CN111808822A - 细胞培养用补料液及提高重组hek293细胞蛋白表达量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞培养用补料液及提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法。所述补料液包括氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、碳水化合物和有机分子。本发明的细胞培养用补料液不含任何生长因子及其它蛋白添加物，为全化学成分界定组分，所有组分化学结构已知，便于配制和储存，成本低。该补料液支持细胞更高密度生长和更高的重组蛋白表达量。该补料液无论用于瞬时转染的重组HEK293细胞还是稳定转染的重组HEK293细胞，都能够有效提高重组蛋白的表达量。本发明为哺乳动物细胞培养技术提供有力工具。

Description

细胞培养用补料液及提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种细胞培养用补料液及提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法。
背景技术
近年来，哺乳动物细胞培养技术的快速发展极大地推动了现代生物医药产业的发展。该项技术已广泛应用于蛋白质药物研发、疫苗制造、干细胞移植、人造组织器官培养等领域，成为当今生命科学研究和生物医药开发的强力工具。
人胚肾(HEK)293细胞由Graham等在1977年分离获得，是生产重组蛋白的理想表达系统。随着HEK293细胞培养技术的发展和重组药用蛋白的需求，HEK293细胞培养生产的药用蛋白日益增加。HEK293细胞无论用于瞬时转染表达系统还是稳定表达系统提高重组蛋白质产量成为研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种全化学成分界定细胞培养用补料液及提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种细胞培养用补料液(提高重组蛋白表达量的HEK293细胞补料液)，所述补料液包括氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、碳水化合物和有机分子；pH值为7.2-7.4。
其中，氨基酸的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000011
Figure BDA0002567252720000021
无机盐的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000022
微量元素的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000023
维生素的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000024
碳水化合物和有机分子的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000025
优选地，所述细胞培养用补料液中：氨基酸的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000026
Figure BDA0002567252720000031
无机盐的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000032
微量元素的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000033
维生素的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000034
碳水化合物和有机分子的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000035
第二方面，本发明提供所述补料液的配制方法：分别配制氨基酸溶液、无机盐溶液、维生素溶液、微量元素溶液、碳水化合物溶液及有机分子溶液，然后将各溶液混合，用超纯水定容，并调pH至7.2-7.4。
第三方面，本发明提供所述补料液在哺乳动物细胞体外培养中的应用。
所述哺乳动物细胞包括但不限于重组HEK293细胞。
第四方面，本发明提供一种提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法，包括：在重组HEK293细胞体外培养过程中，向细胞培养液中添加权利要求1或2所述的补料液。
对于瞬时转染获得的重组HEK293细胞，体外培养24h后，按细胞培养液体积百分比5％-10％的量向细胞培养液中添加补料液。
对于稳定转染获得的重组HEK293细胞，每隔一天按细胞培养液体积百分比5％-10％的量向细胞培养液中添加补料液。
前述的方法，细胞培养条件为：35～37℃，转速130～140r/min，培养6～8天收获蛋白。
本发明中，所述重组HEK293细胞表达的目的蛋白可以是分泌型蛋白，如阿达木单抗、CD15，也可以是胞内蛋白，如CD20。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明的细胞培养用补料液不含任何生长因子及其它蛋白添加物，便于配制和储存，成本低。
(二)本发明的细胞培养用补料液无论用于瞬时转染的重组HEK293细胞还是稳定转染的重组HEK293细胞，都能够有效提高重组蛋白的表达量，为哺乳动物细胞培养技术提供有力工具。与不添加补料液相比，目的蛋白表达量提高了30％～150％，例如阿达木单抗提高38％左右，CD20蛋白表达量提高100％左右，CD15蛋白表达量提高150％左右。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中未添加补料液和添加补料液蛋白表达量对比。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1细胞培养用补料液及其配制方法
一、配制补料液
1、准备配制补料液所需化学试剂。
2、玻璃瓶的灭菌
先清洗玻璃瓶，用毛刷将玻璃瓶内壁刷洗干净后先用自来水冲洗3遍，再用超纯水冲洗3遍，冲洗干净后，盖子拧松，包好锡箔纸，放入高压灭菌锅中。灭菌完毕，取出置于超净台中，冷却后拧紧盖子，可以使用。
3、滤器的灭菌
囊式滤器：冲洗囊式滤器，正反冲洗各15min，按顺序安装，进出气口螺丝拧松，包好锡箔纸，滤器本身包好锡箔纸，管子连接处用扎带扎好，进液管口用锡纸包裹，出液口安装转换瓶，放到高压灭菌锅中灭菌。
4、配制过程
将1L洁净的烧杯用自来水冲洗三遍，再用超纯水冲洗三遍，然后将洗净的转子放入烧杯中，接着将转子和烧杯放在清零过的电子称上称出其质量，最后加入大约700mL的超纯水。加入如下各组分：
氨基酸的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000051
