JP6806970B2 - 細胞免疫療法用培養培地 - Google Patents

Description

本発明は、品質基準の高い細胞培養培地、特に免疫細胞の成長及び増殖のための細胞培養培地、及び作製方法に関する。

活性細胞免疫療法と呼ばれる新たな治療クラスは、がんの治療に対して最も有望な前進の１つである。活性免疫療法は、身体自身の免疫細胞を使用して抗原特異的抗腫瘍効果を促進する目的で患者の免疫系を賦活する。このため、免疫細胞をｉｎ−ｖｉｔｒｏで培養して細胞数を増加し、分化を誘導する。

ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの細胞培養では、制御された温度、細胞付着のための基体、及び適切な成長培地、並びに正しいｐＨ及び浸透圧を保持するインキュベーター等の幾つかの基本的な環境要求を満たさなければならない。

細胞培養培地製剤は文献において十分に説明され、多数の培地が商業的に入手可能である。細胞培養培地は、一般的には、適切なエネルギー源、及び細胞周期を調節する化合物を含む。典型的な培養培地は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、並びに増殖因子、ホルモン、及び付着因子の供給源としての血清である補足物で構成される。栄養素に加えて、培地はｐＨ及び浸透圧の保持も補助する。

細胞培養培地製剤は文献において十分に説明され、多数の培地が商業的に入手可能である。免疫細胞、特にリンパ球の培養及び増殖（expansion）の場合、典型的には細胞培養培地は、免疫細胞に対して身体の自然環境に類似した環境を提供することから、血清又は血漿に由来する。

しかしながら、現状の培養培地中で増殖されるリンパ球の増殖速度及び活性は、まだ十分ではない。さらに、リンパ球増殖結果の量、質及び生存能力に関する予測できる結果は、今のところまれであり、必要とされる品質を識別するために幾つかのバッチの血清を検査する必要があることが通常である。

したがって、本発明の目的は、従来技術の少なくとも１つの不利益を克服することである。

本発明は、特に、使用される細胞培養培地の品質が、細胞免疫療法でのリンパ球の増殖プロセスの結果に対して大きな影響を有するという知見に基づく。特に、本発明者らは、リンパ球の増殖に関して細胞培養培地の品質を決定する多様な品質因子を規定した。本発明者らは、エストラジオール、コルチゾール、ＩＧＦ−１、インスリン、及びＳＨＢＧ等の品質因子が特定の既定濃度で存在しなければならないことを決定することができた。個々の品質因子に対して決定された基準を満たす細胞培養培地は、哺乳動物細胞、特に免疫系の細胞の培養結果を改善する。

したがって、本発明は、
ａ）少なくとも第１のドナーに由来する第１の血液製剤（blood product）を提供する工程、
ｂ）前記第１の血液製剤中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定する工程、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、
ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、細胞培養培地用に前記第１の血液製剤を選択し、ここでさらに前記第１の選択された血液製剤を第１の加工血液製剤に変換してもよく、前記予め定められた範囲内にない場合は、前記第１の血液製剤を選択しない工程、
を含む、２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含む細胞培養培地を作製する方法を提供する。
本発明は、細胞培養培地の体積に基づいて、
３ｎｇ／ｍｌ未満の濃度のＣＣＬ５、
５００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のエオタキシン、
１００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＰＤＧＦ−８８及び／又はＣＸＣＬ−１０、
２００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−１０、
５０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−１３、
２０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２１、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＦＮγ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ１、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１ＲＡ、及び／又はＴＮＦα、
少なくとも６５ｐｍｏｌ／ｌ、好ましくは少なくとも７５ｐｍｏｌ／ｌ、より好ましくは少なくとも８５ｐｍｏｌ／ｌの濃度のエストラジオール、
少なくとも１９０ｎｍｏｌ／ｌ、好ましくは２１０ｎｍｏｌ／ｌ、より好ましくは２２０ｎｍｏｌ／ｌの濃度のコルチゾール、
少なくとも８０μｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１２０μｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１４０μｇ／ｌの濃度のＩＧＦ−１、及び／又は
３１ｎｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは２９ｎｍｏｌ／ｌ未満の濃度のＳＨＢＧ
を含む細胞培養培地を更に含む。
最後に、本発明は細胞を培養するための細胞培養培地の使用を提供する。

本発明者らは、細胞培養免疫療法に対しては、細胞培養培地に関してより一層高い品質基準を満たさなければならないことを見出した。実施例に示されるように、各品質因子における差異は、リンパ球懸濁物の結果において著しい変化をもたらす。特に、品質因子が予め定められた範囲にある培地により、免疫細胞の成長、増加（proliferation）又は増殖（expansion）は細胞の増殖速度、生存率及び活性の増加をもたらす。これらの品質因子の識別により、特に免疫療法用の細胞集団のための改善された細胞培養培地の作製方法が特定できる。

したがって、本発明は、
ａ）第１のドナーに由来する第１の血液製剤を少なくとも提供する工程、
ｂ）前記第１の血液製剤中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定する工程、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、
ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、細胞培養培地用に前記第１の血液製剤を選択し、ここでさらに前記第１の選択された血液製剤を第１の加工血液製剤に変換してもよく、前記場合以外の場合には、前記第１の血液製剤を選択しない工程、
を含む、２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含む細胞培養培地を作製する方法を提供する。

