KR20170031138A - 세포 면역요법을 위한 배양 배지 - Google Patents

세포 면역요법을 위한 배양 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물들의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공하며, 하기 단계들:
a) 제1 공여체로부터 적어도 제1 혈액 산물을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 혈액 산물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
d) 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 상기 선정된 범위에 있는 경우, 상기 세포 배양 배지를 위해 상기 제1 혈액 산물을 선택하고, 선택적으로 상기 제1 선택된 혈액 산물을 제1 가공된 혈액 산물로 전환시키거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 혈액 산물을 선택하지 않는 단계를 포함한다.

Description

세포 면역요법을 위한 배양 배지{CULTURE MEDIUM FOR CELLULAR IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 고품질 기준, 특히 면역 세포의 성장 및 확장 (expansion)을 위한 세포 배양 배지 (cell culture media) 및 제조 방법에 관한 것이다.
암 치료를 위한 가장 유망한 발전 중 하나는 활성 세포 면역요법 (active cellular immunotherapy)이라 불리는 신규한 치료 분야이다. 활성 면역요법은 인체 자체의 면역 세포를 사용하여 항원 특이적 항-종양 효과를 촉진하기 위해 환자의 면역계를 자극한다. 이를 위해, 면역 세포가 세포 수를 증가시키고 분화에 영향을 주기 위해서 인 비트로 (in-vitro) 배양된다.
세포를 인-비트로 배양하기 위해서, 조절된 온도, 세포 부착을 위한 기질, 및 정확한 pH 및 삼투압을 유지하는 적절한 배양 배지 및 인큐베이터와 같은 몇가지 기본 환경 요건이 충족되어야 한다.
세포 배양 배지 조제가 문헌에 잘 개시되어 있으며, 다수의 배지가 상업적으로 이용가능하다. 세포 배양 배지는 일반적으로 세포 주기를 조절하는 적절한 에너지원 및 화합물을 포함한다. 통상적인 배양 배지는 성장 인자, 호르몬 및 부착 인자의 공급원으로서 아미노산, 비타민, 무기 염류, 글루코스 및 혈청의 보충물로 이루어진다. 영양소 외에도, 상기 배지는 또한 pH와 삼투압 유지에 도움을 준다.
세포 배양 배지 조제가 문헌에 잘 개시되어 있으며, 다수의 배지가 상업적으로 이용가능하다. 면역 세포, 특히 림프구의 배양 및 확장을 위해서, 통상적으로 상기 세포 배양 배지가 혈청 또는 혈장으로부터 유래되며, 면역 세포에 신체의 자연 환경과 유사한 환경을 제공한다.
그러나, 최신 기술의 배양 배지에서 확장된 림프구의 증식 속도 및 활성은 아직 충분하지 않다. 더욱이, 상기 림프구 확장 결과의 양 (quantity), 품질 (quality) 및 생존도 (viability)에 관한 예측 가능한 결과가 매우 드물고, 요구되는 품질을 확인하기 위해 혈청의 여러 배치 (batch)를 시험할 필요가 있다는 것이 일반적인 관례이다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래 기술의 단점들 중 적어도 하나를 극복하는데 있다.
본 발명은 특히 사용된 세포 배양 배지의 품질이 세포 면역요법을 위한 림프구의 확장 과정의 결과에 큰 영향을 미친다는 발견에 근거한다. 특히, 본 발명자들은 림프구 확장에 대한 세포 배양 배지의 품질을 결정하는 다양한 품질 인자 (quality factors)를 규정하였다. 본 발명자들은 에스트라디올 (estradiol), 코르티솔 (cortisol), IGF-1, 인슐린 (insulin) 및 SHBG와 같은 품질 인자가 특정의 선정 농도로 존재하는지를 측정할 수 있다. 개별 품질 인자에 대해 결정된 기준을 충족시키는 세포 배양 배지는 포유동물 세포, 특히 면역계의 세포의 배양의 개선된 결과를 제공한다.
그러므로, 본 발명은 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공하며, 하기 단계들을 포함한다:
a) 제1 공여체로부터 적어도 제1 혈액 산물을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 혈액 산물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
d) 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 선정된 범위에 있는 경우, 상기 세포 배양 배지를 위해 상기 제1 혈액 산물을 선택하고, 선택적으로 상기 제1 선택된 혈액 산물을 제1 가공된 혈액 산물로 전환시키거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 혈액 산물을 선택하지 않는 단계.
본 발명은 세포 배양 배지의 부피에 기초하여, 하기를 포함하는 세포 배양 배지를 더 포함한다:
- 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5;
- 500 pg/ml 미만의 농도로 이오탁신 (Eotaxin);
- 100 pg/ml 미만의 농도로 PDGF-88 및/또는 CXCL-10;
- 200 pg/ml 미만의 농도로 IL-10;
- 50 pg /ml 미만의 농도로 IL-13;
- 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, 염기성 FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP 1b, PDGF, IL-1RA, 및/또는 TNFα;
- 적어도 65 pmol/l, 바람직하게 적어도 75 pmol/l, 더 바람직하게 적어도 85 pmol/l의 농도로 에스트라디올;
- 적어도 190 nmol/l, 바람직하게 적어도 210 nmol/l, 더 바람직하게 적어도 220 nmol/l의 농도로 코르티솔;
- 적어도 80 μg/l, 바람직하게 적어도 120 μg/l, 더 바람직하게 적어도 140 μg/l의 농도로 IGF-1; 및/또는
- 31 nmol/l 미만, 바람직하게 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG.
마지막으로, 본 발명은 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 세포 배양 면역요법에 있어서 세포 배양 배지와 관련하여 훨씬 더 높은 품질 기준이 충족되어야 한다는 것을 발견하였다. 실시예에서 개시된 바와 같이, 개별 품질 인자에서의 차이가 림프구 현탁의 결과에서 상당한 변화를 이끈다. 특히, 상기 품질 인자가 소정 범위에 있는 배지에서, 면역 세포의 성장 (growth), 증식 (proliferation) 또는 확장 (expansion)은 상기 세포의 증식 속도, 생존도 및 활성을 증가시킨다. 이러한 품질 인자의 확인으로 세포 배양 배지를 제조하기 위한 개선된 방법, 특히 면역요법을 위한 세포 개체군을 결정할 수 있게 한다.
그러므로, 본 발명은 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공하며, 하기 단계들을 포함한다:
a) 제1 공여체로부터 적어도 제1 혈액 산물을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 혈액 산물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
d) 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 상기 선정된 범위에 있는 경우, 상기 세포 배양 배지를 위해 상기 제1 혈액 산물을 선택하고, 선택적으로 상기 제1 선택된 혈액 산물을 제1 가공된 혈액 산물로 전환시키거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 혈액 산물을 선택하지 않는 단계.
