CN105106116A - 一种脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法和应用。所述的脂质体核酸疫苗佐剂由阳离子脂质、辅助脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质和靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质分子组成。本发明中的靶向分子有利于体系靶向到免疫细胞,阳离子脂质通过静电作用负载核酸疫苗,聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质有利于核酸疫苗从细胞内涵体逃逸出来进入细胞核进行表达,提高核酸提呈效率,产生佐剂效果,显著增强免疫应答。本发明不仅解决了传统减毒和灭活疫苗因灭活失败可能导致的接种感染,及在生产过程中对生物安全的严苛要求等问题,同时本发明制备工艺简化,生物安全性好,可被开发应用于如艾滋病、肿瘤等人类重大疾病的预防和免疫治疗。
Description
技术领域
本发明涉及核酸疫苗领域,尤其涉及一种脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法和在预防和免疫治疗疫苗领域的应用。
背景技术
目前,传染性疾病(如艾滋病、非典型肺炎等)或某些慢性疾病(如肿瘤等)的发生、流行严重地威胁着人类的健康和社会的稳定。疫苗(一类具有生物活性的制品)是目前人类可以控制某一传染性疾病的唯一武器,预防接种不但保护了机体免受传染病病原体的侵袭,而且在群体中也限制了病原微生物的传播。
传统由减毒或灭活的病原微生物制得的、具有刺激机体产生针对病原微生物的特异抗体/细胞免疫的减毒疫苗或灭活疫苗,虽然有效地控制了许多传染病,但是这些疫苗仍然存在一定的缺陷,如:(1)减毒活疫苗能够刺激机体产生体液免疫,还能产生细胞免疫。与灭活疫苗(死疫苗)相比,这类疫苗免疫力强、作用时间长,但存在因减毒不彻底而导致的感染的风险,具有潜在的致病危险(有可能因发生逆行突变而在人体内恢复毒力);(2)灭活疫苗一般只能刺激机体产生抗病毒外膜蛋白的循环性抗体IgM和IgG,表现了一定程度的保护力,但由于所提供的免疫力较短暂,为完成全程免疫,往往需要多次接种,因而可能出现过敏反应。
鉴于上述问题,核酸疫苗倍受青睐。核酸疫苗是近年发展的一种核酸介导的免疫接种疫苗,其本质是含有病原体抗原基因的真核表达载体,当其被导入机体后,可被机体细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白,从而诱发机体对该蛋白的免疫反应。随着导入途径和部位的不同可引发全身或局部的免疫反应。在全身性的免疫应答反应中,既可激活体液免疫,也可诱发细胞免疫。与传统疫苗相比,核酸疫苗具有一定的优势,然而,实验发现,DNA疫苗易被DNA酶、溶酶体降解破坏,无法有效表达,故只能产生微弱的体液和细胞免疫。因此,为了提高DNA疫苗的免疫应答,有必要构建一种理想的载体,与DNA疫苗共同导入机体。
脂质体具有类细胞结构,进入体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能,并改变被包封物质的体内分布;脂质体既无毒性也无免疫原性且在体内可生物降解,不会发生载体材料体内积累而引发的毒性反应。
阳离子脂质体虽然能够通过带正电的阳离子脂质和带负电的核酸分子间的静电作用相复合,有效携载核酸分子;然而,其存在以下两个困难:(1)核酸疫苗需要在细胞核中才能发挥作用,而阳离子脂质体核酸体系进入细胞后无法有效地从内含体中逃逸,因而无法进入细胞核,最终导致免疫应答弱或者无免疫应答;(2)阳离子脂质体核酸体系缺乏靶向性,不能富集在目标释放位点,因而有效输递率低,免疫应答弱。
近年来,阳离子脂质体在核酸疫苗的研制中已引起广泛的关注,探索高效内吞、有效内含体逃逸、靶向性好的核酸疫苗体系可能是疫苗研发的一条有效途径。如何研发一种新型脂质体核酸疫苗体系,其能够使其靶向进入目标细胞、提高核酸体系的细胞内吞,增强内含体逃逸性能,促进核酸分子的高效释放,显著增强机体的免疫应答是目前亟待解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中的不足,本发明提供了一种脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法和应用,特别是提供了一种用于提高核酸疫苗体系的靶向性、抗原表达能力以及免疫应答的脂质体核酸疫苗佐剂及其制备方法和在预防和免疫治疗疫苗领域的应用。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种脂质体核酸疫苗佐剂,其是由阳离子脂质、辅助脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质和靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质组成。特别是提供了一种具有提高核酸抗原提呈能力、增强免疫应答作用的脂质体核酸疫苗佐剂剂型。
本发明的脂质体核酸疫苗佐剂中,靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质有利于体系靶向免疫细胞;阳离子脂质通过静电作用负载核酸疫苗;聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质保护核酸免于降解,并有利于核酸疫苗从免疫细胞的内涵体逃逸出来进入细胞核进行表达,提高核酸疫苗的提呈效率,诱导细胞免疫和体液免疫,同时刺激抗原提呈细胞产生免疫细胞因子,产生佐剂效果,辅助增强免疫应答作用。
