KR100788800B1 - 자가 탄성연골로 캡슐화된 이식물 및 이의 제조방법 - Google Patents

자가 탄성연골로 캡슐화된 이식물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이식물이 상기 이식물을 수령할 개체로부터 유래된 탄성연골에 의해 캡슐화된 이식용 마이크로입자 및 (1) 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리(dissociation)하는 단계; (2) 상기 분리된 탄성연골을 계대배양하여 증폭하는 단계; (3) 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 하는 단계; 및 (4) 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 분리하는 단계를 포함한 이식용 마이크로입자의 제조방법에 관한 것이다.
이식물, 탄성연골, 진동 배양, 마이크로입자

Description

자가 탄성연골로 캡슐화된 이식물 및 이의 제조방법{Transplants Encapsulated with Self-Elastic Cartilage and Method of Preparing the Same}
도 1a는 췌도세포가 탄성연골에 의해 캡슐화되기 전의 상태를, 도 1b는 캡슐화된 후의 상태를 각각 나타낸 것이다.
도 2는 췌도세포가 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자의 병리조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 췌도세포가 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 크기별로 시간 경과에 따른 인슐린 분비 양상을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 자가 유래의 탄성연골로 캡슐화된 이식물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 이식물이 상기 이식물을 수령할 개체로부터 유래된 탄성연골에 의해 캡슐화된 이식용 마이크로입자 및 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리하고 상기 분리된 탄성연골을 계대배양하여 증폭한 후 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 하고 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 분리하는 이식용 마이크로입자의 제조방법에 관한 것이다.
췌도 이식은 중증의 인슐린 의존성의 1형 당뇨병에 대한 새로운 치료방법이다. 인슐린의 투여만으로는 해결되지 않는 신부전증 망막증을 비롯한 신경장애 족부괴양 등의 속발증 등을 휴유증 없이 치료할 수 있다는 점에서 근본 치료법으로 주목 받아 최근에는 임상시술 보고가 세계적으로 매년 증가하고 있다.
하지만, 장기 제공자의 부족, 수술 후 이식편에 대한 면역거부반응의 조절 등 아직도 해결하여야 할 문제점이 많다. 현재로는 평생 면역억제제의 투여를 필요로 하지만 이 또한 환자의 경제적인 부담이 적지 않고, 면역억제제 자체가 가지는 여러 가지 부작용, 그리고 특히 면역억제제가 췌도에 직접적으로 미치는 해로운 영향은 중대한 결점이라고 할 수 있다.
이러한 결점을 극복하기 위하여 면역격리법(Immunoisolation)이 개발되었다. 면역격리법이란, 이상적인 막을 이용해서 O2, CO2 등의 기체, 포도당, 아미노산 등의 영양분 및 호르몬 등의 작은 물질은 자유롭게 확산이 가능하고, 면역담당세포를 포함한 면역계의 물질은 통과할 수 없도록 감싸는 방법이다. 이러한 기술을 이용함으로써 이식을 받는 환자의 면역거부반응을 일으키지 않으면서 이식이 가능하게 되었다.
면역격리법의 개발 초기에는 장기나 조직을 감싸는 막의 재료로서 아가로오스, 알기네이트, 젤라틴, 고분자와 같은 인공적으로 합성된 물질이 이용되었다. 그런데 이러한 합성 물질들은 생체내 적합성 및 내구성이 떨어지고, 재료 자체가 일으키는 이물 반응 때문에 실질적으로 임상에 적용하기 불가능하다는 문제점이 있다.
