CN106540271A - 一种阳离子脂质体基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型阳离子脂质体基因载体及其制备方法和应用，将二棕榈酰磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵溶于氯仿‑甲醇溶液中并使其充分溶解，其中，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵的摩尔比例为1:1~1:5，制得类脂溶液，然后用稳定的氮气流将所述类脂溶液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，干燥后加入蒸馏水进行水化处理，然后进行第一次超声处理，得到透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融数次，然后进行第二次超声处理，即得阳离子脂质体基因载体。通过该制备方法得到的阳离子脂质体基因载体性质稳定，构成的阳离子脂质体药物制剂的包封率和转染效率较高。

Description

一种阳离子脂质体基因载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种新型的非病毒基因给药载体，具体涉及一种新型阳离子脂质体基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
随着分子生物学的发展以及人类基因组计划的完成，基因治疗为遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病以及心脑血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病防治提供了一种极富前景的治疗方法。该方法是将正常基因或有治疗作用的基因通过特定方式导入靶细胞以纠正基因缺陷，最终达到治疗疾病的目的。与传统治疗方法相比，基因治疗可针对目的细胞进行特异性治疗，具有长期疗效。但由于外源基因进入细胞后易被核酸酶全部或部分降解，使外源基因表达效率降低，因此，选择安全高效的基因传递载体携带基因进入细胞并完成基因表达是实现基因治疗的关键。基因传递载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体尽管转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性等多种弊端，限制了其在临床基因治疗上的应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性好、无免疫原性、导入基因容量大、易于规模化生产等优势，在临床应用和治疗过程中可以替代病毒载体，具有重要的应用潜力。因此，
研制安全高效的非病毒基因载体是目前基因治疗中亟待解决的问题。
阳离子脂质体(cationic liposomes,CLs)是目前非病毒基因载体领域的研究热点，其介导的基因转移具有无毒无免疫原性、可重复转染、外源基因不易被降解等优点。1987年，阳离子脂质体首先由Felgner等应用于核酸类药物的传递。目前，阳离子脂质体介导的基因转移被认为是最具发展前景的基因治疗方法。
但是，阳离子脂质体载体材料的脂质组成成分、组成比例以及制备的工艺过程，都会影响到其作为基因载体时的转染效率，从而直接影响到其能否有效保护所携带的外源基因并完成穿膜-入核-表达这一完整的基因治疗过程。虽然国内外研究人员设计开发了多种阳离子脂质体载体材料，并将之应用于细胞转染中，但由于这些载体材料自身存在的不稳定性、转染效率低等特点，真正能广泛应用于临床的阳离子脂质体基因载体材料仍然很少。
阳离子脂质体是基因治疗常用的非病毒载体，其携带的基因转染无插入突变的危险，可携带大片段DNA，而且无毒、无免疫原性，可容纳亲水性和疏水性物质。目前研究结果发现使用阳离子脂质体转移基因，能明显诱导体内入骨肉瘤细胞的凋亡。当用经转铁蛋白修饰的阳离子脂质体转运p53基因后导入预先移植有入骨肉瘤细胞的裸鼠体内，发现肿瘤停止生长且体积明显缩小至对照组的10％左右，同时还发现Bax基因转录活性与p53依赖的凋亡途径直接相关，即基因的激活也依赖于野生型基因的活性，证实了阳离子脂质体在骨肉瘤基因治疗中有重要的作用。虽然阳离子脂质体应用于基因治疗的实验室研究取得了一定的初步成果，但距离临床治疗的广泛应用还远远不够。
如何提高转染效率、降低细胞毒性是影响阳离子脂质体作为非病毒载体应用于基因治疗的关键。另外，阳离子脂质体基因载体的物理化学性质，如粒径、脂质聚集态结构等因素对于转染效率也具有影响。因此，构建安全高效的阳离子脂质体基因载体材料，实现其在基因治疗过程中的基因有效传递，对基因治疗手段的开发具有关键的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种阳离子脂质体基因载体及其制备方法和应用，
