CN1791670A - 用于异种移植的用猪支持细胞培养的猪胰岛 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适于植入受体体内以在体内产生胰岛素的团聚体及其制备方法。该方法包括用来自供体小猪的睾丸的分离的支持细胞培养分离自供体小猪的胰腺的胰岛细胞。优选培养期为5天，并可继以一纯化程序。
Description
技术领域
本发明涉及猪胰腺胰岛细胞用于治疗糖尿病的用途。更特别地但非唯一地，本发明涉及猪胰腺胰岛细胞连同支持细胞(Sertoli cells)通过异种移植用于治疗糖尿病的用途。
背景技术
猪胰岛细胞异种移植的背景和基本原理
1型(胰岛素依赖型)糖尿病是一种常见的内分泌紊乱，其导致相当大的发病率和死亡率，并对于个体患者和卫生保健系统具有严重的经济影响。尽管用胰岛素进行治疗挽救了生命，但通常不能对血液葡萄糖提供足够的控制以防止该疾病的缩短生命的并发症的产生，这引起了关于获得并维持血糖量正常的更佳的方法的广泛研究。在被提出的较新的治疗策略中，从他人或动物所获得的胰腺β胰岛细胞的移植受到了全世界范围内的最大关注。这是因为胰岛细胞移植不仅能修复胰岛素分泌单元，还能恢复对应答于胰岛内和胰岛外产生的多种神经和激素信号的胰岛素释放的精确微调。
由于人胰岛细胞移植(异体移植)受到人胰岛组织短缺的限制，猪胰岛细胞的应用目前被视为最有前途的替代方式，因为：
(a)猪胰岛素和人胰岛素具有密切的结构和生物学相似性；
(b)猪体内与人体内的生理葡萄糖水平相似；和
(c)猪细胞的供应可以通过最优化供体动物的供应而容易地被扩增。
这一治疗方法(被称为“异种移植”)的基本原理是被植入的猪胰岛在1型糖尿病中具有模仿正常生理胰岛素应答的潜力，使得可以在不需要胰岛素或对胰岛素的需求降低的情况下获得接近正常的血液葡萄糖水平。其结果是可以防止长期的糖尿病并发症，而且与接受当前被推荐的“加强的”胰岛素治疗的患者相比会较少出现低血糖。
推广猪胰岛细胞异种移植的障碍和所采用的克服措施
任一新的治疗策略在其可被施行之前都存在问题和缺陷，猪胰岛细胞的异种移植也不例外。该方法的施行存在众多的科学和伦理/政治障碍，但是随着该领域的知识的发展，这些障碍已经不断地减退。已经出现的问题包括：
1.受体的免疫系统对胰岛细胞的排斥：被移植的胰岛对于受体的免疫系统的易损性已经成为成功的胰岛细胞移植的一个主要的科学障碍。被用于克服该问题的策略包括：
a)同时施用免疫抑制药物-尽管其被成功地应用于近期的一些异体移植研究中，但产生了对被移植的胰岛(即，损伤它们的植入和功能并降低它们的胰岛素分泌应答)和受体(即，将患者暴露给患上多种严重的并发症的风险，包括中毒性肾损害、神经毒性、高血压、对感染的易感性增加和骨质疏松症)两者的副作用的双重缺陷。此外，这有方法在改变排斥的进程和发生频率方面不总是有效的。
b)新的、非药物的“免疫保护”策略的开发以保护被移植的胰岛细胞免遭受体的免疫系统的破坏，从而防止局部炎症反应和长期排斥，同时仍使得它们通过分泌胰岛素和控制体内的葡萄糖代谢而发挥作用。在各种“免疫保护”策略中，已经被研究的有：
●管状扩散室和灌注装置(人工胰腺)。至今没有迹象表明这一方法是临床上有用的。
●被移植的胰岛在藻酸盐微胶囊中的包囊化(encapsulation)。已经在糖尿病实验模型中对这一方法进行了详细的研究，在先前的实验性研究中申请人已经证实与未包囊化的胰岛相比该方法赋予了被移植的胰岛显著更长的功能持续期。已经在由链脲霉素引起糖尿病的CD1小鼠、NOD(非肥胖型糖尿病)小鼠、由四氧嘧啶引起糖尿病的新西兰白兔和自发性糖尿病狗中，通过藻酸盐包囊化的猪胰岛的异种移植实现了糖尿病状态的逆转。此外，用藻酸盐包囊化的猪胰岛在两位1型糖尿病患者中进行的初步临床研究提供了令人振奋的结果，两位患者都表现出对胰岛素的需求降低。移植后的第14个月，该胰岛在两位患者中都持续发挥功能，而没有产生副作用或猪逆转录病毒感染的迹象。