本発明による方法は、リンパ球増殖のための因子と組み合わせて、細胞を強力に増加させ且つ増殖されたリンパ球の活性を高める、高品質な細胞培養培地を提供する。さらに、上記方法は、Ｔ細胞等のリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を促進する、品質が常に一定である細胞培養培地の提供を保証する。

本明細書における「細胞培養培地」又は「成長培地」は、動物又は植物の細胞の成長を支持するように設計された液体又はゲルである。成長培地の、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子及び他の栄養素の存在は変化し得る。細胞培養培地には２つのクラス、すなわち、血液製剤系培地及び合成培地がある。

本発明によれば、「血液製剤系培地」は少なくとも１つの血液製剤を含有する。

本明細書における「合成培地」は、化学的に明確な培地である。かかる培地は血液製剤等のいかなる天然由来のブロス（ｂｒｏｔｈ）も含まない。代わりに、全ての構成成分が規定の濃度で上記培地に添加されている。

本明細書における「血液製剤」は、哺乳動物の全血、又は全血のサブセット、特に血漿、血清又は更に血漿及び血清のサブセットを指す。

本明細書における「加工血液製剤」は、血漿、血清及びそれらのサブセットを含む。

本明細書における「血漿」は、哺乳動物の血液血漿を指す。血漿は、通常全血中に血液細胞を懸濁状態で保持する青白い（ｐａｌｅ ｗｈｉｔｅ）、時に黄色の血液の液体成分である。血漿は、大半は水であり、溶解したタンパク質、グルコース、凝血因子、電解質、ホルモン、及び二酸化炭素を含有する。血液血漿を、血液から、例えば抗凝固剤を含有する新鮮血の遠心分離によって調製することができ、ここで血液細胞は遠心分離管の底に落ちる。この際の上清が血液血漿である。

本明細書における「血清」は、凝固因子を含まない血液血漿である。

本明細書における「凝固因子」は、「凝血因子」とも呼ばれ、フィブリノゲン、プロトロンビン、又は第ＶＩＩ因子等の様々なタンパク質を含む。

本明細書における「全血のサブセット」は、全血の一部の構成成分を含む全血に由来する溶液又は懸濁物を指す。血漿及び血清は全血のサブセットである。

本明細書における「ドナー」は、それらから血液製剤が得られる、哺乳動物、特にヒトを指す。提供物は、全血（ＷＢ）であってもよく、又はアフェレーシスによって回収される全血の特定の構成成分であってもよい。

本明細書における「アフェレーシス」は、ドナーの血液を１つの特定の構成要素を分離して残りを循環系に戻す装置を通過させる、医療技術である。例えば、血漿アフェレーシスは、血液血漿のみの回収をもたらし、全ての他の成分をドナーに戻す。

本明細書における、ドナーから「血液製剤を得ること」は、特に血液をドナーの静脈から直接採取することによって、ドナーから血液を回収する動作を指す。

本明細書における「サイトカイン」は、細胞シグナル伝達において重要な幅広く大雑把なカテゴリーの小さなタンパク質（約５〜２０ｋＤａ）である。サイトカインは細胞によって放出され、他の細胞の行動に影響を与える。また、サイトカインは、自己分泌シグナル伝達に関与することができる。サイトカインとして、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、及び増殖因子が挙げられる。

また、「臨床的に有用なリンパ球」は、抗原編集された（ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｄｉｔｅｄ）リンパ球を指す。臨床的に有用なという用語は、リンパ球の下位集団に対しても使用される。特に、好ましい臨床的に有用なリンパ球は、臨床的に有用なＴ細胞又は抗原編集されたＴ細胞である。

本発明による「臨床的に有用な抗原」は、疾患に関連する抗原である。したがって、臨床的に有用な抗原は腫瘍関連抗原ＴＡＡ、病原体関連抗原（ＰＡＡ）、又は自己抗原であり得る。腫瘍反応性リンパ球はＴＡＡに特異的であり、ＴＡＡと相互作用する。感染性疾患反応性リンパ球はＰＡＡに特異的であり、ＰＡＡと相互作用し、自己免疫疾患反応性リンパ球は自己抗原に特異的であり、自己抗原と相互作用する。

本発明によれば、「抗原」（Ａｇ）は、それぞれ適応免疫応答の受容体、ＴＣＲまたは抗体の標的としての機能を果たす、あらゆる構造体である。抗原は、特に、タンパク質、多糖類、脂質、およびその部分構造（ペプチド等）である。脂質及び核酸は、タンパク質又は多糖と組み合わされた場合に、特に抗原性を示す。

１人のドナー又は複数のドナーに由来する血液製剤の提供は、血液製剤を得るプロセスを含まない。

本発明によれば、品質因子は、血液中に見られ得る任意の構成成分であってもよく、その濃度は免疫系の細胞及び幹細胞等の感受性の高い細胞株の成長及び特性に影響を及ぼす。

免疫系の細胞として、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、及び血小板が挙げられるが、これらに限定されない。

血液由来培地は、１人のドナーから別のドナーへ変わると含有物にばらつきがあるという不利益を有する。

本明細書における「病原体関連因子」は、血液中の病原体の存在を識別する因子である。一般的に検査される病原体は、例えば、抗トリパノソーマ・クルージ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、パルボウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、並びにヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）である。病原体関連因子に対する検査は、感染した血液製剤の使用のリスクを最小化する。品質因子は病原体関連因子ではないことが好ましい。

