CN110520214A - 流路构造体及使用其的脂质粒子或微胞的形成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种粒径控制性高地制造例如有用于作为药物传递系统中的纳米尺寸的载体的脂质粒子或微胞的流路构造体及使用所述流路构造体的脂质粒子或微胞的形成方法。所述流路构造体，是在使原料溶液流动的微尺寸的流路中，从两侧面相互不同地配置多个既定宽度的构造件(障板)的二维构造的流路构造体。

Description

流路构造体及使用其的脂质粒子或微胞的形成方法
技术领域
本发明涉及流路构造体及使用所述流路构造体的脂质粒子或微胞的形成方法。详细而言，本发明涉及粒径控制性高地制造例如作为药物传递系统中的纳米尺寸的载体的脂质粒子或两亲性高分子等的微胞的流路构造体及使用所述流路构造体的脂质粒子或微胞的形成方法。
背景技术
脂质纳米粒子，是作为用于药物传递系统(Drug Delivery System，DDS)的纳米载体而最达到实用化，目前已应用在临床上。近来已得知因纳米载体粒径的不同而使药剂往癌组织的送达效率有所不同。此外，由于往脏器的送达效率因载体粒径的不同而不同，因而使此种脂质纳米粒子的粒径控制的重要性逐渐增加。然而，以往作为脂质纳米粒子的调制法而为人所知的挤压法或超声波处理中，被视为往癌组织等组织的送达效率高的粒径约10nm～100nm的脂质纳米粒子，乃难以在所述粒径范围内的任意尺寸下变动少且精密地制作。
另一方面，有人提出微装置可制作粒径经精密地控制的脂质纳米粒子的报告(非专利文献1～非专利文献4)。然而，至目前为止所报告的微装置，由于使用三维混合器构造，所以微装置本身的制作或加工也难以进行。此外，所能够制作的粒径范围窄，故令人期待可开发出粒径控制性更高的脂质纳米粒子形成系统。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：“利用具有混合器结构的微流控装置的脂质纳米粒合成策略”，M.前木，T.斋藤，Y.佐藤，T.安井，N.梶裕贵，A.石田，H.谷，Y.芭芭，H.原岛，和M.渡庆次，《皇家化学学会进展》，5,46181,(2015).(“A Strategy for Synthesis of Lipid NanoparticlesUsing Microfluidic Devices with a Mixer Structure”,M.Maeki,T.Saito,Y.Sato,T.Yasui,N.Kaji,A.Ishida,H.Tani,Y.Baba,H.Harashima,and M.Tokeshi,RSC Advances,5,46181,(2015).)
非专利文献2：“用于siRNA介导的载有siRNA的小尺寸脂质纳米粒的理化性质和效力的说明”，Y.佐藤，Y.注，M.前木，N.梶裕贵，Y.芭芭，M.渡庆次，和H.原岛，《控制释放期刊》，229,48,(2016).(“Elucidation of the Physicochemical Properties and Potencyof siRNA-Loaded Small-Sized Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery”,Y.Sato,Y.Note,M.Maeki,N.Kaji,Y.Baba,M.Tokeshi,and H.Harashima,Journal of ControlledRelease,229,48,(2016).)
非专利文献3：“利用毫秒微流体混合的具有水核和甘油三酯核的有限尺寸脂质纳米粒系统的自下而上设计和合成”，I.V.日加尔采夫，N.贝里沃，I.哈菲兹，A.K.K.梁，C.汉森，和P.R.库里斯，《朗缪尔》，38,3633,(2012).(“Bottom-Up Design and Synthesis ofLimit Size Lipid Nanaparticle Systems with Aqueous and Triglyceride CoresUsing Millisecond Microfluidic Mixing”,I.V.Zhigaltsev,N.Belliveau,I.Hafez,A.K.K.Leung,C.Hansen,and P.R.Cullis,Langmuir,38,3633,(2012).)
非专利文献4：“通过受控微流体形成能够快速发现含蛋白质siRNA的脂质纳米粒”,D.陈，K.T.爱，Y.陈，A.A.艾拓基，C.卡斯特鲁普，G.萨海，A.润，Y.董，K.A.怀特海，和D.G.安德森，《美国化学会志》，134,6948,(2012).(“Rapid Discovery of Protein siRNA-Containing Lipid Manoparticles Enabled by Controlled Microfluidic Formation”,D.Chen,K.T.Love,Y.Chen,A.A.Eltoukhy,C.Kastrup,G.Sahay,A.Jeon,Y.Dong,K.A.Whitehead,and D.G.Anderson,Journal of the American Chemical Society,134,6948,(2012).)
发明内容
发明所要解决的问题
因此，本发明的课题在于提供一种解决所述技术性课题的流路构造体及使用所述流路构造体的脂质粒子形成方法。此外，本发明的课题在于提供一种粒径控制性高地制造例如作为药物传递系统中的纳米尺寸的载体的脂质粒子或两亲性高分子等的微胞的流路构造体及使用所述流路构造体的脂质粒子或微胞的形成方法。
解决问题的技术手段
如所述那样，以往的微装置中，是通过三维混合器构造产生混沌性平流来混合原料溶液而由此形成纳米尺寸的脂质粒子，但也因而难以控制原料溶液的流体行为，所能够制作的粒径的范围也窄。本发明人等人是根据所述技术背景进行精心探讨及研究，为了精密地制作目的的纳米尺寸的脂质粒子，而思考出一种由在使原料溶液流动的微尺寸的流路中，从两侧面相互不同地配置障板(阻碍板)的单纯二维构造的流路构造体所构成的纳米尺寸的脂质粒子形成系统。相对于微尺寸的流路的流路宽度设置固定宽度的障板。与以往的三维混合器构造不同，在所述二维微流路中的混合及稀释，是设为依存于分子扩散。因此，发现通过调整障板的宽度或长度、配置，可控制原料溶液的稀释速度，而能够形成与以往相比粒径控制性更高的纳米尺寸的脂质粒子形成系统。再者，不限于脂质粒子，即使使用例如两亲性嵌段共聚物等的高分子，也确认同样可形成粒径控制性高的纳米尺寸的微胞，因而完成本发明。
亦即，为了解决所述课题，本发明为一种用以形成纳米尺寸的脂质粒子或微胞的流路构造体，其特征在于：所述流路构造体，在其上游侧相互独立的导入第一流动体的第一导入路径与导入第二流动体的第二导入路径分别具有固定长度而合流，并朝向其下游侧形成1个稀释流路；
所述稀释流路，在至少一部分中具有二维地曲折的流路部位；
所述曲折的流路部位，是由以下方式所形成：当以比其更上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向，以比其更上游的稀释流路的流路宽度为y0时，从在Y方向上相向的稀释流路的两侧壁面交互地朝向流路中心侧，在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上，以固定间隔d1、d2···设置至少两个以上的构造件，所述构造件具有1/2y0以上且未达1y0的固定高度h1、h2···，且在X方向上具有固定宽度x1、x2···而突出，来限制稀释流路的流路宽度。
本发明的流路构造体中，包含以下方案：所述流路宽度y0为20μm～1000μm，各构造件的宽度x1、x2···为20μm～1000μm，各构造件间的间隔d1、d2···为20μm～1000μm。
此外，本发明的流路构造体中，包含以下方案：设置有10个～100个构造件。
再者，本发明的流路构造体中，包含以下方案：从第一导入路径与第二导入路径的合流点至最初的构造件的上游侧端部为止的距离，是以使在此之间流动的设定速度的稀释流体以0.1秒以下通过的方式，对应稀释流体的设定速度来规定。