●胰岛与分离自雄性供体动物的睾丸的支持细胞的共移植。这一方法已经被证明保护了胰岛免受免疫介导的排斥并增强了它们的功能和寿命。
2.可能的传染性疾病的传播：这一潜在的问题集中于猪的疾病传播到受体的风险，和细胞操作过程中带入微生物的风险。
3.有关异种移植的伦理问题：这包括使用动物组织用于移植在伦理上是否可接受的问题、供体动物的福利问题、从被选择用于临床试验的患者获得知情同意的问题和该过程对他们的影响。这些问题已经通过一些团体例如英国的纳菲尔德生物道德委员会(Nuffield Council on Bioethics)得到了解决，且已经提出了许多保护未来人类研究的道德完整性不受损害的建议。这些包括将猪组织用于异种移植的“伦理可接受性”；避免或最小化对供体动物的伤害的需要；当获得患者的知情同意的过程中，对患者提供成功的可能性、伴随的风险、可预期的生活质量的详细解释的要求；并告知患者他们对该过程的同意包括对移植后进行微生物检测的同意。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种治疗糖尿病的方法；和/或一种辅助治疗糖尿病的装置，其对上述的方法和/或装置进行了改进或提供了一种替代的方式。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种制备猪胰腺胰岛和猪支持细胞的团聚体(aggregate)的方法，该团聚体植入受体体内能在体内产生胰岛素，该方法包括以下步骤：
1)从供体小猪的胰腺分离猪胰岛细胞；
2)从供体小猪的睾丸分离猪支持细胞；
3)将所述支持细胞与所述胰岛细胞一起培养；
4)形成团聚体。
优选该组合采用从1∶20,000至1∶100(胰岛细胞：支持细胞)的预定比率，更优选该比率在1∶2,000至1∶4,000之间。
优选所述培养步骤持续3-7天的一段时期，更优选5天。
优选在所述胰岛的分离之后继以对所述胰岛进行纯化。
优选所述胰岛的分离和纯化共同包括以下步骤：
a)外科手术切取；
b)胶原酶消化；
c)洗涤和培养所述胰岛。
优选所述消化包括Liberase H和赛罗卡因(Xylocaine)消化。
优选在所述支持细胞的分离之后继以对所述支持细胞进行纯化。
优选所述支持细胞的分离和纯化共同包括以下步骤：
a)外科手术切取；
b)用胰蛋白酶、DNA酶进行消化；
c)洗涤和培养所述细胞。
优选该方法包括以下步骤：
5)对团聚体和/或其组分进行病毒学和微生物学检测和/或监测。
优选地或任选地，该方法包括对所述胰岛和支持细胞之一或优选对两者进行病毒学监测和/或检测的预步骤(步骤1之前)。
优选该方法额外地或任选地包括对小猪供体进行病毒学监测和/或检测的预步骤。
优选所述胰岛和支持细胞得自同一畜群，更优选得自同一供体小猪。
优选所述小猪是一周龄大的供体。
优选对所述小猪进行传染物监测和/或检测。
优选该猪群是新西兰猪群。
优选形成团聚体的步骤包括：保持所述胰岛的固有特性和/或天然结构。
本发明的另一方面提供了一种根据上述方法制备到的猪胰岛和支持细胞的团聚体。
本发明的第三方面提供了一种治疗患有糖尿病的患者的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备一个或多个根据上述方法制备到的猪胰岛和支持细胞的团聚体。
2)给所述患者植入或施用一个或多个团聚体。
优选所述植入或施用所述团聚体的步骤可以通过：