ヒト血液ドナーは、ボランティアのドナー及びモニターされた職業的ドナーを含む。いずれのドナーも健康な個体でなくてはならない。さらに、ヒト血液ドナーは、年齢、体重、及び食餌等の特定の基準を満たさなければならない。モニターされた職業的血液ドナーが登録される。登録においては、ドナー及び提供される血液試料に関する様々なデータが記録される。

第１の血液製剤の提供は、特に、血液製剤の血液バッグキット、バッグ、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、又はマルチウェルプレートへの移動を含む。ある一つの実施形態によれば、第１のドナーに由来する第１の血液製剤を血液バッグキットに移す。

ある一つの実施形態によれば、第１のドナーに由来する第１の血液製剤をマルチウェルプレートに移す。マルチウェルプレートは、特に、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、又は１９２ウェルプレートである。マルチウェルプレートは多数のウェルを有するプレートである。ウェルの数は限定されない。

品質因子の濃度の測定について、様々な方法が当該技術分野で知られている。本発明のある実施形態によれば、品質因子は、比濁分析、計濁法、及びＥＬＩＳＡから選択される方法によって測定される。比濁計は、液体又は気体コロイド中に懸濁された粒子の濃度を測定する計器である。

比濁分析（及び計濁法）は、Ｅｕｒｏｎｏｒｍ ＥＮ ２７０２７（Ｇｅｒｍａｎ ＤＩＮ−Ｎｏｒｍ ｔｈｅ ＩＳＯ Ｎｏｒｍ ７０２７と同じ）に規定される。比濁計は、光線及び光源の片側に設置された光検出器を用いることによって懸濁された粒子を測定する。比濁計では、血液製剤の試料に対して品質因子に特異的な抗体を添加する。その後、抗体と品質因子との相互作用は、光の片側散乱を引き起こす関与をもたらす。したがって、増加又は減少のいずれかを識別することができる。比濁法では、片側散乱光の増加を測定する。計濁法では前方散乱光の減少を測定する。比濁測定の結果は、ネフェロメ濁度単位（ＮＴＵ）として与えられ、品質因子の規定の濃度値とのＮＴＵ曲線による較正によって、品質因子の濃度値に関連付けられる。

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、抗原の存在及び品質を決定するための固相アッセイであり、特にサンドイッチＥＬＩＳＡを使用することができる。病原体関連因子の存在は、特に、ＰＣＲに基づく方法によって特定される。

品質因子の測定された濃度を品質因子の予め定められた濃度範囲と比較することは、特定の品質因子に対する測定から得られた読み出された情報を得て、その品質因子の値が予め定められた範囲の範囲内にあるかどうかを確認することを意味する。検査を検査装置又は検査装置に接続された装置によって自動で行ってもよい。または、測定を行う人によって手動で比較を行うことができる。

本発明による品質因子としてはサイトカイン又は幾つかのサイトカインが好ましい。品質因子は一群のサイトカインであってもよい。さらに、品質因子は全てのサイトカインであってもよい。実施例に示されるように、様々なサイトカインについて、その存在が規定の範囲外、すなわち特定の閾値を上回ると、免疫系の細胞又は幹細胞の成長及び／又は増殖の能力に関して培地の品質が著しく減じることが特定された。特に、免疫療法用の品質で増殖されたリンパ球を得ることができない。

したがって、ある一つの実施形態によれば、品質因子はサイトカインである。しかしながら、免疫系の細胞を成長、特に増殖させる能力に関して増殖培地の品質に強く影響を及ぼす他の構成成分が見いだされている。

興味深いことに、規定の範囲外の品質因子を含む培地、すなわち、選択されない培地でも、組換えタンパク質発現のための細胞の成長に有用な可能性がある。同定されている更なる品質因子は、エストラジオール、コルチゾール、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、インスリン、及びインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）である。

更なる品質因子は具体的には言及されない場合があるが、標準的な細胞株の成長に必ずしも影響を及ぼさなくても、リンパ球の成長及び増殖に関して培地の品質に影響を及ぼす可能性がある。本発明の一つの実施形態によれば、少なくとも１つの品質因子はエストラジオール、コルチゾール、ＳＨＢＧ、インスリン、及びＩＧＦ−１からなる群から選択される。

様々なサイトカインがあり、その存在が予め定められた範囲外であれば、その血液製剤は選択されない。１つの品質因子はＲＡＮＴＥＳとしても知られている、ＣＣＬ５である。ＣＣＬ５の予め定められた範囲は５ｎｇ／ｍｌ未満、特に３ｎｇ／ｍｌ未満である。

全ての濃度値はＩＳＯ７０２７による比濁法によって定義される。したがって、上限は５ｎｇ／ｍｌ、特に３ｎｇ／ｍｌであり、品質因子につい定義される全ての濃度は血液製剤の体積（volume）に基づく。

