CN115044537B - 细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法 - Google Patents

细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115044537B
CN115044537B CN202210771319.9A CN202210771319A CN115044537B CN 115044537 B CN115044537 B CN 115044537B CN 202210771319 A CN202210771319 A CN 202210771319A CN 115044537 B CN115044537 B CN 115044537B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
concentration
cells
cell
cell culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210771319.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115044537A (zh
Inventor
代争
张国锋
贺敏
王克波
杨晓明
叶峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Just Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Hangzhou Just Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Just Biotherapeutics Inc filed Critical Hangzhou Just Biotherapeutics Inc
Priority to CN202210771319.9A priority Critical patent/CN115044537B/zh
Publication of CN115044537A publication Critical patent/CN115044537A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115044537B publication Critical patent/CN115044537B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法。细胞培养用缓冲液，包括氨基酸、氢氧化钠和水；所述氨基酸包括丙氨酸、γ‑氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸；所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为10～15mM/L，所述γ‑氨基丁酸的浓度为10～15mM/L，所述丝氨酸的浓度为10～20mM/L，所述色氨酸的浓度为80～85mM/L，所述酪氨酸的浓度为200～250mM/L；所述氢氧化钠的浓度为0.75～0.85mol/L；所述缓冲液的pH为11～11.4。细胞培养用缓冲液可有效地将细胞培养中的pH控制在合适范围内，对细胞生长和代谢无负面影响，还可以提高蛋白产量。

Description

细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法。
背景技术
在哺乳动物细胞培养过程中，特别是在生物制药中，pH是一个关键的过程参数，其可以显著地影响细胞培养性能，进而影响到产品产量和质量。由于培养过程的pH值可以影响许多哺乳动物细胞类型的细胞内酶活性，因此将pH值控制在适宜的范围里，可以使细胞保持在一个良好状态，从而获得较为理想的产品产量和质量。在典型的哺乳动物细胞培养中，过低或过高的pH值均可杀死细胞，当pH值低于约6.8时，细胞生长开始受到抑制，因此常用的pH值设置点为7.0，控制范围在6.8-7.4之间。
在哺乳动物细胞培养过程中，通常pH值会发生较大的变动。这是因为当细胞接入新鲜的培养基中，这时培养基中的pH值一般为7.4左右，在细胞的生长阶段，细胞摄入的葡萄糖通过无氧发酵变成丙酮酸，而大部分的丙酮酸进一步转变为乳酸，随着乳酸的逐渐积累，培养基被酸化，导致培养体系中的pH逐渐降低，当pH低于6.8时，细胞生长受到抑制，如果这时细胞中的乳酸代谢未及时转变，乳酸的生成量持续大于消耗量，乳酸积累更加严重，这将导致培养体系的pH值持续下降，另外随着细胞呼吸产生的CO2的缓慢积累，这将加剧pH的下降，一旦培养体系中的pH值低于6.6，细胞将基本停止生长并逐渐死亡。细胞生长的宏观表现为：活细胞密度基本不再增加甚至逐渐降低，细胞的活率也逐渐下降。这时常用的方法是用碱，如氢氧化钠，碳酸钠等，来提升pH，使之维持在细胞生长的正常范围，但是碱的加入往往会导致渗透压升高，乳酸积累加剧，细胞的生长环境进一步恶化，从而导致细胞活率的快速下降，细胞培养周期缩短，蛋白产量降低，产品质量也将受到一定程度的影响。
另外，在细胞培养工艺放大到大规模时，一般是500L，2000L，甚至上万升的培养规模。由于在大规模反应器中CO2更易积累，较多的CO2积累导致了培养中的pH持续下降，这时用于控制pH而加入的碱的数量要远多于小试规模，这样就会导致细胞培养的表现比小试规模更差，甚至会导致细胞培养工艺放大的失败。