本发明中,所述的聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质为1,2-十八酰基-sn-甘油-聚羧基三甲胺乙内酯(DG-PCBn)、胆固醇-聚羧基三甲胺乙内酯(DC-PCBn)、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚羧基三甲胺乙内酯(DOPE-PCBn)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基三甲胺乙内酯(DSPE-PCBn)或α-十六烷基丙三醇醚-聚羧基三甲胺乙内酯(HG-PCBn)中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地,本发明所述聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质为DSPE-PCBn、DOPE-PCBn或DG-PCBn中的任意一种或至少两种的混合物。
其中,本发明所述的聚羧基三甲胺乙内酯(PCBn)的聚合度n为1~200之间任意整数,例如可以是1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、120、140、150、160、180、200,优选为1~100之间任意整数,进一步优选为5~50之间任意整数,更优选为10~40间任意整数。
本发明中,所述阳离子脂质为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、精胺-5-羧基-氨基乙酸二十八烷基-酰胺(DOGS)、双油基双甲基氯化铵、N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基丙酰基-胆固醇(DC-Chol)、N,N-二甲基-N-羟乙基-N-(1,2-双十四烷氧基)丙基溴化铵、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基丙胺、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基丙胺或二硬脂基二甲基铵盐中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地,所述阳离子脂质为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)和/或N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)。
本发明中,所述辅助脂质为胆固醇、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地,所述辅助脂质为胆固醇。
优选地,所述靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质中的靶向分子为抗体类、小分子类或适配体类中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地,所述靶向分子为小分子类;进一步优选为糖类、肽类、生长因子或维生素类中的任意一种或至少两种的混合物;更优选为叶酸分子、甘露糖分子、RGD分子、乳铁蛋白分子或转铁蛋白分子中的任意一种或至少两种的混合物,最优选为甘露糖分子。
本发明中,所述阳离子脂质:辅助脂质:(聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质+靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质)三者的摩尔比=1:1:x,其中x=0.01~0.99,例如x可以是0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、0.9、0.99,优选为0.1~0.8,更优选为0.2~0.6。
本发明中,所述靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质:(聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质+靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质)的摩尔比为1%~60%,例如可以是1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%,优选为5%~50%,进一步优选为10%~30%。
第二方面,本发明还提供了一种如第一方面所述的脂质体核酸疫苗佐剂的制备方法,所述制备方法为注入法、薄膜分散法、超声波分散法、反相蒸发法、高压乳匀法、冷冻干燥法、冻融法或超临界法中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地,所述制备方法为注入法、薄膜分散法或超声波分散法中的任意一种或至少两种的混合物,优选为薄膜分散法。
本发明中,采用薄膜分散法制备所述脂质体核酸疫苗佐剂的方法包括如下步骤:
(1)将阳离子脂质、辅助脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质和靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质分别溶于有机溶剂中,充分溶解;
(2)将步骤(1)中的各溶液混合,采用减压旋蒸法去除有机溶剂,形成油膜;
