CN114222813A - 用于增强细胞培养的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了细胞培养方法和与其相关的组合物的改进。部分具体地，本文提供了增加细胞分裂时间和活力的组合物和方法以及试剂盒。本文还提供了用于进行电穿孔的组合物和方法，其中实现了高水平的电穿孔效率并且降低了电穿孔对细胞的有害影响。

Description

用于增强细胞培养的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年7月8日提交的美国临时专利申请第62/871,409号的优先权的权益，所述美国临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2020年6月2日的所述ASCII副本命名为LT01457_SL.txt并且大小为8,090字节。

技术领域

本文提供了细胞培养方法和与其相关的组合物的改进。部分具体地，本文提供了增加细胞分裂时间和活力的组合物和方法以及试剂盒。本文还提供了用于进行电穿孔的组合物和方法，其中实现了高水平的电穿孔效率并且降低了电穿孔对细胞的有害影响。

背景技术

细胞培养组合物和方法是本领域已知的。在许多情况下，期望在细胞扩增到大数量并在细胞群体中保持大数量活细胞的条件下培养细胞。本文提供了针对实现这些目标以及其它目标的组合物和方法。

当将细胞用于治疗目的时，通常期望在不存在血清的情况下培养这些细胞。这样做的原因包含细胞将被血清中存在的外来因子(例如病毒、朊病毒、支原体等)污染的可能性。而且，当用于哺乳动物细胞培养中时，即使从大量(例如，100个或更多个)动物的血液中收集的血清也具有明显的批次间可变性(参见图1)。如从图1所呈现的数据中可以看出，不同批次的可商购获得的人血清显示出总T细胞产率的显著变化(15％到50％)。在转导效率方面也发现了显著变化(数据未示出)。上文是经常使用血清替代物的一些原因。

电穿孔是一种可以将材料引到细胞中的方法。含有细胞和要引入的材料的溶液暴露于短暂的高强度电场中。电场“穿孔”细胞，在其外膜上产生瞬时孔，使溶液中的物质扩散到细胞中。

细胞电穿孔的一个问题是此过程通常会降低细胞活力。进一步地，通常在逆相关电穿孔效率与细胞活力之间寻求平衡。作为实例，生理水平等于细胞内量的钾趋于增加电穿孔细胞的活力(例如，van den Hoff等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,20:2902(1992))。据报道，钙离子的存在会增加电穿孔后细胞的活力。据推测，据报道，存活率增加的原因是电穿孔之后重新密封过程中钙的贡献。van den Hoff等人的表1(《核酸研究》,20:2902(1992))基本上表明，施加到细胞的电荷越高，细胞活力越低，其中测得的最高细胞活力为约69％。

电穿孔介质的渗透压影响细胞活力和大分子通过细胞膜的移动效率。例如，vanden Hoff等人(《核酸研究》,18:6464(1990))建议不要使用低渗电穿孔介质。

需要使高水平的分子引入到细胞中同时维持高水平的细胞活力的电穿孔方法。

发明内容

提供了用于培养和/或扩增具有高细胞活力的细胞(例如，人细胞)的组合物和方法。本文进一步提供了尤其用于将大分子引入到细胞中的组合物、方法系统、试剂盒和方法，其中细胞维持高活力。因此，通常，本文提供了涉及用于维持高细胞活力和产生细胞组合物的细胞过程的组合物和方法，其中所述组合物中的细胞保持高水平的活力。

在一些方面，本文提供了用于制备无血清细胞培养基的方法，以及用于此类方法的组合物和通过此类方法制备的所得培养基。此类方法包含将一种或多种脂蛋白颗粒组合物和/或一种或多种脂蛋白添加到基础培养基中的那些方法。在许多情况下，脂蛋白颗粒组合物和/或脂蛋白以用作血清替代物的量添加。

用于本文所述的方法中并存在于组合物中的脂蛋白颗粒可以包括选自由以下组成的组的一种或多种脂蛋白颗粒：(a)高密度脂蛋白颗粒、(b)低密度脂蛋白颗粒以及(c)极低密度脂蛋白颗粒；以及其它类型的脂蛋白颗粒。

用于本文所述的方法中并存在于组合物中的脂蛋白颗粒可以从天然来源(例如，血液或哺乳动物，如人)获得或可以合成产生(例如，合成脂蛋白颗粒，如合成高密度脂蛋白颗粒)。在一些情况下，合成脂蛋白颗粒可以包括载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、载脂蛋白IV、载脂蛋白-CI、载脂蛋白III、载脂蛋白D、载脂蛋白E和/或一种或多种此类载脂蛋白的一部分。

进一步地，存在于组合物中并用于本文所述的方法的载脂蛋白可以从天然来源(例如，血液或哺乳动物，如人)获得和/或重组产生。另外地，可以使用非哺乳动物细胞(例如，细菌细胞、植物细胞和昆虫细胞等)进行重组产生载脂蛋白和/或其部分。

在一些方面，本文提供了无血清细胞培养基。此类培养基可以包括一种或多种脂蛋白。进一步地，此类培养基可以支持哺乳动物细胞的扩增，其中所述哺乳动物细胞在包括所述一种或多种脂蛋白的所述无血清细胞培养基中的扩增与在不含所述一种或多种脂蛋白但含有血清的培养基中扩增的相同细胞相比增加了至少10％(例如，约10％到约75％、约10％到约70％、约10％到约55％、约10％到约45％、约10％到约35％、约10％到约25％、约20％到约70％、约20％到约55％等)。本文所述的无血清细胞培养基可以含有一种或多种脂蛋白化合物(例如，载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、载脂蛋白IV、载脂蛋白-CI、载脂蛋白III、载脂蛋白D和载脂蛋白E等)和/或脂蛋白的一个或多个子部分之一。进一步地，脂蛋白和/或脂蛋白子部分可以是脂蛋白颗粒(例如，高密度脂蛋白颗粒、低密度脂蛋白颗粒、极低密度脂蛋白颗粒等)的组分。

存在于本文所述的培养基(例如，无血清培养基)中的脂蛋白颗粒可以从天然来源(例如，哺乳动物，如人的血液)获得或者可以是非天然存在的(例如，合成产生的)。进一步地，非天然存在的脂蛋白颗粒可以含有一种或多种非天然存在的蛋白质、一种或多种天然存在的载脂蛋白、天然存在的载脂蛋白的一个或多个部分或这些的一种或多种组合。

可以使用本文所述的组合物和方法培养的细胞包含哺乳动物细胞，如杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人细胞等。进一步地，此类细胞可以源自特定组织(例如，肝、脾、淋巴结、肺等)或属于细胞类别类型(例如，免疫系统细胞)和/或特定细胞类型(例如，FoxP3+调节性T细胞、B细胞)。此类细胞还可以是T细胞和/或特异性T细胞，例如调节性T细胞(例如，FoxP3+调节性T细胞、FoxP3-调节性T细胞等)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、T_H1细胞、T_H2细胞、T_H3细胞、T_H17细胞、T_H9细胞、T_FH细胞等。

在一些情况下，本文提供了用于扩增哺乳动物细胞的方法。此类方法可以包括在允许哺乳动物细胞扩增的条件下在包括一种或多种脂蛋白化合物的无血清细胞培养基中温育哺乳动物细胞。

存在于此类培养基中的脂蛋白化合物可以包括选自由以下组成的组的一种或多种脂蛋白颗粒：(a)高密度脂蛋白颗粒、(b)低密度脂蛋白颗粒以及(c)极低密度脂蛋白颗粒；以及其它类型的脂蛋白颗粒。

本文还提供了用于哺乳动物细胞群体的电穿孔的方法。此类方法可以包括：(a)在允许所述哺乳动物细胞扩增的条件下，使所述哺乳动物细胞群体与一种或多种脂蛋白化合物在培养基(例如，无血清培养基)中接触持续至少12小时(例如，约12到约168小时、约12到约150小时、约12到约120小时、约12到约100小时、约12到约100小时、约12到约72小时、约24到约96小时、约48到约150小时、约48到约96小时、约70到约120小时等)；以及(b)向所述哺乳动物细胞群体施加一个或多个电脉冲以由此对所述哺乳动物细胞群体中的成员的细胞膜进行电穿孔，其中电穿孔效率为至少60％(例如，约60％到约100％、约60％到约95％、约60％到约90％、约60％到约85％、约70％到约100％、约70％到约95％、约70％到约90％、约80％到约100％、约80％到约95％等)，并且其中所述哺乳动物细胞群体中的细胞的活力下降少于10％(例如，约0％到约10％、约0％到约8％、约0％到约7％、约0％到约5％、约3％到约10％、约3％到约8％、约3％到约6％、约5％到约10％等)。

在一些情况下，所述电穿孔效率可以通过所述哺乳动物细胞群体中的成员中的标志物(例如，可检测标志物)的表达来测量。进一步地，标志物(例如，可检测标志物)可以是荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP(S65T/F64L)、祖母绿、Azami绿、AcGFP、ZsGreen等)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、mCitrine、Venus、YPet、PhiYFP等)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、石青、mTagBFP等)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、天蓝、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-青等)、红色荧光蛋白(例如，mPlum、AsRed2、mCherry、mRFP1、HcRed1、mRasberry、mStrawberry、Jred等)、橙色荧光蛋白(例如，mOrange、mKO2、Kusabira-橙、mTangerine、tdTomato等)或其它合适的荧光蛋白)。

本文进一步提供了用于维持活化的T细胞群体的方法。在一些情况下，此类方法包括：(a)产生活化的T细胞群体；(b)在存在脂蛋白补充物的情况下扩增在步骤(a)中产生的活化的T细胞群体；(c)使在步骤(b)中产生的经过扩增的活化的T细胞群体暴露于足够强度的电场，以使在接下来的七天内细胞扩增速率降低至少30％(例如，约30％到约100％、约30％到约95％、约30％到约90％、约30％到约85％、约30％到约80％、约50％到约100％、约50％到约95％、约50％到约85％、约65％到约100％、约65％到约95％、约60％到约90％、约70％到约100％、约70％到约95％、约80％到约98％等)；以及(d)在与步骤(b)中相同的条件下使步骤(c)的活化的T细胞群体维持至少五天(例如，七天、约五天至约十二天、约六天至约十二天、约六天至约十天、约六天至约八天等。)，其中在步骤(a)-(d)期间所述活化的T细胞群体的活力保持在70％以上(例如，约70％到约100％、约80％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约70％到约98％、约80％到约98％、约80％到约95％、约85％到约100％等)。

在一些情况下，一种或多种核酸分子(例如，对嵌合抗原受体进行编码的一种或多种核酸分子)可以在步骤(c)中被将引入到活化的T细胞群体中的单独T细胞中。在一种或多种核酸分子对蛋白质(例如，嵌合抗原受体)进行编码的情况下，蛋白质可以在其被引入的T细胞内稳定或瞬时表达。

当实施用于维持活化的T细胞群体的方法时，例如，如上所述，则活化的T细胞群体可以在上文的步骤(b)中扩增持续约一天到约六天(例如，约一天到约六天、约两天到约六天、约三天到约六天、约一天到约五天、约一天到约四天等)。

进一步地，用于维持活化的T细胞群体的方法，例如，如上所述，可以进一步包括：(e)在步骤(d)之后洗涤所述活化的T细胞群体；以及(f)在不存在脂蛋白补充物的情况下扩增在步骤(e)中产生的经过洗涤的活化的T细胞群体。

另外地，在许多情况下，经过洗涤的活化的T细胞群体的活力在五天时间段内保持在70％以上(例如，约70％到约100％、约80％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约70％到约98％、约80％到约98％、约80％到约95％、约85％到约100％等)，并且经过洗涤的活化的T细胞群体扩增至少三倍(例如，约三倍到约十二倍、约四倍到约十二倍、约五倍到约十二倍、约六倍到约十二倍、约三倍到约十倍、约五倍到约十一倍等)。

如上述那些方法等方法允许细胞的储存和/或运送，同时维持高水平的细胞活力。因此，本文还提供了在步骤(d)期间将活化的T细胞群体运送到不同位置(例如，约10到约5,000英里的位置、约10到约100英里的位置、约50到约5,000英里的位置、约50到约3,500英里的位置、约200到约3,500英里的位置、约300到约3,500英里的位置、约500到约3,500英里的位置、约1,000到约5,000英里的位置等)的方法。

进一步地，还提供了用于储存哺乳动物细胞(例如T细胞)的方法。此类方法可以包括以下步骤(例如，按顺序包括以下步骤)：(a)在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增所述哺乳动物细胞；(b)将所述哺乳动物细胞暴露于电场；以及(c)在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增所述哺乳动物细胞，其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞以比步骤(a)中低至少50％(例如，约50％到约100％、约60％到约100％、约70％到约100％、约80％到约100％、约50％到约90％、约60％到约90％、约70％到约90％、约60％到约85％等)的速率扩增，并且其中所述哺乳动物细胞的活力在步骤(a)-(c)期间保持在70％以上(例如，约70％到约100％、约80％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约70％到约98％、约80％到约98％、约80％到约95％、约85％到约100％等)。

进一步地，所述哺乳动物细胞可以在步骤(c)中扩增持续约一天到约六天(例如，七天、约一天到约六天、约两天到约六天、约三天到约六天、约一天到约五天、约一天到约四天等)。

在一些情况下，步骤(c)中的哺乳动物细胞可以被洗涤并转移到包括至少50％(例如，约50％到约100％、约60％到约100％、约70％到约100％、约80％到约100％、约90％到约100％、约95％到约100％、约50％到约90％、约60％到约80％等)较低浓度的一种或多种脂蛋白化合物的培养基中。

在一些情况下，一种或多种核酸分子(例如，对嵌合抗原受体进行编码的一种或多种核酸分子)可以在步骤(b)中被引入到哺乳动物细胞(例如，T细胞)中。

附图说明

图1人血清示出了批次之间的不一致性。与对照批次的人血清相比，人T细胞在补充有若干个不合格批次的人血清(标记为“huAB血清”)的基础培养基中扩增。具有5％人血清的CTS OPTMIZER^TM培养基。在刺激后的10天的过程内测量生长。

图2示出了人载脂蛋白AI的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，以及此蛋白质的一些区域。

图3示出了人载脂蛋白AII的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，以及此蛋白质的以轮廓样式框列出的一些区域。

图4示出了在补充有8mg/L的HDL(n＝4)的CTS OPTMIZER^TM中培养的T细胞在第5天和第10天的扩增倍数，其中添加(1)HDL作为预调配物(“T细胞补充物中的HDL”)或(2)直接添加到CTS OPTMIZER^TM中(分别为“T细胞补充物中的HDL”和“使用点处的HDL”)(参见实例1)。将这两种HDL添加的扩增倍数与(1)完全CTS OPTMIZER^TM和(2)X-VIVO^TM 15(含5％人血清)中的T细胞的扩增进行比较。

图5示出了在补充有8mg/L的HDL(n＝4)的基础培养基中培养的T细胞在第5天和第10天的存活百分比。标记如图4所示。

图6示出了在存在(1)CTS OPTMIZER^TM和HDL以及(2)完全CTS OPTMIZER^TM(n＝3)的情况下第10天T细胞扩增的CD8+/CD4+比率。发现CD8+:CD4+比率变化1.30倍，对于含有HDL的CTS OPTMIZER^TM，与CTS OPTMIZER^TM相比。