인공적으로 합성된 물질을 대체하기 위하여 선택된 물질이 연골세포이다. 연골조직은 정상상태에서는 혈관, 신경, 림프관이 없어서 백혈구 등 염증 세포의 침입이 불가능하다. 특히, 탄성연골은 구부려도 곧 다시 원래 상태로 돌아오는 유연성과 탄력성이 뛰어나다. 이런 성질은 세포나 조직을 캡슐화하는 막으로서 역할을 하는데 장점이 된다. 특히, 연골조직은 나이가 들어도 딱딱해지지 않는데, 이는 세포외기질로서 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸 등이 다량 존재함과 동시에 이중에서 콜라겐 섬유는 비환원성가교물질인 피리디노린(pyridinoline)과 히스티노알라닌(histidino-alanine)에 의해 성숙하고 안정화되기 때문인 것으로 알려져 있다.
WO 96/40887에 췌도를 무릎관절로부터 유래된 연골로 캡슐화한 기술이 개시되어 있다. 그러나 상기 방법은 생분해성 폴리글리콜산 폴리머를 이용하여 이식에 필요한 췌도를 결집시킨 후 연골막에 넣는 방식을 채택한 것으로서, 여전히 폴리머와 같은 인공 물질을 사용하고 있어 이물 반응을 유발할 수 있다. 특히, 상기 방법에서 연골은 단층(monolayer)이라서 상당히 약하기 때문에 폴리머뿐 아니라 췌도도 얇은 연골막을 뚫고 나올 가능성이 높아서 심각한 이물반응과 면역거부반응이 예상된다. 여기서, 배양 연골막을 이용한 캡슐화는 단순히 별도로 가해지는 방법 없이(예를 들면 시트형식의 인공췌장을 개발한 방식처럼 위에서 무거운 물건으로 눌러주던지 아니면 확실히 접착인자가 회수되는 과정 중에서 같이 떨어져 나와서 이들이 캡슐화하는데 도움을 준다는 등의 방식) 회수한 연골막으로 췌도를 덮고 캡슐화를 기다리는 방식으로 췌도를 긴밀히 결합시킬 수 없고, 또한, 단층의 연골막을 회수하기 위해 실험자가 사용한 세포 스크래퍼(cell scraper)로 콘플루어시가 된 배양 연골 세포막을 인위적으로 떼어내는데 이런 과정은 약한 단층의 막과 연골세포가 생산한 콜라겐 매트릭스를 더욱 손상시키는 원인이 된다. 또한, 무릎에서 유래된 연골을 사용하였는데, 무릎에 심각한 휴유증을 남길 수 있기 때문에 실질적으로 임상에 적용하기 어렵다.
이에 따라 연골조직을 수득하는 장기를 무릎보다는 귀를 선호하게 되었다. 특히, 귀에서 유래된 연골(탄성연골)은 미용성형외과에서 융비술의 자가 이식 재료로 사용되어지고 있으며 연골을 채취한 후에 미용적으로 상처가 남지 않기 때문에 그 안정성과 용이함이 이미 확인되었다고 할 수 있다. 그러나 래트를 포함한 설치류는 탄성연골원인 귀바퀴와 이도가 극히 작기 때문에 설치류를 이용한 동물실험은 거의 불가능하다. 개는 탄성연골이 비교적 커서 래트 보다는 용이하게 순수한 연골조직을 취할 수 있기 때문에 개를 이용한 동물실험이 진행되고 있다. 그러나 동물실험은 설치류를 이용하여 기본적인 실험을 진행한 후 이때의 실험결과를 기반으로 하여 대동물인 개를 대상으로 실험하는 것이 일반적이다. 특히, 개를 이용한 실험은 래트를 이용한 경우 보다 실험에 오랜 시간이 소요되고 정확하고 신속하게 실험을 진행시키는 것이 곤란하다.