본 발명에 따른 방법은 림프구 확장을 위한 인자와 조합하여 세포의 강한 증식 및 확장된 림프구의 높은 활성을 허용하는 고품질의 세포 배양 배지를 제공한다. 또한, 상기 방법은 T-세포와 같은 림프구의 인 비트로 확장을 촉진하는 일관된 품질의 세포 배양 배지의 제공을 보장한다.
본원에 사용된 "세포 배양 배지 (cell culture medium)" 또는 "성장 배지 (growth medium)"는 동물 또는 식물 세포의 성장을 지지하도록 고안된 액체 또는 겔이다. 성장 배지는 pH, 글루코스 농도, 성장 인자 및 다른 영양소의 존재에서 달라질 수 있다. 세포 배양 배지에는 두 가지 종류가 있다: 혈액 산물 기반 배지 및 합성 배지.
본 발명에 따르면, "혈액 산물 기반 배지 (blood product based media)"는 적어도 하나의 혈액 산물을 포함한다.
본원에 사용된 "합성 배지 (synthetic medium)"는 화학적으로 한정된 배지이다. 이러한 배지에는 혈액 산물과 같은 자연 유래 배양액을 포함하지 않는다. 대신에, 모든 성분들이 정해진 농도로 배지에 첨가된다.
본원에 사용된 "혈액 산물 (blood product)"은 포유류의 전혈 또는 전혈의 서브세트, 특히 혈장, 혈청, 또는 혈장 및 혈청의 부가적인 서브세트를 나타낸다.
본원에 사용된 "가공된 혈액 산물 (processed blood product)"은 혈장, 혈청 및 그 서브세트를 포함한다.
본원에 사용된 "혈장 (plasma)"은 포유류의 혈장을 의미한다. 상기는 일반적으로 현탁액에서 전혈 중 혈액 세포를 보유하는 혈액의 옅은 흰색, 때로는 노란색 액체 성분이다. 혈장은 대부분 물이며, 용해된 단백질, 글루코스, 응고 인자, 전해질, 호르몬 및 이산화탄소를 포함한다. 혈장은 혈액으로부터 제조될 수 있으며, 예를 들어 항응고제를 포함하는 신선한 혈액의 원심분리에 의해서 혈액 세포가 원심분리 튜브의 바닥으로 침전된다. 그 후 상층액 (supernatant)이 혈장이다.
본원에 사용된 "혈청 (serum)"은 응고 인자가 없는 혈장이다.
본원에 사용된 "응고 인자 (coagulation factor)"는 또한 "응집 인자 (clotting factor)"라고 하며, 다양한 단백질, 예를 들어 피브리노겐 (fibrinogen), 프로트롬빈 (prothrombin) 또는 인자 VII (factor VII)을 포함한다.
본원에 사용된 "전혈의 서브세트 (subset of whole blood)"는 전혈의 성분의 일부를 포함하는, 전혈로부터 유래된 용액 또는 현탁액을 나타낸다. 혈장 및 혈청은 전혈의 서브세트이다.
본원에 사용된 "공여체 (donor)"는 혈액 산물이 입수되는 포유동물, 특히 인간을 의미한다. 공여 (donation)는 전혈 (whole blood: WB) 또는 성분채집술 (apheresis)에 의해서 회수되는 전혈의 특정 성분일 수 있다.
본원에 사용된 "성분채집술 (apheresis)"은 공여체의 혈액이 장치를 통과하여, 하나의 특정 성분을 분리해내고, 나머지는 순환계로 되돌리는 의료 기술이다. 예를 들어, 혈장분리교환술 (plasmapheresis)은 혈장만을 수집하고; 모든 다른 성분들이 공여체에게 되돌아간다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 공여체로부터 "혈액 산물을 입수하는 것 (obtaining a blood product)"은 공여체로부터 혈액을 회수하는 행위를 나타내며, 특히 상기 공여체의 혈관으로부터 직접 채혈하는 행위를 나타낸다.
본원에서 사용된 "시토킨 (cytokines)"은 세포 신호전달 (cell signaling)에서 중요한 작은 단백질 (~ 5 - 20 kDa)의 광범위하고 정밀하지 않은 카테고리이다. 상기는 세포에 의해서 분비되고, 다른 세포의 거동에 영향을 준다. 시토킨은 또한 자가분비 신호전달 (autocrine signaling)에 관여될 수 있다. 시토킨은 케모킨 (chemokines), 인터페론 (interferons), 인터루킨 (interleukins), 림포킨 (lymphokines), 종양 괴사 인자 (tumour necrosis factor) 및 성장 인자 (growth factors)를 포함한다.
"임상적으로 관련된 림프구 (clinically relevant lymphocytes)"는 항원-편집된 림프구 (antigen-edited lymphocytes)라고 한다. 상기 용어 임상적으로 관련된은 또한 림프구의 하위그룹에 대해서도 사용된다. 특히 바람직한 임상적으로 관련된 림프구는 임상적으로 관련된 T-세포 또는 항원-편집된 T-세포이다.
본 발명에 따른 "임상적으로 관련된 항원 (clinically relevant antigens)"은 질병에 관여하는 항원이다. 따라서, 임상적으로 관련된 항원은 종양-관련 항원 (TAA), 병원체 관련 항원 (PAA) 또는 자가항원 (autoantigens)일 수 있다. 종양-반응성 림프구는 TAAs에 특이적이고, 상호작용한다. 감염성 질환 반응성 림프구는 PAAs에 특이적이고, 상호작용하며, 또한 자가면역 질환 반응성 림프구는 자가항원에 특이적이고, 상호 작용한다.
본 발명에 따르면, "항원 (antigen)" (Ag)은 각각 적응 면역 반응 (adaptive immune response), TCR 또는 항체의 수용체에 대한 표적으로서 제공되는 임의의 구조적 물질이다. 항원은 특히 단백질, 폴리사카리드, 지질 및 펩티드와 같은 그 서브구조이다. 지질 및 핵산은 특히 단백질 또는 폴리사카리드와 결합될 때 항원성 (antigenic) 이다.
공여체 또는 복수의 공여체로부터 혈액 산물을 제공하는 것은 혈액 산물을 입수하는 과정을 포함하지 않는다.
본 발명에 따르면, 품질 인자는 면역계의 세포 및 줄기 세포와 같은 고도 감수성 세포주의 성장 및 특성에 영향을 줄 수 있는 농도로 혈액에서 발견될 수 있는 임의의 성분일 수 있다.