图7示出了在存在(1)CTS OPTMIZER^TM和HDL以及(2)完全CTS OPTMIZER^TM(n＝4)的情况下第10天细胞扩增的表型。发现含有HDL的CTS OPTMIZER^TM的CD27+T细胞增加了12％，与完全CTS OPTMIZER^TM相比。发现含有HDL的CTS OPTMIZER^TM的CCR7+ T细胞增加了19％，与完全CTS OPTMIZER^TM相比。

图8示出了来自五种不同供体(D032、D093、D168、D242和D938)的T细胞的活力差异，这些供体在电穿孔之前已在不含ICSR的含有6mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM(CTSOPTMIZER^TM 6HDL)和CTS OPTMIZER^TM完全中扩增。CTS OPTMIZER^TM完全中的T细胞活力在Y轴上为零(0)。所有五个供体样品的T细胞在第3天被电穿孔(参见黑色向上箭头)。

图9示出了来自在CTS OPTMIZER^TM 6HDL和CTS OPTMIZER^TM完全中培养的五种不同供体的T细胞的平均总细胞活力使用图8中呈现的数据。如图8，细胞在第3天被电穿孔(参见黑色向下箭头)。

图10示出了在CTS OPTMIZER^TM 6HDL和CTS OPTMIZER^TM完全中在10天期间内T细胞的扩增。来自五个供体的T细胞在第3天被电穿孔。

图11示出了在来自五个不同供体的已经在CTS OPTMIZER^TM 6HDL和CTSOPTMIZER^TM完全中扩增的T细胞的电穿孔之后24小时的电穿孔效率。

图12以图形方式示出了图11所示的数据的平均值。

图13示出了在电穿孔之前在各种条件下扩增的来自两个不同供体的T细胞的电穿孔效率。这些扩增条件如下：(1)不含ICSR并且含6mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM，(2)不含ICSR并且含5mg/L HDL和1mg/L LDL的CTS OPTMIZER^TM，(3)不含ICSR并且含4mg/L HDL和2mg/LLDL的CTS OPTMIZER^TM，(4)不含ICSR并且含3mg/L HDL和3mg/L LDL的CTS OPTMIZER^TM，(5)不含ICSR并且含2mg/L HDL和4mg/L LDL的CTS OPTMIZER^TM，(6)不含ICSR并且含1mg/L HDL和5mg/L LDL的CTSOPTMIZER^TM，(7)不含ICSR和6mg/L LDL的CTS OPTMIZER^TM，以及(8)不含ICSR的CTS OPTMIZER^TM和(9)CTS OPTMIZER^TM完全。打开的向下箭头示出了两个供体的常见最高电穿孔效率。

图14示出了各种条件下的T细胞活力。来自单个供体(D032)的T细胞在第3天被电穿孔。标记为“ALL”的T细胞样品在10天的扩增期内一直维持在与预电穿孔接触的相同培养基中。在OPTI-MEM^TM培养基中洗涤和电穿孔细胞。

图15示出了T细胞活力，其中来自单个供体(D032)的T细胞在电穿孔之前和之后在各种条件下培养。T细胞扩增条件与图14中基本相同。

具体实施方式

概述

本文部分提供了与(1)无血清细胞培养、(2)将核酸分子引入到细胞中和(3)将细胞维持在低细胞扩增水平下相关的组合物和方法(参见图14和15)。

关于无血清细胞培养，本文提供了用于培养具有脂蛋白颗粒和/或脂蛋白的动物细胞的组合物和方法。在许多情况下，此类动物细胞是在存在血清的情况下表现出扩增增强的细胞。

关于将核酸分子引入到细胞中，本文提供了用于在允许增加的电穿孔后细胞活力和转染效率的条件下对细胞进行电穿孔的组合物和方法。在一些情况下，本文所述的方法涉及细胞与脂蛋白颗粒和/或脂蛋白的预电穿孔温育。

定义

为了理解本主题和构造所附的专利权利要求，包含了以下定义。本文所使用的缩写在化学和生物学领域具有其常规含义。

除非上下文要求更有限的范围，否则如本文所用，数值或范围的术语“约”在上下文中意指所列举或要求保护的数值或范围的±10％。

如本文所用，术语“脂质”包含蜡、脂肪、油、脂肪酸、甾醇、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和其它。在实施例中，脂质是溶于醇但不溶于水的物质，如蜡、脂肪、油、脂肪酸、甾醇、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或磷脂。在实施例中，脂质是脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂和鞘脂、多聚异戊二烯醇(prenol lipid)、糖脂(saccharolipid)或聚酮化合物。在实施例中，脂质包括酮乙基或异戊二烯基团。在实施例中，脂质是蜡酯。在实施例中，脂质是类二十烷酸(例如，前列腺素、血栓素、白三烯、脂氧素类、消退素或eoxin)。在实施例中，脂质是甾醇脂质。在实施例中，甾醇脂质是胆固醇或其衍生物。在实施例中，胆固醇是nat-胆固醇和/或ent-胆固醇。

如本文所用，术语“脂肪酸”是指通常具有长的饱和或不饱和脂肪族尾的羧酸(或有机酸)。在实施例中，脂肪酸具有至少4个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸具有至少8个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸具有至少12个碳原子长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸具有介于4与24个碳原子之间长度的碳-碳键合链。在实施例中，脂肪酸是天然存在的脂肪酸。在实施例中，脂肪酸是人造的(例如，不是天然产生的)。在实施例中，天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子。在实施例中，天然存在的脂肪酸的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。在实施例中，脂肪酸可以处于游离态(未酯化)或呈酯化形式，如甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、酰基-CoA(硫代酸酯)键合或其它键合形式的一部分。在实施例中，脂肪酸可以酯化为磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或双磷脂酰甘油形式。在实施例中，本文所公开的脂肪酸或脂肪酸衍生物是游离脂肪酸、酯(例如，甲基、乙基、丙基等)、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯(例如，甘油酯)或脂肪酸的醛、酰胺或磷脂版。“饱和脂肪酸”不含有任何双键或沿链的其它官能团。术语“饱和的”是指氢，因为所有碳(除羧酸[-COOH]基团之外)都含有尽可能多的氢。换言之，ω末端含有3个氢(CH3-)，链中的每个碳均含有2个氢(-CH2-)。在“不饱和脂肪酸”中，一个或多个烯烃官能团沿链存在，每个烯烃都用双键“-CH＝CH-”部分取代链中单键“-CH2-CH2-”部分(即，与另一个碳双键合的碳)。链中与双键合的任一侧键合的两个相邻碳原子可以以顺式或反式构型出现。脂肪酸的非限制性实例的表格如下：

如本文所用，术语“脂蛋白补充物”是指含有一种或多种脂蛋白化合物并且可以添加到细胞培养基中的材料。可以存在于脂蛋白补充物中的脂蛋白化合物的实例包含脂蛋白颗粒、载脂蛋白和其子部分、合成的HDL颗粒、从血液(例如，人血)中分离的HDL，以及一种或多种脂蛋白单独或与一种或多种脂质和/或一种或多种脂肪酸组合的混合物。

如本文所用，术语“脂蛋白颗粒”是指转运脂质(例如，胆固醇和甘油三酯)以及其它分子的分子组装体。脂蛋白颗粒通常具有磷脂和胆固醇外层，其中亲水部分向外朝向周围的水，并且每个分子的亲脂部分向内朝向颗粒内的脂质分子。载脂蛋白包埋在外层中。因此，复合物用于使脂肪乳化。脂蛋白颗粒的实例包含归类为高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和极低密度的血浆脂蛋白颗粒。脂蛋白颗粒也可以合成产生。

如本文所用，术语“高密度脂蛋白”(HDL)颗粒是指脂蛋白的主要组之一。HDL颗粒在组成上是异质的，并且通常每颗粒由80-100个蛋白质分子构成，并且可以由数百个脂质分子构成。尽管存在许多不同类型的天然存在的HDL颗粒，但这些颗粒通常含有若干种类型的载脂蛋白，包含载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、载脂蛋白IV、载脂蛋白-CI、载脂蛋白III、载脂蛋白D和载脂蛋白E。HDL颗粒通常由约55％的蛋白质、3％到15％的甘油三酯、26％到46％的磷脂、15％到30％的胆固醇酯和2％到10％的胆固醇构成。约70％的HDL颗粒蛋白质通常是载脂蛋白AI。

基于电泳迁移，HDL颗粒通常可以分为三个亚型。这些亚型是(1)α-迁移物种(例如，球形HDL2和HDL3)，(2)β-迁移物种(例如，pre-β盘状HDL、贫APO-AI和游离APO-AI)，以及(3)γ-迁移物种。

如本文所用，术语“载脂蛋白AI”(APO-AI)是指在人细胞中表达(即在加工之前)的分子量为约31kDa的并且由267个氨基酸组成的蛋白质，其中天冬氨酸作为在HDL颗粒中发现的N端残基并且谷氨酸作为C端残基(参见例如图2)。存在一种主要的APO-AI蛋白同种型(其中pI为5.6，两种次要亚型，pI为5.53和5.46)和多达四种另外的同种型。此蛋白质具有高含量的α-螺旋结构。来自其它生物体的相关蛋白质也落入此术语的范围内。

APO-AI可以在N端处截短约1个氨基酸到约30个氨基酸(例如，约1个氨基酸到约26个氨基酸、约1个氨基酸到约25个氨基酸、约1个氨基酸到约20个氨基酸、约1个氨基酸到约19个氨基酸、约10个氨基酸到约30个氨基酸、约10个氨基酸到约26个氨基酸、约10个氨基酸到约25个氨基酸、约10个氨基酸到约19个氨基酸、约19个氨基酸到约30个氨基酸、约19个氨基酸到约26个氨基酸、约18个氨基酸到约26个氨基酸等)。

如本文所用，术语“基础培养基(basal culture medium)”或“基础培养基(basalculture media)”是指可以补充有另外的组分(例如，血清、血清替代物等)以改善特定细胞类型的扩增的细胞培养基。基础培养基可以包含多种成分，包含氨基酸、维生素、有机盐和无机盐以及碳水化合物来源。每种成分可以以支持细胞培养的量存在，此类量是本领域技术人员通常已知的。基础培养基还可以含有另外的物质，如缓冲物质(例如碳酸氢钠)、抗氧化剂、用于抵消机械应力的稳定剂或蛋白酶抑制剂。可从赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientifics)获得的示例性基础培养基包含高级DMEM(目录号12491-015)、CTS^TMKNOCKOUT^TM DMEM(目录号A12861-01)、DMEM、高糖(目录号11965-084)、高级DMEM/F-12(目录号12634-010)、CTS^TM KNOCKOUT^TM DMEM/F-12(目录号A13708-01)、DMEM/F-12(目录号11320-033)、IMEM(改进的极限必需培养基)(目录号A10489-01)、IMDM(录号12440-046)、Leibovitz's L-15培养基(目录号11415-064)、McCoy's 5A(改良的)培养基(目录号16600-082)、MCDB 131培养基(目录号10372-019)、培养基199(目录号11150-067)、高级MEM(目录号12492-013)、费氏培养基(目录号21475-025)、高级RPMI 1640培养基(目录号12633-012)、RPMI 1640培养基(目录号11875-085)和William's E培养基(目录号12551-032)。

如本文所用，术语“血清替代物”是指可以用于代替血清以增强血清增强细胞扩增的组合物。血清替代物通常含有组分如脂质的混合物。血清替代物的实例包含CTS^TM免疫细胞SR(ICSR)(赛默飞世尔科技公司，目录号A2596101和A2596102)、KNOCKOUT^TM血清替代物(赛默飞世尔科技公司，目录号10828028)、血清替代物1(密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，目录号S0638)和血清替代物溶液(新泽西州洛基山派普泰克公司(PeproTech,Rocky Hill,NJ)，目录号SR100)。

血清替代物的组分不需要很全面。因此，除了一种或多种血清替代物外，还可以将另外的组分(例如，一种或多种细胞因子，如白细胞介素-2(IL-2))添加到基础培养基中。

术语“免疫细胞”是指可以是免疫系统的一部分并执行特定功能的细胞，如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、先天性淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC)、单核细胞或巨噬细胞。还包含具有细胞毒性功能的免疫细胞，如T细胞、NK细胞、NKT细胞、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。“免疫细胞”范围内还包含T细胞亚群，所述亚群可以选自由以下组成的组：(a)Th1 T细胞、(b)Th2 T细胞、(c)Th17 T细胞、(d)Th22 T细胞、(e)调节性T细胞、(f)原初T细胞、(g)抗原特异性T细胞、(h)中枢记忆T细胞、(i)效应记忆T细胞、(j)组织常驻记忆T细胞、以及(k)虚拟记忆T细胞。

如本文所用，术语“活化”是指在足够的细胞表面部分连接之后以诱导可测量的形态、表型和/或功能改变的细胞状态。在T细胞的上下文中，此类活化可能是已经被充分刺激以诱导细胞增殖的T细胞的状态。T细胞的活化还可以诱导细胞因子的产生和/或分泌，以及细胞表面分子(如受体或粘附分子)的表达的上调或下调、或某些分子的分泌的上调或下调和调节或细胞溶解功能的性能。在其它细胞的上下文中，此术语可以推断特定物理化学过程的上调或下调。

在实施例中，刺激包括由细胞表面部分的连接诱导的主要应答。例如，在受体的上下文中，这种刺激可能需要受体的连接和随后的信号传导事件。在实施例中，培养T细胞包括刺激T细胞。关于T细胞的刺激，这种刺激可以指在实施例中随后诱导信号传导事件(如结合TCR/CD3复合物)的T细胞表面部分的连接。在实施例中，刺激事件可以活化细胞并上调或下调细胞表面分子如受体或粘附分子的表达，或上调或下调分子的分泌，如下调肿瘤生长因子β(TGF-β)或上调IL-2、IFN-γ等。可以用于活化的配体包含抗体。此类抗体可以是任何种类、类别或亚型的，只要此类抗体可以与感兴趣的靶标(例如，CD3、TCR或CD28)适当地反应。

用于本文所述的方法(例如，T细胞活化、免疫细胞纯化等)的“抗体”包含：

(a)免疫球蛋白的各种类别或亚类中的任何一种(例如，衍生自任何动物(例如，常规使用的动物中的任何动物，例如，绵羊、兔子、山羊、小鼠、大鼠、骆驼或蛋黄)的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)，

(b)单克隆或多克隆抗体，

(c)完整的抗体或单克隆或多克隆抗体片段，所述片段是含有抗体结合区的那些片段，例如，不含Fc部分(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、V_HH或其它单结构域抗体)的片段，即通过连接完整抗体中的重链组分的二硫键的还原裂解而获得的所谓的“半分子”片段。Fv可以定义为含有轻链的可变区和重链的可变区并表达为两条链的片段。

(d)通过重组DNA或其它合成技术产生或修饰的抗体，其包含单克隆抗体、抗体片段、“人源化抗体”、嵌合抗体或合成制备或改变的抗体样结构。

还包含抗体的功能性衍生物或“等同物”，例如，单链抗体、CDR-移植的抗体等。单链抗体(SCA)可以定义为一种含有轻链的可变区和重链的可变区并由合适的多肽连接剂连接成融合的单链分子的基因工程化分子。