因此，在哺乳动物细胞培养过程中pH的控制尤为重要，现有技术都是在选择乳酸代谢较好的细胞株的前提下，尽可能的在细胞培养过程避免加碱，但是往往较难实现。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种细胞培养用缓冲液，以解决现有技术中添加常规的碱液会导致培养体系中的渗透度升高，乳酸积累加剧，细胞生长环境进一步恶化，活细胞密度及细胞活率都会快速下降，缩短细胞培养周期，蛋白产量下降的技术问题。
本发明的另一个目的在于提供一种所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，该方法简单易行。
本发明的另一个目的在于提供一种细胞的培养方法，通过加入细胞培养用缓冲液，可有效地将细胞培养中的pH控制在合适范围内，对细胞生长和代谢无负面影响，并且在乳酸代谢方面，不会加剧乳酸积累和渗透压升高，还可以提高蛋白产量。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种细胞培养用缓冲液，包括氨基酸、氢氧化钠和水；
所述氨基酸包括丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸；
所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为10～15mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为10～15mM/L，所述丝氨酸的浓度为10～20mM/L，所述色氨酸的浓度为80～85mM/L，所述酪氨酸的浓度为200～250mM/L；
所述氢氧化钠的浓度为0.75～0.85mol/L；
所述缓冲液的pH为11～11.4。
在一种实施方式中，所述丙氨酸的浓度为11～14mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12～14mM/L，所述丝氨酸的浓度为12～18mM/L，所述色氨酸的浓度为81～83.5mM/L，所述酪氨酸的浓度为210～240mM/L。
在一种实施方式中，所述丙氨酸的浓度为12mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12.5mM/L，所述丝氨酸的浓度为15mM/L，所述色氨酸的浓度为82.5mM/L，所述酪氨酸的浓度为215mM/L。
所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
将固体氢氧化钠、固体氨基酸和水进行混合，得到混合液；调节所述混合液的pH至11～11.4；
所述固体氨基酸包括固体丙氨酸、固体γ-氨基丁酸固体、固体丝氨酸、固体色氨酸和固体酪氨酸。
在一种实施方式中，所述混合具体包括：将所述固体氨基酸与所述水混合并进行第一搅拌处理，再加入所述固体氢氧化钠并进行第二搅拌处理。
在一种实施方式中所述第一搅拌处理的转速为250～350rpm，所述第一搅拌处理的拌时间为30～40min。
在一种实施方式中，述第二搅拌处理的转速为250～350rpm，所述第二搅拌处理的拌时间为50～70min。
在一种实施方式中，调节所述混合液的pH至11～11.4后，采用过滤精度为0.2μm的过滤器进行过滤。
细胞的培养方法，包括以下步骤：
将细胞接种至装有液体培养基的容器中并进行振荡培养；当所述液体培养基的pH低于6.6时，加入所述的细胞培养用缓冲液，调节所述液体培养基的pH至6.8～7.2后继续进行振荡培养。
在一种实施方式中，所述振荡培养的温度为36.0℃～37℃。
在一种实施方式中，所述振荡培养的转速为110～125rpm，振荡直径为50mm。
在一种实施方式中，所述振荡培养的湿度为70％～90％。
在一种实施方式中，所述振荡培养的CO2浓度为4.0％～6.0％。
在一种实施方式中，所述细胞的培养周期为7～10天。
在一种实施方式中，所述细胞的接种密度为1.4×106～5.0×106cells/mL。
在一种实施方式中，所述容器包括摇瓶和/或生物反应器。
所述细胞的培养体积小于或等于2000L。
细胞的培养方法，包括以下步骤：
将细胞接种至基础培养基中进行扩增培养，至细胞的密度为(4.5～6.5)×106cells/mL时，在细胞培养容器中进行接种，接种密度为(0.8～1.0)×106cells/mL，当细胞密度达到(17～23)×106cells/mL时降温并继续培养；在培养过程中，当培养体系的pH低于6.6时，加入所述的细胞培养用缓冲液，调节培养体系的pH为6.8～7.2；
在培养的过程中流加补料培养基。
在一种实施方式中，所述细胞接种至基础培养基中的接种密度为(0.4～0.6)×106cells/mL。
在一种实施方式中，所述扩增培养的温度为36.0～37.0℃。
在一种实施方式中，所述扩增培养采用振荡培养，所述振荡培养的转速为105～115rpm。
在一种实施方式中，所述扩增培养的CO2浓度为4.0％～6.0％。
在一种实施方式中，所述扩增培养的湿度为70％～90％。
在一种实施方式中，所述补料培养基选自Cell Boost 7a和Cell Boost 7b，所述Cell Boost 7a每次的添加体积分数为3％～7％，所述Cell Boost 7b每次的添加体积分数为0.3％～0.7％。
在一种实施方式中，所述基础培养基为Actipro培养基。
在一种实施方式中，所述细胞的培养周期为13～15天。
在一种实施方式中，所述细胞培养容器为生物反应器；所述生物反应器包括玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器和一次性生物反应器中的至少一种。
