CN1176714C - 治疗前列腺癌的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

一种治疗活哺乳动物前列腺癌的方法，包括局部施用含有治疗有效浓度胶原酶的组合物。在一实施例中，治疗活哺乳动物前列腺癌的方法包括局部施用含有治疗有效浓度胶原酶和至少一种糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、纤溶酶原激活剂、链激酶和它们混合物的组合物。较佳地施用糖苷酶，如透明质酸酶。用于治疗前列腺癌方法中的组合物还包括钙离子、非离子表面活性剂如TritonX-100和抗生素如庆大霉素，或与它们一起施用。治疗活哺乳动物前列腺癌的其它方法包括如通过局部施用钙离子激活体内前列腺-特异性-抗原(PSA)。

Description

治疗前列腺癌的方法和组合物
发明领域
本发明涉及治疗前列腺癌的方法，通过单独施用胶原酶或与糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、链激酶或它们的混合物合并施用。典型的实施例包括施用包括胶原酶、透明质酸酶、非离子表面活性剂、抗生素和钙离子的混合物的组合物。
发明背景
如今据信约有10,000,000美国男性患有前列腺癌。虽然只有不到3％患有该病的男性因此而死亡，但前列腺癌依旧是男性癌症死亡的第二杀手。这种癌症通常局限于前列腺，但在某些情况中癌症被诊断出时已扩散到骨骼、肾或脑。
疾病的年度检查增加了早期检测的可能性，尤其在疾病扩散之前。这些检查包括直肠指检和血液前列腺-特异性-抗原(PSA)测试。其它检查方法包括超声波成像、放射性核素扫描和活组织检查。
血液PSA测试已使前列腺癌的早期诊断和有效治疗有了革命性的进展。PSA是丝氨酸蛋白酶家族的一种蛋白酶，且是前列腺分泌的最丰富蛋白质中的一种。PSA是在管上皮和前列腺腺泡中合成的，且位于细胞中的胞质粒和小泡、粗糙型内质网、液泡、分泌颗粒和溶酶体(lyosomal)密体。PSA被分泌到前列腺小管腔内，在那里成为精清的成分。为了到达血清，PSA从腔细胞扩散，通过上皮基膜和前列腺基质，或通过毛细管基膜和上皮细胞或进入淋巴。一旦进入血流，大部分PSA就与α-1-抗胰凝乳蛋白酶(PSA-ACT)和α-2-巨球蛋白形成复合物，少量PSA仍为游离状态(游离PSA)。对前列腺癌而言游离PSA的水平通常会升高。
一旦诊断出前列腺癌，就必须确定并施用合适的治疗方法。已有的治疗方法包括根治性前列腺切除术、放疗和激素抑制。为了确定合适的治疗方法，通常考虑一些因素如患者的年龄和疾病的严重程度。通常这种病对较年轻的患者攻击性较高。通常将任何大于0.5cc的肿瘤视为是临床显著的。局部前列腺癌的优选治疗是根治性前列腺切除术。但这种治疗可能会导致死亡、失禁、阳痿、直肠受损或肺栓塞。
因此，需要改善前列腺癌的治疗方法，以降低一种或多种此类不良副作用的可能性。具体说，需要提供改善的治疗方法以降低患者患阳痿的可能性。
发明概述
本发明涉及治疗活哺乳动物前列腺癌的方法。一方面，该治疗涉及体内激活PSA。可以用一些方法中的一种来激活前列腺内或附近的PSA，如通过局部施用钙离子，优选的是与胶原酶和任选地其它水解酶如透明质酸酶联用。
PSA是一种蛋白酶，是前列腺分泌的最丰富蛋白质中的一种。活化的PSA可以降解前列腺癌性肿瘤，通过如干扰肿瘤的初始生长期和/或干扰血管生成期。前列腺癌生长的初期是指肿瘤生长到豌豆大小左右。除非肿瘤在其周围或内部形成其本身的血管，即所谓的血管生成的过程，否则肿瘤不能再长大。血管生成包括将化学信号送递入周围血管从而侵蚀血管壁，将毛细血管送入肿瘤。通过干扰血管生成，肿瘤就不能生长超过其初始大小。在本发明的一方面，通过施用钙离子可激活PSA。
在本发明的另一方面，前列腺癌的治疗方法指施用含有治疗有效浓度胶原酶的组合物。胶原酶可能降解前列腺癌性肿瘤，通过如维持癌性肿瘤周围或内部的连接组织，包括血管生成所产生的毛细血管。
另一方面，本发明的方法涉及局部施用治疗有效浓度的胶原酶，并与糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、链激酶或它们的混合物联用。与胶原酶一起给予的优选酶是糖苷酶，如透明质酸酶。
用于本发明的组合物还可含有钙离子、非离子表面活性剂(如TritonX-100)和抗生素(如庆大霉素)或与它们合并施用。
发明详述
本发明提供了一种治疗前列腺癌的方法。在本发明中发现可以用含有至少一种水解酶的组合物来治疗前列腺癌。本文所用的“治疗”包括预防、抑制、治愈和减轻前列腺癌或其症状和预防或减轻前列腺癌的转移。
前列腺癌的缓解包括降解前列腺肿瘤，如分解前列腺肿瘤结构的完整性或连接组织，从而当与治疗前肿瘤的大小相比此时肿瘤的大小减少了。前列腺癌的治愈包括降解前列腺肿瘤，从而在治疗后就不再检测到肿瘤。可以减少肿瘤的大小或使肿瘤大小变得检测不到，如通过由于供血的缺乏而萎缩或受一种或多种由本发明方法所施用的成分的攻击或降解。
前列腺癌扩散的缓解包括减缓前列腺癌扩散到其它组织的速度。前列腺癌扩散的防止包括预防前列腺肿瘤扩散到前列腺之外。
依据本发明的一种疗法是通过施用治疗有效浓度的组合物，所述的组合物含有能有效缓解、治愈、抑制或防止前列腺癌或预防或减轻前列腺癌扩散量的骨胶原。
将含有胶原酶的组合物局部施用于前列腺。局部施用包括将组合物送入前列腺和/或癌性治疗内或周围。局部施用还包括用组合物包围前列腺和/或癌性肿瘤或将组合物施用于前列腺和/或癌性肿瘤表面。癌性肿瘤包括前列腺癌、癌细胞等。