(3)进一步去除残留的有机溶剂,将所形成的油膜干燥;
(4)向步骤(3)得到的油膜中加入分散溶液,水浴超声,形成脂质体悬液;
(5)将步骤(4)中得到的脂质体悬液进行高压均质和/或进行高压挤出,形成粒径均匀的脂质体核酸疫苗佐剂。
本发明中,步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或甲醇中的任意一种或至少两种的混合物,优选为三氯甲烷。
优选地,步骤(2)所述减压旋蒸的转速为50~300rpm,优选为80~200rpm,进一步优选为100~150rpm。
优选地,步骤(2)所述减压旋蒸的温度为10~70℃,优选为20~60℃,进一步优选为30~55℃。
优选地,步骤(3)所述干燥的时间为3~72h,优选为8~48h,进一步优选为12~36h。
优选地,步骤(4)所述水浴超声的时间为0.1~5h,优选为0.2~3h,进一步优选为0.5~1h。
优选地,步骤(5)所述高压均质的压力为50~240MPa,优选为80~200MPa,进一步优选为100~150MPa;所述高压均质的过压次数为1~50次,优选为3~20次,进一步优选为3~10次。
第三方面,本发明还提供了一种脂质体核酸疫苗,其包括如第一方面所述的脂质体核酸疫苗佐剂。
优选地,所述核酸是DNA和/或RNA、mRNA等基因抗原。
优选地,所述脂质体核酸疫苗佐剂与所述核酸的N/P=y:1,y为0.1~50,例如可以是0.1、0.5、1、2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50,优选为1~10,进一步优选为2~10;其中N为核酸用量,P为脂质体核酸疫苗佐剂中阳离子脂质用量。
优选地,所述脂质体核酸疫苗的体系浓度为0.1~50mM,例如可以是0.1mM、0.2mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM,优选为0.2~20mM,进一步优选为5~10mM。
优选地,所述脂质体核酸疫苗体系工作液为超纯水、去离子水、生理盐水或磷酸盐缓冲液(1×PBS),更优选为生理盐水或1×PBS,最优选为生理盐水。
第四方面,本发明还提供了如第一方面所述的脂质体核酸疫苗佐剂在预防和免疫治疗疫苗中的应用。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明采用将核酸分子与阳离子脂质体通过正负电荷作用相互吸引负载大量核酸抗原;辅助脂质-聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质有利于该剂型在未达到免疫前保护核酸疫苗免于酶降解,而在进入免疫细胞后辅助核酸的内涵体逃逸,提高核酸药物进入细胞核进行表达的有效剂量,使得核酸疫苗作为内源性抗原由主要组织相容复合体提呈给T细胞,显著提高机体的免疫应答;同时,该剂型具有抗原储库效应,可以长期在宿主细胞内控制表达抗原蛋白,具有长期持续的免疫作用。
(2)本发明不仅解决了传统减毒和灭活疫苗因灭活失败可能导致的接种感染,以及在生产过程中对生物安全的严苛要求等问题,同时由于本发明的制备工艺简化,脂质体的剂型与细胞膜具有最为类似的结构,因而该剂型生物安全性好,还可被开发应用于如艾滋病、肿瘤等人类重大疾病的预防和免疫治疗。
附图说明
图1是本发明脂质体核酸佐剂与核酸疫苗的粒径与电位图。
图2是本发明脂质体核酸疫苗佐剂与核酸疫苗的Cryo-TEM图。
图3是本发明脂质体核酸疫苗的琼脂糖凝胶电泳图;其中:泳道1表示裸DNA;泳道2-7表示N/P比例分别为1、3、5、8、10和15的脂质体核酸疫苗。
图4是本发明脂质体核酸疫苗的体外细胞活性图,X表示DSPE-PCB在剂型中的摩尔比。
图5是本发明脂质体核酸疫苗的体外细胞转染图,X表示DSPE-PCB在剂型中的摩尔比。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,以下实施例仅为本发明的优选实施例,以便于更好地理解本发明,因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1
脂质体核酸疫苗佐剂的制备包括如下步骤:
称取阳离子脂质体DOTAP55.84mg,胆固醇30.932mg、DSPE-PCB2061.46mg和DSPE-PCB20-甘露糖26.34mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在45℃,转速122rpm/min的条件下减压旋蒸除去氯仿形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声30min,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例2
称取阳离子脂质体DDAB55.84mg,1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺30.932mg、DG-PCB2071.556mg和DG-PCB20-叶酸107.326mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在55℃,转速152rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声60min,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例3
