CN111705051A - 一种复合消化酶及复合消化酶冻干粉 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种复合消化酶及复合消化酶冻干粉，属于生物组织消化技术领域，其原料包括：胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：10‑20：0.1‑0.3：1‑3：2.5‑5。本发明实施例制得的复合消化酶冻干粉易储存和运输，使用方便，消化能力强，适用于消化大多数肿瘤组织，对于消化如乳腺癌等质地坚硬的组织更加适用，具有很好的通用性。

Description

一种复合消化酶及复合消化酶冻干粉
技术领域
本发明属于生物组织消化技术领域，尤其涉及一种复合消化酶及复合消化酶冻干粉。
技术背景
原代细胞因其特性如拥有正常细胞的形态、能够体现该细胞在生物体内所应该具备的标记和功能，并且克服了连续传代细胞系的污染问题，在基础研究、药物研究与开发和生物制药等领域得到广泛的应用。
在原代细胞培养中，组织消化酶常常用于分离消化组织使其成为单个细胞，是哺乳动细胞分离的主要试剂，应用广泛。
目前，实验室常用的消化酶有胰蛋白酶(Trypsin)和胶原酶(Collagenase)。胰蛋白酶是一种蛋白酶，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用成为球形，从而使细胞分开。胶原酶的化学本质也是一种蛋白质，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，当组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。
实际工作中发现，由于拟消化的组织各有不同，尤其是某些部位的肿瘤组织质地坚硬，单一使用一种消化酶常造成组织消化不完全、消化时间过长、难以获得足够数量和优良增殖能力的细胞以供研究使用。目前各个实验室都是根据文献或经验自行配制消化酶，不但工作繁琐、费时费力，而且酶活力难以得到保持、不耐长期保存、性能不稳定，酶解效果千差万别。
中国专利CN109694846A公开了“含有胰蛋白酶抑制剂的试剂盒及其应用”，包括VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:0.1-20:500-100000:1，优选为50-625:0.5-10:2000-50000:1；还公开了试剂盒在从胰腺样品中分离单细胞中的应用，特别是在制备用于从胰腺样品中分离单细胞的医疗器具中的应用。该专利仅适用于胰腺组织样品的单细胞分离，适用范围较为局限；制得的试剂盒保存条件要求较高，保存时间较短，酶活性很容易失活无效，试剂盒组份多，需要临时配制，造成使用和运输不够便捷。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中不同消化组织配制不同消化酶，费时费力，且酶活性难以保持不耐长期保存的技术问题，提供一种复合消化酶及复合消化酶冻干粉。
一种复合消化酶，其特征在于，其原料包括：胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶。
优选的，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：10-20：0.1-0.3：1-3：2.5-5。
优选的，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：14:0.3:1:5。
一种复合消化酶冻干粉，其原料包括胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶。
优选的，一种复合消化酶冻干粉，其原料还包括蔗糖、甘露醇和无钙镁磷酸缓冲盐。
优选的，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：10-20：0.1-0.3：1-3：2.5-5。
优选的，其原料包括如下质量份组分：40份蔗糖，40份甘露醇，14份胶原酶Ⅰ型，0.3份脱氧核糖核酸酶Ⅰ型，1份透明质酸酶，5份胰蛋白酶和无钙镁磷酸缓冲盐。
优选的，所述物无钙镁磷酸缓冲盐包括如质量份组分8份氯化钠、0.2份氯化钾、1.15份磷酸氢二钠和0.8份磷酸二氢钾。
复合消化酶冻干粉的制备方法包括如下步骤：
向4-8℃无钙镁磷酸缓冲液中依次加入蔗糖、甘露醇、胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶，缓慢搅拌直至各物质完全溶解，溶液澄清透明。
具体的，复合消化酶冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1)配制无钙镁磷酸缓冲液；
(2)配制冻干液：向4-8℃无钙镁磷酸缓冲液中依次加入蔗糖、甘露醇、胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶，缓慢搅拌直至各物质完全溶解，溶液澄清透明(后续加入含量)；