-将所述团聚体在一种合适的生物相容性材料(更优选一种合适的藻酸盐)中包囊化；
-封装到一合适的装置(更优选例如血管化的管(vascularized tube))中；
-基质制剂，包括明胶、胶原蛋白、和天然的碳水化合物聚合物的制剂；
-血浆凝血酶凝块一用异源凝血酶制备的自体血浆凝块。
本发明的另一个方面提供了一种用于植入到患有糖尿病的受体中的装置，该装置包括猪胰腺胰岛和猪支持细胞的团聚体，该团聚体是前面所描述的团聚体或具有前面所描述的团聚体的特征。
优选该包括所述团聚体的装置可以是以下其中之一：
-用做胶囊的一种合适的生物相容性材料(更优选是一种合适的藻酸盐)；
-一种血管化的管；
-基质制剂，包括明胶、胶原蛋白和天然的碳水化合物聚合物的制剂。
-血浆凝血酶凝块—用异源凝血酶制备的自体血浆凝块。
本发明的另一个方面提供了一种制备猪胰岛和猪支持细胞的团聚体的方法，所述胰岛和支持细胞根据图1制备。
本发明的另一个方面提供了一种猪胰岛和猪支持细胞的团聚体，其如本文以及图2-5中的1图或多图所述。
附图说明
图1：显示了根据本发明的优选的团聚体制备方法的流程图。
图2-5：显示了根据本发明的胰岛-支持细胞的团聚体。
发明详述
本发明涉及支持细胞和猪胰岛的“团聚体”的制备和用途。
现有技术中涉及使用支持细胞和胰岛(或其它细胞)的方法通常包括分别单独对它们进行处理和分离，并在进行移植时将它们放在一起。
申请人已经发现以胰岛与支持细胞的预定比率制备团聚体并进行共培养使得胰岛在移植前在体外有时间生长并利用被认为来自支持细胞的生长因子。申请人已经发现，当用支持细胞层对胰岛进行保护时，胰岛的功能更强。
理想地，胰岛和支持细胞来自同一供体。这简化了病毒筛查。
本文所用术语“团聚体”特别地是指天然胰岛结构的表面上的不连续的支持细胞层。
支持细胞和胰岛共移植的基本原理
胰岛细胞与分离自供体动物的睾丸的支持细胞的共移植已经被作为实现以下目的的一种方式进行了研究：
(a)免遭免疫排斥；和
(b)促进胰岛细胞的有丝分裂使得它们在应答葡萄糖刺激时释放更大量的胰岛素并能存活得更久。
已知支持细胞在多种生理活动中具有非常关键的作用，例如某些生长因子(例如，胰岛素样生长因子1和2(IGF-1，IGF-2)和表皮生长因子(EGF))的合成，免疫调节(可能是转化生长因子-β1(TGF-β1)分泌增加的结果)和抗细胞程序死亡(细胞死亡抑制)功能。
申请人近期在实验动物模型中的研究已经表明支持细胞的存在改善了胰岛的体外功能，在糖尿病大鼠、兔和NOD小鼠中进行的胰岛-支持细胞团聚体的异种移植延长了胰岛细胞的存活，导致糖尿病状态的逆转。支持细胞保护胰岛细胞移植不被免疫排斥的精确机制目前还未准确地获知，但看来似乎与支持细胞刺激生长和分化因子的产生相关。
因此，本发明将支持细胞与胰岛以团聚体的形式进行共移植使得支持细胞可以用做胰岛的“保育(nursing)”细胞系统，提供有效的免疫保护并增强它们的功能和寿命。
这一方法与其他方法互补或协同以对被移植的胰岛细胞提供免疫保护和功能持续期。
特别地，本发明涉及胰岛-支持细胞团聚体的以下用途：
-藻酸盐包囊化形式—对被移植的胰岛提供额外的免疫保护。支持细胞与分离自大鼠的胰岛的共-微包囊化的可行性已经在申请人所进行的研究中得到了证实。申请人在实验室中研究了藻酸盐包囊化的支持-胰岛细胞团聚体在实验动物中进行腹膜内移植的有效性和安全性。
-皮下移植装置—使得形成预血管化的自体胶原蛋白蓄积器用于放置胰岛-支持细胞团聚体。这一方法已经被临床应用于1型糖尿病患者。
-基质制剂—其中胰岛-支持细胞团聚体被培养在明胶、胶原蛋白和/或添加有天然碳水化合物多聚体的其它基质中。目前正在移植了胰岛-支持细胞团聚体的动物中以这一方法进行研究，该胰岛与支持细胞间的比率介于1∶2,000和1∶4,000之间。
