CN110343666A - 一种cho细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种CHO细胞培养的补料培养基及CHO细胞培养方法。所述CHO细胞培养的补料培养基包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：氨基酸4.8％‑19.75％，维生素0.00925％‑0.13％，氢氧化钠1.25％‑5.5％，余量为注射用水；其中，氨基酸包括L‑天冬氨酸、L‑酪氨酸、L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑谷氨酸；所述维生素包括核黄素、叶酸、维生素B12、生物素、亚硫酸氢钠甲萘醌、盐酸硫胺素和L‑抗坏血酸。本发明提供的补料培养基及细胞培养方法能够优化CHO细胞生长，提高细胞表达目的蛋白的能力。

Description

一种CHO细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)培养的补料培养基及其制备方法和应用。
背景技术
CHO细胞(Chinese HamsterOvary Cells，中华仓鼠卵巢细胞)是广泛应用的哺乳动物细胞表达系统，已上市、进入临床和临床前研究阶段的大部分治疗性单克隆抗体采用该表达系统进行生产。培养基是CHO细胞生长、产物表达的物质基础。根据加入时机及目的不同，培养基可分为基础培养基和补料培养基，其中基础培养基主要用于细胞早期增殖阶段，补料培养基主要用于早期增殖和表达阶段。因为含有动物血清(如胎牛血清等)的培养基有多种不利因素，因此目前在CHO细胞培养中普遍使用的是无血清培养基。但是由于无血清培养基对于细胞的生长、表达的促进功能有限，所以补料技术现在已经各大生物制药企业竞争的重点之一。
商品化补料培养基长期被国外生物技术公司(如Thermo Fisher公司、Sigma公司、Invitrogen公司、JRH Biosciences公司等)和医药巨头所垄断，价格一般在每升800～2500元。这对于蛋白质药物研发和生产企业无疑是巨大的成本压力。
补料培养基的基本成分虽然都包括氨基酸、维生素、无机盐等，但是商品化补料培养基的具体组成成分及配比属于各个公司的商业秘密。不同细胞株、不同克隆之间代谢需求经常存在差异，需要选择适合的补料培养基。当补料培养基的营养成分发生变化时，蛋白质的结构、糖型分布、聚体情况、电荷变异情况、宿主蛋白/DNA含量等关键质量属性(Critical QualityAttributs，CQAs)都有可能变化，从而影响表达的蛋白质的质量。显然，在成分未知的商品化补料培养基中进行筛选，存在着很大的盲目性：不仅会影响生物仿制药的开发进程，也增大了研发和生产的成本。
现有技术中已经出现了关于补料培养基的研究报道。如公开号CN107460159A(公开日2017年12月12日)的中国发明专利申请“无血清、无蛋白补料培养基及其制备方法和运用”，公开的补料培养基包括浓度为10205-102500mg/L的氨基酸、1900.323-19003.23mg、L的无机盐和微量元素、508.7-5087mg/L的维生素，以及总浓度为3300.2-33002mg/mL的碳水化合物和其它有机物。其中氨基酸部分不含有谷氨酰胺，但包括L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、羟基L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸等20种氨基酸；无机盐和微量元素包括氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、氯化亚锡、硫酸锌、氯化锰等18种物质；维生素部分包括DL-α-硫辛酸、氰钴胺素、D-生物素、叶酸、维生素C等15种维生素；此外还包括还原型谷胱甘肽、亚油酸、丙酮酸钠、D-葡萄糖、P188等碳水化合物及其成分。再如，公开号CN102653729A(公开日2012年9月5日)的中国发明专利申请“一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基”公开的用于中国仓鼠卵巢细胞的补料培养基，含有5.67-10.773g/L氯化钠、4.32-8.208g/L硝酸钙、100-190g/L的D-葡萄糖、3.24-6.15g/L磷酸氢二钠、153-300g/L氨基酸、10-19g/L微量元素、5.5-11g/L维生素和30-100g/L酵母抽提物。