再者，本发明的流路构造体中，包含以下方案：分别设置有多个流路作为所述第一导入路径和/或所述第二导入路径。
再者，本发明的流路构造体中，包含以下方案：所述大致Y方向为相对于流路方向(X方向)以40°～140°的角度所交叉的方向。
亦即，为了解决所述课题，本发明为一种用以形成纳米尺寸的脂质粒子或微胞的流路构造体，其特征在于：所述流路构造体，在其上游侧相互独立的导入第一流动体的第一导入路径与导入第二流动体的第二导入路径分别具有固定长度而合流，并朝向其下游侧形成1个稀释流路；
所述稀释流路，在至少一部分中具有二维地曲折的流路部位；
所述曲折的流路部位，是由以下方式所形成：当以比其更上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向，以比其更上游的稀释流路的流路宽度为y0时，从在Y方向上相向的稀释流路的两侧壁面交互地朝向流路中心侧，在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上，以固定间隔d1、d2···设置至少两个以上的构造件，所述构造件具有1/2y0以上且未达1y0的固定高度h1、h2···，且在X方向上具有固定宽度x1、x2···而突出来限制稀释流路的流路宽度。
此外，为了解决所述课题，本发明为一种在流路构造体中以稀释介质来稀释脂质溶液或两亲性物质溶液而由此形成纳米尺寸的脂质粒子或微胞的脂质粒子或微胞的形成方法，其特征在于：使用具有以下特征的流路构造体作为所述流路构造体，亦即在其上游侧相互独立的第一导入路径与第二导入路径分别具有固定长度而合流，并朝向其下游侧形成1个稀释流路；所述稀释流路，在至少一部分中具有二维地曲折的流路部位；所述曲折的流路部位，是由以下方式所形成：当以比其更上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向，以比其更上游的稀释流路的流路宽度为y0时，从在Y方向上相向的稀释流路的两侧壁面交互地朝向流路中心侧，在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上，以固定间隔d1、d2···设置至少两个以上的构造件，所述构造件具有1/2y0以上且未达1y0的固定高度h1、h2···，且在X方向上具有固定宽度x1、x2···而突出来限制稀释流路的流路宽度的流路构造体；并且以使总流量成为1μl/分～100ml/分的方式，从所述流路构造体的第一导入路径及第二导入路径的一方导入脂质溶液或两亲性物质溶液，从另一方导入稀释溶剂。
发明的效果
通过使用本发明的流路构造体来形成脂质粒子或微胞，可在粒径例如约10nm～100nm的粒径范围内的任意尺寸下变动少且精密地制作，而能够提供有用于作为有效率的药物传递系统(DDS)用的纳米载体的脂质粒子或微胞。
附图说明
图1为说明脂质粒子的生成原理的概要图。
图2为示意性表示本发明的流路构造体之一实施方式中的构造的图面。
图3为示意性表示本发明的流路构造体的另一实施方式中的构成例的图面。
图4为表示实施例中所得到的流路构造体的构造件的数目与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图5为表示实施例中所得到的流路构造体的构造件间的间隔与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图6为表示实施例中所得到的流路构造体的构造件的高度与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图7为表示实施例中所得到的流路构造体的构造件的宽度与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图8为示意性表示实施例中所使用的流路构造体中的构造件的配置的图面。
图9为表示实施例中所使用的流路构造体中的构造件的配置与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图10为表示示出实施例中所使用的流路构造体中的构造件的效果的模拟结果的图表。
图11为说明实施例中所使用的流路构造体中的从溶液合流地点至最初的构造件的上游侧端部为止的距离的图面。
图12为表示实施例中所使用的流路构造体中的从溶液合流地点至最初的构造件的上游侧端部为止的距离与所得到的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图13为说明通过本发明的脂质粒子形成方法所得到的纳米尺寸的脂质粒子的体内(in vivo)实验评估的概要的图面。
图14为表示使用通过本发明的脂质粒子形成方法所得到的纳米尺寸的脂质粒子在体内实验中的脂质粒子肝实质细胞中的基因减弱活性的图表。
图15为表示使用通过本发明的脂质粒子形成方法所得到的纳米尺寸的脂质粒子在体内实验中的肝脏内在观察的结果的显微镜照片。
图16(a)为示意性表示实施例中所使用的流路构造体的构造的图，(b)为表示由此所得到的构造与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表，(c)为表示由此得到的构造与所形成的脂质粒子的粒径分布的关系的图表。
图17(a)为示意性表示实施例中所使用的流路构造体的构造的图，(b)、(c)为表示由此得到的构造与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图18(a)为示意性表示实施例中所使用的流路构造体的构造的图，(b)、(c)为表示由此得到的构造与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图19为表示实施例中所得到的流路构造体的流体导入路径的数目与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图20为表示实施例中所得到的流路构造体的流体导入路径的数目以及构造件的形状及配置与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图21为表示示出实施例中所使用的流路构造体中的因流量的不同所造成的构造件的效果的模拟结果的图表。
图22为表示示出实施例中所使用的流路构造体中的因导入路径数量的不同所造成的效果的模拟结果的图表。
图23为表示实施例中所得到的流路构造体的深度与所形成的脂质粒子的粒径的关系的图表。
图24为表示实施例中所得到的流量的不同与所形成的高分子微胞的粒径的关系的图表。
图25(a)为示意性表示实施例中所使用的流路构造体的构造的图，(b)为表示由此得到的封入有核酸聚阳离子复合体的脂质粒子的粒径与流量的关系的图表。
具体实施方式
以下是根据优选实施方式来详细说明本发明。以下是以形成脂质粒子(脂质体)的情况为中心来说明本发明，但可理解的是在无特别言明时，以下所详述的内容，即使关于例如两亲性嵌段共聚物那样的以在同一分子内具有溶剂可溶部与不溶部的两亲性分子作为构成单位，且不溶部的凡得瓦力(van der Waals forces)成为驱动力来形成各种两亲性分子的微胞时，也可同样地适用。
流路构造体
首先说明本发明的流路构造体。
本发明的流路构造体，概略来说，是在使原料溶液流动的微尺寸的流路中，从两侧面相互不同地配置固定宽度的大致打印机的构造件(障板)的二维构造的流路构造体。与以往的三维混合器构造不同，在此二维性微流路中的稀释是依存于分子扩散。亦即，如图1所示，成为原料的脂质溶液的稀释速度越快，所生成的脂质粒子的尺寸越小。因此，通过调整构造件(障板)的宽度或长度、配置，可控制原料溶液的稀释速度，可形成与以往相比粒径控制性更高的纳米尺寸的脂质粒子。