更なる品質因子はサイトカインであるエオタキシンである。エオタキシンの予め定められた範囲は、８００ｐｇ／ｍｌ未満、特に５００ｐｇ／ｍｌである。別の品質因子はＰＤＧＦ−８８である。ＰＤＧＦ−８８の予め定められた範囲は、１５０ｐｇ／ｍｌ未満、特に１００ｐｇ／ｍｌ又はである。更なる品質因子はＣＸＣＬ−１０である。ＣＸＣＬ−１０の予め定められた範囲は、１５０ｐｇ／ｍｌ未満、特に１００ｐｇ／ｍｌ未満である。更なる品質因子はサイトカインＩＬ−１０である。ＩＬ−１０の予め定められた範囲は２００ｐｇ／ｍｌ未満である。別の品質因子はサイトカインＩＬ−１３である。ＩＬ−１３の予め定められた範囲は８０ｐｇ／ｍｌ未満、特に５０ｐｇ／ｍｌ未満である。更なる品質因子はＩＬ−１ｂである。ＩＬ−１ｂの予め定められた範囲は３０ｐｇ／ｍｌ未満、特に２０ｐｇ／ｍｌ未満である。更なる品質因子はＩＬ−２である。別の品質因子はＩＬ−４である。ＩＬ−５は別の品質因子である。ＩＬ−７は別の品質因子である。また、ＩＬ−８は別の品質因子である。更なる品質因子はＩＬ−９である。また、本発明によれば、ＩＬ−１２ｐ７０は品質因子である。別の品質因子はＩＬ−１５である。本発明による一つの品質因子はＩＬ−１７ａである。ＩＬ−２１は別の品質因子である。更なる品質因子は塩基性ＦＧＦである。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は更なる品質因子である。別の品質因子はインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）である。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は本発明による別の品質因子である。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は本発明による更なる品質因子である。さらに、ＭＣＰ１が品質因子として特定された。別の特定された品質因子はＭＩＰ１ａである。また、ＭＩＰ１ｂもそうである。更なる品質因子はＰＤＧＦである。さらにＩＬ−１ＲＡは別の品質因子であり、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は別の品質因子である。これらの因子は全てヒト血液中に存在し得る既知のサイトカインである。

ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２１、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＦＮγ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ１、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＰＤＧＦ、Ｉｌ１ＲＡ、及びＴＮＦαの因子については、３０ｐｇ／ｍｌ未満、特に２０ｐｇ／ｍｌ未満である。

上に列挙される全てのサイトカインは、培養、特にリンパ球、免疫細胞、又は同じく幹細胞の増殖に影響を及ぼすことが分かった。したがって、これらのサイトカインは、特定の上限までのみ許容される。他の品質因子は、少なくともある程度まで血液製剤中に含まれる必要がある。

ある一つの実施形態によれば、品質因子はエストラジオールである。エストラジオールは、少なくとも６５ｐｍｏｌ／ｌの濃度で血液製剤中に存在しなければならない。エストラジオールの好ましい濃度は少なくとも７５ｐｍｏｌ／ｌである。エストラジオールの濃度は少なくとも８５ｐｍｏｌ／ｌであることがより好ましい。

本発明のある一つの実施形態によれば、品質因子はコルチゾールである。コルチゾールの予め定められた範囲は、少なくとも１９０ｎｍｏｌ／ｌ、好ましくは少なくとも２１０ｎｍｏｌ／ｌ、より好ましくは少なくとも２２０ｎｍｏｌ／ｌである。

本発明の一つの実施形態によれば、品質因子はインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）である。ある一つの実施形態によれば、ＩＧＦ−１の予め定められた範囲は少なくとも１００μｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１３０μｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１４０μｇ／ｌである。

本発明による細胞培養培地が満たさなければならない様々な更なるパラメーターが存在する。特に、標準的な培養因子が予め定められた範囲内に存在する。したがって、上記方法は、標準的な培養因子を測定すること、及びそれらと予め定められた範囲を比較することを更に含む。

標準的な培養因子としては、タンパク質、グルコース、非タンパク質窒素、尿素窒素、アミノ酸窒素、クレアチニン、クレアチン、尿素、総脂質、トリグリセリド、コレステリン、脂質、エステル化成分、リン脂質、脂肪酸、有機酸、ピルビン酸、クエン酸、ケトンが挙げられる。

細胞培養培地の総体積を基準とした前記予め定められた範囲は、タンパク質については６０．０８０．０ｇ／ｌ、グルコースについては４．５ｍｍｏｌ／ｌ〜５．５ｍｍｏｌ／ｌ、非タンパク質窒素については１５ｍｍｏｌ／ｌ〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、尿素窒素については３．５ｍｍｏｌ／ｌ〜７．０ｍｍｏｌ／ｌ、アミノ酸窒素については３．０ｍｍｏｌ／ｌ〜５．０ｍｍｏｌ／ｌ、クレアチニンについては７０．０μｍｏｌ／ｌ〜１４０．０μｍｏｌ／ｌ、クレアチンについては２５．０μｍｏｌ／ｌ〜７０．０μｍｏｌ／ｌ、尿素については３．０μｍｏｌ／ｌ〜５．０μｍｏｌ／ｌ、総脂質については４．５ｇ／ｌ〜８．５ｇ／ｌ、トリグリセリドについては０．６ｍｍｏｌ／ｌ〜２．４ｍｍｏｌ／ｌ、コレステリンについては４．０ｍｍｏｌ／ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／ｌ、脂質については０．３ｍｍｏｌ／ｌ〜０．４ｍｍｏｌ／ｌ、エステル化成分については０．７ｍｍｏｌ／ｌ〜０．８ｍｍｏｌ／ｌ、リン脂質については２．０ｍｍｏｌ／ｌ〜３．０ｍｍｏｌ／ｌ、脂肪酸については０．３ｍｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｍｏｌ／ｌ、有機酸については４．０ｍｍｏｌ／ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／ｌ、ピルビン酸塩については０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜０．２ｍｍｏｌ／ｌ、クエン酸塩については０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜０．２ｍｍｏｌ／ｌ、及び／又はケトンについては０．３ｍｍｏｌ／ｌ〜０．５ｍｍｏｌ／ｌである。