本发明的其它治疗可以通过激活体内PSA进行。体内PSA激活包括激活在前列腺内和/或附近的PSA，尤其是哺乳动物内源性PSA。PSA是一种蛋白酶，被激活后能有助于前列腺肿瘤的溶解或降解。在另一实施例中，通过在前列腺中局部施用钙离子可以激活PSA。
虽然本发明中的方法不希望束缚于理论，现描述涉及本发明方法如何治疗前列腺癌的理论。在初始阶段，癌性治疗生长到豌豆大小。然后通过血管生成，肿瘤长大(即通过将化学信号送递到周围血管，肿瘤在其周围和内部长出血管向肿瘤提供毛细血管)。据信本发明的治疗干扰这种进展。
PSA是一种分子量约为3.3万道尔顿的丝氨酸蛋白酶，且是前列腺分泌物中最丰富的蛋白质之一。据信通过激活PSA，PSA可以部分或完全溶解或降解前列腺内的肿瘤细胞。这种过程特别可用于初始生长阶段的肿瘤以及血管生成阶段的肿瘤。可以通过如施用钙离子激活PSA。
胶原酶是一种金属蛋白酶。据信少量蛋白水解酶的存在可以增加胶原酶的活性，即所存在的蛋白酶的量不能高到蛋白酶将胶原酶消化到使其失活的程度。分泌到前列腺的PSA可能足以增加胶原酶的活性。通过增加胶原酶的活性，胶原酶的活性由不能有效降解足量的底物(如降解结缔组织)的水平上升至能有效降解足够底物的水平。随后例如，在PSA存在下，胶原酶可以降解胶原或结缔组织、肿瘤血管和/或肿瘤细胞基膜。结果，肿瘤的供血减少或停止，导致肿瘤细胞死亡。这也可能会导致人免疫系统向肿瘤进一步的攻击，和辅助前列腺癌的减轻和治愈或减轻或防止前列腺癌的扩散。
在本发明的方法中，胶原酶可以与其它蛋白酶、酶或适用于增加胶原酶活性或辅助肿瘤降解的蛋白质合并施用。例如，胶原酶可以与蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、链激酶或它们的混合物合并施用。
糖苷酶包括任何能催化糖苷键水解的酶。合适的例子包括透明质酸酶、神经氨酸酶、淀粉酶和溶菌酶。优选的糖苷酶包括透明质酸酶。
蛋白酶包括任何能催化蛋白质或肽中一种或多种肽键水解的酶，如羧肽酶、氨肽酶和内肽酶。特别适用的例子包括弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、分散酶、菠萝蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、纤溶酶、舍雷硫代肽酶(serrathiopeptidase)、胰酶、组织蛋白酶-G、纤溶酶原激活剂和多形核(PMN)白细胞丝氨酸蛋白酶。
核酸酶包括任何能催化核酸内酯键水解的酶，如核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。合适的例子包括DNase I和RNase。
酯酶包括任何能催化酯水解的酶。合适的例子包括胆固醇酯酶。
脂肪酶包括任何能催化酰基甘油羧酸酯水解的酶。合适的例子包括磷酸酯酶。
链激酶包括能与纤溶酶原形成复合物从而催化纤溶酶原活化成纤溶酶的蛋白质。
该组合物还可以含有钙离子、表面活性剂和/或抗生素，或与它们合并施用。
可以单独、顺序施用组合物中的成分-胶原酶、其它蛋白酶、蛋白质、或酶、钙离子、表面活性剂和抗生素，较佳地以适用于局部用药的液体药用单位剂型与另一种混合。所施用的组合物的剂量可以在很大的范围中变化这易于由临床医生确定。为获得理想治疗目的的优选剂量取决于患者的年龄、疾病的特性和严重程度、组合物的效力和施用的方式。
较佳地，适用于本发明方法的组合物含有胶原酶和至少一种糖苷酶(较佳地为透明质酸酶)、蛋白酶(较佳地为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、弹性蛋白酶、分散酶或纤溶酶)、或核酸酶(较佳地为DNase I)。更佳地，组合物含有胶原酶和糖苷酶(较佳地为透明质酸酶)。Gokcen等人的美国专利No.5,116,615中描述了适用于本发明方法的组合物，本文将其纳入作为参考。
胶原酶
细菌胶原酶如溶组织梭菌(Clostridium hystolyticum)的胶原酶EC 3.4.24.3是一种已很好定性且可购得的酶，通过在三股螺旋上多个位点的水解，它将胶原降解成短肽。胶原酶在其活性位点含有Zn2+，且与其底物的结合及形成能完全催化活性所需的构型需要Ca2+。
静脉内注射胶原酶显现出对试验动物有极低程度的危害。对小鼠而言，静脉注射胶原酶粗制品的LD-50为300mg/kg体重。已显示胶原酶的口服水溶液在剂量高到8,000mg/kg体重时仍无毒性。对胶原酶而言，大鼠急性静脉注射LD-50可达1272单位/公斤。
细菌胶原酶的商业产品通常含有少量污染蛋白酶、肽酶、粘多糖酶和糖苷酶，包括梭菌蛋白酶、胰蛋白酶和酪蛋白酶样氨肽酶。梭菌蛋白酶是粗制胶原酶制剂中最多的污染酶。梭菌蛋白酶含有必需SH基团，且能被半胱氨酸激活而受巯基结合剂的抑制。梭菌蛋白酶也具有胰蛋白酶类的特异性。粗制胶原酶制剂中含有少量污染酶如胰蛋白酶，梭菌蛋白酶常常比高纯度的胶原酶制剂具有更高的效力，表明在前列腺癌的治疗中可能有多种酶或蛋白酶的共同作用。这些酶和/或蛋白酶能辅助活化胶原和/或辅助降解肿瘤，通过催化水解对肿瘤生长或其结构完整性而言很重要的键。
当与其它蛋白质和/或酶(如糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、链激酶或它们的混合物)联用时，粗制胶原酶制剂在治疗中特别有用。
糖苷酶
适用于本发明方法的糖苷酶包括透明质酸酶、神经氨酸酶、淀粉酶和溶菌酶。较佳地糖苷酶是透明质酸酶。
已知透明质酸酶(透明质酸-4-聚糖水解酶)是一种已知的催化透明质酸(酸性粘多糖)水解成双糖、四糖或它们混合物的酶。优选的是从绵羊睾丸(EC2.1.1.35)衍生出的透明质酸酶。
将75,000国际单位的透明质酸酶注射入动物，血压、呼吸、体温或肾功能都没有明显的变化。通常透明质酸酶是不注射到已知感染的区域的。