면역계의 세포는 이에 한정되는 것은 아니지만, B-세포, T-세포, NK-세포, 단핵구 (monocytes), 수지상 세포 (dendritic cells), 과립구 (granulocytes) 및 혈소판 (platelets)을 포함한다.
혈액 유래 배지는 하나의 공여체에서 다른 공여체로의 변동 (fluctuations) 때문에 성분에 차이가 있다는 단점을 갖는다.
본원에 사용된, "병원체 관련 인자 (pathogen related factors)"는 혈액 중의 병원체의 존재를 확인하는 인자이다. 주로 시험된 병원체는 예를 들어 항-트리파노소마 크루지 (anti-Trypanosoma cruzi), 간염 (hepatitis) B 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 파르보 바이러스 (parvo virus), 수두대상포진바이러스 (varicella-zoster virus), 간염 E 바이러스 (HEV) 및 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency viruses) 타입 1 및 2 (HIV-1, HIV-2)이다. 병원체 관련 인자에 대한 검사는 감염된 혈액 산물을 사용할 위험을 최소화한다. 바람직하게, 품질 인자는 병원체 관련 인자가 아니다.
인간의 혈액 공여체는 자발적 공여체 및 전문적으로 모니터된 공여체를 포함한다. 상기 공여체 모두는 건강한 개체이어야 한다. 또한, 인간 혈액 공여체는 연령, 체중 및 식이 요법과 같은 특정 기준을 충족해야 한다. 전문적으로 모니터된 혈액 공여체가 등록소에 들어갔다. 등록소에서, 상기 공여체 및 제공된 혈액 시료에 대한 다양한 데이터가 기록되었다.
제1 혈액 산물을 제공하는 것은 특히 혈액 백 키트 (blood bag kit), 백 (bag), 컨테이너 (container), 용기 (vessel), 또는 멀티웰 플레이트 (multiwell plate)로 혈액 산물의 전달을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 제1 공여체로부터 제1 혈액 산물이 혈액 백 키트로 전달된다.
일 구현예에 따르면, 제1 공여체로부터 제1 혈액 산물이 멀티웰 플레이트로 전달된다. 멀티웰 플레이트는 특히 24-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 96-웰 플레이트 또는 192-웰 플레이트이다. 멀티웰 플레이트는 다수의 웰이 있는 플레이트이다. 웰의 수는 제한되지 않는다.
품질 인자의 농도를 측정하기 위해, 다양한 방법이 당 분야에 알려져 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 품질 인자가 비탁측정법 (nephelometry), 혼탁측정법 (turbidimetry) 및 ELISA로부터 선택된 방법에 의해 측정된다. 비탁측정기 (nephelometer)는 액체 또는 기체 콜로이드에서 현탁된 입자의 농도를 측정하기위한 장치이다.
비탁측정법 (및 혼탁측정법)이 Euronorm EN 27027 (독일 DIN-Norm the ISO Norm 7027과 동일)에 정의되었다. 비탁측정기는 광선과, 광원 빔의 한쪽면에 설치된 광 검출기를 사용하여 현탁된 미립자를 측정한다. 비탁측정법에서 혈액 산물의 시료에 품질 인자에 특이적인 항체가 첨가된다. 그 후 상기 품질 인자와 항체의 상호작용으로 침전이 일어나서 빛의 측면 산란을 일으킨다. 그러므로, 증가 또는 감소 중 어느 것이 정성화될 수 있다. 비탁측정법에서, 측면-산란된 광의 증가가 측정된다. 혼탁측정법에서 전방-산란된 광의 감소가 측정된다. 상기 비탁측정의 결과가 비탁측정 혼탁도 단위 (nephelometric turbidity unit: NTU)로 제공되며, 품질 인자의 규정된 농도 값을 갖는 NTU-곡선으로 검정 (calibration)함으로써 상기 품질 인자의 농도 값과 관련이 있다.
효소-결합 면역흡착 분석 (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)은 항원의 존재 및 품질을 측정하기 위한 고상 분석법이며, 특히 샌드위치 (sandwich) ELISA가 사용될 수 있다. 병원체 관련 인자의 존재는 특히 PCR-기반 방법에 의해 측정된다.
품질 인자에 대한 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 측정된 농도를 비교하는 것은 특정 품질 인자에 대한 측정으로부터 수득된 판독 값이 취해지고, 상기 품질 인자의 값이 소정 범위 내에 있는지 여부를 체크하는 것을 의미한다. 시험은 시험 장치 또는 시험 장치에 연결된 장치에 의해 자동으로 수행될 수 있다. 대안으로서, 비교가 측정을 수행하는 사람에 의해 수동으로 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 품질 인자는 시토킨 또는 다수의 시토킨이다. 상기 품질 인자는 시토킨의 그룹일 수 있다. 더욱이 상기 품질 인자는 모든 시토킨일 수 있다. 실시예에 개시된 바와 같이, 다양한 시토킨에 대해, 특정 임계값 이상을 의미하는 선정된 범위 밖의 이들 시토킨의 존재는 상기 면역계의 세포 또는 줄기 세포를 성장 및/또는 확장 능력과 관련하여 배지의 품질을 크게 감소시킨다는 것이 판명되었다. 특히 면역 요법의 품질에서 확장된 림프구를 수득할 수 없다.
그러므로, 일 구현예에 따르면, 품질 인자는 시토킨이다. 그러나, 다른 성분이 면역계 세포의 성장, 특히 확장하는 능력과 관련하여 확장 배지의 품질에 크게 영향을 주는 것이 관찰되었다.
흥미롭게도, 선정된 범위 밖의 품질 인자를 가진 배지, 즉, 비-선택된 배지가 재조합 단백질 발현을 위해 세포를 성장시키는데 여전히 유용할 수 있다. 확인되어진 부가적인 품질 인자는 에스트라디올, 코르티솔, 성 호르몬-결합 글로불린 (sex hormone-binding globulin: SHBG), 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1: IGF-1)이 있다.
그러나, 부가적인 품질 인자가 구체적으로 언급되지는 않았지만, 림프구의 성장과 확장에 대해 배지의 품질에 영향을 미치지만, 반면에 표준 세포주의 성장에 반드시 영향을 미치는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 품질 인자가 에스트라디올, 코르티솔, SHBG, 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 시토킨이 있으며, 그 존재가 선정된 범위를 벗어나면 상기 혈액 산물의 비-선택을 유도한다. 하나의 품질 인자는 RANTES로 또한 알려져 있는 CCL5이다. CCL5에 대한 선정된 범위는 5 ng/ml 미만, 특히 3 ng/ml 미만이다.
모든 농도 값은 ISO 7027에 따라 비탁측정법에 의해 정의된 것이다. 따라서, 상위 역치는 5 ng/ml, 특히 3 ng/ml이며; 상기 품질 인자에 대해 정의된 모든 농도는 혈액 산물의 부피에 기초한다.