(3)分装冻干液：使用10ml棕色玻璃瓶分装冻干液，每瓶1ml；
(4)冻干。
通过采用上述技术方案，达到如下技术效果：
(1)本发明实施例通过将胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶按照一定比例混合，形成的复合消化酶对组织解离能力强，耗时短，并且获得的活细胞数量较多和细胞增殖能力较强。
(2)本发明实施例制得的复合消化酶冻干粉易储存和运输，使用方便，消化能力强，适用于消化大多数肿瘤组织，对于消化如乳腺癌等质地坚硬的组织更加适用，具有很好的通用性。
附图说明
图1是实施例1方案下软琼脂克隆形成试验结果显微镜放大图；
图2是对照例1方案下软琼脂克隆形成试验结果显微镜放大图；
图3是对照例2方案下软琼脂克隆形成试验结果显微镜放大图；
图4是对照例3方案下软琼脂克隆形成试验结果显微镜放大图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。
实施例1
1、配制无钙镁磷酸缓冲液：
1.1量取1000ml水，至于搅拌器上，缓慢搅拌。
1.2称取氯化钠8.0克，缓慢加至容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
1.3称取氯化钾0.2克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
1.4称取磷酸氢二钠1.15克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
1.5称取磷酸二氢钾0.2克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解，得到无钙镁磷酸缓冲液。
2、配制冻干液：
依次称取下列物质加入到上述无钙镁磷酸缓冲液中：
2.1称取蔗糖40克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
2.2称取甘露醇40克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
2.3称取胶原酶Ⅰ型(DNaseⅠ)14克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
2.4称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0.3克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
2.5称取透明质酸酶1克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解。
2.6称取胰蛋白酶5克，缓慢加至所述容器中，缓慢搅拌直至完全溶解，得到冻干液。
3、分装冻干液
使用10ml棕色玻璃瓶分装冻干液，每瓶1ml。
4、冻干
将分装好的冻干液放置冻干机中冻干，冻干条件：
1)进料前搁板制冷
设置导热油进口温度4℃；
2)冷冻控制
设置导热油进口温度-45℃，保持180分钟；
3)捕水器制冷
设置捕水器温度-50℃，保持30分钟；
4)预抽真空
设置真空为20Pa；
5)一次升华
将真空设置为0帕，将导热油进口温度升至-15℃用时120分钟，保持240分钟；将导热油进口温度升至0℃用时120分钟，保持420分钟(不掺气)；
6)解析干燥
将真空设置为0Pa，将导热油进口温度升至20℃用时120分钟，保持120分钟，将导热油进口温度升至30℃，保持120分钟；
压盖：冻干完成后压盖密封。
实施例2
配制冻干液的步骤中，称取胶原酶Ⅰ型10克；称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0.2克；透明质酸酶3克；胰蛋白酶4克。其他步骤与实施例1相同。
实施例3
配制冻干液的步骤中，称取胶原酶Ⅰ型20克；称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0.1克；透明质酸酶2克；胰蛋白酶2.5克。其他步骤与实施例1相同。
对照例1
配制冻干液的步骤中，称取胶原酶Ⅰ型10克；称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0.2克；透明质酸酶1克；胰蛋白酶0克。其他步骤与实施例1相同。
对照例2
配制冻干液的步骤中，称取胶原酶II型4克；称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0.2克；透明质酸酶0.1克；胰蛋白酶0克。其他步骤与实施例1相同。
对照例3
配制冻干液的步骤中，称取胶原酶Ⅳ型15克；称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0克；透明质酸酶0克；胰蛋白酶3克。其他步骤与实施例1相同。