其中，氨基酸包括L-丙氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸等20种氨基酸；微量元素包括Cu、Fe、Zn、Mg、Mn、Ni、Na、Se、V、Mo、Sn、和Si；维生素包括氯化胆碱、乙醇胺、DL-α-硫辛酸、I-肌醇、核黄素、硫胺、氰钴胺素、D-泛酸盐、D-生物素、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、腐胺、和吡哆醇。还如，公开号CN106222129A(公开日2016年12月14日)的中国发明专利申请“一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法”，公开了一种自制补料培养基，含有浓度90mM-500mM的半胱氨酸、200mM-400mM的酪氨酸和50mM-150mM的色氨酸。
尽管现有技术中已经出现了一些如上所述的补料培养基，但是生物制药企业对低成本、高蛋白产量的补料培养基的需求仍未得到满足。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于大规模培养CHO细胞的补料培养基以及利用该补料培养基的细胞培养方法。通过本发明的细胞培养方法，不仅能够优化细胞生长、提高蛋白表达量，而且能够降低大规模细胞培养的成本。
为了实现上述技术效果，本发明采用了如下的技术方案：
一种CHO细胞培养的补料培养基，包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：
氨基酸4.8％-19.75％，维生素0.00925％-0.13％，氢氧化钠1.25％-5.5％，余量为注射用水；
其中，氨基酸包括L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸；
所述维生素包括核黄素(维生素B2)、叶酸(维生素B9)、维生素B12、生物素(维生素B7)、亚硫酸氢钠甲萘醌、盐酸硫胺素和L-抗坏血酸。
优选地，以所述补料培养基的总质量为基准，各种氨基酸的质量百分比为：
L-天冬氨酸1.5％-5.5％、L-酪氨酸0.55％-4.5％、L-苏氨酸1％-3％、L-色氨酸0.75％-1.75％、L-谷氨酸1％-5％。
优选地，以所述补料培养基的总质量为基准，各种维生素的质量百分比为：
核黄素0.00025％-0.004％、叶酸0.000625％-0.001％、维生素B120.000625％-0.001％、生物素0.001％-0.016％、亚硫酸氢钠甲萘醌0.00175％-0.028％，盐酸硫胺素0.00125％-0.02％，L-抗坏血酸0.00375％-0.06％。
作为一种优选的实施方式，本发明提供一种CHO细胞培养的补料培养基，包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：
氨基酸8.5％～16％，维生素0.0185％-0.074％，氢氧化钠2.5％～4.5％，余量为注射用水；
其中，以所述补料培养基的总质量为基准，各种氨基酸的质量百分比为：L-天冬氨酸2.5％-4.5％、L-酪氨酸1.5％-3.5％、L-苏氨酸1.5％-2.5％、L-色氨酸1％-1.5％、L-谷氨酸2％-4％；
以所述补料培养基的总质量为基准，各种维生素的质量百分比为：核黄素0.0005％-0.002％、叶酸0.00125％-0.005％、维生素B12 0.00125％-0.005％、生物素0.002％-0.008％、亚硫酸氢钠甲萘醌0.0035％-0.014％，盐酸硫胺素0.0025％-0.01％，L-抗坏血酸0.0075％-0.03％。
作为一种更优选的实施方式，本发明提供一种CHO细胞培养的补料培养基，包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：
氨基酸12.25％-16％，维生素0.0235％-0.074％，氢氧化钠3.5％-4.5％，余量为注射用水；