淀粉酶包括酶如α-淀粉酶或β-淀粉酶，淀粉酶能水解淀粉、糖原和相关多糖中的O-葡糖基。
神经氨酸酶将连接末端非还原性N-和O-酰基神经氨基酸残基的2，3-、2，6-和2，8-葡糖苷键水解成半乳糖，将N-乙酰基己糖胺、或N-或O-酰基神经氨基酸残基水解成半乳糖，将寡糖中的N-乙酰基己糖胺、或N-或O-酰基神经氨基酸残基水解成糖蛋白或糖脂。
溶菌酶水解葡聚糖肽异聚物中N-乙酰基胞壁酸和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖残基间的β-1，4-键。溶菌酶为EC 3.21.17。
蛋白酶
适用于本发明方法蛋白酶的例子包括弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、分散酶、菠萝蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、纤溶酶、舍雷硫代肽酶、胰酶、组织蛋白酶-G、纤溶酶原激活剂和多形核白细胞丝氨酸蛋白酶。
弹性蛋白酶包括任何能水解弹性蛋白的酶。胰弹性蛋白酶EC 3.4.21.36就是一个例子。胰弹性蛋白酶催化蛋白质(包括弹性蛋白)的水解，择优切割Ala-Xaa。
胰蛋白酶是一种择优切割Arg-Xaa和Lys-Xaa的丝氨酸内切蛋白酶。胰蛋白酶为EC 3.4.21.4。
胰凝乳蛋白酶是丝氨酸内切酶EC 3.4.21.1。
链霉蛋白酶(Calbiochem/Behring，La Jolla，California的注册商品名)是从链霉菌得到的各种菌外和菌内蛋白酶的混合物。它能将任何蛋白质基本上完全水解成游离氨基酸。
分散酶是一种通常从多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)得到的中性金属蛋白酶。
菠萝蛋白酶是一种具有广特异性的半胱氨酸蛋白酶，鉴定为EC 3.4.22.32。
梭菌蛋白酶是一种特异性切割Arg-Xaa和Arg-Pro键的半胱氨酸蛋白酶，鉴定为EC 3.4.22.8。
嗜热菌蛋白酶是一种择优切割Xaa-Leu和Xaa-Phe的金属内切蛋白酶，鉴定为EC 3.4.24.27。
枯草杆菌蛋白酶是一种催化蛋白质水解的丝氨酸内切蛋白酶，对肽键特异性广，鉴定为EC 3.4.21.62。
木瓜酶是一种半胱氨酸肽链内切酶，其择优水解结合于Arg、Lys、Phe残基上羰基的肽，鉴定为EC 3.4.22.2。木瓜酶还具有酯酶、硫酯酶、酰胺转移酶和转酯酶活性。
木瓜凝乳蛋白酶是一种具有与木瓜酶类似特异性的内切蛋白酶。木瓜凝乳蛋白酶为EC 3.4.22.6。
纤溶酶也称为血纤蛋白溶酶，是一种将血凝块中的难溶性纤维蛋白转化成可溶性产物的丝氨酸蛋白酶。它是通过蛋白水解从纤溶酶原形成的，择优切割Lys-Xaa和Arg-Xaa。纤溶酶为EC 3.4.21.7。
组织蛋白酶G是一种具有与木瓜凝乳蛋白酶类似特异性的糖蛋白丝氨酸内切蛋白酶。该蛋白酶为EC 3.4.21.20。
纤溶酶原激活剂包括任何能将纤溶酶原转化成纤溶酶的丝氨酸蛋白酶。
多形核(PMN)白细胞丝氨酸蛋白酶包括在多形核白细胞中发现的丝氨酸蛋白酶。
其它蛋白酶包括(但不限制于)胰酶和舍雷硫代肽酶。
核酸酶、脂肪酶和酯酶
适用于本发明方法的核酸酶例子包括DNase I和RNase。DNase I(脱氧核糖核酸酶I)是一种能催化将DNA内切成5’-磷酸二核苷酸和5’-磷酸寡核苷酸终产物的酶。DNase为EC 3.1.21.1。RNase是一类切割磷酸二酯键和RNA链的核酸酶。
适用于本发明方法脂肪酶的例子包括胆固醇脂肪酶。
适用于本发明方法酯酶的例子包括磷酸酯酶。磷酸酯酶是一种催化甘油磷脂水解的酶。已将磷酸酯酶分成A1、A2、B、C和D型。
钙离子
还可施用钙离子来治疗前列腺癌。钙离子可以用以激活胶原酶和/或PSA。可以通过如氯化钙来提供钙离子。通常钙离子的浓度约在1mM到50mM之间，较佳地在10mM和50mM之间，更佳地约为20mM。
在一治疗实例中，活化的PSA能降解或溶解前列腺肿瘤并干扰初始肿瘤生长和/或血管生成。在另一治疗实例中，可以将活化的PSA与胶原酶联合施用，活化的PSA可以增加胶原酶的降解蛋白活性。从而使胶原酶降解前列腺肿瘤。在另一治疗实例中，可以将胶原酶与钙离子和/或蛋白酶、酶、蛋白质、非离子表面活性剂或抗生素一起联合施用来治疗前列腺癌。
非离子表面活性剂
适用于本发明方法的组合物还可含有非离子表面活性剂或与其一起施用。表面活性剂辅助前列腺癌组织的溶解和裂解。合适的表面活性剂的例子包括烷基苯基多氧乙烯表面活性剂如TritonX-100(辛烷基苯氧基多乙氧基乙醇，可以从Rohm and Haas，Philadelphia，PA购得的一种辛烷基苯基多氧环氧乙烷)和其它多氧亚烷基-基的非离子表面活性剂如Tween20/80(Atlas Chemical)、Genapol X-080/100/150、C-100(Hoechst AG)、Thesit(Destin-Werk GMBH)、Brij35、Lubrol PX(ICI Americas)、Igepal CO-630/710(GAF)、Surfonic N-95(Jefferson)、Tergitol NP-27(Union Carbide)。其它合适的表面活性剂包括环氧乙烷与山梨糖醇的部分脂肪酸脂及山梨糖醇酐的缩合产物，如Tween系列(Atlas Chemical)，其中环氧乙烷与醇的摩尔比例在15∶1到25∶1的范围内，脂肪酸成分包括月桂酸、硬脂酸或油酸(C10-C20)。
其它可有用本发明的非离子表面活性剂包括C6-C12烷基酚的环氧乙烷酯，如壬烷苯氧基多氧乙烯醚。特别有用的由8-10摩尔环氧乙烷与壬基苯酚缩合制备的酯。可购得的这种类型的表面活性剂包括Igepal CO系列(GAF Corp.)。