本発明のある一つの実施形態によれば、上記工程は、２つ以上の血液製剤を用いて行われ、選択された血液製剤又は加工血液製剤を合わせて培養培地を形成する。１人のドナーからは、一度に約２００ｍｌ〜５００ｍｌの血液製剤が得られるに過ぎない。したがって、細胞の培養のため、数人のドナーの幾つかの血液製剤を合わせなければならない。細胞培養培地の作製に対しては、選択された血液製剤のみを使用する。

もし選択されない試料において、血液製剤中の１又は複数の品質因子が、適用可能であれば、品質因子の上限値の３０％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満で上限を超える場合、該血液製剤は一時的に選択されない血液製剤とされる。さらに、もし選択されない試料において、血液製剤中の１又は複数の品質因子が、適用可能であれば、品質因子の上限値の３０％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満で下限を超える場合、該血液製剤は一時的に選択されない血液製剤とされる。一時的に選択されない血液製剤は、該選択されない血液製剤と少なくとも１つの選択された血液製剤を混合して規定の範囲内の品質因子を有する混合された血液製剤を得ることができるのであれば、選択された血液製剤となる場合がある。そうでなければ、一時的に選択されない血液製剤は、選択されない血液製剤となる。

また、製品の混合物中の少なくとも１つの品質因子の濃度を決定することができる。したがって、本発明は、

ａ）２以上のドナーに由来する血液製剤の第１の混合物を少なくとも提供する工程、
ｂ）前記第１の混合物中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定する工程、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、
ｄ）前記品質因子に対して測定された前記濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、細胞培養培地用に前記第１の混合物を選択し、前記場合以外の場合には、前記第１の混合物を選択しない工程
を含む、２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含む細胞培養培地を作製する方法を更に提供する。

また、上記混合物に血液製剤を添加して培養培地を形成する前に血液製剤において直接に品質因子の濃度を測定することが好ましい。また、様々な血液製剤の混合物をスクリーニングし、これらが品質因子によって決定される要求を満たすかどうかを確認することが可能である。

血液製剤を、選択後、及び、最終製品すなわち細胞培養培地への添加前に、加工血液製剤へと変換することができる。血液製剤を加工することは、ある一つの種類の血液製剤を別の種類の血液製剤とすることを意味する。例えば、測定され選択された血液製剤は全血であり、その後さらに血漿へと変換される。または、測定され選択された血液製剤は全血であり、加工血液製剤は血清である。別の選択肢では、選択された血液製剤は血漿であり、加工血液製剤は血清である。別の選択肢では、選択された血液製剤は血漿であり、加工血液製剤は血清のサブセットである。また、選択された血液製剤が血清であり、加工血液製剤は血清がサブセットであってもよい。

提供される血液製剤は血漿であることが好ましい。血漿は、例えば免疫系の細胞の培養に頻繁に使用される。さらに、ドナーから血漿アフェレーシスによって容易に血漿を回収することができる。したがって、血漿はまた加工血液製剤でもある。血漿を使用することは、更なる加工工程を必要としないという利点を有する。そのようにして、加工工程を省く。

２以上の品質因子を検査することが好ましく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の品質因子を検査する。より多くの品質因子を検査することは、高度に活性なリンパ球の培養及び増殖に対するより高い品質基準を実際に満たす最終細胞培養培地を得る機会を増す。しかしながら、１つの試料において大量の因子を検査することはまた、プロセスの複雑化を増すことにもなる。したがって、１５未満、１２未満、１０未満、８未満、６未満の品質因子を検査することが好ましい。

本発明のある一つの実施形態によれば、検査される品質因子の数は、２〜６の範囲、好ましくは３〜５の範囲、好ましくは４である。既知の品質因子の特定のサブセットは、その細胞培養培地がリンパ球の増殖又は幹細胞の培養に適格な細胞培地である高い可能性を見出すのに十分であることが分かった。試料全体が高品質試料であるとの指標を提供することを示した品質因子は、ＳＨＢＧ、ＩＧＦ−１、ＣＣＬ５、及びＩＬ−６である。したがって、品質因子はＳＨＢＧであることが好ましい。また、品質因子としてＩＧＦ−１が好ましい。同様に、ＣＣＬ５は好ましい品質因子である。また、ＩＬ−６も好ましい品質因子である。本発明のある一つの実施形態によれば、検査される品質因子は、ＳＨＢＧ、ＩＧＦ−１、ＣＣＬ５、及びＩＬ−６で全部である。

また、品質因子に対する検査は、好適なドナー、特にモニターされる職業的ドナーの選択に使用されてもよい。モニターされる職業的ドナーは、定期的に血液製剤の提供を行い、登録に記録される。

本発明による方法を用いて、血液ドナーを高品質の血液製剤の提供に適していると識別することができる。したがって、本発明による方法は、ドナーのレベルに対して更なる選択工程を提供する。