称取阳离子脂质体DOGS55.84mg,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺30.932mg、DC–PCB50107.318mg和DC–PCB50-RGD160.977mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在60℃,转速182rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声1h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例4
称取阳离子脂质体DOTMA56.47mg,胆固醇30.932mg、DOPE–PCB1061.46mg和DOPE-PCB10-乳铁蛋白26.34mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在65℃,转速190rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声1.2h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例5
称取阳离子脂质体DOTAP55.84mg,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺30.932mg、HG–PCB7071.556mg和HG–PCB70-转铁蛋白107.326mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在45℃,转速222rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声1.5h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例6
称取阳离子脂质体DC-Chol56.47mg,胆固醇30.932mg、DOPE-PCB20107.318mg和DOPE-PCB20-甘露糖160.977mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在50℃,转速230rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声2h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例7
称取阳离子脂质体DOTMA56.47mg,1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺30.932mg、DG-PCB2057.772mg和DG-PCB20-叶酸151.318mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在52℃,转速250rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声2.5h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例8
称取阳离子脂质体N,N-二甲基-N-羟乙基-N-(1,2-双十四烷氧基)丙基溴化铵56.47mg,胆固醇30.932mg、DG-PCB2067.262mg和DG-PCB20-RGD100.886mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在30℃,转速280rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声3h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
实施例9
称取阳离子脂质体1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基丙胺56.47mg,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺30.932mg、DOPE-PCB20100.938mg和DOPE-PCB20-甘露糖151.318mg于100mL的圆底烧瓶中,加入氯仿充分溶解后,在45℃,转速300rpm/min的条件下减压旋蒸除去有机溶剂形成一层薄膜,真空干燥箱中干燥过夜,除去残留的氯仿。然后,加入10mL的无菌磷酸盐缓冲液(1×PBS,pH=7.4)到烧瓶中,37℃超声3.5h,得到淡黄色半透明乳液。将乳液添加到高压均质机中,在压力为100MPa条件下,过压均质3次,制备得到新型脂质体核酸疫苗佐剂。
通过纳米粒度仪(图1)和透射电镜(图2)的结果可知,随着N/P比例增加,所得脂质体核酸疫苗剂型的粒径逐渐变小,当N/P=15时,粒径趋于平稳,达到106nm左右;电位逐渐随着N/P比例增加而增大,从17增加到25mV。说明随着脂质体的加入,脂质体对核酸复合越来越紧凑。通过图2的TEM照片可以看到,所构建的脂质体核酸疫苗剂型为囊泡结构。
实施例10
考察不同N/P比例下,制备得到的脂质体核酸疫苗佐剂对核酸的复合能力。
按照N/P=1、3、5、8、10和15进行复合。取1μg的DNA(即3nM)分别与3、9、15、24、30和45nM的上述脂质体进行复合,复合条件为:室温静置30min,然后进行琼脂糖凝胶电泳实验考察其复合核酸的能力。