한편, 본 발명자는 개의 귀에서 추출한 연골세포를 배양해 시트 형태로 만든 후 그 사이 사이에 다른 개 또는 설치류에서 추출한 췌장 세포를 끼워 넣어서 연골 세포와 이로부터 분비되는 콜라겐에 의해 둘러싸이도록 한 인공췌장을 개시하였다. 그러나 설치류의 경우에는 배양을 거듭하여 계대배양을 하면 연골세포가 대부분 섬유아세포로 오염되어 있기 때문에 시트 형태로 형성되지 않을 뿐 아니라 부분적으로 섬유아세포가 세포간의 결합을 약하게 하여 시트를 회수하는 과정에서 구멍이 생기기도 쉽다. 또한, 섬유아세포는 연골세포를 증폭 배양하는 과정 중에 연골세포 보다 훨씬 활발히 분열하기 때문에 연골세포의 순도를 떨어뜨리는 문제점이 있다. 따라서, 설치류에서 기원하는 연골세포는 시트형태로 만들기 곤란하여 개에서 연골을 채취하여 이용하였다. 아울러, 이러한 인공췌장을 제조하는 과정은 시트를 여러 장 적층화하는 등 제조방법이 복잡하고 많은 시간이 소요된다. 특히, 단층의 연골 시트는 다루는 과정에서 구멍이 나던지 시트가 주름지거나 끝부분이 말려들어가는 등 기술적으로 곤란하여 숙련된 기술이 요구된다. 시트를 적층화하는 단계에서 무게가 있는 물체를 시트의 위부분에 위치시켜 하중을 주도록 하는데, 이런 과정은 안에 들어가 있는 췌도 자체에도 영향을 미쳐서 췌도도 하중을 받고 납작해진다. 이렇게 납작해진 췌도는 기능상 장애를 보이면서 인슐린을 만들어서 방출하는 기능이 떨어진다. 그리고, 연골세포 시트를 이용하여 인공장기를 제조하는 과정은 지속적으로 온도를 37℃로 유지해주어야 하는데 이런 조건을 만족시키려면 배양액을 교환하는 단계 및 현미경으로 관찰하는 단계에서도 37℃ 이하로 내려가지 않도록 하여야 한다. 아울러, 이렇게 하여 수득한 인공 장기는 그 크기가 커서 생체에 직접 이식할 경우에 그 크기에 부합하는 커다란 절개를 요구한다는 문제점 등이 있다.
본 발명자는 임상에서 효율적이고 실질적으로 이용 가능한 면역격리된 이식물을 제공하기 위하여 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리하여 증폭한 후 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 하여 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 제조하고, 상기 마이크로입자는 수령할 개체 기원의 연골세포이므로 수령할 개체의 면역시스템이 비자기(non-self)로 인식하지 않고 자기(self)로 인식함은 물론, 연골세포에 의해 면역반응에 관여하는 세포의 침투가 차단되어 면역거부반응은 방지되면서 영양분과 기체의 확산은 원활하여 이식물의 본래 기능을 장기간 유지시킨다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 한 관점으로서, 이식물이 상기 이식물을 수령할 개체로부터 유래된 탄성연골에 의해 캡슐화된 이식용 마이크로입자를 제공한다.
다른 관점으로서, (1) 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리(dissociation)하는 단계; (2) 상기 분리된 탄성연골을 계대배양하여 증폭하는 단계; (3) 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 하는 단계; 및 (4) 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 분리하는 단계를 포함한 이식용 마이크로입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 이식물이 상기 이식물을 수령할 개체로부터 유래된 탄성연골에 의해 캡슐화된 이식용 마이크로입자에 관한 것이다.
본 발명에서 "이식물(transplant)"은 이식하고자 하는 장기 또는 조직으로부터 유래된 세포를 의미하지만, 이식하고자 하는 장기 또는 조직을 잘게 절단하여 수득한 마이크로 단위의 절편일 수도 있다. 본 발명에서 이식물은 세포 단위이기 때문에 특정 기능(예, 호르몬의 분비)을 새롭게 보유하게 하거나, 본래 갖고 있던 특정 기능이 더욱 증진되도록 유전적으로 변형된 세포일 수도 있다.