ある一つの実施形態によれば、上記方法は、
ａ）前記ドナーに由来する血液製剤を提供すること、
ｂ）第１のドナーの血液製剤中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定すること、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較すること、
ｄ）血漿プールにおける濃度値（if the concentration value for the plasma pool）、前記品質因子について測定された濃度が予め定められた範囲内にある場合は、血漿又は血清の提供用に前記ドナーを選択し、前記場合以外の場合には、前記第１のドナーを選択しないこと、を含むドナー選択を含む。
選択されないドナーは、高品質血液製剤に関する登録から除外される。

また、本発明は、体積基準で
３ｎｇ／ｍｌ未満の濃度のＣＣＬ５、
５００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のエオタキシン、
１００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＰＤＧＦ−８８及び／又はＣＸＣＬ−１０、
２００ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−１０、
５０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−１３、
２０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２１、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＦＮγ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ１、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１ＲＡ、及び／又はＴＮＦα、
少なくとも６５ｐｍｏｌ／ｌ、好ましくは少なくとも７５ｐｍｏｌ／ｌ、より好ましくは少なくとも８５ｐｍｏｌ／ｌの濃度のエストラジオール、
少なくとも１９０ｎｍｏｌ／ｌ、好ましくは少なくとも２１０ｎｍｏｌ／ｌ、より好ましくは少なくとも２２０ｎｍｏｌ／ｌの濃度のコルチゾール、
少なくとも１００μｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１３０μｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１４０μｇ／ｌの濃度のＩＧＦ−１、及び／又は
３１ｎｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは２９ｎｍｏｌ／ｌ未満の濃度のＳＨＢＧ、
を含む細胞培養培地に関する。
上記培地は、安定しており且つ再現可能な結果を出せる制御された人工の環境におけるＴ細胞の培養及び増殖に必要な栄養素を提供する。

細胞培養培地は、本発明による作製方法によって得られた培地であることが好ましい。ある一つの実施形態によれば、細胞培養培地は、少なくとも１つの血液製剤、特に血漿及び／又は血清を含む。血液製剤は血清であることがより好ましい。更なる実施形態によれば、細胞培養培地は２以上のドナーに由来する血液製剤を含む。２以上のドナーに由来する血液製剤は、血清及び／又は血漿から選択されることが好ましい。２以上のドナーに由来する製剤は血清であることがより好ましい。代替的な実施形態によれば、細胞培養培地は合成培地である。

本発明による細胞培養培地が満たさなければならない様々な更なるパラメーターが存在する。特に、標準的な培養因子は予め定められた範囲内にある。標準的な培養因子としては例えば、タンパク質、グルコース、非タンパク質窒素、尿素窒素、アミノ酸窒素、クレアチニン、クレアチン、尿素、総脂質、トリグリセリド、コレステリン、脂質、エステル化成分、リン脂質、脂肪酸、有機酸、ピルビン酸、クエン酸、ケトンが挙げられる。

したがって、本発明の細胞培養培地は、
６０．０８０．０ｇ／ｌの濃度のタンパク質、
４．５ｍｍｏｌ／ｌ〜５．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度のグルコース、
１５ｍｍｏｌ／ｌ〜３０ｍｍｏｌ／ｌの濃度の非タンパク質窒素、
３．５ｍｍｏｌ／ｌ〜７．０ｍｍｏｌ／ｌの濃度の尿素窒素、
３．０ｍｍｏｌ／ｌ〜５．０ｍｍｏｌ／ｌの濃度のアミノ酸窒素、
７０．０μｍｏｌ／ｌ〜１４０．０μｍｏｌ／ｌの濃度のクレアチニン、
２５．０μｍｏｌ／ｌ〜７０．０μｍｏｌ／ｌの濃度のクレアチン、
３．０μｍｏｌ／ｌ〜５．０μｍｏｌ／ｌの濃度の尿素、
４．５ｇ／ｌ〜８．５ｇ／ｌの濃度の総脂質、
０．６ｍｍｏｌ／ｌ〜２．４ｍｍｏｌ／ｌの濃度のトリグリセリド、
４．０ｍｍｏｌ／ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度のコレステリン、
０．３ｍｍｏｌ／ｌ〜０．４ｍｍｏｌ／ｌの濃度の脂質、
０．７ｍｍｏｌ／ｌ〜０．８ｍｍｏｌ／ｌの濃度のエステル化成分、
２．０ｍｍｏｌ／ｌ〜３．０ｍｍｏｌ／ｌの濃度のリン脂質、
０．３ｍｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｍｏｌ／ｌの濃度の脂肪酸、
４．０ｍｍｏｌ／ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／ｌの濃度の有機酸、
０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜０．２ｍｍｏｌ／ｌの濃度のピルビン酸塩、
０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜０．２ｍｍｏｌ／ｌの濃度のクエン酸塩、及び／又は
０．３ｍｍｏｌ／ｌ〜０．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度のケトン
を更に含む。

細胞培養培地は、上に言及される全てのパラメーターを満たすことが好ましい。ある一つの実施形態によれば、細胞培養培地は、
２９ｎｍｏｌ／ｌ未満の濃度のＳＨＢＧ、
１００μｇ／ｌ以上の濃度のＩＧＦ−１、
２０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−６、及び
３ｎｇ／ｍｌ未満の濃度のＣＣＬ５のいずれか１つを含む。
更なる実施形態によれば、細胞培養培地は、
２９ｎｍｏｌ／ｌ未満の濃度のＳＨＢＧ、
１００μｇ／ｌ以上の濃度のＩＧＦ−１、
２０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度のＩＬ−６、及び
３ｎｇ／ｍｌ未満の濃度のＣＣＬ５を含む。