如本文所用，术语“分离”包含从另一种组分中基本上纯化出一种组分的任何方式(例如通过过滤、亲和力、浮力密度或磁性吸引力)。

如本文所用，术语“纯化(purifying)”或“纯化的(purified)”是指提高混合物的组分相对于一种或多种其它组分的量。作为实例，假设Treg细胞存在于混合的T细胞群体中，其中Treg细胞占群体的5％，而所有其它T细胞占总T细胞群体的95％。如果执行的过程给出20％的群体Treg细胞，其中其它T细胞占总T细胞群体的80％，则Treg细胞已被“纯化”。通常，当已经纯化了T细胞子群(或其它细胞类型)时，T细胞子群(或其它细胞类型)的比率将增加至少两倍(例如，从1:10的比率增加到1:5的比率)(例如，约两倍到约100倍、约两倍到约100倍、约2倍到约100倍、约5倍到约100倍、约8倍到约100倍、约15倍到约100倍、约10倍到约40倍等)。

如本文所用，术语“固体载体”是指任何固相材料，在其上可以附接多肽，如抗体以用于纯化目的。因此，术语“固体载体”包含树脂、多孔板的孔和各种类型的珠粒。在一些实施例中，固体载体的构型呈珠粒、球体、颗粒、颗粒体或表面的形式。在一些实施例中，表面是平面的、基本上平面的或非平面的。在一些实施例中，固体载体可以是多孔的或无孔的。在一些实施例中，固体载体可以以孔、凹陷或其它容器的形式配置。在一些实施例中，固体载体可以包括天然多糖、合成聚合物、无机材料或其组合。在一些实施例中，固体载体可以是珠粒。在一些实施例中，此类珠粒可以包括作为交联聚苯乙烯基质和聚乙二醇(PEG)的接枝共聚物的树脂。在一些实施例中，在本文所述的方法中使用的珠粒可以是磁性的。例如，珠粒的磁化允许使用自动处理技术来洗涤和操作磁珠。

如本文所用，“磁珠”是指含有一种或多种金属或其氧化物或氢氧化物的磁响应性颗粒。所关注的磁响应性材料包含顺磁材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料。在一些实施例中，使用任何磁珠，只要这些颗粒分散或悬浮在水性介质中并且具有通过施加磁场而与分散液或悬浮液分离的能力。在一些实施例中，磁珠包含例如铁、钴或镍的盐、氧化物、硼化物或硫化物；以及具有高磁化率的稀土元素(例如赤铁矿和铁氧体)。磁珠的具体实例包含铁、镍和钴。

本文所使用，术语“CD8+T细胞”是指在其表面上呈递共受体CD8的T细胞。CD8是一种作为T细胞受体(TCR)的共受体的可以识别特异性抗原的跨膜糖蛋白。与TCR类似，CD8与主要的组织相容性复合体I(MHC I)分子结合。在实施例中，CD8+T细胞是细胞毒性CD8+T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞、T-杀伤细胞、细胞溶解T细胞或杀伤T细胞)。在实施例中，CD8+T细胞是调节性CD8+T细胞，也称为CD8+T细胞抑制剂。

本文所使用，术语“CD4+T细胞”是指在其表面上呈递共受体CD4的T细胞。CD4是一种作为T细胞受体(TCR)的共受体的可以识别特异性抗原的跨膜糖蛋白。在实施例中，CD4+T细胞是T辅助细胞。T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其它白细胞，包含使B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。当辅助T细胞由在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子与肽抗原一起呈递时，它们变为活化的。一旦活化，它们迅速分裂并且分泌称为细胞因子的小蛋白，所述细胞因子调节或辅助主动免疫应答。这些细胞可以分化为若干种亚型之一，包含T_H1、T_H2、T_H3、T_H17、T_H9、或T_FH，它们分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号引导T细胞进入特定亚型。在实施例中，CD4+T细胞是调节性T细胞。

如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”或“CARs”是指将抗原特异性移植到细胞(例如，T细胞，如原初T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合)的工程化受体。CAR也被称为人造T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。在实施例中，CAR包括一个或多个抗原特异性靶向结构域、胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。在实施例中，如果CAR靶向两种不同的抗原，那么抗原特异性靶向结构域可以串联布置。在实施例中，如果CAR靶向两种不同的抗原，那么抗原特异性靶向结构域可以串联布置并通过接头序列分离。

CAR是将任意特异性移植到免疫细胞(例如，T细胞，如活化的T细胞)上的工程化受体。这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到免疫细胞上；通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。受体之所以称为嵌合体，是因为它们由不同来源的部分构成。CAR可以通过过继性细胞转移用作治疗癌症。将T细胞从患者中去除并进行修饰，以便它们表达对患者的特定癌症具有特异性的受体。将识别并杀死癌细胞的T细胞重新引入到患者体内。在实施例中，源自患者以外的供体的T细胞的修饰可以用于治疗患者。

使用表达嵌合抗原受体的T细胞的过继转移，可以使CAR-修饰的T细胞工程化，以靶向任何与肿瘤相关的抗原。在收集患者的T细胞之后，使细胞基因工程化，以表达专门针对患者的肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后再注入患者体内。

用于癌症免疫疗法的用于使CAR-T细胞工程化的一些方法使用将转基因整合到宿主细胞基因组中的病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒或转座子。可替代地，可以使用非整合载体，如质粒或mRNA，但是这些类型的游离DNA/RNA在重复细胞分裂后可能丢失。因此，工程化CAR-T细胞可能最终会失去其CAR表达。在另一种方法中，使用在T细胞中稳定维持而无需整合到其基因组中的载体。已经发现此策略能够长期转基因表达而没有插入突变或遗传毒性的风险。

如本文所用，术语“同源重组”是指遗传重组的机制，其中包括类似核苷酸序列的两条DNA链交换遗传物质。细胞在减数分裂期间利用同源重组，其中同源重组不仅用于使DNA重排以产生一组完全独特的单倍体染色体，而且用于修复损伤的DNA，尤其是用于修复双链断裂。同源重组的机制是本领域技术人员熟知的并且例如已经通过以下描述：Paques和Haber(Paques F,Haber J E.；《微生物学和分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)63:349-404(1999))。在本文所述的方法中，同源重组是通过分别位于所述供体DNA序列的上游(5')和下游(3')的所述第一侧接元件和所述第二侧接元件的存在来实现，所述侧接元件各自与所述靶序列内的连续DNA序列同源。

如本文所用，术语“非同源末端连接”(NEHJ)是指通过很大程度上独立于同源性的过程将双链断裂(DSB)的两个末端连接的细胞过程。天然存在的DSB是在DNA合成期间(此时复制叉遇到损伤的模板)以及在某些特殊的细胞过程期间(包含V(D)J重组、免疫球蛋白重链(IgH)基因座处发生的类别转换重组，和减数分裂)自发地产生。另外，细胞暴露于电离辐射(X射线和γ射线)、UV光、拓扑异构酶毒物或放射模拟药物会产生DSB。NHEJ(非同源末端连接)途径通过很大程度上独立于同源性的过程连接DSB的两个末端。根据在DSB处产生的特定序列和化学修饰，NHEJ可以是精确的或诱变的(Lieber M R.,非同源DNA末端连接途径修复双链DNA断裂的机制(The mechanism of double-strand DNA break repair by thenonhomologous DNA end-joining pathway.)《生物化学年度评论(Annu Rev Biochem)》79:181-211)。

如本文所用，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指为了通过同源重组引入到基因座中而设计的核酸。供体核酸将通常具有与基因座序列同源的至少一个区域。在许多情况下，供体核酸将具有与基因座序列同源的两个区域。这些同源区域可以位于两个末端之一或可以位于供体核酸内部。在许多情况下，期望被引入到细胞中存在的核酸分子中的核酸“插入”区域将位于两个同源区域之间。

细胞培养组合物

可以使用任何数量的细胞培养调配物来制备本文所述的组合物和/或用于本文所述的方法。

细胞培养组合物通常被设计为本质上是模块化的。一种形式是制备基础培养基并将一种或多种补充物添加到基础培养基中以用于特定细胞类型和/或应用。此外，可以将单独的组分(例如，生长因子、细胞因子等)添加到培养基调配物中。因此，在许多情况下，可以针对多种特定用途改进相当通用的基础培养基。

包含在包含哺乳动物细胞培养基的培养基中的组分包含氨基酸、维生素、葡萄糖、缓冲液、盐、矿物质、pH指示剂(例如，酚红)、脂肪酸、甾醇(例如，胆固醇)、蛋白质/肽(例如，血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子、白细胞介素2、激素等)和脂肪酸载体如环糊精。PCT公开WO 2019/055853中阐述了环糊精在培养基中的用途，所述公开的公开内容以通过引用并入本文中。

基础培养基

多年来，已经开发了相当多的基础培养基。基础培养基通常含有用于细胞生长的基本材料。这些包含维生素和矿物质。此外，通常会存在碳源，如葡萄糖，但也可以添加碳源。

在每种情况下，基础培养基通常是基于细胞类型、来源(动物物种)和培养目的设计的。因此，根据这些因素，基础培养基的组成可能会差异很大。

基础培养基的一个实例是DMEM/F-12。此培养基的调配物列于下表2中。当然，这仅是基础培养基的一个实例。

培养基补充物

如本文别处指出的，为了特定目的对基础培养基进行添加。这些对基础的添加通常是为了达到特定的目的。目的包含允许扩增特定细胞类型、优先扩增混合细胞群体中的一种或多种特定细胞类型、增加一种或多种特定细胞类型的扩增速率、增强存在于混合培养物中的一种或多种细胞类型的细胞活力等。

通常将补充物调配为与一种或多种培养基一起使用以允许这些培养基满足至少一个目的。可以包含在培养基补充物中的一些组分包含(1)血清和组织蛋白和提取物(例如，胎牛血清蛋白、牛垂体提取物)；(2)可以是动物来源(例如，动物组织、奶)、微生物来源(酵母)和/或植物来源(大豆、小麦、大米)的水解产物；(3)生长因子(例如，EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF)；(4)激素(例如，生长激素、胰岛素、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸、雌激素、雄激素、孕酮、催乳素、促卵泡激素、胃泌素释放肽)；(5)载体蛋白(例如，白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等)；(6)脂质和相关分子，如胆固醇、类固醇、脂肪酸(例如，棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、亚油酸酯)、乙醇胺、胆碱、肌醇等；(7)金属(例如，Fe、Zn、Cu、Cr、I、Co、Se、Mn、Mo等)；(8)维生素(例如，脂溶性维生素(A、D、E、K)、水溶性维生素(例如，B₁、B₂、B₆、B₁₂、C、叶酸)；(9)多胺，如腐胺、亚精胺和精胺；(10)还原剂，如2-巯基乙醇、α-硫代甘油、还原型谷胱甘肽；(11)保护剂/去污剂(例如，羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克F-68、吐温80等；(12)粘附因子，如纤连蛋白和层粘连蛋白；以及(13)这些组分的组合。

血清替代物

如本文别处所述，通常期望避免在细胞培养系统中使用动物血清。进一步地，细胞培养基可以调配为不需要用于细胞培养的血清，或者可以以模块化方式调配使得可以将血清替代物添加到培养基中。

已经开发了许多血清替代物。这些包含GIBCO^TM KNOCKOUT^TM血清替代物(KNOCKOUT^TM SR)(赛默飞世尔科技公司，目录号10828010)和CTS^TM免疫细胞SR。

血清替代物可以不含动物来源和/或不含免疫球蛋白。

进一步地，可以调配血清替代物用于培养特定细胞类型(例如，人胚胎干细胞、CD3+T细胞、一种或多种T细胞亚型、B细胞、海拉细胞、293细胞、HEK细胞等)。

脂蛋白补充物

如本文别处所解释的，已经发现通过向细胞组合物中添加脂蛋白补充物可以获得有益的结果。

进一步地，本文呈现的数据证明脂蛋白和脂蛋白颗粒可以充当血清替代物。此类血清替代物的实例是调配的调配物并且以使培养基中存在指定量的以下组分的方式添加到基础培养基中：HDL(0.008g/L)、N-乙酰L半胱氨酸(0.353g/L)、乙醇胺HCl(0.0108g/L)、人白蛋白(21.575g/L)、氯化钾(0.0000216g/L)、亚硒酸钠(0.00000540g/L)、磷酸氢二钠、7H₂O(0.000233g/L)、一盐基磷酸钾(0.0000216g/L)和氯化钠(0.000863g/L)(参见实例1)。如本文所讨论的，HDL可以在此类培养基中被其它脂蛋白颗粒和/或一种或多种脂蛋白(例如，APO-AI和/或APO-AII)替代。

脂蛋白补充物可以呈多种形式，并且可以含有多种不同的组分。此类组分的实例包含一种或多种载脂蛋白(例如，载脂蛋白A(例如，APO-AI、APO-AII、载脂蛋白AIV、载脂蛋白AV)、载脂蛋白B(例如，载脂蛋白B48、载脂蛋白B100)、载脂蛋白C(例如，载脂蛋白CI、载脂蛋白CII、载脂蛋白CIII)、载脂蛋白D、载脂蛋白E(例如，载脂蛋白E-II、载脂蛋白E-IV)、载脂蛋白F、载脂蛋白G和/或载脂蛋白H)。

脂蛋白补充物可以含有从动物(例如，人、狗、猫、黑猩猩、非洲绿猴、鸡等)中获得的脂蛋白颗粒。脂蛋白补充物可以含有在生物体外部产生的脂蛋白颗粒(即合成脂蛋白颗粒)。

用于纯化脂蛋白颗粒的方法是已知的。一种用于纯化LDL颗粒的方法如下。可以如下从300ml的人血浆中分离LDL颗粒。将三ml的100mM EDTA添加到血浆中。然后将混合物在12℃下以41,000x G离心20分钟。丢弃上层白色层，并且将下层转移到新管中。然后将管在12℃下以280,000x G重新离心24小时。混合下层，留下完整的绿色颗粒。然后收集较低的水平并丢弃沉淀物。使用溴化钾(KBr)将收集的LDL血浆的密度调整为1.06。然后将溶液在12℃下以165,000x G离心48小时。最上面的部分含有纯化的LDL颗粒。LDL颗粒在使用前可以在氮气、避光和4℃下保存。

Weibe和Smith(“六种用于分离高密度脂蛋白的方法与使用用于定量血清中胆固醇的参考方法的比较(Six Methods for Isolating High-Density LipoproteinCompared with Use of the Reference Method for Quantifying Cholesterol inSerum)”《临床化学(Clin.Chem.)》31:746-750(1985))描述和比较用于从血清中获得HDL颗粒的多种不同方法。

脂蛋白颗粒也可以从商业来源获得。作为实例，人血中的HDL和LDL颗粒可以购自Lee Biosolutions公司(分别为目录号361-10-0.1和360-10-0.1)、ProSpec-TanyTechnoGene有限公司(分别为目录号PRO-559和PRO-562)。

已经开发了多种方法来产生合成脂蛋白颗粒。一种此类方法在以下中阐述：Tang等人,“载脂蛋白A-I肽的施用途径和脂化对药代动力学和胆固醇动员的影响(Influenceof route of administration and lipidation of apolipoprotein A-I peptide onpharmacokinetics and cholesterol mobilization)”《脂质研究杂志(J.Lipid Res.)》,58:124-136(2017)。本文采用薄膜水化法合成HDL颗粒。简言之，将磷脂1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)以20mg/ml溶解在氯仿中。将APO-AI模拟肽22A、PVLDLFRELLNELLEALKQKLK(SEQ ID NO:3)以10mg/ml溶解在甲醇:水(1:1体积比)中。将DPPC、POPC和22A以不同的重量比混合在4ml的玻璃小瓶中，并涡旋5秒。然后将混合物通过氮气流干燥，并且然后放置于真空烘箱中过夜以除去残留溶剂。所得脂质膜用PBS(pH 7.4)(最终浓度为22A＝15mg/ml)水合并涡旋。将悬浮液在水浴超声仪中均质化5分钟，并且然后用探头超声仪间歇性(50W×10S×12个循环)均质化以形成透明或半透明的22A-sHDL溶液。