본 발명에서 이식물의 유형은 특별히 제한적이지 않다. 한 양태로서 이식물이 내분비 기능을 담당하는 세포인 경우에 특정 질병을 치료하는데 탁월한 효과를 기대할 수 있어 바람직하다. 일례로 이식물이 췌장 유래인 경우에는 당뇨병을 치료하는데, 이식물이 갑상선 유래인 경우에는 갑상선 기능 저하증을 치료하는데 각각 이용될 수 있다. 다른 예로 이식물이 에리스포이에틴를 분비하는 세포, 성장호르몬을 분비하는 세포 또는 혈액응고 인자를 분비하는 세포인 경우에는 각각 빈혈, 왜소증, 혈우병을 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 이식물은 췌장의 췌도 세포(인슐린, 글루카곤 등 호르몬을 분비하여 혈당을 조절하는 세포)인 경우가 바람직한데, 이는 연골세포와 췌도세포가 상호보완 관계에 있기 때문이다. 즉, 연골세포가 분비하는 콜라겐 매트릭스는 췌도 세포에게 보호 작용을 제공하고 췌도 세포가 분비하는 인슐린은 연골세포에게 성장인자로 작용하게 된다.
이러한 이식물을 캡슐화하는 "탄성연골"은 상기 이식물을 수령할 개체의 귀로부터 분리된(isolated) 연골을 의미한다. 연골세포는 신체의 여러 부위에 존재하지만, 귀에 있는 연골세포는 다른 부위에 있는 연골세포에 비하여 상대적으로 용 이하게 분리할 수 있고, 생체의 기능 이상과 같은 후유증을 일으키지 않으며, 상처가 남지 않기 때문에 적합하다.
본 발명에서 이식물은 일차적으로 이를 중심으로 접착된 탄성연골에 의해 캡슐화되지만, 접착된 탄성연골이 콜라겐을 분비하기 때문에 실질적으로 콜라겐으로 이루어진 막에 의해 캡슐화된 것으로 간주할 수 있다. 이러한 막에는 미세한 구멍이 다수 형성되어 있는데 구멍의 크기가 50nm 내지 200nm로 충분히 작기 때문에 이 구멍을 통하여 면역반응에 관여하는 세포는 이동할 수 없지만, O2 및 CO2와 같은 기체 및 포도당, 아미노산과 같은 영양분, 이식물이 분비하는 물질 (예, 호르몬) 등은 이동 가능하다. 따라서, 면역거부반응은 억제되면서도 이식물은 본래의 기능을 발휘할 수 있다.
이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 "마이크로입자"는 그 크기가 200 내지 600㎛인 것을 치료에 이용하는 것이 적합하다. 마이크로입자의 크기가 약 200㎛정도로 보다 작은 경우가 더욱 바람직한데, 이는 이식물이 상대적으로 얇은 두께의 탄성연골에 의해 캡슐화되어 기체 및 영양분의 확산이 보다 원활하게 일어나서 이식물의 수명을 연장하고 증식을 촉진하여 이식물의 본래 기능을 발휘하는데 더욱 유익하게 작용하기 때문이다. 그러나, 마이크로입자의 크기가 200㎛ 보다 극히 작은 경우는 내부에 이식물이 포함되지 않은 탄성연골의 작은 괴일 가능성이 높기 때문에 주의가 요구된다.
본 발명은 (1) 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리(dissociation)하는 단계; (2) 상기 분리된 탄성연골을 계대배양하여 증폭하는 단계; (3) 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 하는 단계; 및 (4) 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 분리하는 단계를 포함한 이식용 마이크로입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (1)에서는 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리(dissociation)한다. 먼저 이식물을 수령할 개체로부터 귀의 이도와 이개를 포함한 탄성연골을 채취하여 피부조직, 피하조직, 근육조직, 연골막(perichondrium), 그 밖의 결합조직을 제거한 후 호모지나이저, 막자사발, 블렌더, 외과용 매스, 주사기, 포르셉, 초음파 장치와 같은 물리적 수단으로 쵸핑(chopping)하여 잘게 조각낸다. 이 때, 탄성연골을 시계접시(watch glass) 상에 올려놓고 수술용 곡가위(curved scissor)를 이용하여 쵸핑하는 것이 바람직하다. 수술용 곡가위는 구부러져 있어 오목한 시계접시와의 밀착된 접촉이 용이하고, 계속되는 수술용 곡가위에 의한 절단 운동은 시계접시를 회전하게 하는데 이러한 원운동이 탄성연골을 중심으로 모이게 하여서 탄성연골에 강한 수술용 곡가위의 절단 운동이 지속적으로 작용하게 되어 결과적으로 탄성연골을 단시간에 보다 작은 크기로 잘게 조각낼 수 있다. 탄성연골이 가능한 잘게 조각나면 이후 단계에서 소화 효소와 접촉하는 단면적이 더욱 넓어지므로 보다 효율적으로 소화가 이루어지면서 소화 시간도 단축시킬 수 있다.
