CN110129365A - 一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用 - Google Patents
一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法，通过向细胞悬液中分别添加含有携带目的基因的真核细胞表达载体质粒、DMEM高糖培养基和转染试剂的转染复合物，并在细胞培养过程中进一步添加转染增强子，在培养的不同阶段添加补料培养基，本发明不仅做到高效率、低成本的基因瞬时转染，还实现了快速稳定地表达重组蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用。
背景技术
通常意义上所说的蛋白表达，多指稳定的基因表达技术。稳定的基因表达技术是生物生产系统的金标准；然而，该过程需要耗费大量时间，从而不利于大通量、高效率地发现新的药用蛋白质。
基因瞬时表达是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上而不整合到染色体上，较短时间内就可获得基因的表达产物，但随着细胞的分裂增殖，这种外源基因最终会消失，其持续时间约为几天到两周。具体地，基因瞬时表达是指DNA进入宿主细胞后，不整合到宿主细胞的基因组DNA上，只是利用宿主细胞的蛋白表达体系，在转染后的某个时间段内表达外源蛋白或病毒；和稳定表达相比，瞬时表达法操作简易、周期短。传统的稳定表达系统，从转染到获得稳定表达细胞株至少需要几个月甚至更长的时间。而在瞬时表达系统中，进入细胞的外源DNA以游离形式存在于细胞中进行基因表达，拷贝数更高，而且其表达不受基因位置和基因沉默的影响。因此瞬时表达系统可能只需要2～4周就能获得足够量的外源蛋白等产物。
因此，基因瞬时表达方法为基因-蛋白质的研究提供了一种快速、方便的方法。相对于稳定的基因表达方法，基因瞬时(蛋白质)表达方法的优点有：(1)微量至中等量的重组蛋白的生产过程大大缩短；(2)可以同时转染不同的细胞系，挑选出最为合适的细胞；(3)用于难以实现稳定表达的重组蛋白质的生产；(4)用于以细胞为基础的高通量筛选。
现阶段的基因瞬时转染多是以脂质体为主，虽然其转染效率高但是其试剂成本比较高，而且对细胞有一定的毒性，适合于稳定细胞株的转染，不适合悬浮细胞的大规模的瞬时转染的生产工艺的开发。其他基因瞬时转染方法包括磷酸钙法、电穿孔法、病毒介导法等。其中，磷酸钙法转染效率低；电穿孔法不能进行大批量细胞的转染，不仅转染效率底，仪器设备的成本也很高；而病毒介导法虽然其转染效率比较理想，但是病毒的制备过程存在一定的风险，所以为了安全性的生产考虑，很难推广使用。
目前也采用高分子聚合物如PEI(聚乙烯亚胺)进行转染，根据对不同分子量(2.5-800kDa)的支链和直链PEI分子的研究结果，PEI的转染效率和细胞毒性主要是由分子量、支链化程度和阳离子电荷密度决定的。随着分子量的增大，转染效率逐渐提升，同时细胞毒性的大幅提升。与支链PEI分子相比，直链PEI分子的细胞毒性更低，同时其具有更强的对DNA分子的压缩能力，增加了形成复合物的平均粒径从而增加细胞与复合物接触的机会，最终提高转染效率。因此，如何得到更加优化的PEI转染试剂，以便有效降低PEI的生物毒性，并应用于相应的细胞培养方法，正是当前需要解决的问题。
综上所述，目前本领域亟需一种高效率、低成本的基因瞬时转染方法，以提高在所转染细胞中稳定地瞬时表达重组蛋白的表达量。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明人根据不同结构的PEI分子所具有的不同特性对PEI转染法进行改进，构建了新的复合转染试剂，其为PEIMAX、LPEI和B-PEI的混合物，其中PEIMAX为大分子量PEI，LPEI为线性PEI，B-PEI为支链PEI。该复合转染试剂有效降低了常规用PEI转染的生物毒性，并达到与脂质体同样甚至更好的转染效果，从而在经济实惠的条件下实现了高的细胞转染效率。
本发明的目的在于提供一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：
S1：将在无血清培养基中生长好的待转染细胞如293F细胞调整细胞悬液的细胞密度后置于转染摇瓶中；
S2：转染复合物的制备：将携带目的基因如IL-6(白介素6)基因的真核细胞表达载体质粒如pCDNA3.4加入到DMEM高糖培养基中，涡旋；然后将转染试剂按照质粒：转染试剂的质量比为1:3-1:10直接加入到上述含有质粒的培养基中，涡旋，将制备的转染复合物在室温下放置10-20min；
S3：在上述转染摇瓶中培养细胞2-4h后，一边摇晃所述转染摇瓶一边将上述转染复合物滴加到所述细胞悬液中，然后将该摇瓶放置在摇床上培养；
S4：细胞培养24h后添加2％体积的转染增强子继续培养；
S5：分别在细胞培养至48h(2天)、96h(4天)、144h(6天)后添加5％体积的补料培养基；
S6：转染后的细胞持续培养5-7天，可收获细胞并检测所转染质粒的目的蛋白表达量。
在本发明上述方法的一些实施方案中，在S1步骤中将生长好的待转染细胞如293F细胞进行计数并调整细胞密度为1-3×106/mL，优选为2×106/mL，然后将100mL体积的该细胞悬液置于500mL体积的摇瓶中。