其中，以所述补料培养基的总质量为基准，各种氨基酸的质量百分比为：L-天冬氨酸3.5％-4.5％、L-酪氨酸2.5％-3.5％、L-苏氨酸2％-2.5％、L-色氨酸1.25％-1.5％、L-谷氨酸3％-4％；
以所述补料培养基的总质量为基准，各种维生素的质量百分比为：核黄素0.001％-0.002％、叶酸0.0025％-0.005％、维生素B12 0.0025％-0.005％、生物素0.004％-0.008％、亚硫酸氢钠甲萘醌0.007％-0.014％、盐酸硫胺素0.005％-0.01％，L-抗坏血酸0.0015％-0.03％。
本发明的第二个目的在于提供上述CHO细胞培养的补料培养基的制备方法，包括如下步骤：
1)根据制备的所述补料培养基的总质量，按上述比例称取所述氨基酸、维生素和氢氧化钠；
2)将氢氧化钠加入注射水中溶解，定容至5mol/L，冷却至室温，得到氢氧化钠溶液；
3)另取注射用水，加入步骤2)制备的氢氧化钠溶液总量的90％，搅拌均匀；
4)将所述氨基酸、维生素加入步骤3)制备的溶液中，持续搅拌30～60min；
5)缓慢加入剩余的步骤2)制备的氢氧化钠溶液，搅拌至粉末完全溶解；
6)用注射用水定容至配制总质量；
7)搅拌5min以上，检测pH值、浊度、渗透压；
8)经步骤7)检测合格的溶液使用微孔滤膜过滤至无菌存储装置中，2-8℃下避光保存，即得。
优选地，所述步骤3)中，所述注射用水的量为所述补料培养基总质量的79％-89％，更优选79％-83.21％。
还优选地，所述步骤7)中，pH应大于11，更优选为11.05-11.33。
优选地，所述步骤7)中，浊度应小于10NTU，渗透压应小于3500mOsm/kg；更优选地，渗透压为1514-2807mOsm/kg；最优选地，渗透压为2176-2807mOsm/kg。
本发明的第三个目的在于提供上述补料培养基或通过上述制备方法制备得到的补料培养基在CHO细胞培养中的应用；尤其是大规模CHO细胞培养中的应用。
优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
此外，本发明还提供一种CHO细胞培养方法，包括如下步骤：
I)接种CHO细胞株至基础培养基中；
II)自接种后每天监测活细胞密度、细胞活力和葡萄糖含量，如有必要，补充葡萄糖；
III)自接种第4天起每天补加本发明所述补料培养基和市售补料培养基，本发明所述补料培养基和市售补料培养基的体积比为1:10；
IV)收获，分离纯化得到目的蛋白。
优选地，本发明所述CHO细胞培养方法包括摇瓶培养和大规模培养。
优选地，所述CHO细胞株为包含目的蛋白核酸编码的CHO-K1细胞。
优选地，所述步骤III)中，补加速度为10ml/min-100ml/min。
优选地，所述步骤III)中，每次补加的本发明所述补料培养基和市售补料培养基的总体积为培养总体积的3％-4％。
优选地，所述步骤III)中，先补加市售补料培养基，再补加本发明所述补料培养基。
还优选地，所述步骤III)中，所述市售补料培养基和本发明所述补料培养基分别一次性加入。
优选地，所述步骤III)中，所述市售补料培养基选自Gibco生产的CHO CDEfficientFeedTM A+、CHO CD EfficientFeedTM B+和CHO CDEfficientFeedTM C+中的一种。
优选地，所述步骤IV)中，在细胞接种后第15天进行收获。
还优选地，所述步骤IV)中，所述目的蛋白为单克隆抗体(如IgG1抗体、IgG4抗体)或单克隆抗体片段。
本发明提供的所述补料培养基以及利用该补料培养基的CHO细胞培养方法，一方面能优化细胞生长，促进其进行正常的葡萄糖及乳酸代谢，维持细胞活率；另一方面，能够提高蛋白表达量及单个细胞的产物比生产速率(Qp)，同时能够保证抗体纯度和糖基化修饰维持在正常水平。
本发明提供的所述补料培养基，制备方法简单、成本低廉，可以显著降低大规模CHO细胞培养的成本，因此应用前景广阔。
附图说明
以下结合附图，对本发明作进一步的说明。
图1为实施例7-12和对比例4-5细胞培养过程中的活细胞密度(VCD-时间)曲线。
图2为实施例13-16细胞培养过程中的活细胞密度(VCD-时间)曲线。
图3为实施例17-25及对比例6-7细胞培养过程中的活细胞密度(VCD-时间)曲线。
图4为实施例7-12和对比例4-5细胞培养过程中的细胞活率(Viability-时间)曲线。