쵸핑하여 잘게 분쇄한 후에는 중성 프로테아제, 트립신, 세린 프로테아제, 엘라스타제 및 콜라게나제로부터 선택된 적어도 하나의 단백질 분해효소로 처리하여 개체의 체온과 동일한 온도에서 (예를 들어 개의 경우에는) 오버나이트 내지 (예를 들어 설치류의 경우에는) 5일 동안 진탕하며 소화시킨다. 본 발명에서 단백질 분해효소를 처리하는 온도와 시간은 단백질 분해효소의 종류 및 개체의 종 등에 따라 달라질 수 있지만, 개체의 탄성연골이 작은 경우에는 순수한 연골세포를 수득하기 위하여 소화효소로 처리하는 시간을 장기간(약 5일) 유지시키는 것이 바람직하다. 그 이유는 다음과 같이 설명될 수 있다. 단백질 분해효소로 소화시키는 과정에서 연골세포와 그 외의 세포(근육세포, 섬유아세포 등)들은 단백질 분해효소에 의해 모두 단일 세포로 분리(dissociation)되게 된다. 본 발명에서는 소화 과정에 진탕을 동반하기 때문에 상기 분리된 단일 세포들은 부유 상태에서 유지되게 된다. 그런데 부유 상태는 세포에게 불리한 조건으로서, 시간이 경과함에 따라 대사율이 높은 세포들부터 사멸하게 되어 대사율이 낮은 연골세포만이 생존하게 된다. 이로써 연골세포만을 순수하게 분리하는 것이 가능하게 된다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (2)에서는 상기 분리된 탄성연골을 계대배양하여 증폭한다. 여기서, 배지로는 당업계에 공지된 임의의 연골세포 증식용 배지를 이용할 수 있는데, 그러한 배지에 콜라겐 합성을 위해 요구되는 아스코르브산은 필수적으로 첨가하고, 그 밖의 증식인자인 FGF(Fibroblast Growth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), IGF(Insulin-like Growth Factor) 등은 필요에 따라 첨가한다. 본 발명에서는 탄성연골 세포를 약 4주간 배양하였을 때 5000배 이 상 증폭시킬 수 있는 CBM(CAMBREX. Co.), CGM SingleQuots(CAMBREX Co.) 및 아스코르브산으로 구성된 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 배양하면서 콘플루언시가 약 90%에 도달하면 트립신-EDTA를 처리하여 증폭된 연골세포를 떼어내어 새로운 배지로 계대배양한다. 본 발명에서 계대배양은 3회 이하로 제한하는 것이 바람직한데, 연골세포는 계대회수를 거듭하여, 특히 4회를 넘어가면 탈분화(de-differentiation)해서 본래의 성질을 잃어 분비하는 세포외기질인 콜라겐의 유형이 II에서 I으로 변하는 등 섬유아세포양(fibroblast-like)으로 변하기 때문이다. 상술한 조건에서 연골세포를 약 4주 동안(즉, 계대회수 4회 이전까지 소요되는 시간) 배양하면 최소 5000배 이상으로 증폭될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (3)에서는 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 한다. 여기서, 이식물이 충분히 캡슐화될 수 있도록 탄성연골을 과량으로 첨가하여야 한다. 세포들은 본래 접착하려는 성질이 있는데, 여기에 진동운동이 동반되기 때문에 인위적으로 세포와 세포의 접촉의 기회가 증가하게 된다. 이로 인하여 이식물을 중심으로 많은 개수의 탄성연골이 신속하게 접착하여 마이크로입자가 성장하게 된다. 특히, 연골세포는 고밀도로 존재하게 되면 그 크기를 유지하면서 원래 연골 조직에 가까운 상태로 되돌아간다. 즉, 연골세포는 고유의 세포외기질인 콜라겐 II를 풍부하게 생산하고 분비하게 되어 결과적으로 비교적 세포수가 적고 세포외기질이 많은 원래 연골세포가 체내에 있을 때와 동일한 성질을 나타내게 된다.