在本发明上述方法的一些实施方案中，在S2步骤中所述质粒：转染试剂的质量比为1:5。进一步地，所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝2:1:1的混合物。
在本发明上述方法的一些实施方案中，在S4步骤中所述转染增强子为酵母提取物和维甲酸的混合物。进一步地，所述酵母提取物的储存浓度为100mg/ml，所述维甲酸的储存浓度为50mg/ml。
在本发明上述方法的一些实施方案中，所述补料培养是基于Hyclone公司的Cellboost 5再配合含糖量添加葡萄糖以使其终浓度为3g/L。
在本发明上述方法的一些实施方案中，在S5步骤中培养48h后，再进行一次重复转染。
本发明一个方面提供一种高效的细胞转染试剂盒，所述试剂盒包括：冷冻的待转染细胞(如293F细胞)、DMEM高糖培养基、转染试剂、转染增强子、补料培养基，其中所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝2:1:1的混合物，且所述转染增强子为酵母提取物和维甲酸的混合物。
本发明另一个方面提供上述试剂盒在构建基因瞬时表达系统中的应用。
本发明又一个方面提供上述试剂盒在构建药物蛋白模型中的应用。
有益效果
本发明的高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法，通过向细胞悬液中分别添加含有携带目的基因的真核细胞表达载体质粒、DMEM高糖培养基和转染试剂的转染复合物，并在细胞培养过程中进一步添加转染增强子，在培养的不同阶段添加补料培养基，不仅做到高效率、低成本的基因瞬时转染，还实现了快速稳定地表达重组蛋白。
附图说明
图1所示为实施例1中细胞转染后，在不同阶段的培养细胞通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较。
图2所示为在步骤S2中所述转染试剂中PEIMAX：LPEI：B-PEI为不同比例的混合物而其他条件相同的条件下，培养细胞144h(6天)后，通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较，其中M为标准蛋白Marker条带，对照为采用常规脂质体转染(脂质体为Invitrogen公司的Lipofectamine2000)，组1-3为采用本发明的转染试剂进行转染，且所述转染试剂中PEIMAX：LPEI：B-PEI的比例，在组1(实施例1)中为2:1:1，在组2(实施例2)中为1:1:1，在组3(实施例3)中为2:1:2。
图3所示为在步骤S2中所述质粒：转染试剂采用不同质量比而其他条件相同的条件下，培养细胞144h(6天)后，通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较，其中步骤S2中所述质粒：转染试剂的比例，在实施例1中为1:5，在实施例4中为1:3，在实施例5中为1:10。
图4所示为在对比例2(除了步骤S4中不添加所述转染增强子以外，其他实验步骤和条件同实施例1的条件)与实施例1中，培养细胞144h(6天)后，通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较，其中1号条带为Marker标记，2号条带为对比例1，3号条带为实施例1。
图5所示为按照实施例1的培养条件，在不同初始细胞密度下，所转染细胞培养120h后检测到目的蛋白的表达量比较。其中与初始细胞密度为2×106/mL(实施例1，组1)相比，初始细胞密度1×106/mL时(实施例6，组2)的细胞生产密度明显比较低，所以蛋白的表达量不是很高，而当初始细胞密度为3×106/mL时(实施例7，组3)因细胞活率降低比较明显蛋白表达量更低。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明实施例主要利用以下仪器：生物安全柜(BOOSERIES A2)、水平低速离心机(X3)购自Thermo；二氧化碳培养箱(NEW Brunswick S41i)、移液器(26300)购自eppendorf；倒置显微镜(XDS-113)购自重庆广电；血细胞记数器(Z318427)购自把因医疗；血细胞计数板(Z319023)购自把因医疗；冰箱(BCD-322W)购自博西华家用电气有限公司；生化培养箱(Blue pard)购自上海一恒科学仪器有限公司。
本发明的实施例主要利用以下试剂：无血清培养基，货号A1435103，购自Gibco的Expi293Expression Medium，用于实现细胞的良好的生长，以便有效保证转染效率的提高；高糖型DMEM基础培养基，即DMEM高糖培养基(也用于稀释质粒或转染试剂)购自Gibco；293F细胞株购自深圳百恩维生物科技有限公司；转染试剂、补料培养基、转染增强子购自同立海源公司。
实施例1：一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
S1：将在无血清培养基(Gibco的Expi293Expression Medium)中生长好的293F细胞进行计数，并调整细胞密度为2×106/mL，将100mL体积的该细胞悬液置于500mL体积摇瓶中；
S2：转染复合物的制备:
(1)将1μg/mL的携带目的基因IL-6(白介素6)基因的真核细胞表达载体质粒pCDNA3.4加入到100μL的DMEM高糖培养基中，涡旋3s；