本発明による細胞培養培地は、血液製剤の混合物からなってもよい。該細胞培養培地は、血液製剤の混合物に加えて更なる構成成分を含むことが好ましい。好ましい実施形態によれば、更なる構成成分は水、ＮａＣｌ、ＰＢＳ、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、及び２−メルカプトエタノールから選択される。

本発明による細胞培養培地は、様々な種々の細胞を培養するのに適している。したがって、本発明は、細胞を培養するための上記細胞培養培地の使用を更に提供する。主な利点は、不死細胞株の培養以外に、患者から得られた細胞、特に免疫系の細胞又は幹細胞の培養にも成功し得ることである。

本発明による培地、特に本発明による方法によって得られた培地により、リンパ球のより高い増殖速度が見られる。本明細書における「増殖（expansion）」又は「クローン増殖（clonal expansion）」は、もとは単一の細胞に由来する娘細胞の産生を意味する。リンパ球のクローン増殖では、全ての子孫は同じ抗原特異性を共有する。

さらに、本発明による培養培地により、細胞培養において総細胞数が増加し得る。特に、同じ抗原特異性を有するリンパ球の増殖された娘細胞の総数の増加が増加し得る。

したがって、使用のある一つの実施形態によれば、細胞は免疫系の細胞、特にリンパ球である。リンパ球は患者から得られることが好ましい。ある一つの実施形態によれば、リンパ球を上記細胞培養培地中で成長、増加（proliferated）及び／又は増殖（expanded）させる。

ある一つの実施形態によれば、培養培地は腫瘍に由来するＴ細胞の増殖に使用される。増殖は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のサイトカインカクテルの使用を含むことが好ましい。本発明によれば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の組成物は、「サイトカインカクテル」とも呼ばれる。

本明細書における「インターロイキン２」又は「ＩＬ−２」は、配列番号１によって定義されるヒトＩＬ−２、及びその機能的等価物を指す。本明細書における「インターロイキン１５」又は「ＩＬ−１５」は、ヒトＩＬ１５及びその機能的等価物を指す。本明細書における「インターロイキン２１」又は「ＩＬ−２１」はヒトＩＬ−２１及びその機能的等価物を指す。

本発明による細胞培養培地、好ましくは本発明による方法によって得られた培地は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１のサイトカイン混合物と組み合わせてリンパ球を増殖することに特に適している。本発明による細胞培養培地は、好ましくはこのサイトカインの混合物と組み合わせて、成長速度を増し、増殖した細胞の総数を増加させるのみならず、細胞プロファイルも改善する。特に、ＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７表現型によって定義される成熟及び分化が改善される。最後に、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の混合物を用いてのリンパ球の増殖では、臨床的に有用なリンパ球、特にＴ細胞の生存率を増加させる。

能動細胞免疫療法では、成長及び増殖の速度が増加すると、患者に由来するリンパ球を得て患者に標準的なリンパ球を再導入するまでの時間が減少する。（臨床的に有用な）リンパ球の生存率が増加すると、能動的な免疫療法製剤の治療的効果が増加する。

上の記載及び関連する図面において提示される教示の利益を有する、本明細書において述べられた本発明について、多くの改変及び他の実施形態が、本発明が関連する技術分野の当業者には思い浮かぶであろう。したがって、本発明は開示される具体的な実施形態に限定されず、改変及び他の実施形態は添付の特許請求の範囲に含まれると意図されることが理解されるべきである。具体的用語が本明細書で採用されるが、それらは総称的及び記述的な意味においてのみ使用され、限定の目的で使用されるものではない。

実施例１−種々の細胞培養培地中におけるリンパ球の増殖
ＮＹ−ＥＳＯ−１で感作された健康なドナーに対してアフェレーシスを行った。血液成分の分離の後、白血球を含有する製剤をその余から分離した。
１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１を含む培地Ｍ１中に細胞を懸濁した。培地は、更に１０μｍｏｌのＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを含有した。細胞は、良好に増殖し、４日後に１０^６／ｍｌの濃度に達した。
同時に、同じプロトコルに従って培地Ｍ２中でリンパ球を増殖させた。顕著なリンパ球の増殖は検出されなかった。

実施例２−細胞培養培地の組成の分析
標準的な検査では、細胞培養培地間で何らの相違も明らかにならなかった。比濁法及び表１において構成成分として列挙される物質に対する抗体を使用して、培地Ｍ１及び培地Ｍ２をより詳しく分析した。

実施例３−異なるドナーの血漿の分析
細胞培養培地の分析からの結果によれば、モニターされた異なる職業的ドナーに由来する血漿試料を得て、エストラジオール、コルチゾール、インスリン、及びＩＧＦ−１の濃度について分析した。結果を表２に提示する。

本発明の方法によれば、血漿試料Ｐ１〜Ｐ３を選択しない。血漿試料Ｐ５をリンパ球の培養に選択する。

実施例４−異なるドナーの血漿の分析
血漿選択を確認するため、その後、血漿試料Ｐ１〜Ｐ５を細胞培養のために調製した。ＮＹ−ＥＳＯ−１で感作された健康なドナーの末梢血から得られたリンパ球を上に記載されるプロトコルに従って培養した。Ｐ５に由来する細胞培養培地での増殖は、培地Ｍ１での増殖に匹敵した（実施例１を参照されたい。）