亦即，本发明的流路构造体，是用以形成纳米尺寸的脂质粒子或两亲性高分子等的两亲性物质的微胞(以下为了简化“脂质粒子或两亲性物质的微胞”，有时仅记载为“脂质粒子”)的流路构造体，例如，如图2所示意性表示，在其上游侧(图面左侧)相互独立的导入第一流动体的第一导入路径10与导入第二流动体的第二导入路径20分别具有固定长度而合流，并朝向其下游侧形成1个稀释流路30，所述稀释流路30，在至少一部分中具有二维地曲折的流路部位50，所述曲折的流路部位50，是由以下方式所形成：当以比其更上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向，以比其更上游的稀释流路的流路宽度为y0时，从在Y方向上相向的稀释流路的两侧壁面交互地朝向流路中心侧，在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上，以固定间隔d1、d2···设置至少两个以上的构造件40，所述构造件40具有1/2y0以上且未达1y0的固定高度h1、h2···，且在X方向上具有固定宽度x1、x2···而突出来限制稀释流路的流路宽度。亦即，在存在有所述构造件40的部位上，在X方向上在固定长度x1、x2···之间，稀释流路的流路宽度y1、y2···被限制在1/2y0以下，尤其是1/2y0以下1/40y0以上。
再者，本发明的流路构造体，概念上如图2所例示且如所述所说明那样，是在微尺寸的流路中从两侧面相互不同地配置大致矩形形的障板的形状，但实际上并不限于如所述那样在流路上配置另外的障板所构成。亦即，只要是相应于通过配置此障板所形成的流路来形成同样形状的流路，则并不特别限定于构造件40的构成，例如，可如图3所示那样地构成所述构造件40，一面将流路构造体的壁面(一面保持几乎固定的厚度)曲折为既定形状并一体地形成，而形成如所述所规定的经曲折且缩扩的二维构造的流路形状，本发明的流路构造体中，当然包含此方案。图3所示的构成，例如可通过使用热塑性树脂、热硬化性树脂、紫外线硬化树脂、金属或玻璃质材料等的射出成型、注模成形、使用三维列印机的成型等而相对容易地形成。
本发明的流路构造体中，如所述那样将构造件40构成为从稀释流路的两侧壁面交互且相互不同地配置的形状而形成曲折的流路部位50的情况，对于提高脂质溶液或两亲性物质溶液(以下为了简化“脂质溶液或两亲性物质溶液”，有时仅记载为“脂质溶液”)在稀释溶剂中的稀释效率，以得到经控制为期望粒径的纳米尺寸的脂质粒子或微胞而言重要。例如，作为类似于本发明的所述构造件40的配置的形状，例如如图8所示，可考量(1)在单侧壁面侧上设置具有同样高度但宽度大的单一的构造件40的形状，(2)仅在单侧壁面侧上设置多个具有同样高度的构造件40的形状，(3)在两壁面侧上设置多个构造件40但分别对称地配置，且各构造件的高度为一半的形状等，但在这些形态中，若与本发明的流路构造体中的曲折的流路部位50相比，则因为流路构造变得更单纯，无法在短时间内进行充分的分子扩散，而无法得到经控制为期望粒径的纳米尺寸的脂质粒子。
第一导入路径10与第二导入路径20合流后的稀释流路30的流路宽度y0，虽某程度受到所要形成的纳米尺寸的脂质粒子的粒径的大小所左右，但具代表性的稀释流路30的流路宽度优选约为20μm～1000μm，更优选约为100μm～200μm。对于得到期望的纳米尺寸，具体例如约10nm～100nm的粒径范围内的尺寸的粒径的脂质粒子而言，在所述范围内的流路宽度y0下以稀释介质来稀释脂质溶液的情况，某程度为必要条件。
接着在本发明的流路构造体中，用以形成提供实质的分子扩散的场所的曲折的流路部位50而配置多个的所述构造件40的数目，虽受到所要得到的脂质粒子的大小，或是各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)、宽度(X方向长度)x1、x2···、相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···等其他条件所左右，但至少两个以上，优选为10个以上，更优选为约10个～100个，可生成期望尺寸的脂质粒子，故优选。构造件40的数目，从形成既定粒子尺寸的脂质粒子的观点来看，所述上限值并无特别限定，原理上例如为1000个以上，或进一步为10000个以上的数目下，也可形成同样的既定粒子尺寸的脂质粒子。然而，所述数目极端地多时，从使原料流动时的流体阻力的增大或流路构造体等的制作成本等提高的观点来看，并不具现实性。
此外，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)，相对于比其更上游侧的稀释流路30的流路宽度y0为1/2y0以上且未达1y0，优选为1/2y0以上39/40y0以下，进而优选为1/2y0以上3/4y0以下，通过存在有所述各构造件40，可从比其更上游侧的稀释流路30的流路宽度y0将流路宽度y1、y2···缩小为未达1/2y0且大于0的宽度。再者，曲折的流路部位50中设置有多个的所述构造件40的各高度h1、h2···并不一定需相同，只要满足所述既定条件，则也可为分别不同。由此所形成的流路宽度y1、y2···也可为分别不同。例如可为随着往下游方向而去，各构造件40的各高度h1、h2···逐渐增长，流路宽度y1、y2···逐渐变窄的方案。通过使各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)成为既定，且这些所存在的部位的流路宽度y1、y2···控制在未达1/2y0的宽度，可提升分子扩散的效率。
虽受到所要得到的脂质粒子的大小，或是构造件40的数目、各混合器构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···、相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···等其他条件所左右，但并无特别限定，具体而言，例如当上游的稀释流路的流路宽度y0为200μm时，所述构造件40的各高度h1、h2···优选为100μm～未达200μm。因此，各构造件40所存在的位置上的流路宽度y1、y2···，是设为未达1/2y0且大于0的宽度的大约未达100μm。
此外，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···，虽受到所要得到的脂质粒子的大小，或是构造件40的数目、各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)、相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···等其他条件所左右，但相对于上游的稀释流路的流路宽度y0，优选设为约1/10y0以上5y0以下的长度。具体而言，例如当上游的稀释流路的流路宽度y0为20μm～1000μm，具代表性而言为200μm时，所述构造件40的各宽度x1、x2···优选为约20μm～1000μm。各构造件40的各宽度x1、x2···并不一定需相同，只要满足所述既定条件，则也可为分别不同。例如可为随着往下游方向而去，宽度x1、x2···逐渐增长的方案。
此外，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···，虽受到所要得到的脂质粒子的大小，或是构造件40的数目、各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)、各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···等其他条件所左右，但相对于上游的稀释流路的流路宽度y0，优选设为约1/10y0以上5y0以下的长度。具体而言，例如当上游的稀释流路的流路宽度y0为20μm～1000μm，具代表性而言为200μm时，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···优选为约20μm～1000μm。相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···并不一定需相同，只要满足所述既定条件，则也可为分别不同。例如可为随着往下游方向而去，间隔d1、d2···逐渐变窄的方案。