(2)按照质粒：转染试剂的质量比为1:5的比例，将1mg/mL的转染试剂直接加入到上述含有质粒的DMEM高糖培养基中涡旋3s，然后将制备的转染复合物在室温下放置10-20min备用，其中所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝2:1:1的混合物；
S3：在上述转染摇瓶中培养细胞2-4h后，一边摇晃转染摇瓶一边将转染混合物滴加转染复合物到细胞悬液中，将添加转染复合物摇瓶放置摇床中进行培养。
S4：细胞培养24h后添加2％体积的转染增强子继续培养，其中所述转染增强子为酵母提取物和维甲酸的混合物，并且酵母提取物的储存浓度为100mg/ml，维甲酸的储存浓度为50mg/ml；
S5：分别在细胞培养至48h(2天)、96h(4天)、144h(6天)后添加5％体积的补料培养基，其中该补料培养基是基于Hyclone公司的Cell boost 5再配合含糖量添加葡萄糖，使其终浓度为3g/L(如希望得到更高的目的蛋白表达量，也可在培养至48h后再进行一次重复转染，转染条件同上)；
使用台盼蓝染色来检测细胞活率，从开始培养细胞至添加转染增强子进行转染后不同培养时间的细胞密度和活率如以下表1所示。
表1：细胞培养不同时期的细胞密度和活率变化
S6：转染后的细胞持续培养5-7天；可收获转染后不同阶段的细胞，并通过SDS-PAGE检测来分析转染质粒以后的目的蛋白表达量，图1所示为转染后48h(2天)、96h(4天)、120h(5天)、144h(6天)检测的目的蛋白表达量。
实施例2：高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
除了步骤S2中所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝1:1:1的混合物以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
实施例3：高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
除了步骤S2中所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝2:1:2的混合物以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
实施例4：高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
除了步骤S2中所述质粒：转染试剂的质量比为1:3以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
实施例5：高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
除了步骤S2中所述质粒：转染试剂的质量比为1:10以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
实施例6：高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
除了步骤S1中调整细胞密度为1×106/mL以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
实施例7：高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法
除了步骤S1中调整细胞密度为3×106/mL以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
表2所示为按照实施例1的培养条件，在不同初始细胞密度下转染和培养细胞，使用台盼蓝染色来检测细胞活率，不同培养阶段所测的细胞密度和细胞活率。
表2：不同初始细胞密度下细胞培养0-144h期间的细胞密度和细胞活率
表2结果表明，与初始细胞密度为2×106/mL相比，初始细胞密度1×106/mL时的细胞生产密度明显比较低，所以蛋白的表达量不是很高，而当初始细胞密度为3×106/mL时细胞活率的降低比较明显；如图5所示，在所转染细胞培养120h后检测到目的蛋白的表达量为，实施例1(组1)>实施例6(组2)>实施例7(组3)。
对比例1：细胞转染方法
除了步骤S4中不添加所述转染增强子以外，其他实验步骤和条件同实施例1。
使用台盼蓝染色来检测细胞活率，对比例1中转染后不同培养时间的细胞密度和活率变化如以下表3所示。
表3：添加转染增强子进行细胞转染后不同时间的细胞密度和活率
结果讨论
将表3中的数据与以上表1数据比较可以看出，与实施例1在步骤S4中添加所述转染增强子相比，添加转染增强子后，细胞转染后细胞密度明显更高。具体地，在培养72h(3天)后达到最高16×106/ml且活率为97％，此后随着培养时间延长逐渐有所降低，至培养144h(6天)后为7.5×106/ml且活率为62％；而在不加转染增强子情况下，细胞转染后细胞密度，在培养72h(3天)后仅为5×106/ml且活率为90％，至培养96h(4天)后为4.3×106/ml且活率为70％。因此，添加转染增强子能够明显促进细胞增殖，从而可以延长细胞持续培养的时间，有效提高目的蛋白的表达量。