在一种实施方式中，所述细胞的培养规模为2L～5000L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的细胞培养用缓冲液可有效地将细胞培养中的pH控制在合适范围内，对细胞生长和代谢无负面影响，并且在乳酸代谢方面，不会加剧乳酸积累和渗透压升高，还可以提高蛋白产量。
(2)细胞培养用缓冲液的制备方法简单易行，将各组分混合均匀。
(3)细胞培养方法稳定、可靠，可成功放大到生产规模。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4中的细胞株A在培养基A中的生长曲线；
图2为实施例4中的细胞株A在培养基B中的生长曲线；
图3为实施例4中的细胞株B在培养基B中的生长曲线；
图4为实施例4中的细胞株A在培养基A中pH与乳酸变化曲线；
图5为实施例4中的细胞株A在培养基B中pH与乳酸变化曲线；
图6为实施例4中的细胞株B在培养基B中pH与乳酸变化曲线；
图7为实施例4中的细胞株A在培养基A中的蛋白含量变化曲线；
图8为实施例4中的细胞株A在培养基B中的蛋白含量变化曲线；
图9为实施例4中的细胞株B在培养基B中的蛋白含量变化曲线；
图10为实施例5中的细胞生长曲线；
图11为实施例5中的细胞培养过程中的pH和乳酸变化曲线；
图12为实施例5中的细胞培养过程中的渗透度变化曲线；
图13为实施例5中的细胞培养过程中的蛋白含量变化曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一方面，本发明涉及一种细胞培养用缓冲液，包括氨基酸、氢氧化钠和水；
所述氨基酸包括丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸；
所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为10～15mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为10～15mM/L，所述丝氨酸的浓度为10～20mM/L，所述色氨酸的浓度为80～85mM/L，所述酪氨酸的浓度为200～250mM/L；
所述氢氧化钠的浓度为0.75～0.85mol/L；
所述缓冲液的pH为11～11.4。
本发明通过将丙氨酸(Ala)、γ-氨基丁酸(GABA)、丝氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)与氢氧化钠的混合液作为细胞培养的调节液，可有效地将细胞培养中的pH控制在合适范围内，对细胞生长和代谢无负面影响，并且在乳酸代谢方面，不会加剧乳酸积累和渗透压升高，还可以提高蛋白产量。
在一种实施方式中，所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度包括但不限于为10mM/L、10.5mM/L、11mM/L、11.5mM/L、12mM/L、12.5mM/L、13mM/L、14mM/L、14.5mM/L或15mM/L。
在一种实施方式中，所述缓冲液中，所述γ-氨基丁酸的浓度包括但不限于为10mM/L、10.5mM/L、11mM/L、11.5mM/L、12mM/L、12.5mM/L、13mM/L、14mM/L、14.5mM/L或15mM/L。
在一种实施方式中，所述缓冲液中，所述丝氨酸的浓度包括但不限于为10mM/L、10.5mM/L、11mM/L、11.5mM/L、12mM/L、12.5mM/L、13mM/L、14mM/L、14.5mM/L、15mM/L、16mM/L、17mM/L、18mM/L、19mM/L或20mM/L。
在一种实施方式中，所述缓冲液中，所述色氨酸的浓度包括但不限于为80mM/L、80.5mM/L、81mM/L、82mM/L、82.5mM/L、83mM/L、83.5mM/L、84mM/L或85mM/L。
在一种实施方式中，所述缓冲液中，所述酪氨酸的浓度包括但不限于为200mM/L、205mM/L、210mM/L、215mM/L、220mM/L、225mM/L、230mM/L、235mM/L、240mM/L、245mM/L或250mM/L。
在一种实施方式中，所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为11～14mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12～14mM/L，所述丝氨酸的浓度为12～18mM/L，所述色氨酸的浓度为81～83.5mM/L，所述酪氨酸的浓度为210～240mM/L。
在一种实施方式中，所述丙氨酸的浓度为12mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12.5mM/L，所述丝氨酸的浓度为15mM/L，所述色氨酸的浓度为82.5mM/L，所述酪氨酸的浓度为215mM/L。
另一方面，本发明还涉及所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
将固体氢氧化钠、固体氨基酸和水进行混合，得到混合液；调节所述混合液的pH至11～11.4；
所述固体氨基酸包括固体丙氨酸、固体γ-氨基丁酸固体、固体丝氨酸、固体色氨酸和固体酪氨酸。
本发明中的细胞培养用缓冲液的制备方法简单易行。
在一种实施方式中，所述混合具体包括：将所述固体氨基酸与所述水混合并进行第一搅拌处理，再加入所述固体氢氧化钠并进行第二搅拌处理。