对照4
配制冻干液的步骤中，称取胶原酶Ⅰ型14克；称取脱氧核糖核酸酶Ⅰ型0克；透明质酸酶0克；胰蛋白酶5克。即仅使用与实施例相同类型、相同量的胶原酶和胰蛋白酶混合，不加入其他消化酶，其他步骤与实施例1相同。
实施例4
用同一组织即卵巢癌，通过实施例1-3、对照例1-4，七种复合消化酶方案对本发明进行阐述，为方便查看比较，实施例1-3、对照例1-4复合消化酶方案如表一所示。
表1
Figure BDA0002605049920000081
具体操作如下：
①取卵巢癌组织，剥离表面的坏死组织、结缔组织和脂肪，用弯眼科剪刀将标本剪成糊状，分成重量相同的7份，转移到离心管中。
②分别向离心管中加入消化液。将离心管置于37℃水浴或温箱中消化。每隔10分钟用移液管吹打5次。取一滴消化物滴在载玻片上于显微镜下观察，基本无胶原纤维，细胞基本分散为单个细胞可以判定消化完成，记录消化时间。
③收获细胞：加入35ml无血清RPMI 1640培养基，混匀后2000rpm离心10分钟，轻轻吸去上清并加入0.5mlRPMI 1640培养基重悬细胞。
④取细胞与等体积的台朌蓝混合，计数活细胞总数；
⑤软琼脂克隆形成试验：使用24孔培养板，每孔细胞100个，做三个平行孔，37℃、5％二氧化碳培养10天统计克隆平均数。
结果如表2和图1-4所示：
表2：
编号 消化时间(分钟) 活细胞总数 克隆数(个)
实施例1 55 4.3*10<sup>5</sup> 14
实施例2 60 4.0*10<sup>5</sup> 13
实施例3 58 4.2*10<sup>5</sup> 14
对照例1 80 3.8*10<sup>5</sup> 10
对照例2 105 3.1*10<sup>5</sup> 9
对照例3 125 2.8*10<sup>5</sup> 3
对照例4 80 3.8*10<sup>5</sup> 10
由表2和图1-4可以看出，同等条件下，本发明实施例1-3对组织的解离能力较强、耗时短，获得的活细胞数量较多和细胞增殖能力较强。其中实施例2、3结果图与实施例1基本一致，对照例4与对照例1结果图一致，因此此处不再赘述。
实施例5
本发明实施例1-3在37℃水浴3小时消化牛跟健胶原25mg，基本消化完全，对照例1-4均有较多剩余。
实施例6
本发明实施例采用的复合消化酶配方制备的复合消化酶冻干粉能够消化解离大多数肿瘤组织，尤其适用于质地坚硬的肿瘤组织如乳腺癌，具有很好的通用性。具体消化时间如表3所示：
表3：
Figure BDA0002605049920000101

Claims (10)

1.一种复合消化酶，其特征在于，其原料包括：胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的复合消化酶，其特征在于，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：10-20：0.1-0.3：1-3：2.5-5。
3.根据权利要求1所述的复合消化酶，其特征在于，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：14:0.3:1:5。
4.一种复合消化酶冻干粉，其特征在于，其原料包括胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的复合消化酶冻干粉，其特征在于，其原料还包括蔗糖、甘露醇和无钙镁磷酸缓冲盐。
6.根据权利要求4所述的复合消化酶冻干粉，其特征在于，所述胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶含量比例为：10-20：0.1-0.3：1-3：2.5-5。
7.根据权利要求5所述的复合消化酶冻干粉，其特征在于，其原料包括如下质量份组分：40份蔗糖，40份甘露醇，14份胶原酶Ⅰ型，0.3份脱氧核糖核酸酶Ⅰ型，1份透明质酸酶，5份胰蛋白酶和无钙镁磷酸缓冲盐。
8.根据权利要求7所述的复合消化酶冻干粉，其特征在于，所述物无钙镁磷酸缓冲盐包括如质量份组分：8份氯化钠、0.2份氯化钾、1.15份磷酸氢二钠和0.8份磷酸二氢钾。
9.根据权利要求5所述的复合消化酶冻干粉的制备方法包括如下步骤：
向4-8℃无钙镁磷酸缓冲液中依次加入蔗糖、甘露醇、胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶，缓慢搅拌直至各物质完全溶解，溶液澄清透明。
10.根据权利要求9所述的复合消化酶冻干粉的制备方法包括如下步骤：
(1)配制无钙镁磷酸缓冲液；
(2)配制冻干液：向4-8℃无钙镁磷酸缓冲液中依次加入蔗糖、甘露醇、胶原酶Ⅰ型、脱氧核糖核酸酶Ⅰ型、透明质酸酶和胰蛋白酶，缓慢搅拌直至各物质完全溶解，溶液澄清透明；
(3)分装冻干液：使用10ml棕色玻璃瓶分装冻干液，每瓶1ml；冻干。
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