图5为实施例13-16细胞培养过程中的细胞活率(Viability-时间)曲线。
图6为实施例17-25及对比例6-7细胞培养过程中的细胞活率(Viability-时间)曲线。
图7为实施例7-12和对比例4-5细胞培养过程中的乳酸代谢(Lac-时间)曲线。
图8为实施例13-16细胞培养过程中的乳酸代谢(Lac-时间)曲线。
图9为实施例17-25及对比例6-7细胞培养过程中的乳酸代谢(Lac-时间)曲线。
图10的柱形图显示的是实施例7-12和对比例4-5目的蛋白含量(Titer)。
图11的柱形图显示的是实施例13-16目的蛋白含量(Titer)。
图12的柱形图显示的是实施例17-25及对比例6-7目的蛋白含量(Titer)。
图13的柱状图显示的是实施例25得到的目的蛋白的糖基化水平，其中STD为原研厂家生产的目的蛋白。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的市售基础培养基、市售补料培养基及标准品均可经商业途径购买。其中，部分试剂和原料购买情况如下：
L-天冬氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸购买自Applichem；
L-酪氨酸、L-苏氨酸、核黄素(B2)、叶酸(B9)、维生素B12、生物素(B7)、亚硫酸氢钠甲萘醌、盐酸硫胺素、L-抗坏血酸购买自Sigma；
氢氧化钠(NaOH)购买自湖南尔康制药股份有限公司；
CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株购买自OPM公司；
注射用水为自制；
全自动生物图像细胞活力分析系统：BeckmanVi-cell XR；
生化分析仪：Nova Biomedical Nova 400；
高效液相色谱：Waters e2695HPLC、Waters UPLC FLR Detector。
实施例1一种CHO细胞培养的补料培养基
本实施例所述的CHO细胞培养的补料培养基，原料组成见表1，通过如下方法制备：
1)按照配制总质量为1000g计，按表1所示比例称取各种所述氨基酸和维生素和氢氧化钠；
2)将氢氧化钠加入注射水中溶解，定容至5mol/L，冷却至室温，得到氢氧化钠溶液；
3)另取550-600g注射用水，加入步骤2)制备的氢氧化钠溶液总量的90％，搅拌均匀；
4)将所述氨基酸、维生素加入步骤3)制备的溶液中，持续搅拌30-60min；
5)缓慢加入剩余的步骤2)制备的氢氧化钠溶液，搅拌至粉末完全溶解；
6)用剩余的注射用水定容至1000g；
7)搅拌5min以上，检测pH值、浊度、渗透压，具体结果见表3；
8)经步骤7)检测合格的溶液使用微孔滤膜过滤至无菌存储装置中，2-8℃下避光保存，即得。
实施例2～6一种CHO细胞培养的补料培养基
上述实施例2～6所述的CHO细胞培养的补料培养基，原料组成分别见表1，按照实施例1相同的步骤分别制备得到1000g补料培养基。各实施例的补料培养基pH值、浊度、渗透压检测结果见表3。经检测，所述各项指标均符合要求。
对比例1～3一种CHO细胞培养的补料培养基
上述对比例1～3所述的CHO细胞培养的补料培养基，原料组成分别见表2，按照实施例1相同的步骤分别制备得到1000g补料培养基。各实施例的补料培养基pH值、浊度、渗透压检测结果见表3。经检测，pH值和/或渗透压未达到要求。其中对比例3的补料培养基渗透压过大，不适于细胞生长，故不用于以后的细胞培养测试。
表1实施例1～6的CHO细胞培养的补料培养基组成
表2对比例1～3的CHO细胞培养的补料培养基组成
表3实施例1～6和对比例1～3的CHO细胞培养的补料培养基检测结果
实施例7～25CHO细胞培养
基础培养基：市售，具体见表4；
补料培养基：实施例1～6制备的补料培养基，市售补料培养基(具体见表4)；
细胞株：1)包含编码抗体-1的CHO-K1细胞，其中所述抗体-1参照中国专利ZL200580026569.4说明书实施例1；2)包含编码抗体-2的CHO-K1细胞，其中所述抗体-2参照中国专利ZL 200980143007.6说明书实施例1；3)包含编码融合蛋白的CHO-K1细胞，其中所述融合蛋白参照中国专利ZL 200480018573.1说明书实施例1。