在一种实施方式中，所述第一搅拌处理的转速为250～350rpm，例如270rpm、290rpm、300rpm、320rpm或340rpm。所述第一搅拌处理的拌时间为30～40min。在一种实施方式中，所述第一搅拌处理的拌时间包括但不限于为30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min或39min。
在一种实施方式中，所述第二搅拌处理的转速为250～350rpm，例如270rpm、290rpm、300rpm、320rpm或340rpm。所述第二搅拌处理的拌时间为50～70min。在一种实施方式中，所述第二搅拌处理的拌时间包括但不限于为50min、52min、55min、57min、60min、62min、65min、67min或70min。
在一种实施方式中，调节所述混合液的pH至11～11.4后，采用过滤精度为0.2μm的过滤器进行过滤。过滤后在2-8℃保存。
在一种实施方式中，采用10N的氢氧化钠或者6M的HCl调节所述混合液的pH至11～11.4。
另一个方面，本发明还涉及细胞的培养方法，包括以下步骤：
将细胞接种至装有液体培养基的容器中并进行振荡培养；当所述液体培养基的pH低于6.6时，加入所述的细胞培养用缓冲液，调节所述液体培养基的pH至6.8～7.2后继续进行振荡培养。
在一种实施方式中，所述细胞的培养周期为7～10天。或者当细胞活率低于60％结束培养。
在一种实施方式中，所述振荡培养的温度为36.0～37.0℃。在一种实施方式中，所述振荡培养的温度包括但不限于为36.4℃或36.5℃。
在一种实施方式中，所述振荡培养的转速为110～125rpm，振荡直径为50mm。在一种实施方式中，所述振荡培养的转速包括但不限于为112rpm、113rpm、11rpm、120rpm、122pm或125rpm。
在一种实施方式中，所述振荡培养的湿度为70％～90％。在一种实施方式中，所述振荡培养的湿度包括但不限于为75％、79％、80％、81％、82％或85％。
在一种实施方式中，所述振荡培养的CO2浓度为4％～6％。在一种实施方式中，所述振荡培养的CO2浓度包括但不限于为4.1％、4.2％、4.3％、4.5％、4.7％、5％、5.2％、5.5％、5.7％或5.9％。
在一种实施方式中，所述细胞的接种密度为1.4×106～5.0×106cells/mL，例如可以为1.5×106cells/mL、2cells/mL、3cells/mL或4cells/mL。
在一种实施方式中，所述容器包括摇瓶和/或生物反应器。
在一种实施方式中，所述细胞的培养体积小于或等于2000L。
在一种实施方式中，根据每日所述液体培养基中葡萄糖残留浓度，向所述液体培养基中添加葡萄糖母液以维持细胞在培养中的正常葡萄糖代谢。
另一方面，本发明还涉及细胞的培养方法，包括以下步骤：
将细胞接种至基础培养基中进行扩增培养，至细胞的密度为(4.5～6.5)×106cells/mL时，在细胞培养容器中进行接种，接种密度为(0.8～1.0)×106cells/mL，当细胞密度达到(17～23)×106cells/mL时降温并继续培养；在培养过程中，当培养体系的pH低于6.6时，加入所述的细胞培养用缓冲液，调节培养体系的pH为6.8～7.2；在培养的过程中流加补料培养基。
在一种实施方式中，所述细胞接种至基础培养基中的接种密度为(0.4～0.6)×106cells/mL。扩增培养培养的时间为3天。
在一种实施方式中，所述扩增培养的温度为36.0～37.0℃。例如可以为36.5℃。在一种实施方式中，所述扩增培养采用振荡培养，所述振荡培养的转速为110～125rpm。在一种实施方式中，所述扩增培养的CO2浓度为4.0％～6.0％。例如可以为5％。在一种实施方式中，所述扩增培养的湿度为70％～90％；例如可以为80％。
在一种实施方式中，所述细胞的培养周期为13～15天。例如可以为13天、14天或15天。
在一种实施方式中，所述基础培养基为Actipro培养基。
在一种实施方式中，所述补料培养基选自Cell Boost 7a和Cell Boost 7b，所述Cell Boost 7a每次的添加体积分数为3％～7％，所述Cell Boost 7b每次的添加体积分数为0.3％～0.7％。在一种实施方式中在培养的第3天、第6天、第8天、第10天和第12天流加所述补料培养基。第3天，Cell Boost 7a和Cell Boost 7b的流加体积分数分别为5％和0.5％；第6天，Cell Boost 7a和Cell Boost 7b的流加体积分数分别为6％和0.6％；第8天，Cell Boost 7a和Cell Boost 7b的流加体积分数分别为6％和0.6％；第10天，Cell Boost7a和Cell Boost 7b的流加体积分数分别为7％和0.7％；第12天，Cell Boost 7a和CellBoost 7b的流加体积分数分别为3％和0.3％。
在一种实施方式中，所述细胞培养容器为生物反应器；所述生物反应器包括玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器和一次性生物反应器中的至少一种。
在一种实施方式中，所述细胞培养规模为2L～5000L。
下面结合具体的实施例进一步解释说明。
1.细胞培养过程中涉及的材料：
(1)稳定表达单克隆抗体XX的CHO细胞株A(CHOK1SV,美国Lonsa)，GS筛选系统)。
(2)稳定表达双克隆抗体XX的CHO细胞株B(CHOK1SV,美国Lonsa)，GS筛选系统)。