还开发了用于产生合成LDL(sLDL)的方法(参见例如，Hayavi和Halbert,“合成低密度脂蛋白，一种用于无血清组织培养的新型仿生脂质补充物(Synthetic Low-DensityLipoprotein,a Novel Biomimetic Lipid Supplement for Serum-Free TissueCulture)”《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》21:1262-1268(2005))。在一种此类方法中，将摩尔比为3:2:1的磷脂酰胆碱、三油酸甘油酯和胆固醇油酸酯溶解在混合物二氯甲烷和胆固醇以及具有以下N端到C端序列的合成肽中：视黄酸–Leu-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-胆固醇(SEQ ID NO:4)或视黄酸–Gly-Thr-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu(SEQ ID NO:5)。这些肽以不同摩尔浓度/摩尔与胆固醇油酸酯混合。然后将二氯甲烷添加到油酸钠水溶液中，并在4℃下使用EmusiFlex-C5微流化器(加拿大奥维斯汀公司(Avestin,Canada))在至多30,000psi的压力下混合。然后在室温下通过蒸发除去混合物的有机溶剂组分。

还使用以下比率的对应胆固醇酯和甘油三酯、油酸(21:41)/亚油酸(50:15)/棕榈酸(12:25)/花生四烯酸(6:1.3)/硬脂酸(0:5.7)而不是纯胆固醇油酸酯和三油酸甘油酯和视黄酸–Leu-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-胆固醇(SEQ ID NO:4)以0.03mol/mol胆固醇酯如上所述制备混合sLDL(sLDL(混合))脂肪酸系统。

可以添加到培养基组合物中的载脂蛋白模拟肽包括表3所示的一种或多种肽。进一步地，还可以将包括此类肽的蛋白质以及其它载脂蛋白模拟肽添加到培养基组合物中。此类蛋白质的大小可以大于表3所示的肽的大小，并且可以此类蛋白质的长度可以为例如约15到约250(例如，约15到约250、约20到约250、约30到约250、约40到约250、约60到约250、约20到约200、约20到约150、约30到约120等)个氨基酸。进一步地，载脂蛋白模拟蛋白可以包括表3所示的一种或多种肽以及其它载脂蛋白模拟肽的多联体(参见表4)。

当肽和蛋白质用于培养基中时，这些分子可以通过如化学合成等方法产生或重组产生。当期望无动物来源的细胞培养时，这将是特别期望的。

重组蛋白的产生是本领域众所周知的。进一步地，重组蛋白可以存在于非动物来源的细胞中。

在一些实施例中，宿主细胞是非动物细胞，如植物细胞。在培养中容易生长的植物细胞的实例包含拟南(Arabidopsis thaliana)(水芹(cress))、蒜(Allium sativum)(大蒜(garlic))、红豆杉(Taxus chinensis)、紫杉(T.cuspidata)、欧洲紫杉(T.baccata)、短叶红豆杉(T.brevifolia)和台湾红豆杉(T.mairei)(红豆杉(yew))、长春花(Catharanthusroseus)(小长春花(periwinkle))、本氏烟(茄科)、烟草(N tabacum)(烟草(tobacco))，包含烟草细胞系如NT-1或BY-2(NT-1细胞可从ATCC获得，目录号74840，还参见美国专利第6,140,075号)、水稻(稻米)、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜(cucumber))、甜叶菊(甜叶)、刺毛黎豆(Stizolobium hassjoo)(马齿苋)、柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝稷(switchgrass))和玉米(Zea mays spp.)(玉米(maize)/玉米(corn))。可以用于重组蛋白产生的另外的宿主细胞的实例包含以下属中的生物体：曲霉菌属(Aspergillus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、镰刀菌属(Fusarium)/赤霉菌属(Gibberella)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、法菲亚属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)。来自此类属的示例性物种包含虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、硫磺菌(Laetiporus sulphureus)、白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、圆酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、黏红酵母(Rhodoturula glutinis)、胶红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)、法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)/藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌(Candida albicans)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

细胞培养

本文提供了用于培养细胞(例如，T细胞)的工作流程、组合物和方法。本文所述的方法被设计用于细胞培养，其中培养的细胞表现出快速的分裂时间高水平的细胞活力。在许多情况下，此类方法可以涉及使用一种或多种脂蛋白补充物培养细胞(例如，哺乳动物细胞)。

如本文别处指出的，细胞通常在补充的基础培养基中培养。许多组分可以添加到基础培养基中以允许或增强培养基中存在的一种或多种细胞类型的扩增。这些组分包含维生素、矿物质、脂质、生长因子和细胞因子。

期望使用不含血清且不含动物来源材料的细胞培养基。“无动物来源”意指没有组分不是从动物或动物细胞中获得的。因此，例如在酵母细胞中产生的重组表达的人蛋白质被认为是无动物来源的，即使它是人蛋白质。本文提供了允许在不包含血清(例如，人血清、牛血清等)的情况下有效扩增动物细胞(例如，哺乳动物细胞)的组合物和方法。此外，本文提供了允许有效扩增动物细胞(例如，哺乳动物细胞)的无动物组合物和与其相关的方法。

在许多情况下，可以在添加细胞之前、期间和/或之后将一种或多种脂蛋白补充物添加到细胞培养基中。进一步地，可以在细胞扩增过程期间从细胞培养基中去除一种或多种脂蛋白补充物。

图4示出了T细胞在不同培养基以及还含有不同组分的不同培养基中扩增的数据。CTSOPTMIZER^TM与ICSR(完全CTS OPTMIZER^TM)的T细胞扩增水平最低。用具有5％人血清X-VIVO^TM发现了下一个最低水平的T细胞扩增。在没有ICSR的情况下，使用具有8mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM发现了最高水平的T细胞扩增，并且两个HDL添加数据集的结果类似。

图5示出了与图4(5)所示的数据相关的T细胞活力％的数据。除了一个例外，所有样品中和所有时间点处的活细胞％都类似。此例外适用于使用ICSR样品对CTS OPTMIZER^TM进行的第5天测量。

图4和5所示的数据证明脂蛋白补充物(例如，HDL)可以用作血清替代物。进一步地，脂蛋白补充物(例如，8mg/L HDL)可以调配为在培养基中产生比血清(例如，人血清)或血清替代物(例如，ICSR)更高的扩增水平，并在扩增过程期间将细胞维持在更高水平的活力下。

添加到组合物中并用于本文所述的方法中的脂蛋白补充物可以含有本文所述的任何数量的组分或组分的组合。在许多情况下，脂蛋白补充物将含有至少一种脂蛋白的全部部分。

进一步地，脂蛋白补充物可以完全是动物来源的，部分是动物来源的，或不含动物来源的。例如，脂蛋白补充物可以含有一种或多种类型的脂蛋白颗粒。进一步地，此类脂蛋白颗粒可以源自天然来源(例如，哺乳动物的血液)或合成产生。

可以将脂蛋白补充物添加到培养基中以产生培养基中的脂蛋白补充物的组分的最终量。例如，可以将脂蛋白补充物添加到培养基中以产生约0.1mg/L到约500mg/L(例如，约0.2mg/L到约15mg/L、约0.1mg/L到约10mg/L、约0.1mg/L到约3mg/L、约1mg/L到约450mg/L、约1mg/L到约400mg/L、约1mg/L到约350mg/L、约1mg/L到约300mg/L、约1mg/L到约250mg/L、约1mg/L到约200mg/L、约1mg/L到约150mg/L、约1mg/L到约100mg/L、约1mg/L到约50mg/L、约1mg/L到约30mg/L、约1mg/L到约20mg/L、约1mg/L到约15mg/L、约1mg/L到约10mg/L、约3mg/L到约20mg/L、约3mg/L到约15mg/L、约5mg/L到约20mg/L、约5mg/L到约12mg/L等)的最终组分浓度。

进一步地，脂蛋白补充物可以以产生特定生长特性的量添加到培养基中。例如，脂蛋白补充物的添加量可以在设定的时间点处产生等于或高于具有ICSR的CTS OPTMIZER^TM(完全CTS OPTMIZER^TM)的T细胞扩增量。可以测量的其它生长特性是活力％和一种或多种T细胞亚型的流行率。进一步地，设定时间点可以是在存在脂蛋白补充物的情况下开始扩增之后的三、四、五、六、七或十天。

作为实例，可以如下进行性能比较。可以使用具有ICSR的CTS OPTMIZER^TM和具有不同量的脂蛋白补充物(例如，纯化的载脂蛋白、HDL、LDL等)的CTS OPTMIZER^TM测试来自四个不同供体的T细胞。在时间为零时，将活化的T细胞(参见实例1)以1×10⁶个细胞/孔的G-REX^TM板接种100U/ml的IL-2。然后将T细胞放置于37℃培养箱中。然后在设定的时间点处比较T细胞样品的所关注特性。例如，如果所关注的特性是第五天的扩增倍数并且获得了表5所示的数据，则来自四个供体的数据表明扩增倍数的增加具有统计学意义，并且与具有ICSR样品的CTS OPTMIZER^TM相比，具有不同量的脂蛋白补充物样品的CTSOPTMIZER^TM的扩增倍数增加为3.5。这表示增加了29％。

在许多情况下，将添加到培养基中的脂蛋白补充物的量等于血清替代物的性能或超过血清替代物的性能(例如，超过约5％到约100％、约5％到约90％、约5％到约80％、约5％到约70％、约10％到约100％、约20％到约100％等)。

脂蛋白补充物组分可以包括单一蛋白质(或肽)、蛋白质混合物、蛋白质片段、蛋白质片段混合物和/或一种或多种脂蛋白颗粒。例如，脂蛋白补充物组分可以包括脂蛋白颗粒，如HDL或LDL。进一步地，可以将HDL和LDL脂蛋白颗粒都添加到培养基中。当这样做时，这些脂蛋白颗粒之一或两者组合的浓度可以在上述范围内或可以在约1mg/L到约30mg/L(例如，约1mg/L到约18mg/L、约1mg/L到约15mg/L、约1mg/L到约10mg/L、约2mg/L到约13mg/L，约3mg/L到约15mg/L，约5mg/L到约12mg/L等)的范围内。进一步地，添加到培养基中的两种脂蛋白颗粒的比率也可能不同。例如，HDL:LDL的比率可以从约10:1到约1:10(例如，从约10:1到约1:10、从约5:1到约1:10、从约1:1到约1:10、从约10:1到约1:5、从约10:1到约1:1等)变化。当然，其它脂蛋白颗粒也可以添加到培养基中。此类脂蛋白颗粒可以从天然来源(例如，人血)获得和/或可以是合成的。

结合图6和表14所述的数据表明CD8+T细胞在具有8mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM中优先扩增。结合图7和表15所示的数据表明CD27 T细胞在具有8mg/L HDL的CTSOPTMIZER^TM中优先扩增，并且CD62L T细胞不优先扩增。

本文阐述了用于扩增T细胞的组合物和方法。在一些情况下，这种扩增将导致产生T细胞群体，其中两种或更多种T细胞亚型在扩增前和扩增后以基本上相同的比率(即在约10％内)存在。在一些情况下，这种扩增将导致T细胞群体的产生，其中两种或更多种T细胞亚型在扩增前和扩增后以不同的相同比率(即，大于约10％，如约11％到约200％、约11％到约90％、约11％到约75％、约30％到约200％、约30％到约100％等)存在。进一步地，此类T细胞亚型包含CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD27+T细胞、CD62L+T细胞和CCR7+T细胞。

如表16-20中的数据所示，单独脂蛋白也可以作为血清替代物添加到培养基中。表16和20所示的数据表明APO-AI和APO-AII充当ICSR的替代物。

从表16-20中的数据可以看出，APO-AI和APO-AII可以支持T细胞扩增和高水平的细胞活力两者。这些数据表明载脂蛋白可以充当血清替代物。因此，本文提供了组合物和方法，其中一种或多种载脂蛋白(例如，约一到约十、约二到约十、约三到约十、约一到约四、约二到约五等)和/或其子部分包含在培养基中。

电穿孔

本文提供了用于对细胞进行电穿孔的组合物和方法。具体地，本文提供的组合物和方法允许对细胞进行电穿孔，从而产生电穿孔后高细胞活力。

在与细胞膜对电场脉冲的响应相关的机械理论方面已经进行了大量工作，电场脉冲迅速增加细胞膜的跨膜电压Um(t)到细胞膜孔隙率急剧上升的值(参见Weaver等人,《生物电化学(Bioelectrochemistry)》87:236-243(2012))。膜孔隙率的变化被认为是由孔形成引起的。

用于电穿孔的大电场脉冲可以通过加热或不加热是主要原因来杀死细胞。两种非热杀伤机制被认为是通过诱导细胞凋亡或坏死。进一步地，据信高强度电场细胞杀伤更多是通过细胞凋亡，而低强度电场细胞杀伤被认为更多是通过坏死。因此，无论细胞死亡机制如何，通常需要调整电场条件使得维持高细胞活力。

可以使用具有不同“间隙”大小的电穿孔比色皿。“间隙”是电流通过的空间。间隙大小可以为约0.1mm到约15mm(例如，约0.5mm到约15mm、约1mm到约15mm、约2mm到约15mm、约2mm到约10mm、约2mm到约8mm、约3mm到约6mm等)。在许多情况下，约4mm的间隙大小将用于动物细胞电穿孔。

在电穿孔期间施加到细胞的电压量可能变化很大，并且可能从约200伏(V)到约1,500V(例如，从约200V到约1,500V、从约200V到约1,500V、从约250V到约1,500V、从约350V到约1,500V、从约300V到约1,500V、从约400V到约1,500V、从约500V到约1,500V、从约600V到约1,500V、从约200V到约1,000V、从约225V到约900V、从约250V到约900V、从约250V到约800V、从约300V到约750V、从约300V到约650V等)。

进一步地，电压可以在多种脉冲持续时间内施加。此类持续时间可以为约1纳秒到约1秒(例如，约150纳秒到约1秒，约250纳秒到约1秒，约300纳秒到约1秒，约500纳秒到约800秒，约1微秒到约1秒，约100微秒到约1秒、约1微秒到约800微秒、约1微秒到约600微秒、约1微秒到约500微秒、约1微秒到约400微秒、约1微秒到约300微秒、约100微秒到约700微秒、约200微秒到约600微秒等)。

当使用超过一个脉冲时，脉冲的数量也可以变化并且可以是约1到约500(例如，约2到约500、约10到约500、约20到约500、约30到约500、约10到约250、约10到约200、约10到约170、约10到约150、约25到约250、约25到约200、约25到约150等)个脉冲。

已经发现，在电穿孔之前用脂蛋白补充物温育细胞可以有利地调节电穿孔对细胞活力的影响。因此，本文阐述了组合物和方法，其中细胞与脂蛋白补充物接触持续一定时间段，然后电穿孔。