-血浆凝血酶凝块—用异源凝血酶制备的自体血浆凝块，用做生物相容性包装装置。
申请人已经测定了提供胰岛抗免疫排斥的最佳保护和最大功能持续期的胰岛细胞与支持细胞的比例可以从1∶20,000以提供最大胰岛素释放降至至少1∶2,000。这一范围是基于申请人与Perugia大学和新加坡国立大学协作在实验室中以胰岛-支持细胞团聚体所进行的实验研究的结果得到的。
优选的以1∶2,000-1∶4,000的比率存在的胰岛-支持细胞团聚体的制备
获取用于组合本发明的胰岛-支持细胞团聚体的猪胰岛和支持细胞的猪群包括饲养在严格的生物安全条件下的无特定病原(SPF)NZ大白猪。在畜群、产仔前1个月的母猪、供体小猪和所使用的组织中监测人兽互传传染可能的来源。新西兰没有朊病毒介导的疾病和许多在世界上其它地方所发现的病毒感染。
本领域技术人员可以预期世界上其它地方的猪群如果在合适的条件下进行繁育，也可以被用于本发明。
经过标准(Ricordi’s)胶原酶消化程序的主要修饰将胰岛细胞分离自7日龄小猪的胰腺。所有的外科手术过程和细胞操作在严格的无菌措施下进行。在进行分离和纯化后，所述胰岛被放置于RPMI培养基中的培养组织中，所述培养基富含2％的人血清白蛋白和10mmol/L的尼克酰胺。然后，在空气与5％CO2的混合物中于37℃培养48小时，并频繁更换培养基。
使用标准(Rajotte’s)的分离方法将支持细胞分离自7日龄小猪的睾丸细胞，所述方法经过修饰以确保最大的细胞产量。在对胰岛和支持细胞进行众多的质量控制检测后(以确保他们的最佳纯度，成活力和不受微生物污染，进一步参见下述)，对支持细胞和胰岛都进行计数，并将后者调节为直径150μm的胰岛等价物(IEQ)。然后以1∶2,000-1∶4,000的比率，将胰岛与支持细胞混合，培养24小时，并刮下以形成团聚体。再培养24小时，然后检测胰岛-支持细胞团聚体的成活力和被释放用于移植前的胰岛素分泌量。
用于本发明的胰岛-支持团聚体的制备方法优选包括严格的感染监测程序包括病毒学监测(进一步参见下述)，细菌、真菌和支原体筛查以及细菌内毒素检测(LAT检测)。任一微生物污染的存在或细胞不符合申请人设定的任以严格的质量控制标准都将导致特定批次的细胞被废弃。
团聚体制剂
图1显示了优选的制备方法的流程图，图2-5显示了根据这一方法制备的团聚体。特别地，图2显示了于培养基中3天的团聚体(未染色，×10)；图3显示了于培养基中3天的团聚体(未染色，×20)；图4显示了于培养基中6天的团聚体(DTZ染色；纯度＞85％；10×)，以及图5显示了于培养基中6天的团聚体(AO/PI染色；成活力＞95％；10×)。
1)支持细胞
a)支持细胞的采集
-在无菌条件下从供体切取睾丸；
-将该腺体切碎成小片(大约1mm大小)；
-通过沉降将被切碎的组织用HBSS洗涤两遍以除去红细胞。
b)支持细胞的第一次消化
-将被切碎的组织放置于40ml的消化液中；
-将人血清白蛋白、Liberase H和利多卡因添加到含有钙和镁的Hanks溶液中；
-以120rmp将瓶子保持在37℃的水浴中18-20分钟；
-用Hanks溶液洗涤所述组织3遍，并于4℃以1500rpm离心10分钟。
c)第二次消化
-加入胰蛋白酶和DNA酶；
-以120rmp，于37℃进行温育，直至白色的团聚体产生；
-取出所述白色团聚体；
-将细胞接种到皮氏培养皿中。
2)胰腺胰岛细胞
胰腺胰岛细胞根据本申请人在WO01/52871(该专利的内容在此处通过引用被并入本申请)中所公开的方法制备。
3)支持/胰岛团聚体
-培养1天后，洗涤培养皿，并以胰岛∶支持细胞为1∶2,000的比率将胰岛(10,000IEQ)添加到每一培养皿中；