其它可用的非离子表面活性剂包括环氧乙烷与疏水聚氧亚烷基缩合的产物，如环氧丙烷与丙二醇缩合。这种类型的化合物包括可购得的表面活性剂Pluronic E-127、Pluronic PX和Pluronic L-62(Wyandotte Corp.)。
其它可用的表面活性剂包括C8-C22烷基醇(每摩尔醇含有2-50摩尔环氧乙烷)的缩合产物。这种类型的表面活性剂包括C10-C20脂肪烷基醇(每摩尔醇含有3-45摩尔环氧乙烷)的缩合产物。这些化合物是可购得的，如Poly-Tergent SLF系列(Olin Chemicals)或Tergitol系列(Union Carbide)。
这些适合的表面活性剂的表现会受如pH、温度、离子强度和表面活性剂浓度的影响。
较佳地，加入浓度占组合物体积约0.1％到10％的表面活性剂。更佳地，表面活性剂存在的浓度约为0.5％到5％(体积)。
抗生素
适用于本发明方法的组合物还可含有抗生素，或可与抗生素一起施用。一般，通过如直接注射前列腺局部适用于前列腺是安全、简单且有效的将组合物引入身体的手段。当然一些局部施用方法可能会有患细菌感染的危险，而后者将导致如发烧、菌尿和菌血病。
抗生素常常可以迅速减轻急性前列腺感染的症状。但，没有一种抗生素是能够有效抵抗所有致病尿道微生物。各种抗生素都具有其自身抗一种或几种微生物品种的范围。较佳地，用于治疗细菌前列腺炎的药物是高脂溶性的；具有碱性pKa；对血浆蛋白质的结合极小；且是常规革兰氏阴性尿路病原体的杀菌剂。
较佳地，本发明的组合物含有合适的抗生素以预防或降低可能与本发明自身方法相关的细菌感染的发病率。所用的抗生素通常提供足够的保护抵抗常遇到的尿路病原体细菌菌株包括：大肠杆菌、粪链球菌、变形菌/单孢菌和凝固酶阳性葡萄球菌。较佳地，抗生素选自基本不抑制组合物酶促活性的抗生素。
本发明组合物中的抗生素(较佳地为庆大霉素或三甲氧苄二胺嘧啶/磺胺甲噁唑)可选自表现出具有合适抗常遇到的尿道病原体细菌菌株活性范围的抗生素，包括：青霉素(青霉素G、青霉素V、苄星青霉素)、氨基青霉素(氨苄青霉素、羟氨苄青霉素)、羧基青霉素(羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、美洛西林)、抗青霉素酶的青霉素(甲氧苯青霉素、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素)、先锋霉素(头孢氨苄、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢唑啉)、氨基糖苷类(链霉素、新霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、西索米星)、四环素(脱氧土霉素、米诺四环素、四环素)、多粘菌素(多粘菌素B和E)、磺胺类药(磺胺异噁唑、琥珀磺胺噻唑)、氟代喹诺酮(环丙沙星、诺氟沙星)、碱性大环内酯(红霉素、竹桃霉素)、洁霉素、氯洁霉素、氯霉素、呋喃妥因和萘定酸。
适用于本发明方法的抗生素包括硫酸庆大霉素(Garamicin，ScheringCrop.，Kenilworth，New Jersey)、三甲氧苄二胺嘧啶/磺胺甲噁唑(Septra，Burroughs Wellcome，Research Triangle Park，N.C.)、呋喃妥因、萘定酸、妥布霉素、阿米卡星和硫酸奈替米星。
较佳地，施用硫酸庆大霉素或三甲氧苄二胺嘧啶/磺胺甲噁唑。如今施用三甲氧苄二胺嘧啶/磺胺甲噁唑是治疗细菌性前列腺炎的首选药物。最近的研究表明在预防手术后细菌的尿道感染中，单剂量庆大霉素、三甲氧苄二胺嘧啶/磺胺甲噁唑或硫酸奈替米星能有效地长期起作用。
三甲氧苄二胺嘧啶是脂溶性碱，与血浆蛋白质的结合有限，通常表现为前列腺组织：血清浓度为2∶1到3∶1。三甲氧苄二胺嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SMX)在尿和前列腺分泌物中产生治疗浓度，且有合适的抗菌活性范围。最佳用TMP/SMX的治疗包括160mg TMP和800mg SMX剂量，一天口服2次，共30天。如果不能耐受TMP/SMX(过敏)，推荐庆大霉素治疗。
在组合物中抗生素存在的量通常约为0.15到150μg/ml浓度。优选的抗生素(硫酸庆大霉素)在组合物中存在的浓度为1.5-150μg/ml，较佳地为10-25μg/ml。另外，就那些一般对氨基糖苷过敏，尤其是对庆大霉素过敏的人而言，甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的联用药物可以替代庆大霉素作为本发明组合物中的优选抗生素。甲氧苄啶存在的优选浓度为1-10μg/ml，较佳地为5-10μg/ml。磺胺甲噁唑存在的优选浓度为30-105μg/ml，较佳地为50-105μg/ml。
所示组合物的制备和测试
本发明作为优选实施例公开了局部施用的组合物水溶液，其含有安全且有效治疗浓度的水解酶胶原酶和透明质酸酶除垢剂TritonX-100和抗生素庆大霉素。较佳地，将所公开的组合物制备成在相对小体积中水解酶较浓的水溶液。
较佳地，所公开的组合物以适用于前列腺内注射的单位制剂提供。可以在生理可接受液态稀释剂(如无热原的盐水)中化合物的溶液或悬浮液的可注射用剂型适用于患者。例如，可以制备装有该冷冻干燥组合物的小瓶，从而可以重新溶解该组合物的无菌成分，得到适用于注射入活哺乳动物的药学上可接受的水溶液。单位剂型优选含有250到250,000U/ml胶原酶；160到160,000U/ml透明质酸酶；0.1％到10％非离子表面活性剂；和0.15到150μg/ml抗生素。较佳地，单位剂型含有2,500到25,000U/ml胶原酶；1,600到16,000U/ml透明质酸酶；0.5到5％非离子表面活性剂；和15到150μg/ml抗生素。