图8和9示出了如实例2中所述产生的数据。T细胞在具有6mg/L HDL的CTSOPTMIZER^TM或具有ICSR的CTS OPTMIZER^TM中扩增持续三天然后在第4天测量细胞活力。如可以看出的，在电穿孔之前T细胞用6mg/L HDL进行了三天的扩增的样品比在ICSR中T细胞进行了三天的扩增的样品表现出显著更高的活力水平。从图8和表21可以看出，在两种扩增条件之间的第4天，T细胞活力增加的范围为20.23和36.21，其中在具有6mg/LHDL的CTSOPTMIZER^TM中扩增的T细胞的平均T细胞活力为70.50，在具有ICSR的CTSOPTMIZER^TM中扩增的T细胞的平均T细胞活力为49.26。

图11和12示出了T细胞在具有6mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM或具有ICSR的CTSOPTMIZER^TM中扩增持续三天的电穿孔效率的数据。除一个供体样品外，所有T细胞均表现出更高的电穿孔效率。

本文提供了用于调节电穿孔对细胞的影响的组合物和方法。在一些方面，在电穿孔之前，细胞与脂蛋白补充物接触持续一定时间段(例如，约1到约6天、约1到约5天、约1到约4天、约1到约3天、约2到约6天、约2到约5天等)。在许多情况下，脂蛋白补充物将存在于培养基中，并且细胞将在预电穿孔期间积极扩增。在一些情况下，在电穿孔之前洗涤细胞，在非培养基溶液(例如，缓冲液)中电穿孔，然后在电穿孔之后重悬于培养基中。在一些情况下，电穿孔后培养基将含有脂蛋白补充物，而在其它情况下，则不会。例如，在一些情况下，T细胞可以在具有6mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM中扩增三天，洗涤并重悬于缓冲液中，然后在缓冲液中电穿孔，然后从缓冲液中分离并重悬于具有ICSR的CTSOPTMIZER^TM中以进行进一步扩增。这个过程基本上就是图8-12所示的天数是如何产生的。

可以添加到培养基中的脂蛋白补充物的量会有所不同。在一些情况下，将使用实例2所示的方法调整量以实现指定的电穿孔效率。电穿孔效率由许多因素(包含细胞类型、细胞的代谢状态、引入到细胞中的核酸分子等)确定。

此外，本文提供了用于提高细胞电穿孔效率的组合物和方法。在许多情况下，细胞将与预电穿孔一起温育的脂蛋白补充物的量如本文别处所述。

可以通过本文所述的方法引入到细胞中的核酸分子包含RNA、DNA和其组合(RNA/DNA杂交体)。此类核酸分子可以设计用于瞬时或稳定表达。可以通过引入具有例如复制起点的核酸分子或被设计为通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的核酸分子(例如，供体核酸分子)来实现稳定表达。

进一步地，引入到细胞中的核酸分子包含单链DNA供体(ssDNA)、平端dsDNA供体(平端)、具有5'突出端(5')的dsDNA供体和/或具有3'突出端(3')的dsDNA供体。

引入到细胞中的核酸分子可以编码一种或多种嵌合抗原受体。

嵌合抗原受体(CAR)可以具有任何数量的结构并且可以设计用于任何数量的目的。许多CAR将胞外抗原识别结构域与细胞内信号传导结构域连接起来，当抗原结合时，细胞内信号传导结构域会活化细胞(例如，T细胞)。CAR通常由三个区域构成：胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。

胞外结构域是CAR暴露在细胞外部的区域，并且可以与潜在的靶分子相互作用。跨膜结构域通常由跨越细胞膜的疏水区域组成(例如，人CD28跨膜结构域)。细胞内结构域(例如，CD3-ζ的胞质结构域)是受体的可以将信号“传输”到细胞内部的内部胞质末端。

细胞维持

已经发现，在与脂蛋白补充物温育之后，细胞被电穿孔，并与脂蛋白补充物维持接触，细胞在一定时间段内维持高活力，但表现出降低的扩增率。

图14和15所示的数据是使用在指定培养基中扩增的T细胞产生的。然后在第3天对这些T细胞进行电穿孔。然后将所有样品中的T细胞维持在指定的培养基中。图14示出的数据示出，当T细胞在存在指定的脂蛋白补充物的情况下扩增，然后电穿孔并各自维持在其原始培养基中时，当存在脂蛋白补充物时细胞活力保持为高。图15示出的数据表明，当T细胞在存在脂蛋白颗粒(HDL以及HDL和LDL的组合)的情况下电穿孔，然后与脂蛋白颗粒接触时，扩增减少。因此，本文提供了用于降低细胞扩增速率同时维持高细胞活力的组合物和方法。

在许多情况下，不断扩增的哺乳动物细胞群体会继续扩增并表现出活力下降的条件，从而导致细胞分裂减少。已经观察到，当细胞首先在存在脂蛋白补充物的情况下扩增，然后放置于电场中时，可以将核酸引入到细胞中，其中细胞活力的损失水平相对较低。进一步地，当此类细胞维持在含有脂蛋白补充物的培养基中时，这些细胞继续维持高水平的细胞活力，同时表现出降低的细胞扩增。因此，本文提供的组合物和方法允许哺乳动物细胞的扩增，随后维持具有低扩增水平但具有高细胞活力的细胞。此类组合物和方法可用于储存细胞。

本文提供了用于储存哺乳动物细胞的方法。此类方法包含那些包括以下步骤的方法。首先，哺乳动物细胞在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增一定时间段(例如，约1天到约10天、约2天到约10天、约3天到约10天、约1天到约8天、约1天到约7天、约1天到约5天、约1天到约4天、约2天到约4天等)。然后哺乳动物细胞使哺乳动物细胞暴露于电场。暴露于电场之后，将细胞维持在适合哺乳动物细胞在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增的条件下。已经发现，可以调整上述过程的条件，使得哺乳动物细胞表现出低水平的扩增，同时维持高水平的细胞活力(参见图14和15)。

制备用于储存并在本文所述的条件下储存的细胞可以是任何数量的不同细胞类型，包含工程化细胞，如T细胞。这些细胞在储存期间可以在37℃下储存，并且可以维持储存，同时保持高水平的细胞活力至少24天(例如，约5天到约24天、约5天到约20天、约5天到约18天、约5天到约15天、约5天到约12天、约5天到约10天、约5天到约7天、约1天到约10天、约3天到约7天、约2天到约8天等)。

进一步地，在储存期结束时，可以洗涤细胞以去除一种或多种脂蛋白化合物，并且然后与不含足够数量的一种或多种脂蛋白化合物以抑制细胞扩增的培养基接触。

可以通过此类方法储存的细胞包含工程化T细胞。T细胞储存方法可以用于将细胞(例如，T细胞，如工程化T细胞)从一个位置运输到另一个位置。

T细胞

任何数量的不同类型的T细胞可以存在于组合物中并且用于本文所述的方法中。这些T细胞中的一些T细胞如下：

原初T细胞通常通过以下表征：L-选择素(CD62L)和C-C趋化因子受体7型(CCR7)的表面表达；不存在活化标志物CD25、CD44或CD69；并且不存在记忆CD45RO同种型。

Th17细胞：T辅助17细胞(或“Th17细胞”或“Th17辅助细胞”)是被认为调节宿主防御的CD4+T辅助细胞的炎性子群，并且涉及组织炎症和某些自身免疫疾病。已经发现，当过继转移到荷瘤小鼠中时，Th17细胞在根除黑色素瘤方面比Th1或非极化(ThO)更有效。Th17细胞的表型是CD3+、CD4+、CD161+。

记忆T细胞：记忆T细胞(也被称为“经历过抗原处理的细胞”)之前经历过遇到抗原。这些T细胞寿命长，可以识别抗原，并且可以快速、强烈地影响对它们之前接触过的抗原的免疫应答。记忆T细胞可以包含：干记忆细胞(TSCM)、中枢记忆细胞(TCM)、效应记忆(TEM)。TSCM细胞具有表型CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Ra+，但它们也表达大量的IL-2R、CXCR3和LFA-1。TCM细胞表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但是不分泌IFN-γ或IL-4。TEM细胞不表达L-选择素或CCR7，但会产生细胞因子，如IFN-γ和IL-4。

记忆T细胞亚型：中枢记忆T细胞(TCM细胞)表达CD45RO、C-C趋化因子受体7型(CCR7)和L-选择素(CD62L)。中枢记忆T细胞表达中等到高水平的CD44。这种记忆亚群通常见于淋巴结以及外周循环中。

组织常驻记忆T细胞(TRM)占据组织(皮肤、肺、胃肠道等)，通常无需循环。据信这些细胞在针对病原体的保护性免疫中起作用。在各种自身免疫疾病中已经牵涉到功能失常的TRM细胞。

虚拟记忆T细胞与其它记忆子群的区别在于，它们似乎不是在强烈的克隆扩增事件后起源的。总体而言，此群体在外周循环中通常很丰富。

治疗方法

在一些方面中，本文提供了治疗有需要的受试者的疾病的方法。此类方法包含向受试者施用通过本文提供的方法获得或产生的细胞(例如，T细胞、NK细胞等)，或此类细胞的后代。

作为实例，对嵌合抗原受体(CAR)进行编码的核酸分子可以被引入到T细胞中以产生CAR-T细胞。然后将这些CAR-T细胞扩增以产生CAR-T细胞药物。然后可以通过抗体与CD3和CD28细胞表面受体的结合来介导T细胞活化。

任何数量的细胞类型(例如，自然杀伤(NK)细胞)都可以用于治疗方法。

NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，所述细胞毒性淋巴细胞构成先天免疫系统的主要组分，并且在响应细胞信号(如干扰素和巨噬细胞衍生的细胞因子)时被活化。NK细胞的细胞毒性活性主要由两种类型的表面受体调节，所述两种类型的表面受体可以被视为“激活受体”或“抑制受体”，但是一些受体例如CD94和2B4(CD244)根据配体相互作用以任何方式工作。

可以例如使用针对CD56和CD3的抗体分离或富集NK细胞，并选择CD56⁺CD3^-细胞。因此，可以对CD3^-细胞进行阴性选择，随后对CD56⁺细胞进行阳性选择。尽管两种选择都可以使用与细胞表面标志物具有结合特异性的抗体结合的固体载体进行，但NK细胞释放仅需要通过阳性选择步骤(即基于CD56⁺的细胞纯化)介导。

作为实例，NK细胞在宿主对肿瘤的排斥中发挥作用，并且已被示出能够杀伤病毒感染的细胞。因此，NK细胞可以用于治疗病毒感染。此外，NK细胞(例如，活化的NK细胞)可以用于癌症的离体疗法和体内治疗两者。

使用CD8+T细胞的非限制性实例(例如，包括增加的CD8+T细胞比例的T细胞扩增群体或从此类扩增群体中分离的CD8+T细胞)包含：基于病毒特异性T细胞用于治疗免疫抑制的移植患者的免疫疗法(如用于巨细胞病毒(CMV)感染和艾普斯登－巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染)。参见例如Heslop等人(2010)《血液》115(5):925-35。另外的非限制性实例包含使用CAR-T和其它模式的工程化病毒特异性T细胞来治疗癌症和感染性疾病。参见例如Pule等人(2008)《自然医学(Nature Medicine)》115(5):925-35和Ghazi等人(2013)《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》35(2):159-168。使用CD4+T细胞的非限制性实例(例如，包括增加的CD4+T细胞比例的T细胞扩增群体或从此类扩增群体中分离的CD4+T细胞)包含治疗HIV+患者和用于治疗自身免疫的扩增CD4+T辅助子群(例如，T_H1、T_H2、T_H3、T_H17、T_H9或T_FH)和调节性T细胞(Treg：CD4+CD25+FoxP3+)。参见例如Tebas等人(2014)《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》370(10):901-10和Riley等人(2009)《免疫学杂志(Immunity)》30(5):656-665。

在一些实施例中，所述T细胞是CD8+T细胞。在实施例中，所述T细胞是CD4+T细胞。

在一些实施例中，基于分化阶段分离T细胞。可以基于存在或不存在某些细胞标志物或蛋白质来评估T细胞群体的分化阶段。用于评估T细胞分化阶段的标志物包含：CD3、CD4、CD5、CD8、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD25、CD27、CD33、CD34、CD45、CD45RA、CD45RB、CD56、CD62L、CD123、CD127、CD278、CD335、CD11a、CD45RO、CD57、CD58、CD69、CD95、CD103、CD161、CCR7，以及转录因子FOXP3。

在实施例中，一旦已经从患者或动物中分离出合适的细胞群体(例如，T细胞群体、B细胞群体等)或亚群，在使用本文阐述的组合物和方法扩增所得的细胞群体之前，可以任选地进行遗传或任何其它合适的修饰或操纵。操纵可以例如采取用抗CD3和抗CD28抗体刺激/重新刺激T细胞以使其活化/重新活化的形式。

在实施例中，可能期望向受试者施用活化的细胞(例如，T细胞、NK细胞等)，并且随后根据本文所提供的方法重新抽血(或进行单采血液成分术)、从中活化和扩增细胞并且向患者重新输注这些活化的和扩增的细胞。

在实施例中，根据本文所提供的方法生成的T细胞亚群可以具有许多潜在使用，包含实验和治疗使用。在实施例中，从患者体内去除少量T细胞，然后在将其重新注入患者体内之前对其进行离体操作和扩增。可以以此方式治疗的疾病的非限制性实例是自身免疫疾病和期望抑制免疫活性(例如，对于同种异体移植耐受性)的病状。在实施例中，治疗方法包括提供哺乳动物，并从含有T细胞的哺乳动物中获得生物学样品；以及根据本文所提供的方法离体扩增/激活T细胞；以及向待治疗的哺乳动物施用扩增的/活化的T细胞。在实施例中，第一哺乳动物和待治疗的哺乳动物可以相同或不同。在实施例中，哺乳动物通常可以是任何哺乳动物，如猫、狗、兔子、马、猪、牛、山羊、绵羊、猴子或人。在实施例中，第一哺乳动物(“供体”)可以是同基因的、同种异体的或异种异体的。

在实施例中，使用本文所提供的组合物和方法产生的T细胞亚群可以用于多种应用和治疗方式。在实施例中，T细胞亚群可以用于治疗疾病状态，包含但不限于癌症、自身免疫疾病、过敏性疾病、炎性疾病、感染性疾病以及移植物抗宿主疾病(GVHD)。在实施例中，T细胞疗法包含在免疫耗竭之后或不在免疫耗竭之后通过本文所提供的方法向受试者输注外部扩增的T细胞亚群，或向受试者输注已从供体受试者分离的外部扩增的异源T细胞(例如，过继性细胞转移)。

在实施例中，当T细胞是CAR-T细胞时，抗原结合部分的选择可以取决于要治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域已知的，并且包含例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、α-胎甲球蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RUL RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、蛋白质(prostein)、PSMA、HER2/神经鞘、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF-1)、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

混合的T细胞群体的来源的实例

在实施例中，混合的T细胞群的起始来源是可以从受试者分离的血液(例如，循环血液)。在实施例中，可以从一种或多种单位血液或通过单采血液成分术或白细胞去除术获得循环血液。在实施例中，单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞、干细胞(例如，诱导多能干细胞)和血小板。可以从多种来源获得T细胞以及其它细胞，包含(但不限于)血液单核细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、淋巴结组织、肠道相关淋巴样组织、黏膜相关淋巴样组织、脾脏组织或任何其它淋巴组织和肿瘤。可以从T细胞系以及自体的或同种异体来源获得T细胞。还可以从异种异体来源，例如，从小鼠、大鼠、非人灵长类和猪获得T细胞。