通过该制备方法得到的阳离子脂质体基因载体性质稳定，其复合核酸的包封率较高、转染效率较高和细胞毒性较低。
本发明采用的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种阳离子脂质体基因载体的制备方法，包括以下步骤：
将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)溶于氯仿-甲醇溶液中并使其充分溶解，制得类脂溶液，然后用稳定的氮气流将所述类脂溶液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，干燥，干燥后加入水进行水化处理，水化处理后进行第一次超声处理，得到透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融数次，冻融后进行第二次超声处理后即得阳离子脂质体基因载体。
经过大量实验验证和分析，所述DPPC和DODAB的摩尔比例为1：1～1：5时，后续载基因的包封率效果和转染效率较佳。最优选的是，所述DPPC和DODAB的摩尔比例为1：3。
优选的，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱的质量与氯仿-甲醇溶液的体积比例为20mg：20～30mL。
优选的，制成薄膜的温度为30～40℃。
优选的，所述旋转的速度为120～160r/min，进一步优选的，所述旋转的速度为140r/min。
优选的，所述第一次超声处理的时间为20～40min，进一步优选的为25～35min，最优选的为30min。第一次超声处理时间对脂质体基因载体的分散均匀性影响较大，经过实验验证和优化，优选超声处理时间为20～40min。
优选的，所述第二次超声处理时间为10～20min，进一步优选的为15min。聚集程度随着超声时间增加而减弱，经过实验优化得到，第二次超声时间10～20min可以得到分散更加均匀的脂质体基因载体。
优选的，冻融方法为：冰箱-18～-25℃冷冻后室温融化，室温为15～37℃。
优选的，将得到的脂质体溶液进行反复冻融四次。实验发现，经4次重复冻融后，脂质体的粒径分布更加均匀，但是当冻融次数增加到5次，脂质体粒径变化很小。
优选的，所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比为1：1～2，进一步优选的为1：1。
本发明的第二个方面，还保护采用上述方法制备得到的阳离子脂质体基因载体。
本发明的第三个方面，提供一种阳离子脂质体核酸类药物制剂，其包含所述阳离子脂质体基因载体、核酸类药物制剂平衡液和待复合核酸。
其中，所述待复合核酸是RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、miRNA及siRNA中的一种或两种以上的混合物。
优选的，所述核酸类药物制剂平衡液为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液或生理盐水。
本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂中，阳离子脂质体：平衡液＝(5～25)mL：100mL，优选为(10～20)g：100mL。
阳离子脂质体基因载体中的氮的摩尔含量和核酸中磷的摩尔含量之比(N/P比)为2～20：1，优选的为8～16：1，进一步优选的为12～16：1。
本发明的第四个方面，提供一种阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述阳离子脂质体在所述核酸类药物制剂平衡液中平衡；
(2)将待复合核酸加入平衡后的阳离子脂质体与核酸类药物制剂平衡液的混合物中进行复合反应。
其中，所述平衡时间为0.5～2h，优选为0.5～1.5h。
所述复合时间为0.5～5h，优选为0.5～2h。
上述阳离子脂质体和/或核酸类药物制剂在制备由基因异常表达引起的相关疾病的治疗药物中的用途。
本发明的有益效果是：
本发明从阳离子脂质成分、中性脂质成分、组成配比、制备工艺等方面，全面考察了脂质体的稳定性、转染效率、细胞毒性和包封率，筛选和设计获得性质稳定和细胞毒性低，在多种细胞转染效率高，与多种外源基因均可有效结合与释放的阳离子脂质基因载体。具体到脂质成分而言，本发明筛选优化得到，以DODAB为阳离子脂质，DPPC为空间稳定脂质，可以与DODAB结合形成稳定的双层膜结构，能够降低阳离子头部的细胞毒性作用并且使其转染效率和包封率较高。具体到脂质成分比例而言，脂质成分比例对阳离子脂质体作为基因载体时的转染效率产生影响，从而直接影响到其能否有效保护所携带的外源基因并完成穿膜-入核-表达这一完整的基因治疗过程，本发明筛选优化得到，所述DPPC和DODAB的摩尔比例为1：1～1：5时，其转染效率相比于其他摩尔比例的较突出。