称取1g的琼脂糖凝胶粉,加入100mL1×TAE溶液(溶液为高压水),在微波炉中采用中高火加热150s,保证琼脂糖凝胶充分溶解,待冷却至40℃~50℃时,按照核酸染料:琼脂糖凝胶溶液(v/v)=1:1000,即加入100μL核酸染料GelGreenTM,摇匀后倒入凝胶槽中,室温下晾干。将不同N/P比例的样品与LoadingBuffer按照体积比6:1进行混合后加入到琼脂糖凝胶孔中,电泳实验条件设置如下:电压110V,电泳时间30min。电泳结束后,在254nm的紫外灯下进行观察。结果如图3所示,在N/P=1的条件下就能将核酸抗原完全复合住,说明实施例1-9的脂质体核酸疫苗佐剂均具有很强的核酸复合能力,可以负载大量的核酸抗原,增加进入免疫细胞的有效抗原量。
实施例11
体外考察脂质体核酸疫苗的细胞毒性。
选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7进行细胞毒性实验,巨噬细胞是免疫实验中抗原提呈细胞的一种重要的细胞模型,主要考察不同N/P比例下新型脂质体核酸疫苗对细胞的毒性。按照2×104个细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板中,5%CO2,37℃条件下,孵育培养24h后将不同N/P比例的样品(含有1μgDNA)与全培养基(10%胎牛血清,1%双抗,1%非必需氨基酸)混合定容为100μL加入96孔板中(每个样品设置6个复孔);继续培养24h后,吸出液体,每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT)继续培养4h;吸出后加入100μL的DMSO(二甲基亚砜),置37℃摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。以自然生长的细胞组为对照,考察新型脂质体核酸疫苗对细胞的毒性。如图4所示,核酸DNA本身对免疫细胞具有很大的细胞毒性,细胞存活率仅为63%;商售试剂lipofectamine2000(Lipo2k)的细胞存活率也仅仅只有50%;而本发明制备的新型脂质体核酸疫苗在N/P比例范围1~10时,细胞存活率均大于90%,表明其具有良好的生物相容性,细胞毒性低,在进入免疫细胞后不会因为毒性而导致免疫细胞无法发挥其功能。
实施例12
体外考察脂质体核酸疫苗的转染效率。
选用pGL4.51荧光素酶报告基因作为核酸模型,细胞膜表面有甘露糖受体的RAW264.7细胞株为细胞模型进行体外转染水平的考察。
转染前一天将RAW264.7细胞按照5×104个细胞/孔的密度接种于24孔板中,待其生长至汇合度为80%以上时,将不同N/P比例的样品(含1μgpGL4.51)与Opti-MEM(或DMEM)混合定容至500μL加入到各孔中,5%CO2,37℃条件下,孵育培养4h后换成全培养基继续培养48h。转染结束后,每孔加入100μL的GloLysis缓冲液室温孵育5min,让细胞裂解,然后分两部分检测:(A)将50μL裂解液转移至化学发光仪的平板,再加入50μL的试剂,室温静置5min后,在荧光发光计中读数;(B)利用BCA蛋白浓度测定试剂盒中的操作检测上述细胞裂解液中所含的蛋白量。上述两部分检测,均以自然生长的细胞组为空白对照,以Lipofectamine2000为阳性对照。
结果如图5所示,核酸DNA基本没有转染效果;商售试剂Lipofectamine2000(Lipo2k)的转染效率为0.82×104RLU/mgprotein;而本发明所制备的脂质体核酸疫苗剂型的转染效率会随着N/P比例的增加出现一个峰值,而后再增加N/P,转染效率会相应降低。特别是当DSPE-PCB摩尔比为0.4,N/P比例为5和8时,转染效率分别为1.94和1.73×104RLU/mgprotein;当DSPE-PCB摩尔比为0.6,N/P比例为10时,转染效率为1.85×104RLU/mgprotein。说明本发明所制备的脂质体核酸疫苗剂型具有很好的转染效果,能够显著增加核酸DNA的蛋白表达效率,增强免疫应答作用效果。
申请人申明,虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解我们描述的具体实施例只是说明性的,而不会用于对本发明的范围的限定,熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所做的等效的修饰以及变化,都应涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (9)
1.一种脂质体核酸疫苗佐剂,其特征在于,其由阳离子脂质、辅助脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质和靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质组成。
2.如权利要求1所述的脂质体核酸疫苗佐剂,其特征在于,所述聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质为1,2-十八酰基-sn-甘油-聚羧基三甲胺乙内酯、胆固醇-聚羧基三甲胺乙内酯、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚羧基三甲胺乙内酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基三甲胺乙内酯或α-十六烷基丙三醇醚-聚羧基三甲胺乙内酯中的任意一种或至少两种的混合物;优选为1,2-十八酰基-sn-甘油-聚羧基三甲胺乙内酯、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺-聚羧基三甲胺乙内酯或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基三甲胺乙内酯中的任意一种或至少两种的混合物;