(3)商业化基础培养基Actipro(GE，美国)；商业化补料培养基Cell boost 7a/7b(GE，美国)。
(4)培养基A(Dynamis,Thermo,美国)，培养基B(ExpiCHO,Thermo,美国)。
(5)丙氨酸，丝氨酸，色氨酸，酪氨酸，GABA(Merck,德国)。
2.本发明实施例中涉及的检测方法，包括：
(1)活细胞密度检测：用Vi-CELL(Beckman,德国)进行活细胞密度检测。
(2)离线pH检测：用Prime CCS血气分析仪(NOVE，美国)进行检测。
(3)摇瓶中细胞代谢生化值检测：用M-100(西尔曼，中国)检测培养过程中的葡萄糖和乳酸含量。
(4)反应器中细胞代谢生化值检测：用Cedex Bio(Roche,瑞士)检测培养过程中的细胞代谢生化值，如葡萄糖、乳酸、氨、IgG等。
(5)培养过程中的渗透度检测：用Osmo PRO(Advance,美国)进行检测。
(6)培养过程中抗体含量检测：用Cedex Bio(Roche,瑞士)检测培养过程中的抗体含量检测。
实施例1
一种细胞培养用缓冲液，包括氨基酸、氢氧化钠和水；
所述氨基酸包括丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸；
所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为1mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12.5mM/L，所述丝氨酸的浓度为15mM/L，所述色氨酸的浓度为82.5mM/L，所述酪氨酸的浓度为215mM/L；
所述氢氧化钠的浓度为0.8mol/L；
所述缓冲液的pH为11～11.4。
所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
将氨基酸粉末与水混合并进行第一搅拌处理，再加入氢氧化钠粉末并进行第二搅拌处理；所述第一搅拌处理的转速为300rpm，所述第一搅拌处理的拌时间为30min；所述第二搅拌处理的转速为300rpm，所述第二搅拌处理的拌时间为60min，直至得到澄清的混合液；调节混合液的pH至11～11.4，0.2um滤器无菌过滤，得到细胞培养用缓冲液(即B-XA缓冲液)，在2-8℃条件保存。
实施例2
一种细胞培养用缓冲液，包括氨基酸、氢氧化钠和水；
所述氨基酸包括丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸；
所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为10mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为10mM/L，所述丝氨酸的浓度为10mM/L，所述色氨酸的浓度为80mM/L，所述酪氨酸的浓度为200mM/L；
所述氢氧化钠的浓度为0.8mol/L；
所述缓冲液的pH为11～11.4。
所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
将氨基酸粉末与水混合并进行第一搅拌处理，再加入氢氧化钠粉末并进行第二搅拌处理；所述第一搅拌处理的转速为300rpm，所述第一搅拌处理的拌时间为35min；所述第二搅拌处理的转速为300rpm，所述第二搅拌处理的拌时间为55min，直至得到澄清的混合液；调节混合液的pH至11～11.4，0.2um滤器无菌过滤，2-8℃保存。
实施例3
一种细胞培养用缓冲液，包括氨基酸、氢氧化钠和水；
所述氨基酸包括丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸；
所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为15mM/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为15mM/L，所述丝氨酸的浓度为20mM/L，所述色氨酸的浓度为85mM/L，所述酪氨酸的浓度为250mM/L；
所述氢氧化钠的浓度为0.8mol/L；
所述缓冲液的pH为11～11.4。
所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
将氨基酸粉末与水混合并进行第一搅拌处理，再加入氢氧化钠粉末并进行第二搅拌处理；所述第一搅拌处理的转速为300rpm，所述第一搅拌处理的拌时间为40min；所述第二搅拌处理的转速为rpm，所述第二搅拌处理的拌时间为65min，直至得到澄清的混合液；调节混合液的pH至11～11.4，0.2um滤器无菌过滤，2-8℃保存。
实施例4
250mL摇瓶中批次培养的实验是将稳定表达某单克隆抗体的CHO细胞株A(CHOK1SV,美国Lonsa，GS筛选系统)和稳定表达某双抗的CHO细胞株B(CHOK1SV,美国Lonsa，GS筛选系统)以1.5x106cells/mL密度接种到250mL摇瓶中，培养体积为50mL，培养基分别为培养基A，培养基B(内部开发基础培养基，奕安济世)，用实施例1的B-XA缓冲液、0.5N氢氧化钠和1M碳酸钠分别调控培养基中的pH。在摇床(Infors，瑞士)培养7天或者当细胞活率低于60％结束培养，摇床的培养参数为36.5℃，5％CO2浓度，125rpm，摇摆直径50mm，湿度80％。
实验设计见表格1。培养过程中每日取样检测活细胞密度，离线PH和细胞代谢生化值。根据每日葡萄糖残留浓度用300g/Kg的葡萄糖母液进行葡萄糖添加从而维持细胞在培养中的正常葡萄糖代谢。