在本发明的阳离子脂质基因载体的制备方法中，采用薄膜分散法和冻融法相结合的技术方法以及其中的两次超声处理，使得脂质体聚集现象降低，分散更加均匀，粒径较小且较均匀，体系的稳定性更高，从而使得阳离子脂质体基因载体的转染效率较高。
其中制备基因载体时，采用的冻融超声法，在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合经过超声处理重新形成分散性更加均匀的脂质体。
阳离子脂质体进行基因转染的前提是与待转染的核酸形成阳离子脂质体/核酸复合物，常规的阳离子脂质体与核酸进行复合时，阳离子脂质体需要过量才能将核酸实现完全包裹，因此需要消耗大量的阳离子脂质体，导致细胞毒性较大。本发明制备的阳离子脂质体其粒径均匀，荷正电多分布于脂质体表面，当N/P比例为(12-16):1时即可基本实现对核酸的完全复合，大大减少了阳离子脂质体的用量，降低了细胞毒性。
本发明制备得到的阳离子脂质体基因载体的包封率高达90.6％，粒径为100～150nm。
附图说明
图1是实施例1中的脂质体透射电镜照片。
图2是对比例1中的脂质体透射电镜照片。
图3是对比例2中的脂质体透射电镜照片。
图4是对比例3中的脂质体透射电镜照片。
图5是实施例4和对比例阳离子脂质体核酸类药物制剂血清稳定性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1阳离子脂质体基因载体的制备
称取DPPC和DODAB，两者的摩尔比例为1：3，置于500ml磨口圆底烧瓶中，加入20m1的氯仿一甲醇(1:1，v/v)混合溶剂使其充分溶解，制得类脂溶液。将圆底烧瓶置于恒温40℃水浴上，通入氮气，在140r/min转速下旋转蒸发使脂质在圆底烧瓶的瓶内壁成为均匀薄膜。再继续通入氮气10min。将干燥后的薄膜用一定量的二次蒸馏水在旋转蒸发器上旋转洗膜，将得到的水化液转入密闭的锥形瓶中，在杯浴式超声器上进行第一次超声处理，处理时间为30min，得到比较透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融四次(冰箱-20℃冷冻后室温融化，室温为15～37℃)，然后进行第二次超声处理后，处理时间为15min，即得阳离子脂质体基因载体。
实施例2阳离子脂质体基因载体的制备
称取DPPC和DODAB，两者的摩尔比例为1：1，置于500ml磨口圆底烧瓶中，加入25m1的氯仿一甲醇(1:2，v/v)混合溶剂使其充分溶解，制得类脂溶液。将圆底烧瓶置于恒温37℃水浴上，通入氮气，在130r/min转速下旋转蒸发使脂质在圆底烧瓶的瓶内壁成为均匀薄膜。再继续通入氮气15min。将干燥后的薄膜用一定量的二次蒸馏水在旋转蒸发器上旋转洗膜，将得到的水化液转入密闭的锥形瓶中，在杯浴式超声器上进行第一次超声处理，处理时间为25min，得到比较透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融四次(冰箱-18℃冷冻后室温融化，室温为15～37℃)，然后进行第二次超声处理后，处理时间为20min，即得阳离子脂质体基因载体。
实施例3阳离子脂质体基因载体的制备
称取DPPC和DODAB，两者的摩尔比例为1：4，置于500ml磨口圆底烧瓶中，加入30m1的氯仿一甲醇(1:2，v/v)混合溶剂使其充分溶解，制得类脂溶液。将圆底烧瓶置于恒温35℃水浴上，通入氮气，在150r/min转速下旋转蒸发使脂质在圆底烧瓶的瓶内壁成为均匀薄膜。再继续通入氮气15min。将干燥后的薄膜用一定量的二次蒸馏水在旋转蒸发器上旋转洗膜，将得到的水化液转入密闭的锥形瓶中，在杯浴式超声器上进行第一次超声处理，处理时间为40min，得到比较透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融四次(冰箱-25℃冷冻后室温融化，室温为15～37℃)，然后进行第二次超声处理后，处理时间为10min，即得阳离子脂质体基因载体。
实施例4阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
(1)制备核酸类药物制剂平衡液：取生理盐水作为核酸类药物制剂的平衡液。
(2)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取8mL的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂平衡液，平衡30min。按照N/P比为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20：1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂平衡液混合，复合1h，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