再者，本发明的流路构造体中，以上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向时，如所述那样，各构造件40具有：从两侧壁面交互地朝向流路中心侧在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上延长，并在流路方向(X方向)上大致呈直角地抵挡的壁面，但此角度并不需严谨地为90°，只要是即使倾斜某程度也可成为有效的构成，则并无特别限定，具体而言，例如可容许约30°～150°，更优选为40°～140°，特别优选为80°～100°的范围。再者，各构造件40的流路中心侧的角部的形状也可容许某程度的圆缓，并无特别限定，例如可容许R50μm以下，更优选为R20μm以下。然而，对于得到控制性更高且均一的纳米尺寸的脂质粒子而言，这些容许差尽可能越少越佳。此外，在图2及图3所示的实施方式中，流路构造体中的上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向的X方向，简便上是表示为直线状，但此X方向仅表示稀释流路的轴线方向，实际上并不限定于此直线状，例如可具有某曲率而弯曲。再者，此时，与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向即Y方向，是指在其单位长度的部位上的与X方向垂直的方向。
此外，本发明的流路构造体，由于如所述那样为二维构造的流路构造体，所以其流路的深度方向(图2、图3中的纸厚方向)的尺寸并无特别限定，例如优选约为10μm～1000μm，更优选约为50μm～200μm。
再者，本发明的流路构造体中，第一导入路径10与第二导入路径20的合流的角度并无特别限定，可相对地以钝角来合流。亦即，在纳米尺寸的脂质粒子的形成中，由于汇合的流体的流体速度极快，所以在本发明的流路构造体中，第一导入路径10与第二导入路径20的合流角度，对于形成纳米尺寸均一的脂质粒子而言并不会造成太大影响。虽无特别限定，但合流角度具体而言例如可设为约10°～180°的范围内。
在形成纳米尺寸的脂质粒子的本发明的流路构造体中，导入于第一导入路径10的第一流动体与导入于第二导入路径20的第二流动体中哪一者为脂质溶液，另一者为稀释介质，并无特别限定。然而，当比较形成纳米尺寸的脂质粒子时所使用的脂质溶液与稀释介质的流量时，一般而言，稀释介质的流量多。因此，本发明的流路构造体中，在第一导入路径10与第二导入路径20的合流不久后的稀释流路30的上游侧，巨观地来看，是以脂质溶液的流动成为薄层且稀释介质的流动成为厚层而形成的状态朝向下游流动。因此，从位于曲折的流路部位50的形成有最初的构造件40的侧壁面(图2、图3中的下侧)侧的导入路径(第二导入路径20)侧所导入的第二流动体为脂质溶液时，脂质溶液的流动与最初的构造件40产生大的碰撞，而有被稀释溶剂的厚流动的层所阻挡并难以往下游侧流动的疑虑。因此，更优选为构成为：从位于曲折的流路部位50的与形成有最初的构造件40的侧壁面(图2、图3中的下侧)侧为相反侧的侧壁面的导入路径(第一导入路径10)侧所导入的第一流动体为脂质溶液的方案。
此外，第一导入路径10、第二导入路径20的宽度也无特别限定，如所述那样在这些合流后的稀释流路30的流路宽度y0，具代表性而言设为约100μm～200μm，对应于此，优选分别设定为约50μm～400μm，更优选设定为约50μm～200μm。
再者，本发明的流路构造体中，从第一导入路径10与第二导入路径20的合流点31开始至最初的构造件40的上游侧端部41为止的距离x0，其距离极长时，亦即经稀释的流体到达至配置有构造件40的曲折的流路部位50时需要过多时间时，所形成的脂质粒子的粒径有增大的倾向。因此，优选是将此间距(距离x0)构成为使设定流量的稀释流体以0.1秒以下通过。具体而言，例如当稀释流体的设定流量(总流量)为1ml/分时，距离x0优选设定为约80mm以下。
再者，本发明的流路构造体中，所述第一导入路径10与所述第二导入路径20的各路径的数目并无特别限定，也可分别设置多个。尤其关于使一般而言流量较脂质溶液多的稀释介质流动的一侧的导入路径，设置多个的情况，有时可成为优选方案。亦即，原因在于：如此地设置多个使稀释介质流动的一侧的导入路径，即使以相对较低的流量使稀释溶液流动，有时也可控制性良好地将所生成的脂质粒子的粒径及所述标准差形成为较小值。
虽无特别限定，但在图18中例示一种在本发明的流路构造体中具有多个作为此种第二导入路径(和/或第一导入路径)的实施方案的一例，其是具有1个导入路径作为导入第一流体的脂质溶液的第一导入路径10，以及具有2个导入路径20a、20b作为导入第二流体的稀释溶剂的第二导入路径20的构造。图18所示的实施例中，2个第二流体导入路径20a、20b相对于中央的第一导入路径10从两侧分别相对地以锐角来合流，在如此的具有多个作为第二导入路径(和/或第一导入路径)的形态中，也如所述那样，第一导入路径与第二导入路径的合流的角度并无特别限定，可相对地以钝角来合流。
此外，在如此那样具有多个作为第二导入路径(和/或第一导入路径)的形态中，在其多个第二导入路径(和/或第一导入路径)的各个中流动的流体的流量比，亦即，例如为图18所示的实施例时，关于在2个第二流体导入路径20a、20b的各个中流动的稀释溶剂的流量比并无特别限定。亦即，即使在第一及第二的各流体导入路径分别仅为1个下，使各流体流动时也可有效地作为本发明的流路构造体而发挥功能，当具有多个作为各流体导入路径时，其多个同种类的导入路径彼此的流量比可设为任意值，不限于流量比为1：1，亦即从多个导入路径各自等量地流动的方案，可考量所要得到的脂质粒子的粒径等，视需要而适当地变更。再者，本发明的流路构造体所具有的曲折的流路部位50的构成为优选方案时，如后述实施例中所示那样，导入稀释溶剂的第二流体导入路径为多个(2个)时，稀释介质的流量比为约1：1～1：10的范围内时，对于所形成的脂质粒子的粒径不会造成太大影响，在所述范围内可控制性良好地将所生成的脂质粒子的粒径及所述标准差形成为较小值。
再者，本发明的流路构造体，如所述那样是用以形成纳米尺寸的脂质粒子或两亲性高分子等的两亲性物质的微胞的流路构造体，当要将例如呈现出与曲折的流路部位相同的胶囊构造的核粒子，作为所包含的后述生理活性物质等来封入于此种纳米尺寸的脂质粒子或两亲性高分子等的两亲性物质的微胞的内部时，可设置具有与所述那样的本发明的具有曲折的流路部位的流路构造体相同构造的流路，作为形成此种核粒子的前处理步骤用的流路，并在此前处理步骤用的流路的下游侧连接所述第二导入路径(或第一导入路径)而构成。再者，所连接的导入路径，原先是作为导入稀释介质的一侧所使用的导入路径。图25(a)为示意性表示此构成的图表，如图示那样，作为全体的流路，设为具有多段地组合曲折的流路部位的形态。通过使用此种具有多段的曲折的流路部位的构造的方案，可通过一连串的操作来调制在纳米尺寸的脂质粒子或两亲性高分子等的两亲性物质的微胞的内部包含有生理活性物质等作为呈现出胶囊构造的核粒子。再者，前处理步骤用的曲折的流路部位与本步骤的脂质粒子或微胞形成用的曲折的流路部位，只不过就皆满足所述规定条件，亦即满足：当以比其更上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向，以比其更上游的稀释流路的流路宽度为y0时，从在Y方向上相向的稀释流路的两侧壁面交互地朝向流路中心侧，在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上，以固定间隔d1、d2···设置至少两个以上的构造件40；所述构造件40具有1/2y0以上且未达1y0的固定高度h1、h2···，且在X方向上具有固定宽度x1、x2···而突出来限制稀释流路的流路宽度的条件的涵义而言为相同，并不限定于此两者为完全相同的构造的方案。对应于各流路部位中所要形成的既定的粒径、所使用的材料等，这些构造件的配置、数目、大小等或是流体的流速条件，可对应各部位来设定条件。再者，作为前处理步骤用的流路的流路构造体中的构造件的配置、数目、大小等，或是稀释流路的宽度或导入路径的数目等条件，与关于所述原先脂质粒子或微胞形成用的流路构造体中所说明者为相同，在此省略所述说明。