在实施例中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术(如FICOLLTM分离)从采集自受试者的单位血液中获得T细胞。可以从受试者的循环血液中分离T细胞。在实施例中，可以通过单采血液成分术或白细胞去除术从受试者获得血液。在实施例中，单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、PBMC、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在实施例中，在暴露于致敏组合物以及随后的活化和/或刺激之前，从受试者获得T细胞来源。在实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞置于适合的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在本文阐述的实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在实施例中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域的普通技术人员将容易理解的，可以通过本领域的技术人员已知的方法来完成洗涤步骤，如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，

2991细胞处理器，巴克斯特公司(Baxter))。在实施例中，在洗涤之后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如无钙(Ca)、无镁(Mg)的PBS。在实施例中，可以去除单采血液成分术样品的不期望组分，并且细胞直接重悬于培养基中。

在实施例中，通过裂解或去除红细胞并消耗单核细胞(例如，通过PERCOLL^TM梯度离心)从外周血淋巴细胞中分离T细胞。在实施例中，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群。

在实施例中，可以为CD3+细胞阳性选择T细胞。可以使用本领域的技术人员已知的任何选择技术。一个非限制性实例是流式细胞分选。在另一个实施例中，可以通过与抗CD3珠温育来分离T细胞。一个非限制性实例是抗CD3/抗CD28缀合珠粒，如CTSTM

CD3/CD28(生命技术公司(Life Technologies Corp.)，目录号11141D)，持续足够的时间段用于期望的T细胞的阳性选择。在实施例中，时间段从30分钟到36小时或更长时间，以及其之间的所有整数值。在实施例中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个实施例中，时间段是10到24小时。在实施例中，温育时间段是24小时。较长的温育时间(如24小时)可以提高细胞产量。在实施例中，在与其它细胞类型相比T细胞很少的任何情况下，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。在实施例中，可以通过针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种可能的方法是通过磁免疫细胞粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述方法使用直接针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。在实施例中，由于供体细胞的可变性，扩增倍数可以基于起始材料而不同。在实施例中，正常起始密度可以介于约0.5×10⁶到约1.5×10⁶之间。

在一些实施例中，可以基于是否存在一种或多种标志物通过选择来生成T细胞亚群。例如，可以基于对CD4+、CD25+、CD127neg/low和任选地，FOXP3+的细胞的选择从混合群体中获得Treg细胞。在实施例中，Treg细胞可以是FOXP3-。在此实例中，选择实际上是指基于一个或多个可定义的特性来“选择”细胞。进一步地，选择可以是阴性的或阳性的，因为它可以针对具有一种或多种特性(阳性)的细胞，或者对于不具有一种或多种特性(阴性)的细胞。

关于Treg细胞，出于说明的目的，可以通过这些细胞与具有附着在其上与CD4和/或CD25结合的抗体的表面(例如，磁珠)结合以及非Treg细胞与具有附着在其上结合CD127的抗体的表面(例如，磁珠)结合而从混合群体中获得这些细胞。作为具体实例，可以将结合有与CD3结合的抗体的磁珠用于分离CD3+细胞。一旦释放，然后可以使获得的CD3+细胞与结合有与CD4结合的抗体的磁珠接触。然后可以使所得的CD3+、CD4+细胞与结合有与CD25结合的抗体的磁珠接触。然后可以使所得的CD3+、CD4+、CD25+细胞与结合有与CD127结合的抗体的磁珠接触，其中收集的细胞是不与珠结合的细胞。

在实施例中，可以同时使用多种特性以获得T细胞亚群(例如，Treg细胞)。例如，还可以使用含有结合有两个或多个细胞表面标志物的抗体的表面。作为具体实例，可以通过将这些细胞与具有附着到其上的与CD4和CD25结合的抗体的表面结合而从这些细胞的混合群体中获得CD4+、CD25+细胞。同时选择多个特性可能会导致大量不期望的细胞类型与所期望的细胞类型“共同纯化”。这是因为，使用上述具体实例，除了CD4+、CD25+细胞之外，还可以获得CD4+、CD25-和CD4-、CD25+的细胞。

本文包含用于获得一个或多个T细胞亚群的成员的方法，其中所述T细胞亚群的成员通过具体特性来鉴定并且与具有不同于这些特性的细胞分离。可以用于本文阐述的方法的特性的实例包含存在或不存在以下蛋白质：CD3、CD4、CD5、CD8、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD25、CD27、CD33、CD34、CD45、CD45RA、CD56、CD62L、CD123、CD127、CD278、CD335、CCR7、K562P、K562CD19和FOXP3。

CAR-T细胞

还提供了用于产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)的组合物和方法。嵌合抗原受体(CAR)是被设计成提供指定的免疫细胞的工程化的受体。受体之所以称为嵌合体，是因为它们由不同来源的部分构成。

在许多情况下，CAR-T细胞表达将抗原结合和T细胞活化功能组合的重组受体。通常，CAR含有三个区域：胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。

胞外结构域是受体的暴露于细胞外部的区域，并且通常含有三个区域：信号肽、抗原识别区域和间隔子。信号肽有助于将CAR整合到细胞膜中。CAR的抗原识别区域通常是单链可变抗体片段(例如，对CD19受体具有结合活性的抗体片段)。跨膜结构域(例如，CD28跨膜结构域)通常是跨T细胞的细胞膜的疏水区域，并允许由胞外结构域接收的信号通过而被传输到T细胞的内部。在抗原识别之后，受体聚簇，并且信号被传输到细胞内结构域。

编码CAR的核酸分子可以以多种形式构造，并且可以通过多种方法引入T细胞。CAR编码区通常将可操作地连接到表达控制序列，如启动子(例如，CMV启动子)。进一步地，这些核酸分子通常将存在于核酸载体(例如，克隆载体)中，所述核酸载体含有如用于调节的元件、翻译终止子和一种或多种可选择标志物等组件。

用于治疗有需要的受试者或患者的一种方法是使用扩增的T细胞并基因修饰T细胞以靶向通过CAR的表达在肿瘤细胞上表达的抗原。在许多情况下，将编码蛋白质(如CAR)的核酸分子引入T细胞，然后扩增工程化的T细胞。

在利用CAR的治疗中，免疫细胞可以从患者血液或其它组织收集。如下所述使T细胞工程化以在其表面上表达CAR，从而允许它们识别特异性抗原(例如，肿瘤抗原)。这些CAR-T细胞然后可以通过本文阐述的方法来扩增并输注到患者体内。在患者输注之后，T细胞将继续扩增并表达CAR，从而允许针对携带工程化CAR以识别特异性抗原的细胞进行免疫应答。

本文还提供了工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR-T细胞表现出抗肿瘤性质。CAR可以被设计成包括胞外结构域，所述胞外结构域具有与T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域。当在T细胞中表达时，CAR能够根据抗原结合特异性重定向抗原识别。

CAR的抗原结合部分包括靶标特异性结合元件，另外称为抗原结合部分。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，CAR的抗原部分结构域包含与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。

编码CAR的天然或合成核酸的表达通常是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接到启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现的。载体可以适合于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有用于调节所希望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、初始序列、和启动子。

可以将核酸克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到以下载体中，这些载体包含但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒、和粘粒。特别感兴趣的载体包含表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且例如在Sambrook等人,(2001,《分子克隆：实验室手册》,纽约冷泉港实验室)以及其它病毒学和分子生物学手册中描述。用作载体的病毒包含但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中有复制功能的起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。

已经开发了多种基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中，并且包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并递送到受试者的细胞中(体内或离体)。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。

另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎各元件可以协同或独立地起作用以活化转录。制备CAR-T细胞的方法是本领域已知的(参见例如美国专利8,906,682)。

细胞活力

许多用于确定细胞活力的方法是已知的。此类方法可以基于检测(1)活的或死的或(2)活跃增殖的细胞。当研究细胞群体时，细胞活力通常以百分比或比率表达。例如，如果使用基于台盼蓝染料的测定来区分活细胞和非活细胞，其中群体大小为100个细胞，并且40个细胞被这种染料染色并且60个细胞没有被这种染料染色，那么60％的细胞是活细胞，并且非活细胞与活细胞的比率为1:1.5。

细胞活力测定可以分为许多类别，包含以下

膜破坏测定：这些测定基于细胞不能保留细胞组分和/或将物质保留在细胞外。可以由细胞膜破裂的细胞释放的一种酶是乳酸脱氢酶。这是一种在许多哺乳动物细胞中发现的稳定酶，当细胞膜不再完整时可以很容易地检测到。台盼蓝可以用作染料排斥测定，其中这种染料不会被活细胞吸收，但会被非活细胞吸收。台盼蓝测定是有利的，因为可以使用光学显微镜轻松地对细胞进行计数。与台盼蓝类似，碘化丙啶(PI)也是一种膜不渗透染料，通常被排除在活细胞之外。这种染料通过嵌入与双链DNA结合。PI在488nm处激发，并在617nm的最大波长处发射。由于这些光谱特性，PI可以与其它荧光染料一起使用，如在488nm处激发的荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE))。

7-氨基放线菌素D(7-AAD)是与DNA结合时会发生光谱偏移的荧光嵌入剂。7-AAD/DNA复合物可以被488nm激光激发，并且其最大发射波长为647nm，使这种核酸染色剂可用于多色荧光显微镜和流式细胞术。7-AAD通常被排除在活细胞之外。

线粒体活性和胱天蛋白酶测定：细胞凋亡早期的一个显著特征是线粒体的破坏，包含膜和氧化还原电位的变化。MITOTRACKER^TM染料(赛默飞世尔科技公司，目录号M34150、M34151和M34152)例如是用于对活细胞中的线粒体进行染色的膜电位依赖性探针。MITOTRACKER^TM染料的荧光信号在活性线粒体中比在具有去极化膜的线粒体中更亮，从而提供了一种用于鉴定群体中的健康细胞的方法。

刃天青(Resazurin)和甲瓒(Formazan)(MTT/XTT)可以测定细胞凋亡过程中预示细胞死亡的各个阶段。ALAMARBLUE^TM细胞活力试剂(赛默飞世尔科技公司，目录号DAL1025)是一种基于刃天青的即用型溶液，其通过使用活细胞的还原能力来定量测量活力而充当细胞健康指标。刃天青是ALAMARBLUE^TM试剂的活性成分，是呈蓝色并且几乎无荧光的无毒、可渗透细胞的化合物。进入活细胞后，刃天青被还原为试卤灵，这是一种呈红色且具有强荧光性的化合物。可以使用基于吸光度或荧光的读板仪检测活力的变化。

当添加到细胞中时，ALAMARBLUE^TM细胞活力试剂会被活细胞的还原环境修饰，并且变成红色并发出高荧光。可以使用吸光度(在570nm和600nm处检测到的)或荧光(使用介于530到560nm之间的激发和590nm处的发射)来检测这种颜色变化和增加的荧光。为了测定活力，可以将此试剂添加到完全培养基中的细胞中(无需洗涤或细胞裂解步骤)，所述细胞然后温育一到四小时，并使用基于吸光度或荧光的读板仪读取。

检测细胞凋亡的一种方法是检测胱天蛋白酶-3/7活性。可以用于此类检测的一种试剂是CELLEVENT^TM胱天蛋白酶-3/7绿色检测试剂(赛默飞世尔科技公司，目录号C10423)。CELLEVENT^TM胱天蛋白酶-3/7绿色检测试剂是一种四氨基酸肽(DEVD(SEQ ID NO:17))，与核酸结合染料缀合，其中最大吸收/发射为约502/530nm。DEVD肽序列(SEQ ID NO:17)是胱天蛋白酶-3/7的切割位点，并且缀合的染料在从肽上切割并与DNA结合之前是无荧光的。CELLEVENT^TM胱天蛋白酶-3/7绿色检测试剂本质上是无荧光的，因为DEVD肽(SEQ ID NO:17)抑制染料与DNA结合的能力。然而，在凋亡细胞中活化胱天蛋白酶-3/7之后，DEVD肽(SEQ IDNO:17)被切割，使染料能够与DNA结合并产生明亮的荧光应答。染料与DNA结合时的荧光发射为约530nm，并且可以使用标准FITC滤光片组进行观察。

功能测定：细胞功能的测定趋于特定于被测定的细胞类型。例如，运动性可以用于评估精子细胞功能。配子存活率可以用于测定生育力。已根据基于氧浓度的变形能力、渗透脆性、溶血、血红蛋白含量和ATP水平对红细胞进行了测定。

核酸掺入测定：这些测定基于将组分掺入到核酸(例如，DNA或RNA)中。此类测定的实例是那些基于将[³H]-胸苷或BrdU掺入到DNA中的测定。

细胞活力测定的选择通常基于许多因素，如成本、速度、测定的容易程度、数据的再现性和/或可靠性以及可用的测量设备。沿着这些路线，例如可以使用以下仪器和/或装置获得测量数据：光学显微镜、流式细胞仪、微阵列、闪烁检测器和分光光度计。

细胞增殖的测量通常与细胞活力直接相关，至少与细胞群体中存在的活细胞有关。细胞增殖和细胞分裂能力部分是细胞活力的度量。对于细胞群体，增殖测定测量细胞群体中细胞分裂的能力。换句话说，非活细胞通常不会增殖。因此，细胞群体中的许多增殖细胞是活细胞。然而，大多数细胞群体，无论这些群体中的细胞是否正在分裂，都含有非活细胞。

细胞增殖可以通过多种不同的方法来测量。一种此类方法是通过测量在细胞培养基中培养的细胞的光密度。这些方法通常基于细胞散射光的能力，其中细胞数量越多，光散射越多。通常使用光度计在600nm处测量光密度。

也可以使用荧光染料进行细胞增殖。一种此类方法涉及使用

细胞增殖测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号C7026)。此试剂盒的基础是使用绿色荧光染料

GR染料，所述荧光染料在与细胞核酸结合时表现出强烈的荧光增强。通过添加含有

GR染料的缓冲液裂解细胞，并且然后直接测量荧光。此测定的线性检测范围从50个或更少的细胞扩展到200μL体积中的约250,000个细胞。激发通常在485nm左右，并且发射检测通常在530nm左右。

试剂盒

本文还提供了用于细胞培养和/或细胞的扩增、基因工程化、活化、储存和电穿孔大分子的试剂盒。本文提供的试剂盒可以具有以下组分中的一种或多种或两种或更多种组分：(1)一种或多种细胞培养基，(2)一种或多种电穿孔试剂，(3)一种或多种高密度脂蛋白，(4)一种或多种脂蛋白化合物(例如，HDL、LDL、APO-AI、APO-AI等)，(5)一种或多种用于活化T细胞的试剂(例如，包括抗CD3和抗CD28抗体的珠粒)以及(6)一套或多套试剂盒组件使用说明(例如，书面说明)。

实例

实例1：在含有脂蛋白的培养基中扩增T细胞

材料/方法：

高密度脂蛋白(HDL)(密苏里州马里兰高地地铁法院第10850号Lee Biosolutions公司(Lee Biosolutions,Inc.,10850Metro Court,Maryland Heights,MO)，目录号361-12)运送并储存在-80℃直至使用，在使用之前在37℃水浴中解冻。购买并测试了三个不同的批次。

将重组载脂蛋白I(APO-AI)(美国马萨诸塞州剑桥坎布里奇肯德尔广场1号B2304室艾博抗公司(Abcam,1Kendall Square,Suite B2304,Cambridge,MA)，目录号ab50239)用CTSOPTMIZER^TM重悬至1mg/mL的终浓度。

载脂蛋白II(APO-AII)：源自血浆的APO-AII从Lee Biosolutions公司获得，并且冷冻运送，然后在-20℃下保存，并且临用前解冻制备(参见上文HDL制备)。