细胞培养按照如下步骤进行：
I)按照0.55±0.10(×106cells/ml)的接种密度，将CHO-K1细胞接种至250ml摇瓶中，基础培养基如表4所示；初始培养体积80ml，培养温度36.5±0.5℃，摇床转速120±10rpm，二氧化碳浓度8±1％，湿度75±5％。
II)自接种后开始每天取样检测活细胞密度、细胞活率及葡萄糖、乳酸等指标。根据生化分析仪检测的葡萄糖浓度结果每天补糖，使葡萄糖浓度维持在2～8g/L。
III)自接种第4天开始每天按照表4所示补加市售补料培养基和实施例1～6的补料培养基(体积比为：实施例1～6的补料培养基∶市售补料培养基＝10:1)；补加的补料培养基体积和为培养总体积的3.3％。先一次性加入市售补料培养基，再一次性加入本发明所述补料培养基；反应器补加速度为10ml/min-100ml/min。
IV)培养第15天收获，取细胞上清液，用高效液相色谱(HPLC)法检测表达量，经ProteinA柱纯化后用高效液相色谱(HPLC)法检测纯度，并检测其它相关指标。结果见图1～图12，以及表5。
此外，实施例25得到的目的蛋白的糖基化分析结果见图13。
对比例4～5CHO细胞培养
基础培养基：市售，具体见表6；
补料培养基：对比例1或2制备的补料培养基，市售补料培养基(具体见表6)；
细胞株：包含编码抗体-1的CHO-K1细胞，其中所述抗体-1参照中国专利ZL200580026569.4说明书实施例1。
细胞培养按照如下步骤进行：
I)按照0.55±0.10(×106cells/ml)的接种密度，将CHO-K1细胞接种至250ml摇瓶中，基础培养基如表6所示；初始培养体积80ml，培养温度36.5±0.5℃，摇床转速120±10rpm，二氧化碳浓度8±1％，湿度75±5％。
II)自接种后开始每天取样检测活细胞密度、细胞活率及葡萄糖浓度、乳酸浓度等指标。根据生化分析仪检测的葡萄糖浓度结果每天补糖，使葡萄糖浓度维持在2～8g/L。
III)自接种第4天开始每天按照表6所示补加市售补料培养基和对比例1或2的补料培养基(体积比为：对比例1或2的补料培养基∶市售补料培养基＝10:1)；补加的补料培养基体积和为培养总体积的3.3％。先一次性加入市售补料培养基，再一次性加入所述对比例补料培养基；反应器补加速度为10ml/min-100ml/min。
IV)培养第15天收获，取细胞上清液，用高效液相色谱(HPLC)法检测表达量，经ProteinA柱纯化后用高效液相色谱(HPLC)法检测纯度，并检测其它相关指标。结果见图1、图4和图7，以及表7。
对比例6～7CHO细胞培养
基础培养基：市售，具体见表6；
补料培养基：市售，具体见表6；
细胞株：包含编码抗体-1的CHO-K1细胞，其中所述抗体-1参照中国专利ZL200580026569.4说明书实施例1。
细胞培养按照如下步骤进行：
I)按照0.55±0.10(×106cells/ml)的接种密度，将CHO-K1细胞接种至250ml摇瓶中，基础培养基如表6所示；初始培养体积80ml，培养温度36.5±0.5℃，摇床转速120±10rpm，二氧化碳浓度8±1％，湿度75±5％。
II)自接种后开始每天取样检测活细胞密度、细胞活率及葡萄糖浓度、乳酸浓度等指标。根据生化分析仪检测的葡萄糖浓度结果每天补糖，使葡萄糖浓度维持在2～8g/L。
III)自培养第4天开始每天按照表6所示一次性补加市售补料培养基；补加的补料培养基体积为培养总体积的3.3％；反应器规模培养的补加速度为10ml/min-1000ml/min。
IV)培养第15天收获，取细胞上清液，用高效液相色谱(HPLC)法检测表达量，经ProteinA柱纯化后用高效液相色谱(HPLC)法检测纯度，并检测其它相关指标。结果见图3、图6和图9，以及表7。
从表5的数据可以看出：以工程化CHO细胞表达不同目的蛋白，采用本发明的补料培养基及细胞培养方法，均可达到较高的PVCD、收获活率、目的蛋白表达量(滴度)和Qp，其中：收获活率平均为92.09％，滴度(Titer)平均为4.31g/L，Qp平均为46.01(pg/c*d)。在培养规模扩大到200L时(实施例25)，得到的目的蛋白与原研药(代号STD)的糖基化水平没有显著差异，参见图1。因此，本发明的补料培养基及细胞培养方法应用范围广，可以用于不同的工程化CHO细胞以及不同的市售基础培养基和市售补料培养基。