表1 250mL摇瓶中批次培养实验
表1中，SF01组、SF05组和SF09组中的“/”分别为不采用调节液进行pH控制(不控制pH)。SF02组表示细胞株A在培养基A中按照上述培养条件进行培养，当pH低于6.6时加入B-XA缓冲液上调pH值至6.8。SF03组除加入0.5N的NaOH上调pH值，其他条件同SF02组。SF04组除加入1M Na2CO3上调pH值，其他条件同SF02组。SF06组除采用培养基B，其他条件同SF02组。SF07组除采用培养基B，其他条件同SF03组。SF08组除采用培养基B，其他条件同SF04组。SF010组除培养细胞株B，其他条件同SF06组。SF11组除培养细胞株B，其他条件同SF07组。SF012组除培养细胞株B，其他条件同SF08组。
检测结果参见图1至图9所示，其中，图1为细胞株A在培养基A中的生长曲线；图2为细胞株A在培养基B中的生长曲线；图3为细胞株B在培养基B中的生长曲线；图4为细胞株A在培养基A中pH与乳酸变化曲线；图5为细胞株A在培养基B中pH与乳酸变化曲线；图6为细胞株B在培养基B中pH与乳酸变化曲线；图7为细胞株A在培养基A中的蛋白含量变化曲线；图8为细胞株A在培养基B中的蛋白含量变化曲线；图9为细胞株B在培养基B中的蛋白含量变化曲线。
由图1至图9可知，细胞株A在培养基A和B的批次培养实验中，随着细胞培养时间的增加，细胞在生长过程中由于代谢产生的乳酸和二氧化碳使培养体系中的pH逐渐下降，在不加入碱性缓冲液调控pH的实验组中，pH会持续下降，直至低于细胞耐受的低pH值6.5，最后导致细胞大量快速死亡。而在另外3个分别用B-AX溶液，0.5N的NaOH溶液和1M的Na2CO3溶液调控pH的实验组中，0.5N的NaOH溶液和1M的Na2CO3溶液的加入会导致乳酸积累加剧，更不利于细胞的生长；而用B-AX溶液调控pH，可以有效的控制pH和改善乳酸积累状况，使细胞生长明显好于其他实验组，并且蛋白含量也明显高于其他实验组。在细胞株B在培养基B的批次培养试验中，在加入B-AX溶液调控pH的实验组，其细胞生长、pH及乳酸变化明显好于其他组，蛋白含量也高于其他实验组。
由以上可知，通过在摇瓶中同一细胞株在不同培养基和同一培养基不同细胞株的测试，结果表明：在细胞培养中用B-AX溶液调控pH，不仅可以有效控制pH和改善乳酸代谢积累情况，还可以显著提高细胞蛋白产量。
实施例5
在3L反应器上的流加补料批次培养方法，包括以下步骤：
3L反应器上的流加补料批次培养的种子细胞是将稳定表达某单克隆抗体的CHO细胞株A培养在基础培养基Actipro(含4mM谷氨酰胺)中的，以0.5±0.1x106cells/mL密度接种进行扩增，在摇床(Infors，瑞士)中培养3天，转速110rpm，温度36.5℃，CO2浓度5％，湿度80％。当种子密度达到4.5-6.5x106cells/mL时进行3L反应器(Finesse,美国)培养接种，接种密度为0.9±0.1x106cells/mL，初始工作体积为1.4L。溶氧控制在50％，初始培养温度为36.5℃，在细胞密度达到17-23x106cells/mL时降温继续培养。培养过程中分别用实施例1的B-XA缓冲液，0.5N氢氧化钠和1M碳酸钠调控pH。在培养的第3天、第6天、第8天、第10天、第12天流加补料培养基，培养周期为13天。实验操作见表格2。
培养过程中每日取样检测活细胞密度和细胞代谢生化值，根据每日葡萄糖残留浓度用300g/Kg的葡萄糖母液进行葡萄糖添加从而维持细胞在培养中的正常葡萄糖代谢。
表2 3L反应器中流加补料批次培养方法
参见图10至图11的检测结果，其中，图10为细胞生长曲线；图11为细胞培养过程中的pH和乳酸变化曲线；图12为细胞培养过程中的渗透度变化曲线；图13为细胞培养过程中的蛋白含量变化曲线。
由图10至图13可知，细胞培养过程中用碱性缓冲液将pH控制在合适的范围内可以得到与不控制pH相一致的细胞生长表现，但是用不同的碱性缓冲液细胞培养表现差异较大，其中用0.5N的NaOH和1M的Na2CO3溶液调控pH，不仅会导致乳酸代谢积累加剧和培养体系中的渗透压显著升高，而且会降低蛋白含量，尤其是使用0.5N的NaOH溶液调控pH，可以是乳酸最高积累到6.0g/L，渗透度升高至450mOsmo/kg，蛋白含量降低约20％。而在用B-AX溶液调控pH，细胞生长状况较好，培养过程中的乳酸和渗透度变化趋势基本同对照组(不控制pH实验组)相同，并且蛋白含量要高于对照组约20％，高于0.5N的NaOH溶液调控pH实验组约45％，高于1.0M对的Na2CO3溶液调控pH实验组约30％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种细胞培养用缓冲液，其特征在于，由氨基酸、氢氧化钠和水组成；
所述氨基酸由丙氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸组成；
所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为10~15mmol/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为10~15mmol/L，所述丝氨酸的浓度为10~20mmol/L，所述色氨酸的浓度为80~85mmol/L，所述酪氨酸的浓度为200~250mmol/L；
所述氢氧化钠的浓度为0.75~0.85mol/L；