-培养24小时；
-将细胞刮下并覆盖于胰岛上以形成团聚体，然后在培养基中放置24小时；
-这一时间后，胰岛/支持团聚体被备好用于移植或用于包囊化；
-用台盼蓝、苏丹III和抑制素染色以用于检测支持细胞成活力和计数。
病毒学监测
如上面所指出的那样，使用为了检测移植材料是否存在PERV(内源逆转录病毒)这一目的而开发的高特异性和高灵敏度的检测对移植材料中是否存在PERV进行检测优选是本发明的胰岛/支持细胞团聚体制备方法所必需的一部分。除了PERV，注意力还被集中在其它能引起动物传染病和xenoses的潜在的传染性病原，包括猪巨细胞病毒(PCMV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)、猪嗜淋巴细胞疱疹病毒(PLHV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪E型肝炎病毒。优选这种多水平病毒筛查策略作为本发明的方法的一部分被进行，包括：
-对畜群进行是否存在上述病毒的常规监测。
-对供体年龄组(1周龄的新生猪)进行是否存在病毒的常规检测。
-对待用于异种移植的胰岛和支持细胞的常规检测。
胰岛-支持细胞团聚体临床使用前的研究
在Diatranz的实验室进行的一项研究中，将藻酸盐包囊化的胰岛-支持细胞团聚体(比率1∶4,000)和藻酸盐包囊化的不含支持细胞的胰岛的移植物的效力和安全性在新西兰白兔与实验诱导的糖尿病中进行了比较(每组5个动物)。
两组都经腹腔注射接受剂量为10,000IEQ/kg的胰岛细胞。在移植后5周的随诊期间，两组中的周平均血液葡萄糖水平均下降，每一组中有两只兔被认为已经对移植成功地进行了应答。在随后的尸检中，在任一组的受体动物的腹腔器官中都没有发现异常的组织学结果。
在NOD(非肥胖型糖尿病)小鼠进行的一项研究中也获得了相似的结果，所述小鼠接受了剂量为10,000IEQ/kg的澡酸盐包囊化胰岛的腹腔内移植物，所述胰岛含或不含支持细胞。接受了胰岛-支持细胞团聚体(比率1∶4,000)的5只鼠中的2只和只接受了胰岛的6只鼠中的2只有部分应答，每一组中有1个动物呈现出正常的血液葡萄糖水平达5周。
尽管在这些研究中使用了1∶4,000的比率，本领域技术人员将清楚其它比率在不偏离本发明的范围内也可以被使用。
胰岛-支持细胞团聚体临床研究
申请人对胰岛-支持细胞团聚体进行了大量的临床研究。在一个实验中，用皮下不锈钢移植装置将胰岛-支持细胞团聚体移植到12位青少年1型糖尿病患者体内，该装置形成(外科手术除去特氟隆棒)血管化的胶原蛋白蓄积器，被导入该蓄积器中的细胞由钢网管机械保护。最初，在每位患者的上腹壁上形成了两个这种血管化的胶原蛋白蓄积器，6个月以后再形成两个蓄积器。每位患者以对应于250,000胰岛等价物(IEQs)的剂量接受胰岛-支持细胞团聚体(比率范围从1∶30至1∶100)被注射到各蓄积器中，6个月后在第二次形成的两个蓄积器的每一个中重复该剂量。
12位患者中的5位顺利地对这一治疗产生应答。在持续约8周的一段时期后，这5位患者对胰岛素的需求开始下降并且通常在第二次移植后进一步地下降。12个月后，平均日胰岛素剂量的减少超过50％，其中一位患者在该时间后不再需要胰岛素。平均日血液葡萄糖水平和糖基化血红蛋白(HbA1C)的改善也被记录。在12位患者中的任一患者中都未检测到副作用的产生，且12个月后的PERV监测测试仍保持阴性。
Claims (28)
1.一种制备猪胰腺胰岛和猪支持细胞的团聚体的方法，该团聚体经植入受体体内能在体内产生胰岛素，该方法包括以下步骤：
1)从供体小猪的胰腺分离猪胰岛细胞；
2)从供体小猪的睾丸分离猪支持细胞；