制备本发明的组合物。得到冷冻干燥的胶原酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)和透明质酸酶(Boehringer/Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)，用含有20mM到50mM CaCl2(CBSCa)的柠檬酸盐缓冲盐水重新溶解所需的浓度。将从溶组织梭菌(Clostridium hystolyticum)中得到的胶原酶进行层析纯化，此胶原酶含有原低污染量的酶梭菌蛋白酶、胰蛋白酶和酪蛋白酶。同样层析纯化自绵羊睾丸得到的透明质酸酶。所有酶的活性都以每mg国际单位表示。
当在4℃以冷冻干燥保存时，这些酶都是稳定的。但这有利于防止湿气进入冷冻干燥的酶。例如，通常在开启前将装有冷冻干燥酶的冷小管升温至室温。一般将酶稀释重新溶解的溶液避光存储于4℃，当在工作台进行操作使将它们置于冰浴中。
较佳地，用新鲜蒸馏的去离子无菌水来还原酶，和制备用于注射用溶液的缓冲液。在一优选实施例中，所用的缓冲液是0.05M柠檬酸盐缓冲盐水(CBS，pH6.7)，含有足够量(较佳地为0.01M到0.05M，更佳地为0.02M到0.05M)的钙离予以活化胶原酶。据信任何合适的缓冲溶液如Ringers盐水或Tris缓冲盐水都是可用的。但缓冲液通常含有足以活化胶原酶的钙离子，且通常不含钙鳌合剂如EDTA或酶活性的其它抑制剂(如半胱氨酸)。
优选的缓冲液表现为生理pH，其范围约为6.5到7.5，优选的是6.7到7.0。盐水如氯化钠浓度约0.1M到0.2M，优选的是0.15M到0.2M。类似地，柠檬酸盐的浓度较佳地为0.02M到0.1M，优选的为0.05M到0.1M。，
0.05M CBS+20mM CaCl2(pH6.7)的制备物由550mg柠檬酸钠、190mgNaOH和876mg NaCl溶解于100ml无菌无热原的去离子水中构成。用3ml 1NNaOH将溶液的pH调节至6.7，并加入294mg CaCl2。加入表面活性剂TritonX-100(Malinckrodt，Paris，Ky)和抗生素庆大霉素(Sigma Chemical Co.)至合适的终浓度。TritonX-100在20℃的密度为1.082g/ml(20℃924μl/g)。在100ml混合物中加入1.5ml 10mg/ml(15mg)抗生素的无菌溶液，从而得到含有终浓度为150μg/ml庆大霉素的溶液。
用标准方法纯化和灭菌此法得到的溶液。用含有TritonX-100(0.1％到10％)、抗生素庆大霉素(1.5到150μg/ml)和CaCl2(20mM)的柠檬酸盐缓冲盐水(pH6.7)无热原的水制备胶原酶和透明质酸酶(0.1％到10％)的酶溶液(5ml)，并通入1ml柱(Detoxi-Gel)中以除去潜在的内毒素。药学上可接受的溶液制备的最后步骤包括将此组合物通过孔径为0.2m微米的已确定为无菌无热原的微孔聚砜过滤器。由聚砜构成的低蛋白结合滤膜显示明显比相当的醋酸/硝酸纤维素膜过滤器更少的蛋白质吸收。用0.2mm无菌过滤器过滤起到抗微生物污染的保护作用。另外，过滤使患者接触不溶性颗粒或微团聚体的危险性最小。
按医院药房标准方法进行人肠胃外用药的药学上可接受的溶液的重新溶解和制备。当在4℃储存时，在含有20mM CaCl2(CBSCa6.7)(浓度范围为0.1％到10％)的0.05M柠檬酸盐缓冲盐水的胶原酶/透明质酸酶/TritonX-100/庆大霉素(CHTG)的溶液能稳定2周，且保持高度有效地溶解人和犬的前列腺组织。据信组合物的毒性不会高于已知的各成分的毒性。
从Sigma Chemical Company购得自溶组织梭菌(Clostridium hystolyticum)衍生的胶原酶(EC 3.4.24.3)(XI型，产品#C-7657，批号：96F-6801和96F-6838；XI-S型，产品#C-4785，批号：17F-6814)。观察到酶活性(以胶原酶U/mg计)和污染酶水平的批间的变化，范围为：胶原酶1910到2450U/mg、梭菌蛋白酶0.86到1.4U/mg、酪蛋白酶40到85U/mg和胰蛋白酶0.05到0.52U/mg。
一个单位胶原酶活性的定义为在钙离子存在时，37℃，pH7.4，5小时内能从天然胶原释放肽(相当于茚三酮颜色)成1微摩尔L-亮氨酸的胶原酶量。存在2.5mM二硫苏糖醇时，在25℃pH7.6，1个单位梭菌蛋白酶每分钟能水解1微摩尔N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)。在pH7.5，37℃，1个单位的酪蛋白酶(非特异性蛋白酶)在5小时内能将酪蛋白水解产生颜色相当于1微摩尔(181μg)L-酪氨酸。pH7.6，37℃，一个单位的胰蛋白酶活性每分钟能水解1微摩尔N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)。
可以按本领域已知的方法确定胶原酶和其它酶的活性。Gokcen等人的美国专利No.5,116,615公开了胶原酶和透明质酸酶分析的实例，本文将其纳入作为参考。
组合物基本无内毒素，内毒素指已知对人和动物有剧烈副作用的革兰氏阴性菌的热原性脂多糖成分。
给药方法
本发明的一个方法涉及活化体内PSA。在一实施例中，通过如局部施用治疗有效浓度的钙离子在体内活化PSA。通过与局部施用治疗有效量的胶原酶(通常可以和选定的蛋白酶、蛋白质或酶、钙离子、表面活性剂和/或抗生素合并施用)联用，可以在体内活化PSA。