상기 단계 (3)에서 배지로는 인슐린 방출 분석용 배지가 이용될 수 있는데, 상기 배지는 포도당의 농도가 80㎎/dl 내지 120mg/dl이 되도록 RPMI 글루코오스(-) 배지 및/또는 Ham's F-12 배지에 글루코오스, 10% FBS, HEPES, 아스코르브산, 항생제, 항진균제를 추가하여 이루어지는 것이 바람직하다. 진동 배양은 입체 8자형, 평면 8자형 또는 평면 좌우형으로 이동 가능한 진동 배양용 셰이커를 이용하여 진동의 세기를 60 내지 80rpm으로 설정하고, 5 내지 10일 동안 개체의 체온과 동일한 온도에서 진행하는 것이 바람직하다. 상기 진동 속도는 배양 용기의 직경에 따라 달라질 수 있다. 배양 용기로는 이의 표면에 세포가 접착되지 않도록 고안된 비 접착성 배양 접시(즉, 부유 배양용 접시) 또는 삼각 플라스크를 사용한다. 예를 들면, 약 37℃에서 친수성을 나타내어 세포가 전혀 접착되지 않는 HydroCellTM 배양 접시(Cellseed. Co.)를 사용할 수 있다. 이를 통하여 약 200 내지 600㎛의 마이크로입자를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (4)에서는 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 분리한다. 단계 (3)의 진동배양이 5 내지 10일이 경과하면 배양접시 내에 다양한 크기의 마이크로입자가 존재하게 된다. 이들을 단순히 분리하거나 크기별로 분리하기 위하여, 한 양태로서 멸균 처리된 마이크로 피펫을 이용해서 위상차현미경 하에서 관찰하면서 마이크로 피펫으로 마이크로입자를 흡입하여 새로운 배양접시(부유배양용 접시)에 옮겨 담는 방식이 이용될 수 있다. 이 때, 배양접시를 원운동시키면서 원심력에 의해 마이크로입자를 중심으로 모이게 하고 마이크로피펫의 팁(tip)을 이용해서 배양액과 같이 흡입하면 팁의 직경보다 작은 마이크로입자만 흡입할 수 있다. 이렇게 분리된 마이크로입자는 인슐린 방출 분석용 배지에 넣어서 보관할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
연골세포의 분리 및 배양
개(Beagle, 12~24 개월령) 및 래트(Brown Norway Rat, 350±50g)로부터 귀의 이도와 이개를 포함한 탄성연골을 채취하여 피부조직, 피하조직, 근육조직, 연골막, 그 밖의 결합조직을 제거한 후 시계접시 상에 올려놓고 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하여 잘게 조각내었다. 그리고, 0.3% 콜라게나제 II 및 0.25% 트립신 효소를 배지(gibco사의 Ham's F-12 배지, 10%의 FBS, HEPES, 아스코르브산, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신)에 용해시켜 소화 용액을 제조하였다. 개에서 얻은 탄성연골은 상기 소화 용액으로 처리하고 37℃의 항온수조에서 진탕하면서 오버나이트(overnight) 동안 소화시키는 한편, 래트에서 얻은 탄성연골은 상기 소화 용액으로 처리하고 37℃의 항온수조에서 진탕하면서 5일 동안 소화시켜서 탄성연골이 단일 세포로 분리되도록 하였다.