3)将所述支持细胞与所述胰岛细胞一起培养；
4)形成所述团聚体。
2.权利要求1的方法，其中所述团聚体是预定比率为从1∶20,000至1∶100的胰岛：支持细胞的混合物。
3.权利要求2的方法，其中所述比率介于1∶2,000至1∶4,000之间。
4.上述权利要求中任一项的方法，其中的培养步骤的时间为3至7天。
5.权利要求4的方法，其中所述时间是5天。
6.上述权利要求中任一项的方法，其中在分离所述胰岛后继以对所述胰岛进行纯化。
7.权利要求6的方法，其中所述胰岛的分离和纯化共同包括以下步骤：
a)外科手术切取；
b)胶原酶消化；
c)洗涤和培养所述胰岛。
8.权利要求7的方法，其中所述胶原酶消化包括Liberase H和赛罗卡因消化。
9.上述权利要求中任一项的方法，其中在分离所述支持细胞后继以对所述支持细胞进行纯化。
10.权利要求9的方法，其中所述支持细胞的分离和纯化共同包括以下步骤：
a)外科手术切取；
b)用胰蛋白酶、DNA酶进行消化；
c)洗涤和培养所述细胞。
11.上述权利要求中任一项的方法，该方法进一步包括以下额外步骤：
5)对所述团聚体和/或其组分进行病毒学检测和微生物学检测和/或监测。
12.上述权利要求中任一项的方法，其中该方法额外地或任选地包括在步骤1之前对胰岛和支持细胞之一或两者进行病毒学监测和/或检测的预步骤。
13.上述权利要求中任一项的方法，其中该方法额外地或任选地包括对小猪供体进行病毒学监测和/或检测的预步骤。
14.上述权利要求中任一项的方法，其中所述胰岛和支持细胞来自同一畜群或来自同一供体小猪。
15.权利要求14的方法，其中所述小猪是约1周龄的供体。
16.上述权利要求中任一项的方法，其中对所述小猪进行传染物监测和/或检测。
17.上述权利要求中任一项的方法，其中所述小猪来自新西兰猪群。
18.上述权利要求中任一项的方法，其中所述形成团聚体的步骤额外地或任选地包括保持所述胰岛的固有特性和/或天然结构。
19.基本上根据权利要求1-18中任一项的方法制备的猪胰岛和支持细胞的团聚体。
20.一种治疗糖尿病患者的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备一个或多个基本上根据权利要求1-18中任一项的方法制备的猪胰岛和支持细胞的团聚体，
2)给所述患者植入或施用一个或多个团聚体。
21.权利要求20的方法，其中植入或施用所述团聚体的步骤可以通过：
-将所述团聚体在一种合适的生物相容性材料中进行包囊化；
-封装到一合适的装置中；
-基质制剂，包括明胶、胶原蛋白和天然的碳水化合物聚合物的制剂；
-血浆凝血酶凝块—用异源凝血酶制备的自体血浆凝块。
22.权利要求21的方法，其中所述生物相容性材料是一种合适的藻酸盐。
23.权利要求21或22的方法，其中所述合适的装置是一种血管化的管。
24.一种用于植入到患有糖尿病的受体中的装置，该装置包括猪胰腺胰岛和猪支持细胞的团聚体，该团聚体是权利要求19的团聚体或具有权利要求19的团聚体的特征。
25.权利要求24的装置，其中包括所述团聚体的装置可以是以下其中之一：
-用做胶囊的一种合适的生物相容性材料；
-一种血管化的管；
-一种基质制剂，其包括明胶、胶原蛋白和天然的碳水化合物聚合物的制剂；
-血浆凝血酶凝块—用异源凝血酶制备的自体血浆凝块。
26.权利要求25的装置，其中所述生物相容性材料是一种合适的藻酸盐。
27.基本上根据图1制备猪胰腺胰岛和猪支持细胞的团聚体的方法。
28.基本上如说明书和图1-5中任一图所述的猪胰腺胰岛和猪支持细胞的团聚体。
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