本发明的其它方法涉及施用可用于治疗前列腺癌的肠胃外组合物的水溶液。合适的组合物如上所述，且包括治疗有效量的胶原酶且任选含有一种或多种如下成分：如上所述选定的蛋白酶、蛋白质或酶、钙离子、表面活性剂和抗生素。在一实施例中，该组合物含有胶原酶、透明质酸酶、钙离子、表面活性剂和抗生素。可用如CaCl2提供钙离子。表面活性剂可以是如TritonX-100，而抗生素可以是如庆大霉素。
将此组合物局部施用于前列腺。局部施用包括将组合物施用于前列腺和/或癌细胞或肿瘤内或其附近，较佳地为肿瘤内。局部施用包括用组合物包围前列腺和/或癌性肿瘤或将组合物适用于前列腺和/或癌性肿瘤的表面。例如，通过直接的前列腺内注射或灌注入前列腺，能局部施用组合物。较佳地，小容量如约5cc或更少，通过注射。而较大的容量如5cc以上通过缓慢灌注约15-20分钟。
为了证明施用的精确性，即组合物是否施用于前列腺细胞或肿瘤的附近或进入它们，泌尿科医生通常可以通过如成像(可以在诊断过程和前列腺活体检查过程中得到)得到前列腺图像。
局部施用组合物，从而局部给予治疗有效量的组合物来治疗前列腺癌。较佳地，该量足以降解前列腺肿瘤，治愈或减轻前列腺癌。
在一实施例中，通过前列腺内局部注射施用组合物。通过在指诊直肠控制(digital rectal control)和/或超声波指导下，将一长的细针插入前列腺内进行前列腺内注射。这种注射通常是在局部麻醉下进行的，且注射溶液可以用碘卡因(iodocaine)稀释。在注射过程中，针可以不时地重定位，以使组合物得到能最好地分布。有一些注射途径将本文所公开的组合物引入前列腺。
施用的优选路径是经尿道的前列腺内(病损内)注射。经尿道方法是在插入导管后迅速进行的。注射的组合物的量通常为1到50cc。
为了使注射的组合物的有效性最佳，可以用充气囊扩张前列腺尿道。通过膀胱镜插入的囊，抑制注射入的酶溶液通过多孔管道系统(流注入尿道)的立即溢出。这种注射方法的优点是此方法能直接用膀胱镜观察病损的瘤状区域。在前列腺直接注射的过程中，患者所经受的痛苦和不适最小，且可以与肌内注射相比。
另外，可以用前列腺注射的经腹膜或经直肠路径。注射的经腹膜路径包括在超声波和/或指诊指导下，将22g×20cm的针吸活检用的针通过会阴插入前列腺。然后，将1-50cc所公开的组合物局部注射入前列腺的各侧叶。通常在局部麻醉下进行注射。在注射过程中，针可以不时地重定位，以使组合物得到能最好地分布。在指诊直肠控制下可以用超声波指导针的定位。这种经会阴路径的注射是一种较好的替代经尿道或经直肠的方法，能减少由注射后细菌感染而引起的潜在并发症。
为了降低与经会阴前列腺内注射相关的细菌感染，推荐使用无菌注射方法而且这是本领域技术人员已知的。将多种标准杀菌制剂(如Phiso-Hex、Betadine、聚乙烯吡啶酮-碘或洗必泰)中的任何一种施用于会阴的皮肤上，以提供适当的注射前的抗菌保护。使用无菌尿、适当的皮肤保护和杀菌方法，整个过程发生感染并发症的比例应较低。
经直肠路径将针引入直肠壁，并在进行直肠指诊时注射入前列腺。用微弧形的22g×20cm柔韧型针吸活检用的针进行通过经直肠路径的注射。使用Franzen针导向器(Precision Dynamics，San Fernando，Calif)，在超声波和/或触感指导方法下，能让针安全地插入所怀疑的病损处。将无菌前列腺针导向器置于带有手套的食指上。通过导向器将针插入直肠，并触摸前列腺疑有病损的区域。可以将约1-50cc溶液注射入前列腺的侧叶。为了注射足够的物质，将针前后移动3-5次。可以在注射前使用麻醉胶以降低针插入时的疼痛。
一旦注射，前列腺叶就膨胀，尺寸增加并变得涨满。在注射位点通过的注射液可以引起的分布很广的与微梗塞相关静脉痉挛。在注射后可能发生急性无尿。注射入前列腺的液体充满注射位点叶泡，且通过泡小管可以通过邻近的叶泡进入前列腺尿道。有1/3到1/2的注射液最终进入前列腺尿道。
在前列腺原位将5cc以上的组合物注射入体内，导致反射性平滑肌收缩，使治疗性酶溶液迅速通过多孔管远离靶组织而进入尿道。注射的冲力将导致注射位点的前列腺组织破裂。注射的液体可能进入腺泡系统的管，并完全充满该腺。一旦腺被充满，液体就占据了阻力最小的通道并进入尿道。
注射液可以进入前列腺循环并可能会分散梗塞的小区域。引起血管血栓静脉炎的酶可能是广布的出血性梗塞产生的原因。由包括肾的亚甲篮分泌的试验证明约1/5前列腺注射用可能进入体循环。前列腺的囊下和尿道周的区域天然具有更多的血管，且可以提高液体进入血流的循环。将印度碳黑染料颗粒注射入前列腺，在股盆的淋巴腺内肉眼或显微镜未观察到可检查的颗粒。前列腺注射液通过针的插入点可能还到达前列腺表面和前列腺周围的组织。
在前列腺内注射硫酸钡的不透放射线的微乳剂后，立即进行的放射照相显示前列腺囊下液体漏出，并进入膀胱。偶尔，看见液体还渗漏到囊外。
被注射的前列腺小叶会坏死，主要是因为注射组合物的酶促反应，部分是因为注射液体在压力下的剪切力。通过针插入点漏出的部分液体可能会导致表面血管的形成血栓且可能会造成附近脏器的粘附。渗漏出的液体量取决于局部压力，而且可能为增加注射的压力。通过尿道周围静脉的注射液可能会使它们发炎和形成血栓，而后尿道上皮坏死和脱落。
预计在前列腺尿道的周围可能为发生尿道和尿道周增溶，而导致尿道上皮剥落。与注射组织增溶酶相关的组织生理学变化包括那些因腺管的液体逸出而造成的导管和周围小泡的损伤。自针孔留出的液体可能为影响那里的囊管和平滑肌纤维肌性的基质。
前列腺的直接局部注射而导致的高浓度治疗性酶是主要问题，但没有代谢失效的危险。当感染急性加剧时不推荐这种前列腺内注射，因为通常会有注射剂侵染及可能的败血症的危险。在注射后的几周可能会存在血尿和血性精液。