对比例4～5采用的补料培养基分别是对比例1～2制备的，与本发明实施例的补料培养基比较，仅是其中个别成分含量不同。但是表7示出的对比例4～5的细胞培养结果，与表5的数据比较可以看出：培养结束时各对比例的Titer、PVCD以及收获时的细胞活率显著低于各实施例，说明各对比例都未能显著促进细胞生长及表达。
另外，对比例6与实施例19相比，工程化CHO细胞、基础培养基、市售补料培养基和培养条件均相同，差别仅在于对比例6未添加本发明的补料培养基；类似的，对比例7与实施例22相比，工程化CHO细胞、基础培养基、市售补料培养基和培养条件均相同，差别也仅在于对比例7未添加本发明的补料培养基。但是对比例6和实施例19，以及对比例7和实施例22在收获活率、目的蛋白表达量、Qp等方面均存在差异显著：实施例19的收获活率、PVCD、目的蛋白表达量、Qp和SEC分别较对比例6提高了14.94％、26.56％、122.73％、69.63％和0.18％；实施例22的收获活率、目的蛋白表达量、Qp和SEC分别较对比例7提高了12.84％、102.86％、90.14％和0.93％。
可见，本发明的补料培养基及细胞培养方法可显著优化细胞生长，促进细胞进行正常的葡萄糖和乳酸代谢，提高细胞表达目的蛋白的能力和目的蛋白的表达量，同时还可以更好地保证抗体纯度和使糖基化修饰维持在正常水平。
综上所述，通过上述实施例及对比例，充分证明本发明的补料培养基及细胞培养方法具有优异的技术效果、广泛的适用性以及广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种CHO细胞培养的补料培养基，包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：
氨基酸4.8％-19.75％，维生素0.00925％-0.13％，氢氧化钠1.25％-5.5％，余量为注射用水；
其中，氨基酸包括L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸；
所述维生素包括核黄素、叶酸、维生素B12、生物素、亚硫酸氢钠甲萘醌、盐酸硫胺素和L-抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的补料培养基，其特征在于，以所述补料培养基的总质量为基准，各种氨基酸的质量百分比为：
L-天冬氨酸1.5％-5.5％、L-酪氨酸0.55％-4.5％、L-苏氨酸1％-3％、L-色氨酸0.75％-1.75％、L-谷氨酸1％-5％。
3.根据权利要求1所述的补料培养基，其特征在于，以所述补料培养基的总质量为基准，各种维生素的质量百分比为：
核黄素0.00025％-0.004％、叶酸0.000625％-0.001％、维生素B120.000625％-0.001％、生物素0.001％-0.016％、亚硫酸氢钠甲萘醌0.00175％-0.028％，盐酸硫胺素0.00125％-0.02％，L-抗坏血酸0.00375％-0.06％。
4.一种CHO细胞培养的补料培养基，包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：
氨基酸8.5％～16％，维生素0.0185％-0.074％，氢氧化钠2.5％～4.5％，余量为注射用水；
其中，以所述补料培养基的总质量为基准，各种氨基酸的质量百分比为：L-天冬氨酸2.5％-4.5％、L-酪氨酸1.5％-3.5％、L-苏氨酸1.5％-2.5％、L-色氨酸1％-1.5％、L-谷氨酸2％-4％；
以所述补料培养基的总质量为基准，各种维生素的质量百分比为：核黄素0.0005％-0.002％、叶酸0.00125％-0.005％、维生素B12 0.00125％-0.005％、生物素0.002％-0.008％、亚硫酸氢钠甲萘醌0.0035％-0.014％，盐酸硫胺素0.0025％-0.01％，L-抗坏血酸0.0075％-0.03％；
优选地，一种CHO细胞培养的补料培养基，包括氨基酸、维生素、氢氧化钠和注射用水，以所述补料培养基的总质量为基准，各组分的质量百分比为：
氨基酸12.25％-16％，维生素0.0235％-0.074％，氢氧化钠3.5％-4.5％，余量为注射用水；
