸发法制备阳离子脂质体

称取3mg溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、3mg二油酰基磷脂酰和0.6mg人参皂苷Rh2(质量比为5:5:1)，加入3mL无水乙醇，溶解于25mL的茄形瓶中。加入1.5mL PBS，形成油包水的乳液。利用旋转蒸发仪旋蒸除去有机溶剂，水浴温度为55℃。在旋蒸过程中，瓶壁会形成一层胶状物，继续旋蒸直至胶状物脱落。将旋蒸得到的脂质体悬液置于超声波细胞粉碎仪中进行冰浴超声，功率为500W，每次超声3s，间歇2s，总计5min。制得的脂质体于4℃下保存。

实施例3真空干燥法制备阳离子脂质体

称取3mg溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、3mg二油酰基磷脂酰和0.6mg人参皂苷Rh2(质量比为5:5:1)，加入3mL无水乙醇，溶解于25mL的茄形瓶中，水浴超声30s。在真空干燥箱中移除有机溶剂，真空干燥的温度为50℃。在干燥后的物质中加入4mL PBS进行水化，水浴温度为50℃，时间为1h，转速为200rpm。将水化后得到的脂质体悬液置于超声波细胞粉碎仪中进行冰浴超声，功率为500W，每次超声3s，间歇2s，总计5min。制得的脂质体于4℃下保存。

实施例4冻融法制备阳离子脂质体

称取3mg溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、3mg二油酰基磷脂酰和0.6mg人参皂苷Rh2(质量比为5:5:1)，溶解于无水乙醇中。原料溶解后，进行旋蒸，旋蒸时水浴的温度为55℃，直至茄形瓶内壁形成一层薄膜。加入4.0mL PBS进行水化，水化过程的温度为50℃，时间为1h，转速为200rpm。将水化后得到的脂质体悬液置于超声波细胞粉碎仪中进行冰浴超声，功率为500W，每次超声3s，间歇2s，总计5min。将超声后的脂质体在-20℃的环境下冻干10h，室温复融，重复两次。制得的脂质体于4℃下保存。

图1-1、1-2分别为实施案例1得到的阳离子脂质体的粒径、电位分布图；图2为实施案例1得到的阳离子脂质体的TEM图；图3为实施案例1-4对应的制备方法得到的阳离子脂质体的粒径、PDI结果；图4为实施案例1-4对应的制备方法得到的阳离子脂质体的电位结果。从图中可以看出，在四种制备方法中，由薄膜分散法制备得的阳离子脂质体具有良好的粒径与电位综合效果。其粒径集中分布在130nm左右，且具有均一性，电位约为35mv。在透射电镜下，也显示出脂质体所具备的结构特征。

实施例5琼脂糖凝胶电泳法测定载体与siRNA结合比例

9μg/mL siRNA溶液与由实施例1制备的阳离子脂质体在Tris盐酸盐缓冲液中进行孵育，总体积20μL。室温孵育30min后，加入2μL 6×上样缓冲液。之后在1％的琼脂糖凝胶的1×TAE缓冲液中进行电泳，电压为100V，时间为40min。将电泳后的胶用2μL溴化乙锭进行染色。图5为由实施例1制备的阳离子脂质体载体与siRNA在不同质量比例下的凝胶电泳图，所述的siRNA为抗荧光素酶基因siRNA，1组为siRNA对照组，2组为脂质体2000/siRNA对照组，3-7组对应的本发明制得的阳离子脂质体与siRNA的比例依次为2.5:1、5:1、10:1、15:1、20:1。从图中可以看出，当脂质体与siRNA的质量比大于15:1时，可以形成对siRNA较好的包封效果。

实施例6阳离子脂质体的细胞毒性

利用MTT法测定脂质体的细胞毒性。将B16F10细胞以1×10⁵细胞个数每孔的密度接种于24孔板，孵育24h后，移除培养基，用不含胎牛血清的DMEM培养基替代(500μL/孔)。设置PBS对照组，3.3μg/mL脂质体2000组，本发明所制得的阳离子脂质体组(2.5,5.0,10,15μg/mL)，将对应的组别加入孔中，37℃孵育6h。之后，用含胎牛血清的DMEM培养基移除脂质体，孵育18h后，用PBS洗两遍。加入5mg/mL的MTT的DMEM溶液，孵育4h后，用DMSO移除培养介质并溶解甲瓒，测定细胞活性。图6为由实施例1制得的阳离子脂质体在不同浓度(2.5、5、10、15μg/mL)时的细胞毒性，脂质体2000浓度为3.3μg/mL。从图中可以看出，在不同的浓度组别下，即使达到15μg/mL，阳离子脂质体组的细胞存活率均要高于脂质体2000组。