부가적인 품질 인자는 시토킨 이오탁신이다. 상기 이오탁신의 선정된 범위는 800 pg/ml 미만, 특히 500 pg/ml이다. 다른 품질 인자는 PDGF-88이다. PDGF-88의 선정된 범위는 150 pg/ml 미만, 특히 100 pg/ml 미만이다. 부가적인 품질 인자는 CXCL-10이다. CXCL-10의 선정된 범위는 150 pg/ml 미만, 특히 100 pg/ml 미만이다. 부가적인 품질 인자는 시토킨 IL-10이다. IL-10에 대한 선정된 범위는 200 pg/ml 미만이다. 또 다른 품질 인자는 시토킨 IL-13이다. IL-13의 선정된 범위는 80 pg/ml 미만, 특히 50 pg/ml 미만이다. 부가적인 품질 인자는 IL-1b이다. IL-1b의 선정된 범위는 30 pg/ml 미만, 특히 20 pg/ml 미만이다. 부가적인 품질 인자는 IL-2이다. 다른 품질 인자는 IL-4이다. IL-5는 다른 품질 인자이다. IL-7은 다른 품질 인자이다. 또한, IL-8은 다른 품질 인자이다. 부가적인 품질 인자는 IL-9이다. 본 발명에 따르면, 또한 IL-12p70은 품질 인자이다. 다른 품질 인자는 IL-15이다. 본 발명에 따른 하나의 품질 인자는 IL-17a이다. IL-21은 다른 품질 인자이다. 부가적인 품질 인자는 염기성 FGF이다. 상피 성장 인자 (epidermal growth factor: EGF)는 부가적인 품질 인자이다. 다른 품질 인자는 인터페론 감마 (IFNγ)이다. 과립구-콜로니 자극 인자 (granulocyte-colony stimulating factor: GCSF)는 본 발명에 따른 다른 품질 인자이다. 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)는 본 발명에 따른 부가적인 품질 인자이다. 더욱이, MCP1은 품질 인자로 결정된다. 결정된 다른 품질 인자는 MIP1a, 또한 MIP1b이다. 부가적인 품질 인자는 PDGF이다. 더욱이, IL-1RA는 다른 품질 인자이고, 종양 괴사 인자 α (tumor necrosis factor α: TNFα)는 다른 품질 인자이다. 모든 상기 인자는 인간 혈액 중 존재할 수 있는 시토킨으로 알려져 있다.
상기 인자에 있어서, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, 염기성 FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP 1b, PDGF, II1RA, 및 TNFα는 30 pg/ml 미만, 특히 20 pg/ml 미만이다.
상기 기재된 모든 시토킨이 배양, 특히 림프구, 면역 세포 또는 줄기 세포의 확장에 영향을 주는 것이 발견되었다. 따라서, 상기 시토킨이 특정 상부 역치에만 허용된다. 다른 품질 인자가 적어도 특정 정도로 혈액 산물 중에 포함될 필요가 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 품질 인자는 에스트라디올이다. 에스트라디올은 혈액 산물 중 적어도 65 pmol/l의 농도로 존재해야 한다. 에스트라디올에 대한 바람직한 농도는 적어도 75 pmol/l이다. 더 바람직하게, 에스트라디올의 농도는 적어도 85 pmol/l이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 품질 인자는 코르티솔이다. 코르티솔에 대한 선정된 범위는 적어도 190 nmol/l, 바람직하게는 적어도 210 nmol/l, 더 바람직하게는 적어도 220 nmol/l이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 품질 인자는 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1)이다. 일 구현예에 따르면, IGF-1에 대한 선정된 범위는 적어도 100 μg/l, 바람직하게는 적어도 130 μg/l, 더 바람직하게는 적어도 140 μg/l이다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지가 충족해야 하는 부가적인 다양한 파라미터들이 있다. 특히, 표준 배양 인자들이 선정된 범위내에 존재한다. 따라서, 상기 방법은 표준 배양 인자들을 측정하는 단계 및 이들을 선정된 범위와 비교하는 단계를 더 포함한다.
표준 배양 인자의 예는 하기를 포함한다: 단백질, 글루코스, 비-단백질 질소, 우레아 질소, 아미노산 질소, 크레아티닌 (creatinine), 크레아틴 (creatine), 우레아, 총 지질 (total lipids), 트리글리세리드, 콜레스테린 (cholesterine), 지질, 에스테르화 성분 (esterified components), 포스포리피드 (phospholipids), 지방산, 유기산, 피루베이트 (pyruvate), 시트레이트 (citrate), 케톤 (ketones).
상기 세포 배양 배지의 전체 부피에 기초한 선정된 범위는 단백질에 있어서 60080.0 g/l; 글루코스에 있어서 4.5 내지 5.5 mmol/l, 비-단백질 질소에 있어서 15 내지 30 mmol/l, 우레아 질소에 있어서 3.5 내지 7.0 mmol/l, 아미노산 질소에 있어서 3.0 내지 5.0 mmol/l; 크레아티닌에 있어서 70.0 내지 140.0 μmol/l; 크레아틴에 있어서 25.0 내지 70.0 μmol/l; 우레아에 있어서 3.0 내지 5.0 μmol/l; 총 지질에 있어서 4.5 내지 8.5 g/l, 트리글리세리드에 있어서 0.6 내지 2.4 mmol/l, 콜레스테린에 있어서 4.0 내지 6.5 mmol/l, 지질 0.3 내지 0.4 mmol/l의 농도, 에스테르화 성분에 있어서 0.7 내지 0.8 mmol/l, 포스포리피드에 있어서 2.0 내지 3.0 mmol/l, 지방산에 있어서 0.3 내지 0.9 mmol/l; 유기산에 있어서 4.0 내지 6.0 mmol/l, 피루베이트에 있어서 0.1 내지 0.2 mmol/l, 시트레이트에 있어서 0.1 내지 0.2 mmol/l, 및 케톤에 있어서 0.3 내지 0.5 mmol/l의 농도이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계는 하나 이상의 혈액 산물로 실시될 수 있으며, 상기 선택된 혈액 산물 또는 가공된 혈액 산물이 조합되어 배양 배지를 형성한다. 하나의 공여체로부터, 약 200 내지 500 ml의 혈액 산물만이 한번에 입수될 수 있다. 따라서, 세포의 배양을 위해서, 몇 명의 공여체의 몇 개의 혈액 산물들이 조합되어야 한다. 상기 세포 배양 배지의 제조에 있어서, 선택된 혈액 산물만이 사용되었다.