如图1所示，实施例1中细胞转染后，在不同阶段的培养细胞通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较结果表明，转染后细胞表达的目的蛋白总量随着时间的延长逐渐增加，表现出积累性。
如图2所示，在步骤S2中所述转染试剂中PEIMAX：LPEI：B-PEI为不同比例的混合物而其他条件相同的条件下，培养细胞144h(6天)后，通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后进行目的蛋白表达量比较；其中M为标准蛋白Marker条带，对照为采用常规脂质体转染(脂质体为Invitrogen公司的Lipofectamine2000)，组1-3为采用本发明的转染试剂进行转染，且所述所述转染试剂中PEIMAX：LPEI：B-PEI的比例，在组1(实施例1)中为2:1:1，在组2(实施例2)中为1:1:1，在组3(实施例3)中为2:1:2；结果表明，组1的目的蛋白表达量明显最高，依次分别为组2、组3、对照组，其中对照组最低。因此实施例1的转染试剂组分配比为优选方案。
如图3所示，在步骤S2中所述质粒：转染试剂采用不同质量比而其他条件相同的条件下，培养细胞144h(6天)后，通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较，其中步骤S2中所述质粒：转染试剂的比例，在实施例1中为1:5，在实施例4中为1:3，在实施例5中为1:10。结果表明，质粒与转染复合物的比例，随着转染复合物的增加而增加，但该比例达到1:10时候，其目的蛋白表达量与1:5相比没有明显差异，因此从节约成本考虑，优选采用1:5的比例。
如图4所示为在对比例2(除了步骤S4中不添加所述转染增强子以外，其他实验步骤和条件同实施例1的条件)与实施例1条件下，培养细胞144h(6天)后，通过SDS-PAGE检测分析的转染质粒以后的目的蛋白表达量比较，其中1号条带为Marker标记，2号条带为对比例1，3号条带为实施例1。结果表明，与不添加转染增强子相比，添加转染增强子进行转染后培养细胞中目的蛋白的表达量有明显增加。
如图5所示，按照实施例1的培养条件，在不同初始细胞密度下所转染细胞培养120h后检测到目的蛋白的表达量有明显差异。其中与初始细胞密度为2×106/mL(实施例1，组1)相比，初始细胞密度1×106/mL时(实施例6，组2)的细胞生产密度明显比较低，所以蛋白的表达量不是很高；而当初始细胞密度为3×106/mL时(实施例7，组3)，因细胞活率降低比较明显而使得蛋白表达量更低。结果所测得目的蛋白的表达量，实施例1(组1)>实施例6(组2)>实施例7(组3)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将在无血清培养基中生长好的待转染细胞调整细胞悬液的细胞密度后置于转染摇瓶中；
S2：转染复合物的制备：将携带目的基因的真核细胞表达载体质粒加入到DMEM高糖培养基中，涡旋；然后将转染试剂按照质粒：转染试剂的质量比为1:3-1:10直接加入到上述含有质粒的培养基中，涡旋，将制备的转染复合物在室温下放置10-20min备用；
S3：在上述转染摇瓶中培养细胞2-4h后，一边摇晃所述转染摇瓶一边将上述转染复合物滴加到所述细胞悬液中，然后将该摇瓶放置在摇床上培养；
S4：细胞培养24h后添加2％体积的转染增强子继续培养；
S5：分别在细胞培养至48h、96h、144h后添加5％体积的补料培养基；
S6：转染后的细胞持续培养5-7天，然后收获细胞并检测所转染质粒的目的蛋白表达量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1步骤中将生长好的待转染细胞进行计数并调整细胞密度为1-3×106/mL，将100mL体积的该细胞悬液置于500mL体积的摇瓶中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2步骤中所述质粒：转染试剂的质量比为1:5。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝2:1:1的混合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在S4步骤中所述转染增强子为酵母提取物和维甲酸的混合物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料培养是基于Hyclone公司的Cellboost 5再配合含糖量添加葡萄糖以使其终浓度为3g/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在S5步骤中培养48h后，再进行一次重复转染。
8.一种高效的细胞转染试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：冷冻的待转染细胞、DMEM高糖培养基、转染试剂、转染增强子、补料培养基，其中所述转染试剂为PEIMAX：LPEI：B-PEI＝2:1:1的混合物，且所述转染增强子为酵母提取物和维甲酸的混合物。
9.权利要求8所述试剂盒在构建基因瞬时表达系统中的应用。
10.权利要求8所述试剂盒在构建药物蛋白模型中的应用。
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