实施例7阳离子脂质体用于siRNA递送的效率评估

按照每孔5×10⁴的细胞数将HCT116-Luc种在24孔板中，达到80％覆盖率后，弃去培养液，用PBS洗两遍。每孔加入0.5mL不含胎牛血清的RPM1640培养液。设计空白对照组、siRNA组、脂质体2000/siRNA组、阳离子脂质体/siRNA组，载体与siRNA的质量比为10:1，每组三个重复，载体与siRNA复合物的最终浓度为1μg/mL。37℃孵育6h后，用包含胎牛血清的RPM1640培养液移除剩余的载体，孵育18h后，用PBS洗两遍并收集细胞。利用荧光素酶报告基因试剂盒测量荧光素酶的活性。图7为实施例7中空白对照组、siRNA组、脂质体2000/siRNA组、本发明制得的阳离子脂质体/siRNA组的抑制荧光素酶基因表达效率。A1、A2代表包含不同植物甾醇或人参皂苷的阳离子脂质体/siRNA组,其抗荧光素酶基因表达的效率要高于脂质体2000。从图中可以看出，与脂质体2000相比，两种不同的阳离子脂质体均显示出相当的抑制荧光素酶基因表达的效率，证明了其在转染时的高效性。

实施例8冷冻干燥法处理后的阳离子脂质体的稳定性

将脂质体以10mg/mL的浓度分散于含海藻糖的PBS中，海藻糖与脂质体的质量比设为1:1、2:1、4:1、6:1、8:1。取1mL放置于5mL的玻璃小瓶中，在冻干机中进行冻干。首先将试样在-80℃冷冻12h，干燥过程分两个阶段：-55℃，100μbar，24h；20℃，20μbar，24h。冻干完成后，将玻璃瓶进行密封。4℃储存一定时间后，评价siRNA的递送效率，步骤参见实施例6。图8为空白对照组与在不同的冻干保护剂与脂质体比例(1:1、2:1、4:1、6:1、8:1)下，阳离子脂质体在冻干后8周内存储过程中粒径的变化情况。从图中可以看出，特定冻干保护剂与脂质体比例下，其粒径不会有显著的变化，说明脂质体在存储过程中并未有明显的聚集情况。图9为实施例8中8周内，对照组与在不同的冻干保护剂与脂质体比例下，经冻干后的脂质体复合siRNA后，对荧光素酶基因表达效率的影响情况。从图中可以看出，在特定冻干保护剂与脂质体比例下，即使是在第8周，脂质体依然具有良好的转染效率，约为新鲜制备时的80％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种高效低毒且稳定性良好的用于基因递送的空白脂质体，其特征在于，所述的空白脂质体为阳离子脂质体，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含膜稳定剂，所述膜稳定剂为植物甾醇类化合物或人参皂苷类化合物中的一种或多种，

其中，植物甾醇类化合物如式I所示：

其中，R₁为

中的一种；

所述人参皂苷类化合物为人参皂苷PPT、人参皂苷PPD、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk2中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质体中不含胆固醇，所述式Ⅰ所示的植物甾醇类化合物或式II所示的人参皂苷类化合物代替胆固醇作为膜稳定剂；所述植物甾醇类化合物为谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、燕麦甾醇中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体中，还包括阳离子脂质和助磷脂，所述阳离子脂质包括溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、双十烷基二甲基溴化铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、脂质多聚-L-赖氨酸中的一种或多种；助磷脂为二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；所述的阳离子脂质与膜稳定剂的质量比为0.1:1-50:1，较佳地为0.1:1-30:1。

4.根据权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体中，所述的阳离子脂质与助磷脂的质量比为0.1:1-50:1，较佳地为0.1:1-30:1。

5.根据权利要求1-4任一项所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体采用薄膜分散法、真空干燥法、逆相蒸发法或冻融法制备。

6.权利要求1-4任一项所述的阳离子脂质体在制备负载活性物质的脂质体中的应用，所述的负载活性物质的脂质体中的活性物质为核酸类药物，所述的核酸类药物为siRNA，mRNA、DNA中的一种或多种，所述的负载活性物质的脂质体是指将核酸类药物中的一种或多种包封于如权利要求1-4任一项所述的空白脂质体中。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的阳离子脂质体与活性物质的质量比例为0.1:1-40:1，较佳地为0.5:1-30:1。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在负载所述活性物质之前，所述阳离子脂质体采用冻干法保持长时间的稳定性。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述冻干法中采用的冻干保护剂为葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇中的一种或多种，所述的冻干保护剂与阳离子脂质体的质量比为0.1:1-20:1，较佳地为0.1:1-15:1。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述负载活性物质的脂质体作为治疗动脉粥样硬化、高血压、创伤或肿瘤治疗的药物。

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