선택되지 않은 시료에서, 혈액 산물 중 하나 이상의 품질 인자가 상한, 이용가능하다면 상기 품질 인자의 상한 값의 30 % 미만, 더 바람직하게 20 % 미만, 가장 바람직하게는 10 % 미만을 초과한다면, 상기 혈액 산물은 일시적으로 선택되지 않는 혈액 산물이다. 더욱이, 선택되지 않은 시료에서 혈액 산물 중 하나 이상의 품질 인자가 하한, 이용가능하다면 상기 품질 인자의 상한 값의 30 % 미만, 더 바람직하게 20 % 미만, 가장 바람직하게는 10 % 미만을 초과한다면, 상기 혈액 산물은 일시적으로 선택되지 않는 혈액 산물이다. 일시적으로 선택되지 않은 혈액 산물은, 일시적으로 선택되지 않는 혈액 산물을 적어도 하나의 선택된 혈액 산물과 혼합하여 상기 정의된 범위로 상기 품질 인자를 갖는 혼합된 혈액 산물을 수득할 수 있다면 선택된 혈액 산물이 될 수 있다. 상기 일시적인 선택되지 않은 혈액 산물은 선택되지 않은 혈액 산물이 되었다.
상기 산물들의 혼합물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물들의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공한다:
a) 2 이상의 공여체들로부터 적어도 혈액 산물들의 제1 혼합물을 제공하는 단계;
b) 상기 제1 혼합물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
d) 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 선정된 범위 내에 있는 경우, 상기 세포 배양 배지를 위해 제1 혼합물을 선택하거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 혼합물을 선택하지 않는 단계.
또한, 배양 배지를 형성하기 위해서 상기 혼합물로 상기 혈액 산물을 첨가하기 전에 상기 혈액 산물 중에서 직접 상기 품질 인자의 농도를 측정하는 것이 바람직하다. 또한, 혈액 산물들의 다양한 혼합물을 스크리닝하고, 상기 품질 인자에 의해서 측정되는 바와 같이 이들이 상기 요건을 충족하는지를 입증할 수 있다.
상기 혈액 산물이 선택 후에, 최종 산물, 즉 세포 배양 배지로 첨가되기 전에, 가공된 혈액 산물로 전환될 수 있다. 상기 혈액 산물을 가공한다는 것은 혈액 산물의 한가지 타입을 혈액 산물의 다른 타입으로 만드는 것을 의미한다. 예를 들면, 측정되고 선택된 상기 혈액 산물은 전혈이고, 이후에 혈장으로 부가적으로 전환된다. 대안으로서, 상기 측정되고 선택된 혈액 산물은 전혈이고, 상기 가공된 혈액 산물은 혈청이다. 다른 선택은 선택된 혈액 산물은 혈장이고, 가공된 혈액 산물은 혈청인 것이다. 다른 선택은 상기 선택된 혈액 산물은 혈장이고, 가공된 혈액 산물은 혈청의 서브세트인 것이다. 또한 선택된 혈액 산물은 혈청일 수 있고, 가공된 혈액 산물은 혈청의 서브세트이다.
바람직하게, 제공되는 혈액 산물은 혈장이다. 혈장은 예를 들어 면역계의 세포의 배양에 빈번하게 사용된다. 더욱이, 혈장은 공여체로부터 혈장분리교환술에 의해서 용이하게 회수될 수 있다. 따라서, 상기 가공된 혈액 산물은 혈장이다. 혈장을 사용하는 것은 추가적인 공정 단계가 필요하지 않다는 장점이 있다. 그러므로, 상기 공정 단계를 절약한다.
바람직하게, 2개 이상의 품질 인자가 시험되며, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 품질 인자가 시험되었다. 더 많은 품질 인자들을 시험할수록, 고도로 활성인 림프구를 배양 및 확장하기 위한 더 높은 품질 기준을 실제로 충족하는 최종 세포 배양 배지를 수득할 수 있는 기회를 증가시킨다. 그러나, 하나의 시료에서 다량의 인자들을 시험함으로써 또한 공정의 복잡성이 증가된다. 그러므로, 바람직하게 15 미만, 12 미만, 10 미만, 8 미만, 6 미만의 품질 인자가 시험되었다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시험된 품질 인자의 수는 2 내지 6의 범위, 바람직하게 3 내지 5의 범위, 바람직하게 4개이다. 알려져 있는 품질 인자의 특정 서브세트는, 상기 세포 배양 배지가 림프구의 확장 또는 줄기 세포의 배양에 적당한 세포 배지라는 높은 가능성을 찾기에 충분하다는 것을 발견하였다. 전체 시료가 고 품질 시료임을 나타내는 것을 제공하도록 개시되는 품질 인자들은 SHBG, IGF-1, CCL5 및 IL-6이다. 그러므로, 바람직하게 상기 품질 인자는 SHBG이다. 또한, 바람직하게는 품질 인자로서 IGF-1이다. 마찬가지로, CCL5는 바람직한 품질 인자이다. IL-6은 또한 바람직한 품질 인자이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 시험된 모든 품질 인자는 SHBG, IGF-1, CCL5 및 IL-6이다.
품질 인자에 대한 시험이 또한 적당한 공여체, 특히 전문적으로 모니터된 공여체의 선택에 사용될 수 있다. 전문적으로 모니터된 공여체는 규칙적으로 혈액 산물을 공여하였고, 등록소에 기록되었다.
본 발명에 따른 방법에 의해서, 혈액 공여체가 고품질의 혈액 산물의 공여에 대해 적당한지가 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 공여체의 수준에 대한 부가적인 선택 단계를 제공한다.
일 구현예에 따르면, 본 방법은 공여체 선택을 포함한다:
a) 상기 공여체로부터 혈액 산물을 제공하는 단계;
b) 제1 공여체의 상기 혈액 산물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
d) 상기 혈장 풀 (plasma pool)에 대한 농도값, 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 선정된 범위 중에 있는 경우, 혈장 또는 혈청 공여를 위해 상기 공여체를 선택하거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 공여체를 선택하지 않는 단계.
선택되지 않은 공여체가 고품질 혈액 산물을 위해 등록소로부터 제거된다.
본 발명은 또한 세포 배양 배지의 부피에 기초하여, 하기를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다:
- 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5;
- 500 pg/ml 미만의 농도로 이오탁신;
- 100 pg/ml 미만의 농도로 PDGF-88 및/또는 CXCL-10;
- 200 pg/ml 미만의 농도로 IL-10;
- 50 pg /ml 미만의 농도로 IL-13;
- 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, 염기성 FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP 1b, PDGF, II1RA, 및/또는 TNFα;
- 적어도 65 pmol/l, 바람직하게는 적어도 75 pmol/l, 더 바람직하게는 적어도 85 pmol/l의 농도로 에스트라디올;
- 적어도 190 nmol/l, 바람직하게는 적어도 210 nmol/l, 더 바람직하게는 적어도 220 nmol/l의 농도로 코르티솔;
- 적어도 100 μg/l, 바람직하게 적어도 130 μg/l, 더 바람직하게 적어도 140 μg/l의 농도로 IGF-1; 및/또는
- 31 nmol/l 미만, 바람직하게 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG.