按所治疗的患者的情况，所施用的组合物的治疗有效剂量范围为1cc到50cc，较佳地含有160到160,000U/ml透明质酸酶、250到250,000胶原酶、0.1到10％非离子表面活性剂(较佳地为TritonX-100)；和0.15到150μg/ml抗生素(较佳地为庆大霉素)。更佳地，剂量包括2,500到25,000U/ml胶原酶、1,600到16,000U/ml透明质酸酶、0.5到5％非离子表面活性剂(较佳地TritonX-100)和15到150μg/ml抗生素(较佳地庆大霉素)。这些剂量范围表示估计能有效治疗前列腺癌的组合物各成分的量。但组合物的剂量可以按患者的年龄、病症的特性和严重程度、组合物的效力及施用的途径变化。可以每天、每周或每月注射施用指示剂直到达到所需的治疗结果。
在一些实施例中，为了确定合适的剂量，确定肿瘤的尺寸因为较大的肿瘤可能需要较高浓度的施用于本发明方法的组合物。例如，对小于7g的肿瘤，通常施用单次灌输的剂量。灌输剂量可以为5cc，较佳地含有250-250,000U/ml胶原酶、160-160,000透明质酸酶、0.1％到10％非离子表面活性剂、0.15-150μg/ml抗生素和20mM-50mM CaCl2的柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)。较佳地缓慢将此注射剂注射入肿瘤，如约几分钟。如果需要在此注射后还可再注射。例如，可以再次施用这种治疗，如在1周或1个月内，也可重复施用如每周或每月。
当肿瘤为7到15g时，通常在第一次注射剂量后可以用较大剂量的组合物。例如，第一次施用所述的5cc灌注剂量。然后，缓慢地施用第二份25到45cc的相同组合物，如约15-20分钟。如果需要可以顺序施用这些指示剂，但一般不超过50cc总体积。例如，可以再次施用这种治疗，如可以在一周或一个月重复施用，例如每周或每月。
对大于15g的肿瘤，第一次施用灌注剂量可以给予至多50cc，随后可以施用如上所述的更大的剂量。
其它给药方法
如果遇到限制或抑制本发明组合物治疗效果的问题，可以使用其它送递方法。例如，酶治疗的有效性可能受如下限制：外部给予的酶的半衰期短、外源蛋白质的免疫应答的产生、抗蛋白酶效应子(α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白)的抑制、或将酶特异性导向病损瘤状区域的能力的丧失。
可用许多不同的载体系统将酶促组合物送递到所需的前列腺位点。通常，合适的载体将治疗剂送递到其靶点而不会丧失特异性或反应性。较佳地，载体能与治疗性酶连接且可以保持成复合物直到送递完成。较佳地载体应避免触发导致本发明组合物生物降解或失活的免疫防御机制。
可以施用缓释组合物，即可以缓释、防止进入体循环并增加组合物的前列腺特异性定位。可以用缓释植入法提供这种制剂，或以微胶囊或吸附于生物可降解聚合物或前列腺特异性免疫球蛋白提供。
较佳地将抗体用作酶脂质体载体系统。用抗体作为将治疗剂送递到特定组织的载体系统开发了能独特识别和结合抗原的抗体。同样，携带治疗剂的抗体能更有效地结合于组织(天然分布许多血管或经历血管生成)。另外，可用不同品种识别不同细胞类型的免疫酶螯合物混合剂。
可以产生组织特异性单克隆抗体，更好地确定将定位的抗原性细胞靶。可以用F(ab)或F(ab’)2片段改善定位特性。含有F(c)片段的抗体比F(ab)或(Fab’)2片段能特异性结合更长的时间，而后两者表现出加速的清除机制。最近对人-鼠(嵌合的)单克隆抗体的开发可以有治疗应用，且与传统鼠衍生的单克隆抗体相比具有优越性。人-小鼠抗体表现出广范围且高度的特异性。当注射入人体时，嵌合的抗体比常规自鼠衍生的小鼠单克隆抗体更不易触发免疫反应。人单克隆抗体的制备及其作为载体的使用可以进一步降低接受外源蛋白质的接受者的免疫应答程度。将这些因素如抗体制备、剂量和注射途径，也可以控制抗球蛋白应答。
免疫定向酶治疗的目的是将有效浓度的酶送递到组织的活性特异性位点降低对附近正常组织的毒性，从而提高治疗指数。可以将酶复合于单克隆抗体，这种单克隆抗体共价结合于酶而不影响酶的催化活性。与天然的保持水解蛋白活性的酶相比，缀合于组织特异性单克隆抗体的酶能在所定向的组织中实现更高程度的特异性定位。
其它特异性定位构思包括酶原-抗体复合物(胰蛋白酶原)或酶-抗体复合物(胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、DNase)，它们保留了酶和抗体活性。可以将酶包囊于组蛋白、血红细胞(RBC)空胞(ghost)、聚乳酸和其它生物可降解膜或合成的微胶囊(含有前列腺特异性抗体)，以增加和维持溶解的蛋白酶在前列腺组织中的定向、定位和活性。
施用胶原酶和透明质酸酶能有免疫效果，重复注射可能导致产生抗体滴度且伴随过敏症及严重性较低的过敏反应的危险。另外，存在胶原酶后透明质酸酶的特异性抗体可能为抑制酶的活性。如果受体免疫系统将活性酶识别为外源的，则可能发生潜在的免疫问题。可能会针对酶产生抗体且使酶失活或沉淀。使用人类的酶或那些由重组方法产生的酶可以将这些潜在的免疫并发症最小化。
避免免疫监视系统的策略包括将酶制剂包埋在生物可降解小泡中的方法，以保护酶的活性且有利于特异性送递。将组织特异性蛋白质(单克隆抗体)附着于这些小泡，可以实现对细胞病理特异性位点的定位。可以将酶包埋在脂质体或其它生物可降解微胶囊中，与用于特异性定位的组织特异性单克隆抗体相连。
脂质体是含有水相的同心磷脂双层小球体，已表明可用作载体系统。现今的脂质体制备技术已可以将各种药物、激素或酶掺入各相。可以将单克隆抗体掺入脂质体的外层，从而增加含治疗剂的脂质体的送递特异性。