优选地,所述聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质的聚合度n为1~200之间任意整数,优选为1~100之间任意整数,进一步优选为5~50之间任意整数,更优选为10~35之间任意整数。
3.如权利要求1或2所述的脂质体核酸疫苗佐剂,其特征在于,所述阳离子脂质为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、精胺-5-羧基-氨基乙酸二十八烷基-酰胺、双油基双甲基氯化铵、N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基丙酰基-胆固醇、N,N-二甲基-N-羟乙基-N-(1,2-双十四烷氧基)丙基溴化铵、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基丙胺、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基丙胺或二硬脂基二甲基铵盐中的任意一种或至少两种的混合物;优选为(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵和/或N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺;
优选地,所述辅助脂质为胆固醇、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的任意一种或至少两种的混合物;优选为胆固醇;
优选地,所述靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质中的靶向分子为抗体类、小分子类或适配体类中的任意一种或至少两种的混合物;优选为小分子类;进一步优选为糖类、肽类、生长因子或维生素类中的任意一种或至少两种的混合物;更优选为叶酸分子、甘露糖分子、RGD分子、乳铁蛋白分子或转铁蛋白分子中的任意一种或至少两种的混合物,最优选为甘露糖分子。
4.如权利要求1-3任一项所述的脂质体核酸疫苗佐剂,其特征在于,所述阳离子脂质:辅助脂质:(聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质与靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质的混合物)三者的摩尔比为1:1:x,其中x=0.01~0.99,优选为0.1~0.8,更优选为0.2~0.6;
优选地,所述靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质:(聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质与靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质的混合物)的摩尔比为1%~60%,优选为5%~50%,进一步优选为10%~30%。
5.如权利要求1-4任一项所述的脂质体核酸疫苗佐剂的制备方法,其特征在于,所述制备方法为注入法、薄膜分散法、超声波分散法、反相蒸发法、高压乳匀法、冷冻干燥法、冻融法或超临界法中的任意一种或至少两种的组合;优选为注入法、薄膜分散法或超声波分散法中的任意一种或至少两种的混合物,进一步优选为薄膜分散法。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述薄膜分散法包括如下步骤:
(1)将阳离子脂质、辅助脂质、聚羧基三甲胺乙内酯中性脂质和靶向分子修饰的聚羧基三甲胺乙内酯脂质分别溶于有机溶剂中,充分溶解;
(2)将步骤(1)中的各溶液混合,采用减压旋蒸法去除有机溶剂,形成油膜;
(3)进一步去除残留的有机溶剂,将所形成的油膜干燥;
(4)向步骤(3)得到的油膜中加入分散溶液,水浴超声,形成脂质体悬液;
(5)将步骤(4)中得到的脂质体悬液进行高压均质和/或进行高压挤出,形成粒径均匀的脂质体核酸疫苗佐剂。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或甲醇中的任意一种或至少两种的混合物,优选为三氯甲烷;
优选地,步骤(2)所述减压旋蒸的转速为50~300rpm,优选为80~200rpm,进一步优选为100~150rpm;
优选地,步骤(2)所述减压旋蒸的温度为10~70℃,优选为20~60℃,进一步优选为30~55℃;
优选地,步骤(3)所述干燥的时间为3~72h,优选为8~48h,进一步优选为12~36h;
优选地,步骤(4)所述水浴超声的时间为0.1~5h,优选为0.2~3h,进一步优选为0.5~1h;
优选地,步骤(5)所述高压均质的压力为50~240MPa,优选为80~200MPa,进一步优选为100~150MPa;所述高压均质的过压次数为1~50次,优选为3~20次,进一步优选为3~10次。
8.一种脂质体核酸疫苗,其特征在于,其包括如权利要求1-4任一项所述的脂质体核酸疫苗佐剂以及核酸;
优选地,所述核酸是DNA和/或质粒;
优选地,所述脂质体核酸疫苗佐剂中的阳离子脂质与所述核酸的摩尔比为y:1,其中y为0.1~50,优选为1~10,进一步优选为2~10;
优选地,所述脂质体核酸疫苗的体系浓度为0.1~50mM,优选为0.2~20mM,进一步优选为5~10mM。
9.如权利要求1-4任一项所述的脂质体核酸疫苗佐剂在制备预防和免疫治疗疫苗中的应用。
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