상기 배지는 안정하고 재현가능한 결과를 수득할 수 있는 제어된, 인공적인 환경에서 T-세포 배양 및 확장을 위해 필요한 영양소를 제공한다.
상기 세포 배양 배지는 본 발명에 따른 제조 방법에 의해서 수득된 배지가 바람직하다. 일 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 적어도 하나의 혈액 산물, 특히 혈장 및/또는 혈청을 포함한다. 더 바람직하게, 상기 혈액 산물은 혈청이다. 부가적인 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물을 포함한다. 바람직하게, 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물들이 혈청 및/또는 혈장으로부터 선택된다. 더 바람직하게, 2 이상의 공여체들로부터 산물은 혈청이다. 대안적인 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 합성 배지이다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지가 충족되는데 다양한 부가적인 파라미터가 있다. 특히, 표준 배양 인자들이 선정된 범위내 존재한다. 표준 배양 인자의 예로는 하기를 포함한다: 단백질, 글루코스, 비-단백질 질소, 우레아 질소, 아미노산 질소, 크레아티닌, 크레아틴, 우레아, 총 지질, 트리글리세리드, 콜레스테린, 지질, 에스테르화 성분, 포스포리피드, 지방산, 유기산, 피루베이트, 시트레이트, 케톤.
따라서, 본 발명의 세포 배양 배지는 하기를 더 포함한다:
- 60080.0 g/l의 농도로 단백질
- 4.5 내지 5.5 mmol/l의 농도로 글루코스;
- 15 내지 30 mmol/l의 농도로 비-단백질 질소;
- 3.5 내지 7.0 mmol/l의 농도로 우레아 질소;
- 3.0 내지 5.0 mmol/l의 농도로 아미노산 질소;
- 70.0 내지 140.0 μmol/l의 농도로 크레아티닌;
- 25.0 내지 70.0 μmol/l의 농도로 크레아틴;
- 3.0 내지 5.0 μmol/l의 농도로 우레아;
- 4.5 내지 8.5 g/l의 농도로 총 지질 ;
- 0.6 내지 2.4 mmol/l의 농도로 트리글리세리드;
- 4.0 내지 6.5 mmol/l의 농도로 콜레스테린 ;
- 0.3 내지 0.4 mmol/l의 농도로 지질;
- 0.7 내지 0.8 mmol/l의 농도로 에스테르화 성분;
- 2.0 내지 3.0 mmol/l의 농도로 포스포리피드;
- 0.3 내지 0.9 mmol/l의 농도로 지방산;
- 4.0 내지 6.0 mmol/l의 농도로 유기산;
- 0.1 내지 0.2 mmol/l의 농도로 피루베이트 ;
- 0.1 내지 0.2 mmol/l의 농도로 시트레이트 ; 및/또는
- 0.3 내지 0.5 mmol/l의 농도로 케톤 .
바람직하게, 상기 세포 배양 배지는 전술한 모든 파라미터를 충족시킨다.
일 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 하기 중 어느 하나를 포함한다:
- 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG;
- 적어도 100 μg/l의 농도로 IGF-1;
- 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-6; 및
- 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5.
부가적인 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 하기를 포함한다:
- 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG;
- 적어도 100 μg/l의 농도로 IGF-1;
- 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-6; 및
- 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 혈액 산물의 혼합물로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 상기 세포 배양 배지는 혈액 산물의 혼합물 뿐만 아니라 부가적인 성분들을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 부가적인 성분들은 물, NaCl, PBS, DTT, TCEP, 또는 2-메르캅토에탄올로부터 선택된다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 다양한 상이한 세포들을 배양하기에 적당하다. 그러므로, 본 발명은 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지의 용도를 더 제공한다. 주된 장점은 불멸의 세포주의 배양 이외에, 환자로부터 입수된 세포, 특히 면역계의 세포 또는 줄기 세포가 성공적으로 배양될 수 있다는 것이다.
본 발명에 따른 배지, 특히 본 발명에 따른 방법에 의해서 수득된 배지에 있어서, 림프구의 훨씬 더 높은 확장율이 발견되었다. 본원에서 사용된 "확장 (expansion)" 또는 "클로날 확장 (clonal expansion)"은 단일 세포로부터 원래 유래되는 딸 세포 (daughter cell)의 생성을 의미한다. 림프구의 클로날 확장에서, 모든 결과 (progenies)는 동일한 항원 특이성을 공유했다.
더욱이, 세포 배양에서 본 발명에 따른 배양 배지에 의해서, 세포들의 증가된 전체 수가 수득될 수 있다. 특히, 동일한 항원 특이성을 갖는 림프구의 전체 확장된 딸 세포의 증가된 수가 수득될 수 있다.
그러므로, 상기 용도의 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 면역계의 세포, 특히 림프구이다. 바람직하게, 상기 림프구가 환자로부터 입수된다. 일 구현예에 따르면, 상기 림프구가 상기 세포 배양 배지에서 성장, 증식 및/또는 확장된다.
일 구현예에 따르면, 상기 배양 배지가 종양으로부터 유래된 T-세포의 확장에 사용된다. 바람직하게, 상기 확장은 IL-2, IL-15 및 IL-21의 시토킨 칵테일 (cytokine cocktail)의 사용을 포함한다. 본 발명에 따르면, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조성물은 또한 "시토킨 칵테일"이라 한다.
본원에서 사용되는, "인터루킨 2 (interleukin 2)" 또는 "IL-2"는 서열번호: 1에 의해서 정의된 인간 IL-2 및 그 기능성 균등물을 나타낸다. 본원에서 사용되는, "인터루킨 15 (interleukin 15)" 또는 "IL-15"는 인간 IL-15 및 그 기능성 균등물을 나타낸다. 본원에서 사용되는, "인터루킨 21 (interleukin 21)" 또는 "IL-21"은 인간 IL-21 및 그 기능성 균등물을 나타낸다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지, 바람직하게 본 발명에 따른 방법에 의해서 수득된 배지는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-21의 시토킨 혼합물과 조합된 림프구의 확장에 특히 적당하다. 바람직하게, 시토킨의 혼합물과 조합에서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 증가된 성장율, 확장된 세포의 증가된 전체 수 뿐만 아니라 상기 세포의 향상된 프로파일을 제공한다. 특히, CD45RA/CCR7 표현형에 의해서 정의된 성숙 및 분화가 향상되었다. 마지막으로, 시토킨 IL-2, IL-15 및 IL-21의 혼합물에 의한 림프구의 확장은 임상적으로 관련된 림프구, 특히 T-세포의 증가된 생존도를 유도하는 것을 발견하였다.