所述缓冲液的pH为11~11.4。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用缓冲液，其特征在于，所述缓冲液中，所述丙氨酸的浓度为11~14mmol/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12~14mmol/L，所述丝氨酸的浓度为12~18mmol/L，所述色氨酸的浓度为81~83.5mmol/L，所述酪氨酸的浓度为210~240mmol/L。
3.根据权利要求2所述的细胞培养用缓冲液，其特征在于，所述丙氨酸的浓度为12mmol/L，所述γ-氨基丁酸的浓度为12.5mmol/L，所述丝氨酸的浓度为15mmol/L，所述色氨酸的浓度为82.5mmol/L，所述酪氨酸的浓度为215mmol/L。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将固体氢氧化钠、固体氨基酸和水进行混合，得到混合液；调节所述混合液的pH至11~11.4；
所述固体氨基酸由固体丙氨酸、固体γ-氨基丁酸、固体丝氨酸、固体色氨酸和固体酪氨酸组成；
所述混合具体包括：将所述固体氨基酸与所述水混合并进行第一搅拌处理，再加入所述固体氢氧化钠并进行第二搅拌处理。
5.根据权利要求4所述的细胞培养用缓冲液的制备方法，其特征在于，包含以下特征（1）~（3）中的至少一种：
（1）所述第一搅拌处理的转速为250~350rpm，所述第一搅拌处理的拌时间为30~40min；
（2）所述第二搅拌处理的转速为250~350rpm，所述第二搅拌处理的拌时间为50~70min；
（3）调节所述混合液的pH至11~11.4后，采用过滤精度为0.2μm的过滤器进行过滤。
6.细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将细胞接种至装有液体培养基的容器中并进行振荡培养；当所述液体培养基的pH低于6.6时，加入权利要求1~3中任一项所述的细胞培养用缓冲液，调节所述液体培养基的pH至6.8~7.2后继续进行振荡培养。
7.根据权利要求6所述的细胞的培养方法，其特征在于，包含以下特征（1）~（8）中的至少一种：
（1）所述振荡培养的温度为36.0~37.0℃；
（2）所述振荡培养的转速为110~125rpm，振荡直径为50mm；
（3）所述振荡培养的湿度为70%~90%；
（4）所述振荡培养的CO2浓度为4.0%~6.0%；
（5）所述细胞的培养周期为7~10天；
（6）所述细胞的接种密度为1.4×106~5.0×106 cells/mL；
（7）所述容器包括摇瓶和/或生物反应器；
（8）所述细胞的培养体积小于或等于2000L。
8.细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将细胞接种至基础培养基中进行扩增培养，至细胞的密度为（4.5~6.5）×106 cells/mL时，在细胞培养容器中进行接种，接种密度为（0.8~1.0）×106 cells/mL，当细胞密度达到（17~23）×106 cells/mL时降温并继续培养；在培养过程中，当培养体系的pH低于6.6时，加入权利要求1~3中任一项所述的细胞培养用缓冲液，调节培养体系的pH为6.8~7.2；
在培养的过程中流加补料培养基。
9.根据权利要求8所述的细胞的培养方法，其特征在于，包含以下特征（1）~（10）中的至少一种：
（1）所述细胞接种至基础培养基中的接种密度为（0.4~0.6）×106 cells/mL；
（2）所述扩增培养的温度为36.0~37.0℃；
（3）所述扩增培养采用振荡培养，所述振荡培养的转速为110~125rpm；
（4）所述扩增培养的CO2浓度为4.0%~6.0%；
（5）所述扩增培养的湿度为70%~90%；
（6）所述补料培养基选自Cell Boost 7a和Cell Boost 7b，所述Cell Boost 7a每次的添加体积分数为3%~7%，所述Cell Boost 7b每次的添加体积分数为0.3%~0.7%；
（7）所述基础培养基为Actipro培养基；
（8）所述细胞的培养周期为13~15天；
（9）所述细胞培养容器为生物反应器；所述生物反应器包括玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器和一次性生物反应器中的至少一种；
（10）所述细胞的培养规模为2L~5000L。
CN202210771319.9A 2022-06-30 2022-06-30 细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法 Active CN115044537B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210771319.9A CN115044537B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210771319.9A CN115044537B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115044537A CN115044537A (zh) 2022-09-13
CN115044537B true CN115044537B (zh) 2024-05-24

Family

ID=83164976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210771319.9A Active CN115044537B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115044537B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CN107460159A (zh) * 2017-08-14 2017-12-12 上海多宁生物科技有限公司 无血清、无蛋白补料培养基及其制备方法和运用