本发明中所述的N/P比是阳离子脂质体基因载体中的氮的摩尔含量和核酸中磷的摩尔含量之比，这是基因转染领域中的技术人员所熟知的常识，在此不再赘述。
对比例1
称取DPPC和DODAB，两者的摩尔比例为1：3，置于500ml磨口圆底烧瓶中，加入20m1的氯仿一甲醇(1:1，v/v)混合溶剂使其充分溶解，制得类脂溶液。将圆底烧瓶置于恒温40℃水浴上，通入氮气，在140r/min转速下旋转蒸发使脂质在圆底烧瓶的瓶内壁成为均匀薄膜。再继续通入氮气10min。将干燥后的薄膜用一定量的二次蒸馏水在旋转蒸发器上旋转洗膜，将得到的水化液转入密闭的锥形瓶中，在杯浴式超声器上进行第一次超声处理，处理时间为30min，得到比较透明的脂质分散液，即得阳离子脂质体基因载体，其透射电镜照片如图2所示，与图1相比，该方法制备得到的阳离子脂质体基因载体聚集较为严重。冻融处理对基因载体的分散性影响较大。
阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备：
(1)制备核酸类药物制剂平衡液：取生理盐水作为核酸类药物制剂的平衡液。
(2)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取上述8mL的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂平衡液，平衡30min。按照N/P比为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20：1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂平衡液混合，复合1h，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
对比例2
称取DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)和DC-Chol(3β-[N—(N′，N′-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇)，两者的摩尔比例为1：3，置于500ml磨口圆底烧瓶中，加入20m1的氯仿一甲醇(1:1，v/v)混合溶剂使其充分溶解，制得类脂溶液。将圆底烧瓶置于恒温40℃水浴上，通入氮气，在140r/min转速下旋转蒸发使脂质在圆底烧瓶的瓶内壁成为均匀薄膜。再继续通入氮气10min。将干燥后的薄膜用一定量的二次蒸馏水在旋转蒸发器上旋转洗膜，将得到的水化液转入密闭的锥形瓶中，在杯浴式超声器上进行第一次超声处理，处理时间为30min，得到比较透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融四次，然后进行第二次超声处理后，处理时间为15min，即得阳离子脂质体基因载体。透射电镜照片如图3所示，从图中可见，该方法制备得到的阳离子脂质体基因载体聚集较为严重，分散不明显。
阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备：
(1)制备核酸类药物制剂平衡液：取生理盐水作为核酸类药物制剂的平衡液。
(2)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取上述8mL的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂平衡液，平衡30min。按照N/P比为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20：1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂平衡液混合，复合1h，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
对比例3
称取DODAB和DPPC，两者的摩尔比例为1：2，置于500ml磨口圆底烧瓶中，加入20m1的氯仿一甲醇(1:1，v/v)混合溶剂使其充分溶解，制得类脂溶液。将圆底烧瓶置于恒温40℃水浴上，通入氮气，在140r/min转速下旋转蒸发使脂质在圆底烧瓶的瓶内壁成为均匀薄膜。再继续通入氮气10min。将干燥后的薄膜用一定量的二次蒸馏水在旋转蒸发器上旋转洗膜，将得到的水化液转入密闭的锥形瓶中，在杯浴式超声器上进行第一次超声处理，处理时间为30min，得到比较透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融四次，然后进行第二次超声处理后，处理时间为15min，即得阳离子脂质体基因载体。透射电镜照片如图4所示，从图中可见，该方法制备得到的阳离子脂质体基因载体聚集较为严重，分散不明显。
阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备：
(1)制备核酸类药物制剂平衡液：取生理盐水作为核酸类药物制剂的平衡液。
(2)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：称取上述8mL的阳离子脂质体，溶于100mL核酸类药物制剂平衡液，平衡30min。按照N/P比为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20：1分别取相应量的siRNA溶于10μL的生理盐水，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂平衡液混合，复合1h，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
实验例1透射电镜(TEM)检测
利用透射电镜负染技术，对制备好的脂质体进行透射电镜检测，目的是观察所制备脂质体的形态是否稳定。通过透射电镜检测，观察到所制备的脂质体外观呈规则圆球形，另外，还可以观察到脂质双分子层结构。如图1所示，为实施例1中的脂质基因载体透射电镜照片，从图中可以看出，脂质体分散均匀，通过对每个脂质体颗粒半高宽的测量，求出统计平均值，结果得到脂质体粒径大约为100－150nm。如图2～4所示，为对比例1、2和3中的脂质体基因载体透射电镜照片，相比于图1而言，脂质体聚集现象较为严重。
实施例2粒径及表面电势(Zeta potential)的测定
本发明以Zetaszier Nano-ZS测量测定载体的粒径及其表面电位。结果平均粒径为126.38nm，粒径分布系数PDI＝0.243。
粒径分布系数体现了粒子粒径均一程度，是粒径表征的一个重要指标。从图1～4中，图1中的粒径分布相对较均匀和分散较均匀。
实施例3阳离子脂质体核酸类药物制剂的血清稳定性的研究
体内循环过程中存在大量带负电荷的血清蛋白，易与正电荷的阳离子脂质体发生吸附，形成大尺寸的聚集体而被单核吞噬系统清除，导致阳离子脂质体基因转染效率降低。本实验考察了本发明所述阳离子脂质体核酸类药物制剂的血清稳定性。将N/P比为12/1和16/1的基因制剂(实施例4所述)和对比例1、2和3(N/P比为12/1)加入含有8％胎牛血清(FBS)的培养基中，在37℃条件下搅拌，定时取样测定核酸类药物制剂的粒径变化，通过粒径变化来分析核酸类药物制剂的血清稳定性。结果如图5所示，在10天内，本发明的阳离子脂质体核酸类药物制剂的粒径变化小，说明其具有很好的血清稳定性，图5中A表示实施例4中N/P比为12/1的核酸类药物制剂的血清稳定性，B表示实施例4中N/P比为16/1的核酸类药物制剂的血清稳定性。而对比例1、2和3的变化较大，说明其血清稳定性较差。图5种C、D和E分别表示对比例1、2和3中的核酸类药物制剂的血清稳定性。
实验例4阳离子脂质体核酸类药物制剂的细胞毒性
良好的生物相容性是核酸类药物制剂应用的前提，本实验采用COS-7和MCF-7细胞模型，考察了不同N/P比条件下的阳离子脂质体核酸类药物制剂的细胞毒性。将COS-7和MCF-7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，培养24h。将不同N/P比的含有0.25μgsiRNA的制剂(实施例4所述)加入含有8％FBS的培养基中，培养24h。每孔加入8μL的MTT于培养基中，在37℃条件下孵育4h。移除培养基，加入100μL的DMSO，在37℃条件下孵育5min，溶解MTT结晶。采用酶联免疫检测仪在波长为490nm条件下测定吸光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。本发明阳离子脂质体核酸类药物制剂在不同N/P比下，结果见表1，细胞存活均大于80％，说明该核酸类药物制剂具有很好的生物相容性。
细胞存活率＝药物组吸光度值/参照组吸光度值(空白)×100％。
表1：细胞毒性考察结果
实验例5阳离子脂质体/DNA复合物的制备及转染活性评价
用移液枪取一定量的阳离子脂质体基因载体(实施例1、2和对比例1～3)稀释于一定体积的去离子水中，取一定量的质粒pEGFP-N1稀释于一定体积的去离子水中，平衡30min后，将含质粒pEGFP-N1去离子水缓慢加入到含有阳离子脂质体的溶液中，混合均匀，复合时间为30min，配成一定比例的阳离子脂质体/DNA复合物溶液，用于转染活性评价。
具体操作如下：每孔DNA的用量为0.9ug，稀释到50uL无血清的DMEM培养液中，轻轻混匀，平衡30min。将上述阳离子脂质体分为六个梯度3uL，9uL，18uL，21uL，25uL，30uL分别加入到50uL无血清的DMEM培养液，将稀释的脂质体加入DNA溶液中混匀，室温静置20min。相对应的N/P＝1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20：1。