활성 세포 면역요법에서, 증가된 성장 및 확장율은, 환자로부터 림프구 시료를 입수하는 시간으로부터, 표준 림프구를 환자에게 재도입하는 시간으로 감소시킨다. 상기 (임상적으로 관련된) 림프구의 증가된 생존도는 활성 면역요법 산물의 치료적 효과를 증가시켰다.
본원에 제시된 본 발명의 많은 변형 및 다른 구현예들이 상기 서술 및 관련 도면에 제시된 교시의 이익을 갖도록 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해서 만들어질 것이다. 그러므로, 본 발명은 개시된 특정 구현예에 한정되는 것은 아니며, 변형 및 다른 구현예가 첨부된 청구범위의 범위내에 포함되는 것으로 이해된다. 특별한 용어가 본원에 사용되었음에도 불구하고, 상기는 일반적이고 서술적인 의미로 사용되며, 제한의 목적으로 사용되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 - 상이한 세포 배양 배지에서 림프구의 확장
성분채집술이 NY-ESO-1로 프라임된 건강한 공여체에서 실시되었다. 상기 혈액 성분들의 분리 후에, 백혈구를 포함하는 산물이 나머지로부터 분리되었다.
세포가 1000 U/ml의 IL-2, 10 ng/ml의 IL-15 및 10 ng/ml의 IL-21을 갖는 배지 M1에 현탁되었다. 상기 배지는 또한 10 μmol의 NY-ESO-1 펩티드를 포함하였다. 상기 세포가 잘 확장되어서, 4일 후에 106/ml의 농도에 도달했다.
동시에, 림프구가 동일한 프로토콜에 따라 배지 M2에서 확장되었다. 림프구의 현저한 확장이 검출되지 않았다.
실시예 2 - 조성물 세포 배양 배지의 분석
표준 시험은 상기 세포 배양 배지 사이의 임의의 차이를 나타내지 않았다. 비탁측정법 및 하기 표 1에 성분으로 기재된 물질들에 대한 항체들을 사용하여, 배지 M1 및 M2가 더 상세하게 분석되었다.
Figure pct00001
실시예 3 - 상이한 공여체의 혈장의 분석
상기 세포 배양 배지의 분석으로부터의 결과에 따라서, 상이한 전문적으로 모니터된 공여체로부터 혈장 시료가 입수되고, 에스트라디올, 코르티솔, 인슐린 및 IGF-1의 농도에 대해서 분석되었다. 결과가 하기 표 2에 제시되었다.
Figure pct00002
본 발명의 방법에 따르면, 상기 혈장 시료 P1 내지 P4가 선택되지 않았다. 혈장 시료 P5가 림프구 배양을 위해서 선택되었다.
실시예 4 - 상이한 공여체의 혈장의 분석
혈장 선택을 확인하기 위해서, 그 후 상기 혈장 시료 P1 내지 P5가 세포 배양을 위해서 준비되었다. NY-ESO-1로 프라임된 건강한 공여체의 말초 혈액으로부터 입수된 림프구가 상기에 개시된 프로토콜에 따라 배양되었다. P5로부터 세포 배양 배지에서 확장이 배지 M1에서 확장에 필적한다 (실시예 1 참조).

Claims (24)

  1. 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물들의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지 (cell culture medium)를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
    a) 제1 공여체로부터 적어도 제1 혈액 산물을 제공하는 단계;
    b) 상기 제1 혈액 산물 중 적어도 하나의 품질 인자 (quality factor)의 농도를 측정하는 단계;
    c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
    d) 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 상기 선정된 범위에 있는 경우, 상기 세포 배양 배지를 위해 상기 제1 혈액 산물을 선택하고, 선택적으로 상기 제1 선택된 혈액 산물을 제1 가공된 혈액 산물로 전환시키거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 혈액 산물을 선택하지 않는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단계들 a) 내지 d)가 상이한 공여체들로부터 1 이상의 혈액 산물로 실시되며, 상기 선택된 혈액 산물 또는 가공된 혈액 산물이 조합되어서 상기 배양 배지를 형성하는 방법.
  3. 2 이상의 공여체들로부터 혈액 산물의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
    a) 2 이상의 공여체들로부터 적어도 혈액 산물들의 제1 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 상기 제1 혼합물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
    c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
    d) 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 선정된 범위에 있는 경우, 상기 세포 배양 배지를 위해 상기 제1 혼합물을 선택하거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 혼합물을 선택하지 않는 단계.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 산물이 전혈, 혈장, 혈청 또는 그 서브세트 (subsets)로부터 선택되는 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 품질 인자는 시토킨 (cytokine)으로부터 선택되거나, 또는 에스트라디올 (estradiol), 코르티솔 (cortisol), 성 호르몬-결합 글로불린 (sex hormone-binding globulin: SHBG), 인슐린 (insulin) 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1: IGF-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 시토킨이 인터루킨 6 (interleukin 6: IL-6), 인터페론-γ (interferon-γ: IFNγ), 인터루킨 1 수용체 작용제 (interleukin 1 receptor agonist: IL-1RA), 인터루킨 5 (IL-5), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor: TNFα), CCL5 (RANTES), 인터루킨 2 (IL-2), 인터루킨 1b (IL-1b), 이오탁신 (Eotaxin), 염기성 FGF, 상피 성장 인자 (epidermal growth factor: EGF), 혈소판-유래 성장 인자 (platelet-derived growth factor: PDGF-88), C-X-C 모티프 케모킨 10 (C-X-C motif chemokine 10: CXCL-10) 100 pg/ml, 인터루킨 13 (IL-13), 인터루킨 4 (IL-4), MCP1, 인터루킨 8 (IL-8), MIP1a, 인터루킨 10, 과립구-콜로니 자극 인자 (granulocyte-colony stimulating factor: GCSF), 인터루킨 15 (IL-15), 인터루킨 7 (IL-7), 인터루킨 12p70 (IL12p70), 인터루킨 17a (IL-17a), 인터루킨 9 (IL-9) 및 인터루킨 21 (IL-21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 품질 인자는 SHBG, IGF-1, CCL5 및 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 2 이상의 품질 인자가 시험되는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 품질 인자는 CCL5, 이오탁신, PDGF-88, CXCL-10, IL-10, IL-13, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, 염기성 FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP1b, PDGF, IL-1RA, TNFα, 에스트라디올, 코르티솔, IGF-1 및 SHBG로부터 선택되는 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 품질 인자들이 시험되고, 상기 품질 인자는 SHBG, IGF-1, CCL5 및 IL-6인 방법.