接着说明本发明的脂质粒子或微胞的形成方法。本发明的脂质粒子的形成方法，其特征在于：使用具有所述构成的本发明的流路构造体，并以使总流量成为1μl/分～100ml/分的方式，从所述流路构造体的第一导入路径10及第二导入路径20的一方导入脂质溶液或两亲性物质溶液，从另一方导入稀释溶剂。
通过此方法，可精密地制作期望的纳米尺寸，具体而言，例如约10nm～100nm的粒径范围内的任意尺寸的脂质粒子或两亲性物质的微胞，所制造的脂质粒子或微胞，可优选地用作有效率的药物传递系统(DDS)用的纳米载体。
本发明的脂质粒子的形成方法所使用的流路构造体的特征如上所述，通过将所述流路构造体中的构造件40的数目、各构造件40的高度(Y方向长度)h1、h2···、宽度(X方向长度)x1、x2···、相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···设为既定范围，可使所生成的脂质粒子的粒径范围在既定范围内变化，再者，通过调整原料溶液的流量、稀释比率，可控制性良好地形成期望的纳米尺寸的脂质粒子。
再者，使用以往的微装置时，若未以极高流量，例如约5ml/分来送液，则无法形成理论上可形成的最小尺寸即粒径约20nm的脂质粒子，但在本发明中，通过使用所述本发明的流路构造体，即使以更低流量，例如500μl/分来送液，也可控制性良好地制作粒径约20nm的脂质粒子。
本发明的脂质粒子的形成方法中，朝所述流路构造体送液的脂质溶液及稀释溶剂的总流量，对应所要形成的脂质粒子的尺寸或所述流路构造体的构成的不同而在所述1μl/分～100ml/分的范围内适当地调整，从粒径控制性的观点来看，更优选为50μl/分～500μl/分的流量范围。
对于本发明的脂质粒子的形成方法中所使用的脂质溶液及稀释介质的组成以及由这些所得的稀释比率，并无特别限定。本发明的脂质粒子或微胞的形成方法，原理上是将在水混合性有机溶剂中溶解有脂质或两亲性物质的溶液，视需要在加温条件下添加于水溶液(稀释介质)以稀释，而形成以脂质体为首的脂质粒子或两亲性物质的微胞，此手法中可使用以往一般所知的组成等。
脂质溶液所含有的脂质成分并无特别限定，例如可使用大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰肌醇类、神经鞘磷脂(sphingomyelin)类、磷脂酸类、长链烷基磷酸盐类、神经节苷脂、糖脂质类、磷脂酰甘油类、固醇类等的一种或两种以上的脂质。在用作药物传递系统(DDS)用的纳米载体的方案中，作为构成脂质粒子(脂质体等)的脂质，可列举出使用磷脂质与胆固醇的组合，尤其是磷脂质的一种即磷脂酰胆碱类与胆固醇的组合者，作为优选的一例。
此外，两亲性物质并无特别限定，可例示出两亲性高分子化合物，例如聚苯乙烯-聚环氧乙烷嵌段共聚物、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷嵌段共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚己内酯-聚乙二醇共聚物等的两亲性嵌段共聚物等。
溶解所述脂质以调制脂质溶液时所使用的水混合性有机溶剂并无特别限定，优选例如使用醇类、醚类、酯类、酮类、缩酮类等的可与水混合的有机溶剂，尤其使用乙醇、叔丁醇、1-丙醇、2-丙醇及2-丁氧基乙醇等醇类。此外，作为调制两亲性物质溶液时所使用的水混合性有机溶剂，虽可使用同样的溶剂，但优选例子可列举出四氢呋喃等醚类、氯仿等。
另一方面，稀释介质可根据所要形成的脂质粒子的用途等，适当地使用水或基本上以水为主成分的例如生理食盐水、磷酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲液等水溶液。
此外，根据所得到的脂质粒子或微胞的用途等，如一般所知者那样，可在脂质粒子或微胞中调配生理活性物质等。虽无特别限定，但例如可例示抗癌剂、抗氧化剂、抗菌剂、抗炎剂、维生素剂、血红蛋白、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)、肽、蛋白质、疫苗、生发剂、保湿剂、色素类、美白剂、颜料等的药剂、生理活性物质、化妆品等。这些添加物若为水溶性，则可预先调配于所述稀释介质中而由此包含于所形成的脂质粒子或微胞的水相中。此外，若为油溶性，则可纳入于脂质粒子的脂质膜中。再者，例如在通过本发明所形成的脂质粒子或微胞内，能够以将药剂、生理活性物质、化妆品等分散于水相中的粒子(核粒子)的形态来纳入。
此外，如在所述领域中一般所知者那样，也可通过官能基等来修饰脂质粒子的表面。依据所述官能基的修饰，可通过将官能基预先键结于磷脂质等或在脂质粒子的形成后将官能基键结而实现。所述脂质溶液中的水混合性有机溶剂的浓度，此外，稀释所述脂质溶液的稀释介质的调配比，如在所述领域中一般所知者那样，只要是以形成脂质粒子(脂质体)的方式构成为与脂质组成及脂质浓度相依的适当的范围，则并无特别限定。
再者，本发明的脂质粒子或微胞的形成方法中，由于使用所述流路构造体并以稀释介质来稀释脂质溶液或两亲性物质，故无特别限定，此外，虽因所使用的脂质或两亲性物质及水混合性有机溶剂的种类的不同而某程度受到左右，但具体而言，例如设为脂质溶液或两亲性物质溶液的流量与稀释介质的流量的比率约1：1～1：50，更优选约1：3～1：10，对于得到良好的分散效率而言为优选。
实施例
以下根据实施例来更具体说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
在具有图2所示的基本构造的流路构造体中，调查用以制作期望的纳米尺寸的脂质粒子所需的构造件40的个数的影响性。
将流路宽度y0＝200μm，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm维持为固定，并制作构造件40的个数分别为6个、10个、20个、100个的流路构造体。以1：3或1：9的流量比并成为既定的总流量的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。将结果示于图4。如图4所示，不论通过何种条件皆可形成纳米尺寸的脂质粒子，尤其若构造件40的个数为10个以上，则可控制性良好地形成20nm～100nm范围的目的尺寸的粒子。
实施例2
在具有图2所示的基本构造的流路构造体中，调查用以制作期望的纳米尺寸的脂质粒子所需的相邻接的构造件40间的间隔d1、d2···的影响性。
将流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的宽度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···＝100μm维持为固定，并制作相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···分别为100μm、200μm、500μm、1mm的流路构造体。以1：3或1：9的流量比并成为既定的总流量的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。再者，为了参考，使用同一流路宽度的流路构造体中不具有构造件40的流路构造体，以及以往所知的混沌型混合器来进行同样的试验。再者，混沌型混合器，是依循所述非专利文献1所记载的内容来制作相同者(在直径200μm的流路中配置69循环的宽50μm、深31μm的混沌型混合器者)而使用(非专利文献1中的关联部分的记载，是对应所述关联而包含于本说明书中)。将结果示于图5。如图5所示，不论通过何种条件皆可形成纳米尺寸的脂质粒子，尤其若相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···为500μm以下，则可控制性良好地形成10nm～100nm范围的目的尺寸的粒子。
实施例3
在具有图2所示的基本构造的流路构造体中，调查用以制作期望的纳米尺寸的脂质粒子所需的各构造件40的高度(Y方向长度)h1、h2···的影响性。