이러한 과정을 통하여 얻은 단일 세포는 연골 세포의 개수를 증폭하기 위한 증식용 배지에 접종하여 배양하였다. 개의 경우에는 0.5 x 104로 접종하고, 이어지는 계대 배양에서는 0.25 x 104로 배양하는데 반하여, 래트의 경우에는 1.0 x 104로 접종하고, 이어지는 계대 배양에서는 0.5 x 104로 접종하였다. 여기서, 증식용 배지로는 CBM(CAMBREX. Co.) + CGM SingleQuots(CAMBREX. Co.) + 아스코르브산을 사용하였으며, 콘플루언시가 90%에 도달하였을 때 트립신-EDTA로 처리하여 증폭된 연골 세포를 배양 접시로부터 떼어내었다.
<실시예 2>
췌도의 분리
래트(Brown Norway Rat 또는 Lewis Rat, 350±50g)로부터 췌장을 적출해서 Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)(Gibco.Co.)에 10%의 FBS와 HEPES를 첨가한 용액에 콜라게나제 P(Roche. Co.)를 용해시켜 2㎎/㎖의 콜라게나제 P를 제조하고 이를 이용해서 소화시키고 Histopaque(Sigma Co.)를 이용하는 농도구배법에 의해 순화시키고 회수하였다. 이렇게 하여 분리된 췌도 세포를 위상차현미경을 이용하여 관찰하고 그 결과를 도 1a에 나타내었다.
<실시예 3>
연골세포에 의한 췌도의 캡슐화
실시예 1을 통하여 3차례 계대배양하여 얻은 연골세포 300 x 104/㎖와 실시예 2를 통하여 수득한 췌도세포를 혼합하여 배양용기로는 지름 6cm HydroCellTM(Cellseed. Co,)를 이용하고, 배지로는 인슐린 방출 분석용 배지를 이용하며, 진동 배양용 셰이커(모델명: NA-201, Nissin Co.)를 이용해서 70rpm의 진동을 가하면서 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 이 때, 인슐린 방출 분석용 배지(100㎎/dl)는 RPMI glucose(-)(Gibco Co.)에 Ham's F-12(Gibco Co.)를 동량으로 섞고 소량의 글루코오스(D-glucose, Sigma)를 첨가해서 100mg/dl로 농도를 조정한 후 10% FBS, HEPES(Dojindo) 및 아스코르빈산(Sigma)을 첨가하여 제조하였다. 항생제 및 항진균제로는 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B의 혼합물(Gibco Co.)을 배지 100 ㎖ 당 1㎖의 양으로 첨가하였다. 이렇게 배양하면 배양 개시 후 12시간부터 마이크로입자를 육안으로 관찰할 수 있었으며, 수득한 마이크로입자를 위상차현미경로 관찰하고 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
여기서, 다양한 크기의 마이크로입자가 존재하는데, 이들을 200㎛ 이상과 이하인 마이크로입자로 분리하기 위하여 배양접시를 원운동시키면서 원심력에 의해 마이크로입자를 중심으로 모으고 200㎛의 팁을 구비한 마이크로피펫을 이용하여 배양액과 같이 흡입하여 200㎛이하의 마이크로 입자만 흡입하였다. 이런 작업을 반복해서 두 개의 다른 새 부유배양용 배양접시에 나누어 담고 인슐린 방출 분석용 배지를 첨가하였다.
<실시예 4>
인슐린 분비 여부 확인
A. 병리조직학적 검사
실시예 3을 통하여 얻은 마이크로입자는 4%의 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고 15% 수크로오스 용액, 30% 수크로오스 용액에 순차적으로 적응시킨 후 동결절편으로 만들고 이 절편을 잘라서 병리조직학적인 검사로 H&E 염색을 실시하였다. 검사 결과를 도 2에 나타내었다.