  11. 청구항 5 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 산물의 부피에 기초하여, 상기 정의된 농도 범위는:
    - CCL5에 대해 3 ng/ml 미만;
    - 이오탁신에 대해 500 pg/ml 미만;
    - PDGF-88 및 CXCL-10에 대해 100 pg/ml 미만;
    - IL-10에 대해 200 pg/ml 미만;
    - IL-13에 대해 50 pg /ml 미만;
    - IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, 염기성 FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP 1b, PDGF, IL-1RA, 및 TNFα에 대해 20 pg/ml 미만;
    - 에스트라디올에 대해 적어도 65 pmol/l, 바람직하게 적어도 75 pmol/l, 더 바람직하게 적어도 85 pmol/l;
    - 코르티솔에 대해 적어도 190 nmol/l, 바람직하게 적어도 210 nmol/l, 더 바람직하게 적어도 220 nmol/l;
    - IGF-1에 대해 적어도 100 μg/l, 바람직하게 적어도 130 μg/l, 더 바람직하게 적어도 140 μg/l;
    - SHBG에 대해 31 nmol/l 미만, 바람직하게 29 nmol/l 미만인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하기를 포함하는 공여체 선택을 포함하는 방법:
    a) 상기 공여체로부터 혈액 산물을 제공하는 단계;
    b) 제1 공여체의 상기 혈액 산물 중 적어도 하나의 품질 인자의 농도를 측정하는 단계;
    c) 상기 품질 인자에 대해 선정된 농도 범위에, 품질 인자의 상기 측정된 농도를 비교하는 단계;
    d) 상기 혈장 풀 (plasma pool)에 대한 농도값, 상기 품질 인자에 대해 측정된 상기 농도가 선정된 범위 중에 있는 경우, 혈장 또는 혈청 공여를 위해 상기 공여체를 선택하거나, 또는 그렇지 않다면, 상기 제1 공여체를 선택하지 않는 단계.
  13. 세포 배양 배지의 부피에 기초하여, 하기를 포함하는 세포 배양 배지:
    - 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5;
    - 500 pg/ml 미만의 농도로 이오탁신;
    - 100 pg/ml 미만의 농도로 PDGF-88 및/또는 CXCL-10;
    - 200 pg/ml 미만의 농도로 IL-10;
    - 50 pg /ml 미만의 농도로 IL-13;
    - 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL12p70, IL-15, IL-17a, IL-21, 염기성 FGF, EGF, IFNγ, GCSF, GM-CSF, MCP1, MIP1a, MIP 1b, PDGF, IL-1RA, 및/또는 TNFα;
    - 적어도 65 pmol/l, 바람직하게 적어도 75 pmol/l, 더 바람직하게 적어도 85 pmol/l의 농도로 에스트라디올;
    - 적어도 190 nmol/l, 바람직하게 적어도 210 nmol/l, 더 바람직하게 적어도 220 nmol/l의 농도로 코르티솔;
    - 적어도 100 μg/l, 바람직하게 적어도 130 μg/l, 더 바람직하게 적어도 140 μg/l의 농도로 IGF-1; 및/또는
    - 31 nmol/l 미만, 바람직하게 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG.
  14. 청구항 13에 있어서, 적어도 하나의 혈액 산물, 특히 혈장 및/또는 혈청을 포함하는 세포 배양 배지.
  15. 청구항 14에 있어서, 2 이상의 공여체들로부터 혈청을 포함하는 세포 배양 배지.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 합성 배지인 세포 배양 배지.
  17. 청구항 13 내지 16 중 어느 한 항에 있어서,
    - 60080.0 g/l의 농도로 단백질;
    - 4.5 내지 5.5 mmol/l의 농도로 글루코스;
    - 15 내지 30 mmol/l의 농도로 비-단백질 질소;
    - 3.5 내지 7.0 mmol/l의 농도로 우레아 질소;
    - 3.0 내지 5.0 mmol/l의 농도로 아미노산 질소;
    - 70.0 내지 140.0 μmol/l의 농도로 크레아티닌;
    - 25.0 내지 70.0 μmol/l의 농도로 크레아틴;
    - 3.0 내지 5.0 μmol/l의 농도로 우레아;
    - 4.5 내지 8.5 g/l의 농도로 총 지질;
    - 0.6 내지 2.4 mmol/l의 농도로 트리글리세리드;
    - 4.0 내지 6.5 mmol/l의 농도로 콜레스테린;
    - 0.3 내지 0.4 mmol/l의 농도로 지질;
    - 0.7 내지 0.8 mmol/l의 농도로 에스테르화 성분;
    - 2.0 내지 3.0 mmol/l의 농도로 포스포리피드;
    - 0.3 내지 0.9 mmol/l의 농도로 지방산;
    - 4.0 내지 6.0 mmol/l의 농도로 유기산;
    - 0.1 내지 0.2 mmol/l의 농도로 피루베이트;
    - 0.1 내지 0.2 mmol/l의 농도로 시트레이트; 및/또는
    - 0.3 내지 0.5 mmol/l의 농도로 케톤을 더 포함하는 세포 배양 배지.
  18. 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 있어서,
    - 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG;
    - 적어도 100 μg/l의 농도로 IGF-1;
    - 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-6; 및
    - 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5 중 어느 하나를 포함하는 세포 배양 배지.
  19. 청구항 13 내지 19 중 어느 한 항에 있어서,
    - 29 nmol/l 미만의 농도로 SHBG;
    - 적어도 100 μg/l의 농도로 IGF-1;
    - 20 pg/ml 미만의 농도로 IL-6; 및
    - 3 ng/ml 미만의 농도로 CCL5를 포함하는 세포 배양 배지.
  20. 청구항 13 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, PBS를 더 포함하는 세포 배양 배지.
  21. 세포를 배양하기 위한, 청구항 13 내지 20 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지의 용도.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 세포는 림프구, 특히 환자로부터의 림프구인 세포 배양 배지의 용도.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 림프구가 상기 세포 배양 배지 중 성장 (grown), 증식 (proliferated), 및/또는 확장 (expanded)되는 세포 배양 배지의 용도.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 림프구가 IL-2, IL-15 및 IL-21의 적어도 하나의 항원 시토킨 칵테일 (cytokine cocktail)의 존재하에 상기 세포 배양 배지에서 확장되는 세포 배양 배지의 용도.
KR1020177000767A 2014-06-10 2015-06-10 세포 면역요법을 위한 배양 배지 KR102573837B1 (ko)

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