除了让酶免受生理失活且防止免疫并发症外，将酶包埋在合成的微胶囊或生物可降解的小泡中，还可以提供特异性送递的有价值的方法。各种形式的酶包埋技术可用于包埋酶，包括：活细胞空胞、合成的聚合物微胶囊；和由胆固醇、卵磷脂和磷脂酸构成的脂类小泡(脂质体)。用受体本身的红细胞送递活性酶可以避免由潜在的在合成载体(如脂质体和微胶囊)中施用酶所引起的免疫和生理问题。
将聚乙二醇(PEG)共价连接于酶可以使这些蛋白质无免疫原性，可以延长它们的循环半衰期，从而逃避天然酶抑制剂的抑制作用，而且可以在减少自体溶解的情况下提高酶活性。PEG与蛋白质的连接是很简单的，且可以通过超滤纯化可以得到均匀的反应产物。
用如下典型实施例进一步说明本发明。这些实施例无任何限制作用。
实施例
实施例1：患有局部前列腺癌男性的研究的第一个病例
一位70岁的男性被诊断出患有未扩散前列腺癌(即由放射性核素扫描和CAT扫描检测没有扩散)。估计前列腺内肿瘤的大小为7克。由声像图看出肿瘤的位置为右侧叶。血液的PSA水平为40ng/ml。
如上所述(组合物的制备和测试)制备注射用组合物，包括12,500U/ml胶原酶、7,500U/ml透明质酸酶、1％(v/v)TritonX-100、150μg/ml庆大霉素和40mmolCaCl2的0.05M柠檬酸盐缓冲盐水(Ph6.7)。将最终的组合物注入注射用的针筒(5cc)中。
在患者进行膀胱镜检查前先局部麻醉。将膀胱镜置于尿道中，将注射针插入病损区(肿瘤)，并用超声波成像监测。一旦将针固定好，将在约4-5分钟内缓慢地注射5cc注射用组合物。在注射过程中，监测表征中毒、过敏或其它不良反应的生命征象。
患者恢复正常，没有任何表征对注射组合物不良反应的征象。临床过程中没有情况发生。在3个月的过程中血液PSA水平逐渐减低到正常水平(4ng/ml或更低)并保持正常。5年后，患者被诊断为无前列腺癌。
实施例2：患有局部前列腺癌男性的第二个病例
一位65岁的男性被诊断出患有局部前列腺癌(即由放射性核素扫描和CAT扫描检测没有扩散)。估计前列腺内肿瘤的大小为15克。肿瘤的位置为右侧叶且是一个实体瘤。
如上所述(组合物的制备和测试)制备注射用组合物，包括2,400U/ml胶原酶、1,600U/ml透明质酸酶、1％(v/v)TritonX-100、150μg/ml庆大霉素和120mmolCaCl2的0.05M柠檬酸盐缓冲盐水(Ph6.7)。注射液的总体积为30cc。
在膀胱镜的监测下，将组合物注射入肿瘤。首先，缓慢注射5cc剂量。然后，将剩下的25cc缓慢地在约25-20分钟内灌注。完成注射后，监测表征中毒、过敏或其它不良反应的生命征象。
患者恢复和注射预后都没有异常情况发生。在3个月的过程中血液PSA水平逐渐减低到正常水平(4ng/ml或更低)并保持正常。5年后，患者被诊断为无前列腺癌。
实施例3：患有局部前列腺癌男性的第三个病例
一位72岁的男性被诊断出患有局部前列腺癌(即由放射性核素扫描和CAT扫描检测没有扩散)。估计前列腺内肿瘤的大小为9克，且其分布比较分散。血液的PSA水平为30ng/ml。
制备10cc含有50mM氯化钙的0.05M柠檬酸盐缓冲盐水(pH6.7)的组合物。在膀胱镜的监测下，将此氯化钙组合物注射入前列腺的多个位点。完成注射后，监测表征中毒、过敏或其它不良反应的生命征象。约一个月后，约75％肿瘤已降解。随后，在病损处第二次注射25mM氯化钙的0.05M柠檬酸盐缓冲盐水指示剂(约5cc)。3年后，临床诊断患者没有癌症，且患者的PSA水平在正常范围内。
必须指明，除非特别指明，在本发明说明书和权利要求书中所用的“一”和“该”包括复数形式。因此，如含有“一种化合物”的组合物包括含有两种或多种化合物的混合物。
已参考各种特别和优选实施例和技术描述了本发明。但可以理解，在本发明的精神和范围内还可以有许多变化和改进。

Claims (11)

1.胶原酶在制备治疗前列腺癌的组合物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还含有透明质酸酶。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物适用于前列腺内注射。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胶原酶浓度为2400到25,000U/ml。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物含有浓度为1600到16,000U/ml的透明质酸酶。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还含有非离子表面活性剂。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述非离子表面活性剂是TritonX-100。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还含有抗生素。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的组合物还含有庆大霉素。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还含有CaCl2。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物含有浓度为2500-25,000U/ml的胶原酶，浓度为1600-16,000U/ml的透明质酸酶。
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