培养Hela细胞或293细胞，传入24孔板，密度为0.6×105个/mL，待细胞达到50-60％进行转染。在转染前，将24孔板的培养液换成500uL不含抗生素的培养液培养。将100uL脂质体/DNA复合物加入到细胞中，补加无血清DMEM 300ul，轻轻混匀，常规条件培养，细胞孵育24小时后，换成含10％血清DMEM培养液。继续培养24小时后常规处理后流式细胞仪观测。
实验结果
转染评价实验结果表明，上述三种脂质材料实施例1、2都有良好的基因转染效果，在HeLa，293细胞株的pEGFP基因转染评价中显示出好的基因表达效率。与对比例相比，在最佳N/P比时，实施例1和2的基因载体的转染效果明显优于对比例。研究表明本发明特定的脂质材料和制备工艺可明显提高转染效果，可望开发应用作为高效的阳离子脂质体材料和基因转染试剂，部分活性测定结果如表2。
基因转染效果的评价试验方法是本领域技术人员公知的，在此不进行赘述。
表2：脂质材料对不同细胞株的转染效果
实验例6包封率的测定
使用葡聚糖凝胶过滤法测定包封率，分离实验例5中复合物的脂质体和游离DNA，紫外分光光度法测定游离DNA的量，DNA总量与游离DNA的量分别记为C0和C1，按公式：包封率/％＝(1-C1/C0)×100％，计算脂质复合物的包封率为90.6％左右。相比于对比例1～3中的阳离子脂质体载体复合DNA的包封率在60～80％左右，可见，本发明的工艺方法制备得到的阳离子脂质体基因载体的包封率效果十分突出。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种阳离子脂质体基因载体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
将二棕榈酰磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵溶于氯仿-甲醇溶液中并使其充分溶解，其中，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱和双十八烷基二甲基溴化铵的摩尔比例为1:1~1:5，制得类脂溶液，然后用稳定的氮气流将所述类脂溶液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，干燥，干燥后加入水进行水化处理，水化处理后进行第一次超声处理，得到透明的脂质分散液，然后再将分散液进行反复冻融数次，冻融后进行第二次超声处理，即得阳离子脂质体基因载体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述二棕榈酰磷脂酰胆碱的质量与氯仿-甲醇溶液的体积比例为20mg：20~30mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：制成薄膜的温度为30~40℃。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：第一次超声处理时间为20~40min；第二次超声处理时间为10~20min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：冻融方法为：冰箱-18~-25℃冷冻后室温融化；将得到的脂质体溶液进行反复冻融四次。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述氯仿-甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比为1：1~2。
7.采用权利要求1~6中任一项所述的方法制备得到的阳离子脂质体基因载体。
8.一种阳离子脂质体核酸类药物制剂，其特征是：其包含权利要求7所述的阳离子脂质体基因载体、核酸类药物制剂平衡液和核酸类药物。
9. 如权利要求8所述的制剂，其特征是：所述核酸类药物是RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、miRNA及siRNA 中的一种或两种以上的混合物；
所述核酸类药物制剂平衡液为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液或生理盐水；
所述阳离子脂质体：平衡液＝ (5～ 25)mL：100mL，优选为(10～ 20)g ：100mL。
10.权利要求8或9所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备方法，其特征是：
(1) 将所述阳离子脂质体在所述核酸类药物制剂平衡液中平衡；
(2) 将待复合核酸加入平衡后的阳离子脂质体与核酸类药物制剂平衡液的混合物中进行复合反应。
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