X-VIVO^TM 15(马里兰州沃克斯维尔龙沙公司(Lonza,Walkersville,MD)，目录号04-418Q)是一种无血清培养基，含有L-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红，专为造血细胞调配。

除非另有说明，HDL、LDL和载脂蛋白的调配如表6所示。

细胞培养：T细胞分离：从StemExpress(马里兰州罗克维尔医疗核心街9707号230室(9707 Medical Center Drive,Suite 230,Rockville,MD)，目录号LE005F)获得来自正常供体的去鉴定的冷冻单采袋。使用

UNTOUCHED^TM人T细胞试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号11344D)从PBMC中阴性分离T细胞。

T细胞活化和扩增：T细胞(接种密度0.125×10⁶vc/mL，1×10⁶vc/孔在8mL总培养基中)用

人T-扩增器CD3/CD28(赛默飞世尔科技公司，目录号11141D)以每T细胞3个珠粒的比率活化并在24孔G-

板中的CTS OPTMIZER^TM T细胞扩增无血清培养基中培养。在VI-CELL^TM XR分析仪上对细胞进行计数(印第安纳州印第安纳波利斯贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Indianapolis IN))。

所有实验均在24孔G-

板(明尼苏达州圣保罗市西北第五大道33号700室威尔逊沃尔夫公司(Wilson Wolf,33 5th Ave NW,Suite 700,St Paul,MN,)，P/N 80192M)中进行，除了在24孔静态板中进行的APO-AI实验(康宁生命科学公司(Corning LifeSciences)，目录号3524)。

此实例中使用了以下培养基：

1.CTS OPTMIZER^TM+HDL:2.6％T细胞补充物(赛默飞世尔科技公司，目录号A37050-01)、2mM谷氨酰胺、4mM GLUTAMAX^TM(赛默飞世尔科技公司，目录号35050061)、8mg/L HDL。

2.完全CTS OPTMIZER^TM:2.5％ICSR、2.6％T细胞补充物、2mM谷氨酰胺、4mMGLUTAMAX^TM。

HDL和APO-AII实验使用以下方案在24孔G-

板中进行：

第0天：大量T细胞在不含ICSR、T细胞补充物和谷氨酰胺或GLUTAMAX^TM的基础CTSOPTMIZER^TM中解冻，并且然后将它们以1×10⁶个细胞/孔接种，每孔总共8mL。然后用

人T-扩增器CD3/CD28以3:1的珠粒:细胞活化T细胞。然后将IL-2添加到100U/mL。

第3天：将IL-2重新添加到另外的100U/mL中。

第5天：通过在不干扰细胞的情况下缓慢去除4mL总培养基进行培养基交换，然后将新鲜的4mL培养基添加到孔中。然后使用VI-CELL^TM XR分析仪(贝克曼库尔特公司)对细胞进行悬浮并计数。还将IL-2重新添加到另外的100U/mL中。

第7天：通过在不干扰细胞的情况下缓慢去除4mL总培养基进行培养基交换，然后在不干扰细胞的情况下添加4mL新鲜培养基。还将IL-2重新添加到另外的100U/mL中。

第10天：然后使用VI-CELL^TM XR分析仪对细胞进行并计数。通过磁分离从0.5×10⁶个细胞中去除

用针对CD3、CD4、CD8、CD27、CCR7和CD62L的抗体进行表面染色。流式细胞仪分析在GALLIOS^TM流式细胞仪和KALUZA^TM软件上进行。

APO-AI实验使用以下方案在24孔静态板中进行：

第0天：大量T细胞在基础CTS OPTMIZER^TM中解冻，并且以1×10⁶个细胞/孔接种，每孔总共8mL。然后用

人T-扩增器CD3/CD28以3:1的珠粒:细胞活化T细胞。然后将IL-2添加到100U/mL

第3天、第5天和第7天：然后使用VI-CELL^TM XR分析仪对细胞进行并计数。细胞以0.5×10⁶个细胞/mL的浓度进料。在每次进料之后还将IL-2重新添加到另外的100U/mL中饲料。

第10天：然后使用VI-CELL^TM XR分析仪对细胞进行并计数。

表型确定：使用或者不使用HDL将原代人T细胞扩增持续10天。通过磁分离从0.5×10⁶个细胞中去除

用针对CD3、CD4、CD8、CD27、CD62L和CCR7的抗体进行表面染色。流式细胞仪分析在GALLIOS^TM流式细胞仪和KALUZA^TM软件(印第安纳州印第安纳波利斯贝克曼库尔特公司)上进行。

结果：

细胞生长和活力：T细胞扩增表达为总扩增倍数。表7和8所示的数据证明了T细胞在含有不含ICSR的HDL的培养基和含有ICSR的培养基中的生长。在两组不同的条件下扩增细胞。条件1：CTS OPTMIZER^TM中的8mg/L HDL、2.6％T细胞补充物(赛默飞世尔科技公司，目录号A37050-01)、2mM谷氨酰胺和4mM GLUTAMAX^TM。条件2：CTS OPTMIZER^TM中的2.6％ICSR、T细胞补充物、2mM谷氨酰胺和4mM GLUTAMAX^TM。结果表明，当T细胞在不含ICSR但含添加的HDL的CTS OPTMIZER^TM中扩增时，T细胞生长显著增加。表8示出的数据表明，在第5天和第7天，随着HDL的增加，在条件1和2下扩增的T细胞的活力显著增加。

用HDL进行了8次实验，并且结果表明示出HDL在第5天平均增加了8倍，并且在第10天增加了6.6倍。发现HDL在第5天将活力平均增加了22.5％。

图4(表10和11)示出了数据是在T细胞补充物中调配HDL以评估HDL是否与在使用点处添加它对生长具有相同的影响。测试了来自四个不同供体的T细胞。结果证明，在T细胞补充物中调配的HDL示出了与在使用点处添加HDL对细胞生长的影响相同。结果还示出了，在第5天，与完全CTS OPTMIZER^TM相比，在含有HDL的条件下生长增加了4.4倍，与补充有5％人血清的X-VIVO^TM(马里兰州沃克斯维尔龙沙公司，目录号BEBP02-054Q)相比，HDL增加了1.3倍。图5(表12和13)示出了在含有HDL的T细胞补充物、使用点处的HDL，完全CTSOPTMIZER^TM和补充有5％人血清的X-VIVO^TM中扩增的细胞的活力数据。结果证明，与完全CTSOPTMIZER^TM相比，HDL使细胞活力增加了34％。

图6(表14)示出了通过HDL和完全CTS OPTMIZER^TM的细胞生长的CD8:CD4比率。结果示出了，与完全CTS OPTMIZER^TM相比，在含有HDL的条件下，CD8与CD4的比率变化1.8倍。

图7(表15)示出了在第10天评估的细胞的表型。结果示出了，与完全CTSOPTMIZER^TM(CO)相比，含有HDL的细胞具有更高的CD27+和CCR7+表型。

表16、17和18示出了在不含ICSR的CTS OPTMIZER^TM中测试原生APO-AII的数据。结果示出了，与完全CTS OPTMIZER^TM(CO)相比，在含有2μg/mL APO-AII的条件下，第5天的生长平均增加1.3倍，并且第10天的生长平均增加1.3倍。图8A、9A和10A示出的活力示出了，在含有2μg/mL APO-AII的条件下，第5天平均增加14.3％，并且第10天平均增加9.5％。

当使用含有ICSR的重组APO-AI培养基确定T细胞扩增时，产生了表19所示的数据。结果示出了第10天的生长增加了1.1倍。表20中的数据示出了，与使用完全CTS OPTMIZER^TM(CO)相比，在CTS OPTMIZER^TM中含有1mg/ml APO-AI+ICSR的条件下，第5天的活力增加了3.5％，并且第10天的活力增加了5.6％。

实例2：用脂质扩增的细胞的电穿孔

方法

除非另有说明，此实例中使用以下方法。此外，在此实例中，从密苏里州马里兰高地地铁法院第10850号Lee Biosolutions公司(目录号361-10和361-12)获得的HDL直接添加到培养基中，无需进一步稀释。

使用(1)包括抗CD3和抗CD28抗体珠粒的珠粒(赛默飞世尔科技公司，目录号11131D)和(2)IL-2(100IU/mL)(赛默飞世尔科技公司，目录号CTP0021)作为对照在恢复培养基(不含ICSR的含有6mg/L HDL的CTS OPTMIZER^TM(也被称为“CTS OPTMIZER^TM 6HDL”)或CTS OPTMIZER^TM完全(含有ICSR的CTS OPTMIZER^TM))中使T细胞活化3天。在第3天，对细胞进行计数、洗涤，然后重悬在OPTI-MEM^TM细胞培养基(赛默飞世尔科技公司，目录号11058021)中并进行电穿孔(氖转染系统公司(Neon Transfection System)，1100V，两个脉冲长度，每个20毫秒)。电穿孔之后，细胞在含有IL-2(100IU/mL)的CTS OPTMIZER^TM完全培养基中温育。使用pAAV-GFP载体(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs Inc.)，目录号AAV-400)在电穿孔之后24小时确定细胞活力和电穿孔效率(GFP表达)。使用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司，GALLIOS^TM仪器)确定GFP表达。在第7天对细胞进行计数，并且以0.5×10⁶/ml的浓度与新鲜培养基和IL-2(100IU/mL)一起转移到新的12孔静态板中，并且培养直至第10天，此时确定活力和计数。

图14和15中所示的数据是通过以下变化产生的。在这些实验中，细胞在10天的工作流程中不断与指定的培养基接触。

结果

在本文所述的一些实验中，发现单独供体之间的数据差异。此类变化可以在图8中看到，所述图示出了使用来自五个不同供体的T细胞产生的数据。

图8所示的数据表示在CTS OPTMIZER^TM 6HDL和CTS OPTMIZER^TM完全中培养的T细胞之间的活力数据的比较。每个时间点处和每个供体的基线(零)是通过在CTSOPTMIZER^TM完全中测量T细胞的细胞活力来设定的。因此，每个条的高度反映了活力的差异。

图8中的数据示出了，在电穿孔之后24小时观察到活力的最大差异，其中CTSOPTMIZER^TM 6HDL样品的T细胞活力的平均增强为约20％。从数据中可以看出，在电穿孔之后24小时，所有五个供体样品在电穿孔之前在CTS OPTMIZER^TM 6HDL中扩增的T细胞的活力高于在CTS OPTMIZER^TM完全中扩增的T细胞的活力。这些数据证明，在电穿孔之后24小时，用6mg/L HDL对T细胞进行电穿孔前扩增使细胞活力增加。

图9所示的数据还证明了在电穿孔之后，用6mg/L HDL对T细胞进行电穿孔前扩增使细胞活力更高。具体地，图9中表示的数据示出了，CTS OPTMIZER^TM 6HDL在电穿孔之后24小时的细胞活力的平均下降低于CTS OPTMIZER^TM完全。对于CTS OPTMIZER^TM 6HDL，第3天和第7天的平均细胞活力被示出为约90％(第3天：88.95％，SD 2.42；第7天：91.83％，SD3.08)，这在第4天降低到平均约70％(71.14％，SD 7.26)。对于CTS OPTMIZER^TM完全，第3天和第7天的平均细胞活力被示出为约87％(第3天：86.57％，SD 1.13；第7天：88.17％，SD5.79)，这在第4天降低到平均约50％(50.83％，SD 10.54)。因此，CTS OPTMIZER^TM 6HDL在第4天的活力下降约18％(17.81％)，并且CTS OPTMIZER^TM完全在第4天的活力下降约36％(35.74％)。因此，在电穿孔之后24小时，CTS OPTMIZER^TM 6HDL中的细胞扩增使细胞活力比在CTS OPTMIZER^TM完全中高约50％。

图10所示的数据示出了，在电穿孔之前在CTS OPTMIZER^TM 6HDL中扩增的T细胞在第10天实现(分别为46.34倍扩增，SD 16.62对41.05倍扩增，SD 11.83)比在CTS OPTMIZER^TM完全中扩增的T细胞更高的扩增。

图11和12示出了在电穿孔之前在CTS OPTMIZER^TM 6HDL和CTS OPTMIZER^TM完全中扩增的T细胞的电穿孔效率的比较。发现CTS OPTMIZER^TM 6HDL的电穿孔效率为平均值58.99％，SD 11.64，并且CTS OPTMIZER^TM完全的电穿孔效率为平均值51.74％，SD 5.79。因此，观察到与CTS OPTMIZER^TM完全相比，CTS OPTMIZER^TM 6HDL的电穿孔效率提高了约7％。

图13所示的数据示出了在不同条件下从两个供体获得的T细胞的电穿孔效率比较。观察到CTS OPTMIZER^TM 6HDL和不含的ICSR的含有5mg/L HDL和1mg/L LDL的CTSOPTMIZER^TM的最高一致的电穿孔效率。

图14所示的数据示出了，当细胞在不含ICSR的CTS OPTMIZER^TM中保持与HDL和LDL接触时，T细胞活力在电穿孔之后七天时段内维持不变。图15中的数据示出了，在电穿孔之后，在不含ICSR的CTS OPTMIZER^TM中，保持与HDL和LDL接触的T细胞的扩增显著慢于转移到CTS OPTMIZER^TM完全中的T细胞的扩增。因此，图14和15所示的数据证明核酸分子可以被引入到T细胞中并且细胞可以在低扩增/高活力状态下维持至少七天。

其它实施例

尽管已经结合其具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都处于以下权利要求的范围内。

尽管参考其优选的实施例已经具体地展示和描述了本发明，但是本领域的技术人员将会理解的是，在不脱离由所附权利要求书涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的各种改变。

实施例可以根据以下编号的条款：

条款1.一种用于制备无血清细胞培养基的方法，所述方法包括将脂蛋白颗粒组合物或脂蛋白组合物添加到基础培养基中，其中所述脂蛋白颗粒组合物或脂蛋白组合物以一定量添加以充当血清替代物。

条款2.根据条款1所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括选自由以下组成的组的一种或多种脂蛋白颗粒：(a)高密度脂蛋白颗粒；(b)低密度脂蛋白颗粒；以及(c)极低密度脂蛋白颗粒。

条款3.根据条款1或2所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括从人血中获得的脂蛋白颗粒。

条款4.根据条款1到2中任一项所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括合成脂蛋白颗粒。

条款5.根据条款1、2或4中任一项所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括合成高密度脂蛋白颗粒。

条款6.根据条款4所述的方法，其中所述合成脂蛋白颗粒包括载脂蛋白AI或载脂蛋白AII。

条款7.根据条款5所述的方法，其中所述合成脂蛋白颗粒包括载脂蛋白AI或载脂蛋白AII的一部分。

条款8.根据条款6到7中任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白AI或所述载脂蛋白AII是重组产生的。

条款9.根据条款8所述的方法，其中使用非哺乳动物细胞重组产生所述载脂蛋白AI或所述载脂蛋白AII。

条款10.根据条款9所述的方法，其中所述非哺乳动物细胞是昆虫细胞。

条款11.一种无血清细胞培养基，其包括一种或多种脂蛋白化合物，其中所述无血清细胞培养基支持哺乳动物细胞的扩增，并且其中与在不含所述一种或多种脂蛋白化合物但含有血清的培养基中扩增的相同细胞相比，所述哺乳动物细胞在包括所述一种或多种脂蛋白化合物的所述无血清细胞培养基中的扩增增加10％。