CN107760651A (zh) * 2016-08-23 2018-03-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种细胞培养基及生产蛋白质的方法
CN110343666A (zh) * 2019-07-10 2019-10-18 通化东宝生物科技有限公司 一种cho细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用
CN114134114A (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 博雅干细胞科技有限公司 从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CN107760651A (zh) * 2016-08-23 2018-03-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种细胞培养基及生产蛋白质的方法
CN107460159A (zh) * 2017-08-14 2017-12-12 上海多宁生物科技有限公司 无血清、无蛋白补料培养基及其制备方法和运用
CN110343666A (zh) * 2019-07-10 2019-10-18 通化东宝生物科技有限公司 一种cho细胞培养的补料培养基及其制备方法和应用
CN114134114A (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 博雅干细胞科技有限公司 从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
康伟.《生物制药技术行业发展研究》.中国商务出版社,2018,127. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115044537A (zh) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Patnaik et al. L‐tyrosine production by recombinant Escherichia coli: fermentation optimization and recovery
CN109652478B (zh) 谷氨酸的绿色清洁发酵工艺
JP6723163B2 (ja) 発酵系
JP6393267B2 (ja) かん流細胞培養システムを最適化するための方法およびシステム
JP2020534787A (ja) 黒麹種菌の連続培養及びそれを用いたクエン酸製造方法
US20090220934A1 (en) Methods and processes of controlling fermentation
WO1998041611A9 (en) Process for the continuous culture of cells
GB2602727A (en) Method of culture
Heijnen et al. Fundamental bottlenecks in the application of continuous bioprocesses
CN111454877A (zh) 一种cho细胞培养方法
CN115044537B (zh) 细胞培养用缓冲液及其制备方法和细胞培养方法
CN102168118A (zh) 一种用于提高色氨酸发酵产量的方法
KR20020067623A (ko) 발효에 의한 ｏ-아세틸-ｌ-세린의 제조방법
CN110628850B (zh) 一种基于控制比生长速率的半连续生产庆大霉素C1a的方法
CN102220396A (zh) 阿卡波糖简易的发酵方法
CN111944857A (zh) 一种提高l-异亮氨酸产率的发酵方法
JP3958089B2 (ja) 嫌気性菌の連続培養法
CN109628526B (zh) 一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法
US20120258502A1 (en) Method of producing recombinant plasmid dna using substantially solid growth medium
CN115340984A (zh) 一种cho细胞培养方法
CN113684322B (zh) 一种降低抗体类蛋白高聚甘露糖型水平的方法
CN117946954B (zh) 一种亮氨酸生产菌株及其构建方法与应用
CN112680396B (zh) 单抗或重组蛋白大规模生产中细胞扩增的方法
Li et al. High-density Escherichia coli Fermentation and Protein Production Using the Eppendorf BioFlo® 120 Bioprocess Control Station
CN117384989A (zh) 一种降低抗体类蛋白酸性电荷异质体水平的质量调控方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant