CN115247148B - 用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法 - Google Patents

用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法，所述用于培养免疫细胞的培养基包括：基础培养基、血清替代物、IL‑2、胸腺五肽、三磷酸腺苷二钠及乙酰半胱氨酸；所述用于培养免疫细胞的培养基中各组分的配比：基础培养基为1000ml，血清替代物为10ml，IL‑2为50万～100万单位，胸腺五肽为0.5～1mg，三磷酸腺苷二钠为10～20mg，乙酰半胱氨酸为50～100mg。本发明的技术方案能够很好地解决了免疫细胞体外培养的周期限制及产能有限的技术难题，为临床应用提供来源和标准统一的大量的免疫细胞，此外，本发提供的方法配制简单，添加物均为商品化的药品及生物制剂，质量安全、可控。

Description

用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于培养免疫细胞的培养基及细胞的培养方法。
背景技术
肿瘤，又称为癌症，是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。肿瘤细胞具有异常的形态、代谢和功能，它生长旺盛，常呈持续性不受机体控制的生长，最终破坏机体各器官的正常功能从而导致机体死亡。肿瘤免疫治本质上绝大多数都是通过人体免疫细胞发挥抗肿瘤作用已成为未来肿瘤治疗的主要手段，结合当前常用手术、化疗及放疗方法，为最大限度延长肿瘤患者生命甚至完全治愈提供了无限可能。通过对自体免疫细胞进行体外激活和扩增，然后将其重新输回肿瘤患者体内，并辅以合适的生长因子，促使其发挥杀伤杀死肿瘤细胞的功能。目前，过继性免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一。过继细胞免疫治疗ACT主要包括非特异性疗法LAK、CIK、DC、NK和特异性TIL、TCR、CAR。众所周知的免疫细胞培养周期都很短，一般14～21天不等，随着培养时间的延长细胞活性等也会降低，直接影响治疗效果，另外，住院的患者本身存在很多不稳定因素导致不能按时进行免疫治疗，因子一种适合大规模长期培养免疫细胞的培养基具有巨大的应用价值。
综上所述，免疫细胞在培养基中长时间培育的过程中如何保证免疫细胞的活性，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提出一种用于培养免疫细胞的培养基，旨在解决传统免疫细胞在长时间培养过程中的细胞活性问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种用于培养免疫细胞的培养基，所述用于培养免疫细胞的培养基包括：基础培养基、血清替代物、IL-2、胸腺五肽、三磷酸腺苷二钠及乙酰半胱氨酸；所述用于培养免疫细胞的培养基中各组分的配比：基础培养基为1000ml，血清替代物为10ml，IL-2为50万～100万单位，胸腺五肽为0.5～1mg，三磷酸腺苷二钠为10～20mg，乙酰半胱氨酸为50～100mg。
在本发明一实施例中，所述血清替代物的体积浓度为1％。
在本发明一实施例中，所述IL-2的浓度为1000u/ml。
在本发明一实施例中，所述胸腺五肽的浓度为1ug/ml。
在本发明一实施例中，所述三磷酸腺苷二钠的浓度为20ug/ml。
在本发明一实施例中，所述乙酰半胱氨酸的浓度为100ug/ml。
为解决上述技术问题，本发明还提出一种细胞的培养方法，采用如上所述的用于培养免疫细胞的培养基，包括以下步骤：
对免疫细胞活化诱导7天；
采用用于培养免疫细胞的培养基对诱导后的免疫细胞进行扩增培养；
每2天至3天补充用于培养免疫细胞的培养基，补液前对原液免疫细胞进行计数；
其中，所述每2天至3天补充用于培养免疫细胞的培养基，补液前对原液免疫细胞进行计数的步骤中：每2天至3天根据补液后1.5×106个细胞/ml补充用于培养免疫细胞的培养基，直至临床使用。
本发明的技术方案用于免疫细胞的培养基能够使免疫细胞体外长期培养扩增，大量扩增后的免疫细胞性能稳定；应用本发明培养30天后的免疫细胞活性、表型、杀伤毒性、因子分泌能力稳定，细胞产能显著提高。本发明很好地解决了免疫细胞体外培养的周期限制及产能有限的技术难题，为临床应用提供来源和标准统一的大量的免疫细胞，此外，本发提供的方法配制简单，添加物均为商品化的药品及生物制剂，质量安全、可控。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所述细胞的培养方法的一实施流程图；
图2为本发明所述细胞的培养方法中所述免疫细胞的其中一活力展示图；
图3为本发明所述细胞的培养方法中所述免疫细胞的其中一活力展示图；
图4为本发明所述细胞的培养方法中免疫细胞的因子分泌能力鉴定表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
下面将在具体实施例中对本发明提出的用于培养免疫细胞的培养基的具体结构进行说明：
在本实施例的技术方案中，一种用于培养免疫细胞的培养基，用于培养免疫细胞的培养基包括：基础培养基、血清替代物、IL-2、胸腺五肽、三磷酸腺苷二钠及乙酰半胱氨酸；用于培养免疫细胞的培养基中各组分的配比：基础培养基为1000ml，血清替代物为10ml，IL-2为50万～100万单位，胸腺五肽为0.5～1mg，三磷酸腺苷二钠为10～20mg，乙酰半胱氨酸为50～100mg。
可以理解地，本发明采用的551H3培养液作为免疫细胞扩增培养的基础培养基；添加成分的作用机理说明：血清替代物的作用：避免自体血浆的不足及个体差异导致维持工艺的不稳定；提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。IL-2(白细胞介素-2)为免疫细胞体外培养的必需因子，可以促进免疫细胞的体外存活、扩增及活化，促进因子分泌等功能。胸腺五肽诱导免疫细胞的分化，增加IFN-r的分泌，提高免疫细胞的活力。三磷酸腺苷二钠参与细胞的代谢及生化合成反应，用于补充能量。乙酰半胱氨酸为人体内合成谷胱甘肽的前提物质，具有很强的清除自由基的作用，通过增加细胞内GSH水平阻止细胞老化及凋亡，具有保护作用，维持其活性。因此，本发明提供的用于免疫细胞的培养基能够使免疫细胞体外长期培养扩增，大量扩增后的免疫细胞性能稳定；应用本发明培养30天后的免疫细胞活性、表型、杀伤毒性、因子分泌能力稳定，细胞产能显著提高。本发明很好地解决了免疫细胞体外培养的周期限制及产能有限的技术难题，为临床应用提供来源和标准统一的大量的免疫细胞，此外，本发提供的方法配制简单，添加物均为商品化的药品及生物制剂，质量安全、可控。
在本发明一实施例中，血清替代物的体积浓度为1％。
在本发明一实施例中，IL-2的浓度为1000u/ml。
在本发明一实施例中，胸腺五肽的浓度为1ug/ml。
在本发明一实施例中，三磷酸腺苷二钠的浓度为20ug/ml。
在本发明一实施例中，乙酰半胱氨酸的浓度为100ug/ml。
实施例1
一种用于培养免疫细胞的培养基，具体组成包括：基础培养基为1000ml；血清替代物为10ml，血清替代物的体积浓度为1％；IL-2为50万～100万单位，IL-2的浓度为1000u/ml；胸腺五肽为0.5～1mg，胸腺五肽的浓度为1ug/ml；三磷酸腺苷二钠为10～20mg，三磷酸腺苷二钠的浓度20ug/ml；乙酰半胱氨酸为50～100mg，乙酰半胱氨酸的浓度为100ug/m。
本发明提出的细胞的培养方法，采用如上的用于培养免疫细胞的培养基，包括以下步骤：
S10：对免疫细胞活化诱导7天；
S20：采用用于培养免疫细胞的培养基对诱导后的免疫细胞进行扩增培养；
S30：每2天至3天补充用于培养免疫细胞的培养基，补液前对原液免疫细胞进行计数；
其中，每2天至3天补充用于培养免疫细胞的培养基，补液前对原液(补充前的液体)免疫细胞进行计数的步骤中：每2天至3天根据补液后1.5×106个细胞/ml补充用于培养免疫细胞的培养基，直至临床使用。按本发明的补液方式可以使其每个补液周期免疫细胞数量增殖2～3倍以上，并且末次补液后5天内细胞不会出现皱缩、凋亡等现象，活性稳定。免疫细胞为MAK免疫细胞(自主研发)培养为例进行说明，MAK(Mixed-activatedkiller)免疫细胞是一种具有高效肿瘤杀伤活性的免疫细胞群；免疫应细胞是以CD56+(CD3-CD16+CD56+和CD3+CD56+)为主的具有肿瘤杀伤活性的淋巴细胞，其杀伤机理与NK、CIK、TIL相同。此培养应用范围广泛，不限于MAK，同样适用于LAK、NK、CIK、TIL等免疫细胞的体外扩增培养。
免疫细胞(MAK细胞)的活力鉴定：
分别取培养18天、21天、24天、27天(末次补液)、32天的4例对照组MAK细胞(使用正常补液培养基551H3含血替、IL-2，其培养方法与本发明上述的培养方法相同)和实验组(使用本发明的用于免疫细胞培养的培养基，培养方法为上述培养方法)MAK细胞进行细胞活力检测，加液前收集细胞悬液40ml，离心清洗3遍后进行活力检测，采用上海睿钰CountstarRigelS2计数仪进行数量及活率检测，检测结果如表1、图2、图3显示：实验组细胞活率均>95％，稳定增殖，随着时间延长细胞活性保持不变，对照组随着时间的延长活率逐渐下降，增殖能力逐渐降低，均显著性低于实验组。由此说明：本发明培养基可以显著促进细胞的增殖，长期维持细胞的活力。
表1
MAK细胞在不同时间段不同培养基组活力检测
免疫细胞(MAK细胞)的表型鉴定：
取培养18天、21天、24天、27天(末次补液)、32天的4例的对照组MAK细胞(使用正常补液培养基551H3含血替、IL-2，其培养方法与本发明上述的培养方法相同)和实验组(使用本发明的用于培养免疫细胞的培养基，培养方法为上述培养方法)MAK细胞进行表面标志物检测，加液前收集细胞悬液2ml，离心清洗3遍后计数，收集留取2×106个细胞分3个流式上样管进行抗体标记，上机检测，结果如表2显示MAK细胞应用不同培养基不同时间段的检测结果无差异，P>0.05；由此说明：本发明培养基对细胞表型不会产生影响，细胞表型的改变主要取决于诱导、活化阶段。
表2
MAK细胞在不同时间段不同培养基组表型检测
免疫细胞(MAK细胞)的因子分泌能力鉴定：
取培养18天、21天、24天、27天(末次补液)、32天的4例的对照组MAK细胞(使用正常补液培养基551H3含血替、IL-2，其培养方法与本发明上述的培养方法相同)和实验组(使用本发明的用于培养免疫细胞的培养基，培养方法为上述培养方法)MAK细胞进行因子分泌能力检测，加液前收集细胞悬液5ml，离心清洗3遍后计数，按照效靶比20:1与A549肿瘤细胞进行共培养，肿瘤细胞刺激24h后收集上清，冻存，全部取样结束后通过ELISA法对上清中IFN-r含量进行检测，结果如图4显示：对照组因子分泌能力随培养时间的延长分泌功能急剧下降，存在显著性差异；实验组因子分泌能力随时间延长存在下降趋势，无显著性差异；由此说明：本发明培养基能够长期维持细胞的因子分泌能力。
免疫细胞(MAK细胞)的杀伤毒性鉴定：
取培养18天、21天、24天、27天(末次补液)、32天的4例的对照组MAK细胞(使用正常补液培养基551H3含血替、IL-2，培养方法与本发明上述的培养方法相同)和实验组(使用本发明的用于培养免疫细胞的培养基，培养方法为上述培养方法)MAK细胞进行杀伤毒性检测，加液前收集细胞悬液5ml，离心清洗3遍后计数，按照效靶比10:1与荧光素酶标记的A549肿瘤细胞进行共培养，肿瘤细胞刺激24h后上机检测，结果显示：对照组随培养时间的延长杀伤毒性功能急剧下降，存在显著性差异，p<0.05；实验组随时间的延长杀伤毒性功能存在下降趋势，无显著性差异，p>0.05；直至停止补液后5天杀伤毒性下降严重，存在显著性差异，p<0.05；细胞培养21天后，实验组均高于对照组，存在显著性差异，p<0.05；由此说明：本发明培养基能长期维持细胞的杀伤毒性，直至长时间停止补液。
表3MAK细胞在不同时间段不同培养基组杀伤毒性检测
注：a/b/c/d/e间具有显著性差异，P<0.05，a>b>c>d>e。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述用于培养免疫细胞的培养基包括：基础培养基、血清替代物、IL-2、胸腺五肽、三磷酸腺苷二钠及乙酰半胱氨酸；
所述用于培养免疫细胞的培养基中各组分的配比：基础培养基为1000ml，血清替代物为10ml，IL-2为50万～100万单位，胸腺五肽为0.5～1mg，三磷酸腺苷二钠为10～20mg，乙酰半胱氨酸为50～100mg。
2.根据权利要求1所述的用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述血清替代物的体积浓度为1％。
3.根据权利要求1所述的用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述IL-2的浓度为1000u/ml。
4.根据权利要求1所述的用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述胸腺五肽的浓度为1ug/ml。
5.根据权利要求1所述的用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述三磷酸腺苷二钠的浓度为20ug/ml。
6.根据权利要求1所述的用于培养免疫细胞的培养基，其特征在于，所述乙酰半胱氨酸的浓度为100ug/ml。
7.一种细胞的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1至6中任一项所述的用于培养免疫细胞的培养基，包括以下步骤：
对免疫细胞活化诱导7天；
采用用于培养免疫细胞的培养基对诱导后的免疫细胞进行扩增培养；
每2天至3天补充用于培养免疫细胞的培养基，补液前对原液免疫细胞进行计数；
其中，所述每2天至3天补充用于培养免疫细胞的培养基，补液前对原液免疫细胞进行计数的步骤中：每2天至3天根据补液后1.5×106个/ml补充用于培养免疫细胞的培养基，直至临床使用。
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Clinical study of ligustrazine hydrochloride injection combined with cyclosporine A in treatment of aplastic anemia and its effect on serum inflammatory factors;Li Chao等;《rug Evaluation Research》;第44卷(第6期);第1301-1305页 *

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CN115247148A (zh) 2022-10-28

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