将流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm维持为固定，并制作各构造件40的高度(Y方向长度)h1、h2···分别为70μm、100μm、150μm的流路构造体。以1：3或1：9的流量比并成为既定的总流量的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。再者，为了参考，使用同一流路宽度的流路构造体中不具有构造件40的流路构造体，以及以往所知的混沌型混合器(与实施例2所使用的混合器相同)来进行同样的试验。将结果示于图6。如图6所示，若各构造件40的高度(Y方向长度)h1、h2···为100μm，则可控制性良好地形成10nm～100nm范围的目的尺寸的粒子。
实施例4
在具有图2所示的基本构造的流路构造体中，调查用以制作期望的纳米尺寸的脂质粒子所需的构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···的影响性。
将流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm维持为固定，并制作各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···分别为50μm、70μm、100μm的流路构造体。以1：3或1：9的流量比并成为既定的总流量的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。再者，为了参考，使用同一流路宽度的流路构造体中不具有构造件40的流路构造体，以及以往所知的混沌型混合器(与实施例2所使用的混合器相同)来进行同样的试验。将结果示于图7。如图7所示，不论通过何种条件皆可形成纳米尺寸的脂质粒子，尤其若构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···为100μm，则可控制性良好地形成10nm～100nm范围的目的尺寸的粒子。
实施例5
如图8所示，准备具有本发明的基本构造的流路构造体(流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)，同时分别准备(1)在单侧壁面侧上设置具有同样高度但宽度大的单一的构造件40的形状、(2)仅在单侧壁面侧上设置多个具有同样高度的构造件40的形状、(3)在两壁面侧上设置多个构造件40但分别对称地配置且各构造件的高度为一半的形状的流路构造体，然后调查对于制作期望的纳米尺寸的脂质粒子而言构造件的配置的影响性。将结果示于图9。如图9所示，仅具有本发明的基本构造的流路构造体，可控制性良好地形成目的尺寸的粒子。
实施例6
为了模拟具有本发明的基本构造的流路构造体中的脂质溶液的稀释状态，以流量比1：3且总流量50μl/分，使脂质溶液的水混合性有机溶剂即乙醇与作为稀释溶剂的水流动于流路构造体，并通过通用性物理模拟软件康模数尔多物理场(COMSOL Multiphysics)来模拟所述流动。将结果示于图10中。如图10所示，由于构造件的存在，可达到脂质溶液的稀释分散化，尤其在所述个数为第十个时，可证明分散极为均质地进行。
实施例7
为了调查具有本发明的基本构造的流路构造体中的从第一导入路径10与第二导入路径20的合流点31开始至最初的构造件40的上游侧端部41为止的距离x0的长短对脂质粒子的粒径所造成的影响性，在具有本发明的基本构造的流路构造体中，制作将所述距离x0分别变更为30mm、50mm、65mm、80mm、100mm的流路构造体。再者，这些流路构造体的流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm皆为共通。
以0.1ml/分的流量使作为脂质溶液的10mg/ml的磷脂质/乙醇溶液，以及以0.9ml/分的流量使作为稀释溶剂的生理食盐水(总流量1.0ml/分)在各流路构造体中流动，并比较所形成的脂质粒子的粒径。图11为示意性表示在所述总流量下使脂质溶液及稀释溶剂流动时的从合流点31的距离与到达所需时间的关系。将所得到的结果示于图12。如图12所示，距离x0为80mm以上(通过时间约0.1秒以上)时，所得到的脂质粒子的粒径变大。另一方面，距离x0为65mm以下(通过时间约0.08秒以下)时，可得到良好的粒径。
实施例8
相对于具有本发明的基本构造的流路构造体(流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)，以流量比1：3且总流速500μl/分，使脂质组成为pH响应性阳离子性脂质(YSK05)、胆固醇、聚乙二醇脂质(YSK05/胆固醇/mPEG2k-DMG为70/30/1-3(mol％)的比率)的脂质溶液(乙醇中8mM脂质浓度)，与作为稀释介质的干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)溶液(25mM乙酸缓冲液、pH4.0)流动，而尝试制作由pH响应性阳离子性脂质(YSK05)、胆固醇、聚乙二醇脂质、siRNA所构成的脂质粒子。其结果如图13所示，可确认形成粒径为100nm以下且尺寸均一性高的脂质纳米粒子。
将所制作的各脂质纳米粒子，以0.1或0.4mg(siRNA)/kg(体重)的比率静脉内投药于4周大的雌性美国癌症研究所(Institute for Cancer Research，ICR)鼠，并进行肝实质细胞中的基因减弱活性及投药药剂的肝脏内局部观察。肝实质细胞中的基因减弱活性，在静脉内投药24小时后抽血，并通过调查血浆中的第VII因子(F7)活性来进行。肝脏内局部观察，是通过共焦点激光扫描型显微镜观察静脉内投药30分钟后的肝脏的各部位来进行。再者，肝脏内局部观察用的脂质纳米粒子，是使用以Dil(0.5mol％)将脂质进行荧光标识的脂质纳米粒子。将所得到的结果示于图14、图15。如图14所示，使用本发明的流路构造体所制作的脂质粒子，在体内，可良好地发挥投药量相依性的基因减弱活性，尤其是粒径大的1％聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)者，显示高活性(约3倍)。此外，如图15所示，使用本发明的流路构造体所制作的脂质粒子，在体内，可良好地发挥药物传递作用，尤其是粒径小的3％PEG者，朝血液的非特异性聚集少，可选择性地到达肝实质细胞(组织深部)。
实施例9
本发明的流路构造体中，调查用以制作期望的纳米尺寸的脂质粒子所需的流路宽度y0的影响性。
如图16(a)所示，准备具有本发明的基本构造的流路构造体(流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)，同时分别准备(1)流路宽度y0＝400μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝300μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm的流路宽度虽比所述基本构造的流路构造体宽，但流路宽度y0与各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)的比率为相同的4：3的流路构造体，(2)流路宽度y0＝400μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝350μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm的流路宽度比所述基本构造的流路构造体宽，且流路宽度y0与各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)的比率设为8：7的流路构造体。
以1：9的流量比并成为既定的总流量的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。再者，为了参考，同一流路宽度的流路构造体中不具有构造件40的流路构造体，将结果示于图16。如图6(所示，即使将流路宽度y0设为400μm，对粒径控制性也无大影响。此外，流路宽度y0与各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)的比率为4：3的流路构造体，与比率8：7的流路构造体相比，对于粒径控制性可得到稍微良好的结果。
实施例10
本发明的流路构造体中，调查各构造件的斜率的影响性。
在具有流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm的基本构成的流路构造体中，如图17(a)所示意性表示，制作各构造件的壁面与流路方向(X方向)之间所形成的角度θ构成为40°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°或140°(90°±50°)的流路构造体。
以1：3或1：9的流量比并成为总流量50μl/分、100μl/分或500μl/分的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。将结果示于图17(b)、(c)。如图17(b)、(c)所示，即使各构造件的壁面在流路方向(X方向)上在约90°±50°的范围内倾斜，也同样可形成具有既定的粒径的脂质粒子，此外，可确认能够通过流量条件来控制脂质粒子的粒径。
实施例11
本发明的流路构造体中，调查流体的导入路径数目的影响性。在具有本发明的基本构造的流路构造体(分别具有各1个的第一导入路径10及第二导入路径20。流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)之外，另外准备：除了具有如图18(a)所示意性表示，2个第二流体导入路径20a、20b相对于中央的第一导入路径10从两侧合流的形状之外，具有与具有所述基本构造的流路构造体相同的构造的流路构造体。
在具有所述2个第二流体导入路径20a、20b的流路构造体中，以全体计使脂质：生理食盐水的流量比成为1：3的方式从第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径20a、20b导入生理食盐水，并且以使分别从第二导入路径20a与第二导入路径20b所导入的生理食盐水的流量比成为1：1、3：1、1：3、9：1、1：9的方式一面调整一面导入，并调查脂质粒子的粒径。
此外，为了参考，在分别具有各1个的第一导入路径10及第二导入路径20的具有本发明的基本构造的流路构造体中，与所述同样地，以全体计使脂质：生理食盐水的流量比成为1：3、1：5、1：7、1：9、1：20的方式，一面调整一面从第一导入路径10导入脂质溶液，从第二导入路径20导入生理食盐水，并调查脂质粒子的粒径。将结果示于图18(b)、(c)。
图18(b)表示在具有2个第二流体导入路径20a、20b的流路构造体中，分别从第二导入路径20a与第二导入路径20b所导入的生理食盐水的流量比的变化对脂质粒子的粒径所造成的影响的图表。从图18(b)所示的结果中，可得到在所述具有2个第二流体导入路径20a、20b的流路构造体中，分别从第二导入路径20a与第二导入路径20b所导入的生理食盐水的流量比的变化，对所得到的脂质粒子的粒径不会造成太大影响的结果。
图18(c)表示使用具有2个第二流体导入路径20a、20b的流路构造体时与使用具有1个第二导入路径20的流路构造体时对脂质粒子的粒径所造成的影响的图表。从图18(c)所示的结果中，示出通过将第二流体导入路径2构成为多个(2个)与分别仅具有1个第一流体导入路径及第二流体导入路径的流路构造体相比，低流量下所生成的脂质粒子的粒径的标准差降低，粒径的变动变少。同时示出在相同的脂质：生理食盐水的流量比(1：3)下，所得到的脂质粒子的粒径也有变小的倾向。
实施例12
本发明的流路构造体中，对于流路构造体的曲折的流路部位的形状(各构造件的形状、配置)为不同的方案，调查流体的导入路径数目的影响性。
亦即，作为流路构造体，准备：与实施例11所使用的流路构造体为相同的(1)具有1个第一导入路径10与2个第二流体导入路径20a、20b从其两侧合流的形状，且关于曲折的流路部位为本发明的所述基本构造(流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)的流路构造体，(2)具有1个第一导入路径10与2个第二流体导入路径20a、20b从其两侧合流的形状，且关于曲折的流路部位为流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝100μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm的流路构造体，(3)具有1个第一导入路径10与2个第二流体导入路径20a、20b从其两侧合流的形状，且关于曲折的流路部位为流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝500μm的流路构造体，(4)具有本发明的基本构造的流路构造体(分别具有各1个的第一导入路径10及第二导入路径20。流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)，再者，(5)为了参考，在与所述(4)的流路构造体为相同流路宽度的流路构造体中不具有构造件40的流路构造体。
在这些5个流路构造体中，以全体计使脂质：生理食盐水的流量比成为1：3的方式从第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径20a、20b导入生理食盐水，并且在所述(1)～(3)的流路构造体中，以使分别从第二导入路径20a与第二导入路径20b所导入的生理食盐水的流量比成为1：1、3：1、1：3、9：1、1：9的方式一面调整，一面以总流量50μl/分导入，生成脂质粒子并调查所得到的脂质粒子的粒径。将所得到的结果示于图19、图20。
如图19所示，当使用具有多个(2个)第二流体导入路径2的所述(1)～(3)的流路构造体时，与分别仅具有1个第一流体导入路径及第二流体导入路径的所述(4)的流路构造体相比，所得到的脂质粒子的粒径、标准差皆小。此外，如图19、图20所示，因分别从第二导入路径20a与第二导入路径20b所导入的生理食盐水的流量比的不同，使用所述(2)及(3)的流路构造体时，示出粒径产生相对性的变化。另一方面，使用所述(1)的流路构造体时，示出粒径并未因流量比而受到较大影响。
实施例13
与所述实施例6同样地，为了模拟具有本发明的基本构造的流路构造体中的脂质溶液的稀释状态，以流量比1：3使脂质溶液的水混合性有机溶剂的乙醇与作为稀释溶剂的水流动于流路构造体，并通过通用性物理模拟软件康模数尔多物理场(COMSOLMultiphysics)来模拟所述流动。再者，为了调查因总流量的不同所形成的稀释过程，将总流量设定为100μl/分与500μl/分。将所得到的结果示于图21。如图21所示，总流量大者，表示出可通过构造件迅速地稀释。
实施例14
为了对于(1)具有本发明的基本构造的流路构造体中的脂质溶液的稀释状态，以及(2)与所述实施例10所使用的流路构造体同样地，除了具有2个第二流体导入路径20a、20b相对于中央的第一导入路径10从两侧合流的形状之外，具有与具有所述基本构造的流路构造体相同的构造的流路构造体中的脂质溶液的稀释状态进行模拟，以流量比1：3且总流量50μl/分使脂质溶液的水混合性有机溶剂的乙醇与作为稀释溶剂的水流动于流路构造体，并与所述实施例6同样地通过通用性物理模拟软件康模数尔多物理场(COMSOLMultiphysics)来模拟所述流动。再者，在具有2个第二流体导入路径20a、20b的所述(2)的流路构造体中，从第二流体导入路径20a与第二流体导入路径20b所导入的乙醇量是设为均等的1：1。将所得到的结果示于图22。如图22所示，将第二流体导入路径2构成为多个(2个)的流路构造体，与分别仅具有1个第一流体导入路径及第二流体导入路径的流路构造体相比，表示出可更迅速地稀释。
实施例15