无机盐的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000052
微量元素的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000053
Figure BDA0002567252720000061
维生素的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000062
碳水化合物和有机分子的组成及用量如下：
Figure BDA0002567252720000063
5、混合定容
将溶解后的试剂用超纯水定容，并将最终混合液的pH调至7.2-7.4之间。
6、无菌过滤
将灭菌且已贴上标签的1L无菌蓝盖瓶(蜀牛)喷洒酒精后放入超净工作台中，然后将囊式滤器的转换瓶瓶盖和1L蓝盖瓶瓶盖进行无菌对换，打开蠕动泵，将转速调节到300r/min，待补料液快到1L蓝盖瓶刻度线时关闭蠕动泵，过滤结束。放入冰箱2～8℃避光储存。
二、瞬转HEK293细胞表达蛋白验证
1、转染当天对用于转染的种子HEK293细胞(种子HEK293细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染携带有外源基因的表达载体，得到的重组细胞。重组细胞所表达的目的蛋白为阿达木单抗或CD20蛋白)进行取样计数，用于转染的细胞密度范围应控制1.8×106～2.3×106cells/mL之间，细胞活率≥94％，培养体积为每支生物反应管(品牌：TTP，货号：87050)10mL。
2、配制转染复合物，将含有质粒DNA的混合液加入到含PEI的混合液中轻轻混匀，计时，静置15min。15min后，将转染混合液加入到细胞液中，轻轻混匀，拧紧盖子，除最小孔外其它孔均用标签纸盖住。
3、细胞培养
将贴好标签的生物反应管放至摇床培养，培养条件：温度36.5℃，转速135r/min。
4、补料
培养24h后，在生物安全柜内用移液管吸取预热过的800μl(体积百分数8％)补料液，添加至细胞液中，混合完毕后将生物反应管放回摇床继续培养(注意无菌操作)。
5、计数，转染后24h(补料前)、转染后3-5天、收获前均需要对细胞液取样计数。
6、通常培养6天后收获细胞，收获时取若干1.5mL的EP管，将生物反应管中的细胞液轻轻摇匀，用移液器吸取1mL细胞液加到EP管中，先计数，然后将细胞液3000rpm离心5min，当表达的目的蛋白为阿达木单抗时，离心后留上清，当表达的目的蛋白为CD20时，留取细胞沉淀。
7、质检，用ELISA方法检测重组蛋白表达量。
实验结果如图1所示。
从图1可以看出，添加补料液后蛋白表达量，与不添加补料液相比，阿达木单抗表达量提高38％，CD20蛋白表达量提高100％。
三、稳转HEK293细胞表达蛋白验证
1、接种
接种密度：控制在0.4×106～0.7×106cells/mL的细胞密度进行接种(种子HEK293细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染携带有外源基因的表达载体，得到的重组细胞。重组细胞所表达的目的蛋白为CD15)。总培养体积为50mL，培养瓶为250mL蓝盖三角摇瓶(蜀牛)。培养条件为：温度36.5℃，转速135r/min。
2、补料
补料液添加方式：细胞密度达到3×106～4×106cells/mL的细胞密度后补料(接种体积)5％，此后隔天补料(接种体积)5％。
3、收获
随着培养时间的延长，蛋白量累加，无降解现象，可考虑延长培养时间，收获细胞活率可低至40％-50％。
4、质检
用ELISA方法检测重组蛋白表达量。实验结果如图1所示。
从图1可以看出，添加补料液后蛋白表达量明显增高，与不添加补料液相比，CD15蛋白表达量提高150％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.细胞培养用补料液，其特征在于，所述补料液包括氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、碳水化合物和有机分子；pH值为7.2-7.4；
其中，氨基酸的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000011
无机盐的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000012
微量元素的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000013
维生素的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000014
Figure FDA0002567252710000021
碳水化合物和有机分子的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000022
2.根据权利要求1所述的补料液，其特征在于，
其中，氨基酸的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000023
无机盐的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000024
微量元素的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000025
维生素的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000031
碳水化合物和有机分子的组成及用量如下：
Figure FDA0002567252710000032
3.权利要求1或2所述补料液在哺乳动物细胞体外培养中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞为重组HEK293细胞。
5.提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法，其特征在于，包括：在重组HEK293细胞体外培养过程中，向细胞培养液中添加权利要求1或2所述的补料液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对于瞬时转染获得的重组HEK293细胞，体外培养24h后，按细胞培养液体积百分比5％-10％的量向细胞培养液中添加补料液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对于稳定转染获得的重组HEK293细胞，每隔一天按细胞培养液体积百分比5％-10％的量向细胞培养液中添加补料液。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：35～37℃，转速130～140r/min，培养6～8天。
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