B. 인슐린 분비량 측정
마이크로입자는 제작시간(예비실험데이터 7일)을 뺀 약 2주에 걸쳐 인슐린의 분비량을 측정하였다. 200㎛ 이상의 크기를 갖는 마이크로입자(마이크로입자 대)와 200㎛ 이하의 크기를 마이크로입자(마이크로입자 소)를 나누어서 진행하였다. 마이크로입자를 통상의 배양접시에 위치시키고 실시예 3에서 이용된 인슐린 방출 분석용 배지(100㎎/dl 인슐린 농도의 RPMI 글루코오스(-) · Ham's F-12의 혼합배지에 10% FBS, HEPES, 아스코르브산, 항생제)를 첨가하고 24시간 동안 정치한 후 배양액을 채취하여 IMXTM 인슐린 · 다이나박크® (ABBOTTTO JAPAN. Co.): 효소 면 역분석법으로 인슐린의 양을 측정하였다. 인슐린의 양은 총 1 내지 13일 동안 매일 측정하였다.
인슐린의 분비량 측정결과 도 3에 나타낸 바와 같이 13일 동안 마이크로입자로부터 인슐린이 분비되는 것을 확인할 수 있었으며, 8일 이후에 인슐린의 분비량이 증가하는 경향을 보였다. 또한, 3일이 경과한 후에는 200㎛이하인 마이크로입자(마이크로입자 소)가 200㎛ 이상인 마이크로입자(마이크로입자 대) 보다 우수한 인슐린 분비 작용을 보여주었다.
본 발명의 마이크로입자는 이식물이 수령할 개체 기원의 연골세포이므로 수령할 개체의 면역시스템이 비자기(non-self)로 인식하지 않고 자기(self)로 인식함은 물론 연골세포에 의해 캡슐화되어 면역반응에 관여하는 세포의 침투 또한 차단되어 면역거부반응은 방지되면서 영양분과 기체의 확산은 원활하여 이식물의 본래 기능을 장기간 유지시킬 수 있다.

Claims (12)

  1. 이식물이 상기 이식물을 수령할 개체로부터 유래된 탄성연골에 의해 캡슐화된 이식용 마이크로입자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 이식물은 세포인 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 이식물은 췌장의 췌도로부터 유래된 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자.
  4. 제 1항에 있어서,
    크기가 200 내지 600㎛인 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자.
  5. (1) 이식물을 수령할 개체 유래의 탄성연골을 분리(dissociation)하는 단계; (2) 상기 분리된 탄성연골을 계대배양하여 증폭하는 단계; (3) 탄성연골과 이식물을 혼합하여 진동 배양함으로써 이식물을 중심으로 탄성연골이 접착하도록 하는 단계; 및 (4) 이식물이 탄성연골에 의해 캡슐화된 마이크로입자를 분리하는 단계를 포함한 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    단계 (1)은 탄성연골을 쵸핑하여 분쇄한 후 단백질 분해효소를 처리하여 소화시키는 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    탄성연골은 시계접시 상에 올려놓고 수술용 곡가위를 이용하여 쵸핑하는 것을 특징을 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    탄성연골은 단백질 분해효소로 처리하고 오버나이트 내지 5일 동안 진탕 배양하면서 소화시키는 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  9. 제 5항에 있어서,
    단계 (2)의 배양에서 계대배양 회수는 3회 이하로 제한하는 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  10. 제 5항에 있어서,
    단계 (3)에서 진동배양은 인슐린 방출 분석용 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    인슐린 방출 분석용 배지는 글루코오스의 함량이 80mg/dl 내지 120mg/dl인 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
  12. 제 5항에 있어서,
    단계 (3)의 진동배양은 5 내지 10일 동안 진행하는 것을 특징으로 하는 이식용 마이크로입자의 제조방법.
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