本发明的流路构造体中，调查流路构造体的流路深度(三维性的扩展)的影响性。
制作：皆具有本发明的基本构造(流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)，且流路的深度(图2、图3中的纸厚方向)为100μm(流路深度/流路宽度＝0.5)的流路构造体，以及流路的深度为200μm(流路深度/流路宽度＝1)的流路构造体。以1：3或1：9的流量比并成为既定的总流量的方式，一面调整一面从这些流路构造体的第一导入路径10导入脂质溶液(乙醇中的10mg/ml磷脂酰胆碱溶液)，从第二导入路径导入生理食盐水，以进行脂质粒子的形成并调查所得到的脂质粒子的粒径。将所得到的结果示于图23。如图23所示，即使流路的深度成为2倍，粒径控制性也未观察到变化。
实施例16
调查本发明的流路构造体是否与脂质粒子的形成相同地可进行高分子微胞的形成。
相对于具有本发明的基本构造的流路构造体(流路宽度y0＝200μm，构造件40的个数＝100，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，宽度(X方向长度)x1、x2＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm)，以流量比(聚合物溶液：水)＝1：10、总流速10μl/分、50μl/分、100μl/分、300μl/分、500μl/分，使两亲性嵌段共聚物的聚苯乙烯(Polystyrene，PS)-聚环氧乙烷(polyethylene oxide，PO)嵌段共聚物(PS47-PEO46-PS47、数量平均分子量(Mn)＝约12000)的四氢呋喃溶液(在四氢呋喃1ml中为1mg的聚合物浓度)，与作为稀释介质的超纯水流动，以尝试制作高分子微胞。其结果如图24所示，与脂质粒子相同，可确认能够形成粒径为100nm以下且尺寸均一性高的高分子微胞，且也可通过流量条件来控制微胞的粒径。
实施例17
在具有图25(a)所示的构造的流路构造体中，尝试形成封入核酸-聚阳离子复合体而成的期望的纳米尺寸的脂质粒子。
所使用的流路构造体，如图25(a)所示，具有以下构造：在上游侧连接具有用以形成由核酸-聚阳离子复合体所构成的核粒子的前处理步骤用的曲折的流路部位的流路构造体部(以下称为“前处理用流路构造体部”)，在其下游侧连接具有用以形成本步骤的脂质粒子的曲折的流路部位的流路构造体部(以下称为“本步骤用流路构造体部”)；并构成为具有前处理用流路构造体部的下游导出口连结于本步骤用流路构造体部的第二导入路径(稀释介质导入路径)的形态。
再者，本步骤用流路构造体部的流路条件，是将流路宽度y0＝200μm，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm维持为固定，并将构造件40的个数设为20个，另一方面，前处理步骤用流路构造体部的流路条件，也将流路宽度y0＝200μm，各构造件40的高度h1、h2···(Y方向长度)＝150μm，各构造件40的宽度(X方向长度)x1、x2···＝100μm，相邻接的各构造件40间的间隔d1、d2···＝100μm维持为固定，并将构造件40的个数设为20个，而制作流路构造体。
首先以5：1的流量比并成为最终的本步骤的既定总流量的方式，一面调整一面从前处理步骤用流路构造体部的第一导入路径导入聚左旋赖氨酸/缓冲液(10mM HEPES缓冲液中的0.1mg/ml聚赖氨酸、pH7.4)，从第二导入路径导入核酸/缓冲液(10mM HEPES缓冲液中的0.1mg/ml DNA、pH7.4)，而尝试形成由核酸-聚阳离子复合体所构成的核粒子。再者，以1：5的流量比并成为本步骤的既定总流量的方式，一面调整一面从本步骤用流路构造体部的第一导入路径使脂质溶液(乙醇中的2mg/ml DOPE/DSPE-PEG/DCP(5.2：2.4：0.4)溶液)流动而导入，此外，从本步骤用流路构造体部的第二导入路径，使从连结于此的前处理步骤用流路构造体部所导出的被处理溶液直接流动而导入，以形成脂质粒子并调查所得到的脂质粒子的粒径。将结果示于图25(b)。此实施例中，在前处理步骤用流路构造体部中形成核酸-聚阳离子复合体的核粒子(粒径10nm～20nm)，最终如图25(b)所示，不论是通过哪一条件皆可形成封入有所述核粒子而成的纳米尺寸的脂质粒子，总流量大者，表示出粒径减少。
再者，所述略称分别表示以下所述的涵义。
HEPES＝4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)
DOPE＝二油酰磷脂酰乙醇胺(Dioleoylphosphatidylethanolamine)
DSPE-PEG＝二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(distearylphosphatidylethanolamine-polyethylenglycol)
DCP＝磷酸二鲸蜡酯(dicetylphosphate)
符号的说明
10：第一导入路径
20：第二导入路径
30：稀释流路
31：合流点
40：构造件
50：曲折的流路部位

Claims (8)

1.一种流路构造体，是用以形成纳米尺寸的脂质粒子或微胞的流路构造体，其特征在于：所述流路构造体，在其上游侧相互独立的导入第一流动体的第一导入路径与导入第二流动体的第二导入路径分别具有固定长度而合流，并朝向其下游侧形成1个稀释流路；
所述稀释流路，在至少一部分中具有二维地曲折的流路部位；
所述曲折的流路部位，是由以下方式所形成：当以比其更上游的稀释流路的轴线方向至其延长方向为X方向，以与所述X方向垂直地交叉的稀释流路的宽度方向为Y方向，以比其更上游的稀释流路的流路宽度为y0时，从在Y方向上相向的稀释流路的两侧壁面交互地朝向流路中心侧，在大致Y方向(大致+Y方向、大致-Y方向)上，以固定间隔d1、d2…设置至少两个以上的构造件，所述构造件具有1/2y0以上且未达1y0的固定高度h1、h2…，且在X方向上具有固定宽度x1、x2…而突出，来限制稀释流路的流路宽度。
2.根据权利要求1所述的流路构造体，其中所述流路宽度y0为20μm～1000μm，各构造件的宽度x1、x2…为20μm～1000μm，各构造件间的间隔d1、d2…为20μm～1000μm。
3.根据权利要求1或2所述的流路构造体，其中设置有10个～100个所述构造件。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的流路构造体，其中从所述第一导入路径与所述第二导入路径的合流点至最初的构造件的上游侧端部为止的距离，是以使在此之间流动的设定速度的稀释流体以0.1秒以下通过的方式，对应稀释流体的设定速度来规定。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的流路构造体，其中分别设置有多个流路作为所述第一导入路径和/或所述第二导入路径。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的流路构造体，其中所述大致Y方向为相对于流路方向(X方向)以40°～140°的角度所交叉的方向。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的流路构造体，其中导入第一流动体的第一导入路径与导入第二流动体的第二导入路径中任一路径连接于位于其上游侧的前处理用流路，所述前处理用流路具有与权利要求1～6中所规定的流路构造体为相同的构造。
8.一种脂质粒子或微胞的形成方法，是在流路构造体中以稀释介质来稀释脂质溶液或两亲性物质溶液而由此形成纳米尺寸的脂质粒子或微胞的脂质粒子或微胞的形成方法，其特征在于：使用根据权利要求1～7中任一项所述的流路构造体作为所述流路构造体，并以使总流量成为1μl/分～100ml/分的方式，从所述流路构造体的第一导入路径及第二导入路径的一方导入脂质溶液或两亲性物质溶液，从另一方导入稀释溶剂。
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