条款12.根据条款11所述的无血清细胞培养基，其中所述一种或多种脂蛋白化合物中的至少一种脂蛋白化合物是载脂蛋白AI。

条款13.根据条款11到12所述的无血清细胞培养基，其中所述一种或多种脂蛋白化合物中的至少一种脂蛋白化合物是载脂蛋白AII。

条款14.根据条款11到13中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述一种或多种脂蛋白化合物中的至少一种脂蛋白化合物是脂蛋白颗粒的组分。

条款15.根据条款14所述的无血清细胞培养基，其中所述脂蛋白颗粒是高密度脂蛋白。

条款16.根据条款14到15中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述脂蛋白颗粒从哺乳动物中获得。

条款17.根据条款14到15中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述脂蛋白颗粒是非天然存在的。

条款18.根据条款17所述的无血清细胞培养基，其中所述非天然存在的脂蛋白颗粒含有非天然存在的蛋白质、天然存在的载脂蛋白或天然存在的载脂蛋白的一部分。

条款19.根据条款11到18中任一项所述的无血清细胞培养基，其中细胞活力的增加处于10％到约75％的范围内。

条款20.根据条款11所述的无血清细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞是杂交瘤细胞。

条款21.根据条款20所述的无血清细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

条款22.根据条款21所述的无血清细胞培养基，其中所述人细胞是免疫细胞。

条款23.根据条款22所述的无血清细胞培养基，其中所述免疫细胞是T细胞。

条款24.根据条款23所述的无血清细胞培养基，其中所述T细胞是选自由以下组成的组的一种或多种T细胞：(a)调节性T细胞；(b)CD4+T细胞；(c)CD8+T细胞；(d)TH1细胞；(e)TH2细胞；(f)TH3细胞；(g)TH17细胞；(h)TH9细胞；以及(i)TFH细胞。

条款25.根据条款23到24中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述T细胞通过与CD3表面标志物连接而从血液中分离出来。

条款26.一种用于扩增哺乳动物细胞的方法，所述方法包括在允许所述哺乳动物细胞扩增的条件下在包括一种或多种脂蛋白化合物的无血清细胞培养基中温育所述哺乳动物细胞。

条款27.根据条款26所述的方法，其中所述脂蛋白化合物包括一种或多种脂蛋白颗粒。

条款28.根据条款27所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒化合物包括选自由以下组成的组的一种或多种脂蛋白颗粒：(a)高密度脂蛋白颗粒；(b)低密度脂蛋白颗粒；以及(c)极低密度脂蛋白颗粒。

条款29.一种用于对哺乳动物细胞群体进行电穿孔的方法，所述方法包括：(a)在允许所述哺乳动物细胞扩增的条件下，使所述哺乳动物细胞群体与一种或多种脂蛋白化合物在无血清培养基中接触持续至少12小时；以及(b)向所述哺乳动物细胞群体施加一个或多个电脉冲以由此对所述哺乳动物细胞群体中的成员的细胞膜进行电穿孔，其中电穿孔效率为至少60％，并且其中所述哺乳动物细胞群体中的细胞的活力降低少于10％。

条款30.根据条款29所述的方法，其中所述电穿孔效率通过所述哺乳动物细胞群体中的成员中的可检测标志物的表达来测量。

条款31.根据条款30所述的方法，其中所述可检测标志物是荧光蛋白。

条款32.一种用于维持活化的T细胞群体的方法，所述方法包括：(a)产生所述活化的T细胞群体；(b)在存在脂蛋白补充物的情况下扩增在步骤(a)中产生的所述活化的T细胞群体；(c)使在步骤(b)中产生的经过扩增的活化的T细胞群体暴露于足够强度的电场，以使在接下来的七天内细胞扩增速率降低至少30％；以及(d)在与步骤(b)中相同的条件下维持步骤(c)的所述活化的T细胞群体持续七天，其中在步骤(a)-(d)期间所述活化的T细胞群体的活力保持在70％以上。

条款33.根据条款32所述的方法，其中一种或多种核酸分子在步骤(c)中被引入到所述活化的T细胞群体中的单独T细胞中。

条款34.根据条款33所述的方法，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一种核酸分子对嵌合抗原受体进行编码。

条款35.根据条款34所述的方法，其中所述嵌合抗原受体在所述活化的T细胞群体中的单独T细胞中稳定表达。

条款36.根据条款32所述的方法，其中所述活化的T细胞群体在步骤(b)中扩增持续三天。

条款37.根据条款32所述的方法，其进一步包括：(e)在步骤(d)之后洗涤所述活化的T细胞群体；以及(f)在不存在脂蛋白补充物的情况下扩增在步骤(e)中产生的经过洗涤的活化的T细胞群体。

条款38.根据条款37所述的方法，其中在五天的时间段内，所述经过洗涤的活化的T细胞群体的活力保持在70％以上，并且所述经过洗涤的活化的T细胞群体扩增至少三倍。

条款39.根据条款32所述的方法，其中在步骤(d)期间，所述活化的T细胞群体被运送到不同的位置。

条款40.根据条款32所述的方法，其中所述不同的位置相距大于100英里。

条款41.一种用于储存哺乳动物细胞的方法，所述方法按顺序包括以下步骤：(a)在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增所述哺乳动物细胞；(b)将所述哺乳动物细胞暴露于电场；以及(c)在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增所述哺乳动物细胞，其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞以比步骤(a)中低至少50％的速率扩增，并且其中所述哺乳动物细胞的活力在步骤(a)-(c)期间保持在70％以上。

条款42.根据条款41所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。

条款43.根据条款41所述的方法，其中所述哺乳动物细胞在步骤(c)中扩增持续七天。

条款44.根据条款43所述的方法，其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞的所述细胞活力在七天的扩增期间保持在70％以上。

条款45.根据条款41所述的方法，其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞被洗涤并转移到包括至少50％较低浓度的所述一种或多种脂蛋白化合物的培养基中。

条款46.根据条款41所述的方法，其中核酸分子在步骤(b)中被引入到所述哺乳动物细胞中。

条款47.根据条款46所述的方法，其中所述核酸分子对嵌合抗原受体进行编码。

条款48.根据条款47所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。

序列表

<110> 生命技术公司（LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION）

<120> 用于增强细胞培养的组合物和方法

<130> LT01457PCT

<140>

<141>

<150> 62/871,409

<151> 2019-07-08

<160> 17

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp

20 25 30

Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp

35 40 45

Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys

50 55 60

Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr

65 70 75 80

Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp

85 90 95

Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys

100 105 110

Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe

115 120 125

Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu

130 135 140

Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu

145 150 155 160

Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala

165 170 175

Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp

180 185 190

Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn

195 200 205

Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu

210 215 220

Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln

225 230 235 240

Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala

245 250 255

Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

260 265

<210> 2

<211> 100

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Lys Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Ile Cys Ser Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ala Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser

20 25 30

Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu

35 40 45

Met Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr

50 55 60

Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly

65 70 75 80

Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln

85 90 95

Pro Ala Thr Gln

100

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 未知（Unknown）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “未知的描述：APO-AI模拟肽22A”

<400> 3

Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Lys Gln Lys Leu Lys

20

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 4

Leu Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 5

Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 6

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu

1 5 10 15

Ala Phe

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 7

Glu Lys Leu Lys Ala Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ala Lys Leu Glu Glu

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 8

Glu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 9

Glu Lys Leu Leu Glu Leu Leu Lys Lys Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu

1 5 10 15

Leu Leu

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 10

Glu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu

1 5 10 15

Lys Leu

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 11

Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Leu

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 12

Leu Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 13

Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Lys Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成多肽”

<400> 14

Glu Lys Leu Lys Ala Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ala Lys Leu Glu Glu

1 5 10 15

Leu Leu Glu Lys Leu Lys Ala Lys Leu Glu Glu Leu Lys Ala Lys Leu

20 25 30

Glu Glu Leu Leu

35

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 15

Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu

1 5 10 15

Ala Phe Leu Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu

20 25

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “人工序列的描述：合成肽”

<400> 16

Leu Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Glu Lys Leu Leu Glu

1 5 10 15

Leu Leu Lys Lys Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu

20 25

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 未知（Unknown）

<220>

<221> source

<223> /注释 = “未知的描述：'DEVD'基序肽”

<400> 17

Asp Glu Val Asp

1

Claims (48)

1.一种用于制备无血清细胞培养基的方法，所述方法包括将脂蛋白颗粒组合物或脂蛋白组合物添加到基础培养基中，其中所述脂蛋白颗粒组合物或脂蛋白组合物以一定量添加以充当血清替代物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括选自由以下组成的组的一种或多种脂蛋白颗粒：

(a)高密度脂蛋白颗粒；

(b)低密度脂蛋白颗粒；以及

(c)极低密度脂蛋白颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括从人血中获得的脂蛋白颗粒。

4.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括合成脂蛋白颗粒。

5.根据权利要求1、2或4中任一项所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒组合物包括合成高密度脂蛋白颗粒。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述合成脂蛋白颗粒包括载脂蛋白AI或载脂蛋白AII。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述合成脂蛋白颗粒包括载脂蛋白AI或载脂蛋白AII的一部分。

8.根据权利要求6到7中任一项所述的方法，其中所述载脂蛋白AI或所述载脂蛋白AII是重组产生的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中使用非哺乳动物细胞重组产生所述载脂蛋白AI或所述载脂蛋白AII。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述非哺乳动物细胞是昆虫细胞。

11.一种无血清细胞培养基，其包括一种或多种脂蛋白化合物，其中所述无血清细胞培养基支持哺乳动物细胞的扩增，并且其中与在不含所述一种或多种脂蛋白化合物但含有血清的培养基中扩增的相同细胞相比，所述哺乳动物细胞在包括所述一种或多种脂蛋白化合物的所述无血清细胞培养基中的扩增增加10％。

12.根据权利要求11所述的无血清细胞培养基，其中所述一种或多种脂蛋白化合物中的至少一种脂蛋白化合物是载脂蛋白AI。

13.根据权利要求11所述的无血清细胞培养基，其中所述一种或多种脂蛋白化合物中的至少一种脂蛋白化合物是载脂蛋白AII。

14.根据权利要求11到13中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述一种或多种脂蛋白化合物中的至少一种脂蛋白化合物是脂蛋白颗粒的组分。

15.根据权利要求14所述的无血清细胞培养基，其中所述脂蛋白颗粒是高密度脂蛋白。

16.根据权利要求14到15中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述脂蛋白颗粒从哺乳动物中获得。

17.根据权利要求14到15中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述脂蛋白颗粒是非天然存在的。

18.根据权利要求17所述的无血清细胞培养基，其中所述非天然存在的脂蛋白颗粒含有非天然存在的蛋白质、天然存在的载脂蛋白或天然存在的载脂蛋白的一部分。

19.根据权利要求11到18中任一项所述的无血清细胞培养基，其中细胞活力的增加处于10％到约75％的范围内。

20.根据权利要求11所述的无血清细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞是杂交瘤细胞。

21.根据权利要求20所述的无血清细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

22.根据权利要求11所述的无血清细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。

23.根据权利要求22所述的无血清细胞培养基，其中所述免疫细胞是T细胞。

24.根据权利要求23所述的无血清细胞培养基，其中所述T细胞是选自由以下组成的组的一种或多种T细胞：

(a)调节性T细胞；

(b)CD4+T细胞；

(c)CD8+T细胞；

(d)T_H1细胞；

(e)T_H2细胞；

(f)T_H3细胞；

(g)T_H17细胞；

(h)T_H9细胞；以及

(i)T_FH细胞。

25.根据权利要求23到24中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述T细胞通过与CD3表面标志物连接而从血液中分离出来。

26.一种用于扩增哺乳动物细胞的方法，所述方法包括在允许所述哺乳动物细胞扩增的条件下在包括一种或多种脂蛋白化合物的无血清细胞培养基中温育所述哺乳动物细胞。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述脂蛋白化合物包括一种或多种脂蛋白颗粒。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述脂蛋白颗粒化合物包括选自由以下组成的组的一种或多种脂蛋白颗粒：

(a)高密度脂蛋白颗粒；

(b)低密度脂蛋白颗粒；以及

(c)极低密度脂蛋白颗粒。

29.一种用于对哺乳动物细胞群体进行电穿孔的方法，所述方法包括：

(a)在允许所述哺乳动物细胞扩增的条件下，使所述哺乳动物细胞群体与一种或多种脂蛋白化合物在无血清培养基中接触持续至少12小时；以及

(b)向所述哺乳动物细胞群体施加一个或多个电脉冲以由此对所述哺乳动物细胞群体中的成员的细胞膜进行电穿孔，

其中电穿孔效率为至少60％，并且其中所述哺乳动物细胞群体中的细胞的活力降低少于10％。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述电穿孔效率通过所述哺乳动物细胞群体中的成员中的可检测标志物的表达来测量。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述可检测标志物是荧光蛋白。

32.一种用于维持活化的T细胞群体的方法，所述方法包括：

(a)产生所述活化的T细胞群体；

(b)在存在脂蛋白补充物的情况下扩增在步骤(a)中产生的所述活化的T细胞群体；

(c)使在步骤(b)中产生的经过扩增的活化的T细胞群体暴露于足够强度的电场，以使在接下来的七天内细胞扩增速率降低至少30％；以及

(d)在与步骤(b)中相同的条件下维持步骤(c)的所述活化的T细胞群体持续七天，

其中在步骤(a)-(d)期间所述活化的T细胞群体的活力保持在70％以上。

33.根据权利要求32所述的方法，其中一种或多种核酸分子在步骤(c)中被引入到所述活化的T细胞群体中的单独T细胞中。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一种核酸分子对嵌合抗原受体进行编码。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述嵌合抗原受体在所述活化的T细胞群体中的单独T细胞中稳定表达。

36.根据权利要求32所述的方法，其中所述活化的T细胞群体在步骤(b)中扩增持续三天。

37.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括：

(e)在步骤(d)之后洗涤所述活化的T细胞群体；以及

(f)在不存在脂蛋白补充物的情况下扩增在步骤(e)中产生的经过洗涤的活化的T细胞群体。

38.根据权利要求37所述的方法，其中在五天的时间段内，所述经过洗涤的活化的T细胞群体的活力保持在70％以上，并且所述经过洗涤的活化的T细胞群体扩增至少三倍。

39.根据权利要求32所述的方法，其中在步骤(d)期间，所述活化的T细胞群体被运送到不同的位置。

40.根据权利要求32所述的方法，其中所述不同的位置相距大于100英里。

41.一种用于储存哺乳动物细胞的方法，所述方法按顺序包括以下步骤：

(a)在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增所述哺乳动物细胞；

(b)将所述哺乳动物细胞暴露于电场；以及

(c)在包括一种或多种脂蛋白化合物的培养基中扩增所述哺乳动物细胞；

其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞以比步骤(a)中低至少50％的速率扩增，并且

其中所述哺乳动物细胞的活力在步骤(a)-(c)期间保持在70％以上。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述哺乳动物细胞在步骤(c)中扩增持续七天。

44.根据权利要求43所述的方法，其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞的所述细胞活力在七天的扩增期间保持在70％以上。

45.根据权利要求41所述的方法，其中步骤(c)中的所述哺乳动物细胞被洗涤并转移到包括至少50％较低浓度的所述一种或多种脂蛋白化合物的培养基中。

46.根据权利要求41所述的方法，其中核酸分子在步骤(b)中被引入到所述哺乳动物细胞中。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述核酸分子对嵌合抗原受体进行编码。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。

Images