Claims (7)

1. ｂ）第１のドナーから得られた第１の血液製剤中の品質因子であるエストラジオール、コルチゾール、ＩＧＦ−１、インスリン、及びＳＨＢＧの濃度を測定する工程、
   ｃ）測定された前記品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、ここで前記予め定められた濃度範囲は、前記血液製剤の体積基準で
   エストラジオールについて６５ｐｍｏｌ／ｌ以上、
   コルチゾールについて１９０ｎｍｏｌ／ｌ以上、
   ＩＧＦ−１について１００μｇ／ｌ以上、
   インスリンについて７．２ｍｌＥ／ｌ以上、及び
   ＳＨＢＧについて３１ｎｍｏｌ／ｌ未満
   である、
   ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、リンパ球培養培地用に前記第１の血液製剤を選択し、ここでさらに前記第１の選択された血液製剤を第１の加工血液製剤に変換してもよく、前記場合以外の場合には、前記第１の血液製剤を選択しない工程
   を含み、
   異なるドナーに由来する、２つ以上の血液製剤を用いて前記工程ｂ）〜ｄ）が行われ、前記選択された血液製剤又は加工血液製剤を組み合わせて培養培地を形成する、
   ２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含むリンパ球培養培地を作製する方法。
2. ｂ）２以上のドナーから得られた血液製剤の第１の混合物中の品質因子であるエストラジオール、コルチゾール、ＩＧＦ−１、インスリン、及びＳＨＢＧの濃度を測定する工程、
   ｃ）測定された前記品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、ここで前記予め定められた濃度範囲は、前記血液製剤の体積基準で
   エストラジオールについて６５ｐｍｏｌ／ｌ以上、
   コルチゾールについて１９０ｎｍｏｌ／ｌ以上、
   ＩＧＦ−１について１００μｇ／ｌ以上、
   インスリンについて７．２ｍｌＥ／ｌ以上、及び
   ＳＨＢＧについて３１ｎｍｏｌ／ｌ未満
   である、
   ｄ）前記品質因子に対して測定された前記濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、リンパ球培養培地用に前記第１の混合物を選択し、前記場合以外の場合には、前記第１の混合物を選択しない工程
   を含む、２以上のドナーに由来する混合血液製剤を含むリンパ球培養培地を作製する方法。
3. 前記血液製剤が全血、血漿、血清、及びそれらのサブセットから選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１受容体アゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、インターロイキン２（ＩＬ−２） インターロイキン１ｂ（ＩＬ−１ｂ）、エオタキシン、塩基性ＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−８８）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＭＣＰ１、インターロイキン８（ＩＬ−８）、ＭＩＰ１ａ、インターロイキン１０、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２ｐ７０（ＩＬ１２ｐ７０）、インターロイキン１７ａ（ＩＬ−１７ａ）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、及びインターロイキン２１（ＩＬ−２１）からなる群から選択される、さらなる品質因子の濃度が前記工程ｂ）において測定される、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記予め定められた濃度範囲が、前記血液製剤の体積基準で
   ＣＣＬ５について３ｎｇ／ｍｌ未満、
   エオタキシンについて５００ｐｇ／ｍｌ未満、
   ＰＤＧＦ−８８及びＣＸＣＬ−１０について１００ｐｇ／ｍｌ未満、
   ＩＬ−１０について２００ｐｇ／ｍｌ未満、
   ＩＬ−１３について５０ｐｇ／ｍｌ未満、
   ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２１、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＦＮγ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ１、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１ＲＡ、及びＴＮＦαについて２０ｐｇ／ｍｌ未満、
   エストラジオールについて７５ｐｍｏｌ／ｌ以上、
   コルチゾールについて２１０ｎｍｏｌ／ｌ以上、及び／又は
   ＩＧＦ−１について１３０μｇ／ｌ以上
   である、請求項４に記載の方法。
6. 前記予め定められた濃度範囲は、前記血液製剤の体積基準で
   エストラジオールについて８５ｐｍｏｌ／ｌ以上、
   コルチゾールについて２２０ｎｍｏｌ／ｌ以上、
   ＩＧＦ−１について１４０μｇ／ｌ以上、及び／又は
   ＳＨＢＧについて２９ｎｍｏｌ／ｌ未満
   である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
7. ｂ）第１のドナーから得られた血液製剤中の品質因子であるエストラジオール、コルチゾール、ＩＧＦ−１、インスリン、及びＳＨＢＧの濃度を測定すること、
   ｃ）測定された前記品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較すること、ここで前記予め定められた濃度範囲は、前記血液製剤の体積基準で
   エストラジオールについて６５ｐｍｏｌ／ｌ以上、
   コルチゾールについて１９０ｎｍｏｌ／ｌ以上、
   ＩＧＦ−１について１００μｇ／ｌ以上、
   インスリンについて７．２ｍｌＥ／ｌ以上、及び
   ＳＨＢＧについて３１ｎｍｏｌ／ｌ未満
   である、
   ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合は、血漿又は血清の提供に対して前記ドナーを選択し、前記場合以外の場合には、前記第１のドナーを選択しないこと、
   を含むドナーの選択を含む、
   請求項１に記載の方法。