其中，以所述补料培养基的总质量为基准，各种氨基酸的质量百分比为：L-天冬氨酸3.5％-4.5％、L-酪氨酸2.5％-3.5％、L-苏氨酸2％-2.5％、L-色氨酸1.25％-1.5％、L-谷氨酸3％-4％；
以所述补料培养基的总质量为基准，各种维生素的质量百分比为：核黄素0.001％-0.002％、叶酸0.0025％-0.005％、维生素B12 0.0025％-0.005％、生物素0.004％-0.008％、亚硫酸氢钠甲萘醌0.007％-0.014％、盐酸硫胺素0.005％-0.01％，L-抗坏血酸0.0015％-0.03％。
5.权利要求1至4中任一项所述的补料培养基的制备方法，包括如下步骤：
1)根据制备的所述补料培养基的总质量，按上述比例称取所述氨基酸、维生素和氢氧化钠；
2)将氢氧化钠加入注射水中溶解，定容至5mol/L，冷却至室温，得到氢氧化钠溶液；
3)另取注射用水，加入步骤2)制备的氢氧化钠溶液总量的90％，搅拌均匀；
4)将所述氨基酸、维生素加入步骤3)制备的溶液中，持续搅拌30～60min；
5)缓慢加入剩余的步骤2)制备的氢氧化钠溶液，搅拌至粉末完全溶解；
6)用注射用水定容至配制总质量；
7)搅拌5min以上，检测pH值、浊度、渗透压；
8)经步骤7)检测合格的溶液使用微孔滤膜过滤至无菌存储装置中，2-8℃下避光保存，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述注射用水的量为所述补料培养基总质量的79％-89％，更优选79％-83.21％；
优选地，所述步骤7)中，pH应大于11，更优选为11.05-11.33；
优选地，所述步骤7)中，浊度应小于10NTU，渗透压应小于3500mOsm/kg；更优选地，渗透压为1514-2807mOsm/kg；最优选地，渗透压为2176-2807mOsm/kg。
7.权利要求1至4中任一项所述的补料培养基或通过权利要求5或6所述制备方法制备得到的补料培养基在CHO细胞培养中的应用；尤其是大规模CHO细胞培养中的应用；
优选地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
8.一种CHO细胞培养方法，包括如下步骤：
I)接种CHO细胞株至基础培养基中；
II)自接种后每天监测活细胞密度、细胞活力和葡萄糖含量，如有必要，补充葡萄糖；
III)自接种第4天起每天补加权利要求1至4中任一项所述的补料培养基或通过权利要求5或6所述制备方法制备得到的补料培养基和市售补料培养基，权利要求1至4中任一项所述的补料培养基或通过权利要求5或6所述制备方法制备得到的补料培养基和市售补料培养基的体积比为1:10；
IV)收获，分离纯化得到目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，所述CHO细胞培养方法包括摇瓶培养和大规模培养；
优选地，所述CHO细胞株为包含目的蛋白核酸编码的CHO-K1细胞。
10.根据权利要求8或9所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，所述步骤III)中，补加速度为10ml/min-100ml/min；
优选地，所述步骤III)中，每次补加的权利要求1至4中任一项所述的补料培养基或通过权利要求5或6所述制备方法制备得到的补料培养基和市售补料培养基的总体积为培养总体积的3％-4％；
优选地，所述步骤III)中，先补加市售补料培养基，再补加权利要求1至4中任一项所述的补料培养基或通过权利要求5或6所述制备方法制备得到的补料培养基；
还优选地，所述步骤III)中，所述市售补料培养基和权利要求1至4中任一项所述的补料培养基或通过权利要求5或6所述制备方法制备得到的补料培养基分别一次性加入；
优选地，所述步骤III)中，所述市售补料培养基选自Gibco生产的CHO CDEfficientFeedTM A+、CHO CD EfficientFeedTM B+和CHO CDEfficientFeedTM C+中的一种；
优选地，所述步骤IV)中，在细胞接种后第15天进行收获；
还优选地，所述步骤IV)中，所述目的蛋白为单克隆抗体或单克隆抗体片段。
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