CN1685038A - 用于对原代肝细胞进行灌注和铺板的方法以及其培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于培养具有改善了的长期功能和改善了的存活力的原代肝细胞的方法，包括在存在抗氧化剂和作为能产生活性氧和活性氮类的酶的功能性抑制剂的试剂的条件下对所述肝细胞进行铺板。一种优选的实施方案提供了2－氧－噻唑烷和生育酚琥珀酸酯的组合。另一种特别优选实施方案提供了NG－甲基精氨酸和甘露醇的组合。

Description

用于对原代肝细胞进行灌注和铺板的方法以及其培养基
本发明得到了国家卫生部基金的部分资助，并且，美国政府拥有对它的某些权利。
发明领域
本申请涉及能改善原代肝细胞的长期功能的方法。
发明背景
肝细胞组成了肝脏的主体，并且负责肝脏在代谢和解毒方面的中心作用。因此，培养的肝细胞，在研究化学实体在肝脏中的药理学和毒理学方面是重要的。正常的成年人肝细胞的原代培养物提供了用于研究哺乳动物，优选人类的肝脏生理学的很多方面的体外模型，例如，包括血浆蛋白的分泌，药物和异生素的氧化代谢，以及前致癌剂的激活。另外，所述培养物提供了由于伦理学原因在动物中不可能的条件下研究诸如细胞因子，生长因子和嗜肝病毒的生理病理学刺激对肝脏特殊功能的影响的独特方式。
业已提出了将培养的肝细胞用于构建体外的肝脏辅助装置(LAD)，这种装置被推荐用作患有急性或爆发性肝功能衰竭的患者的治疗装置。LAD可以起着临时支持装置的作用，它被设计成能提供肝脏功能，直到肝脏移植或患者自身的肝脏再生。LAD整合了包括分离的肝细胞的生物反应器，预计该反应器能够对肝功能衰竭患者的循环血浆中的物质进行解毒。
不过，将分离的肝细胞用于上述多种用途中的任意一种的挑战之一是上述很多分化的功能是瞬时的，在培养物中仅持续几小时至几天。例如，采用传统细胞培养技术生长的原代肝细胞，通常只能存活3-7天时间，并且有2-4天时间表现出分化的功能。Nishibe，Y，和Hirata，M.在培养的猴肝细胞中诱导细胞色素P-450同工酶。Int JBiochem Cell Bio.27：3：279-285.1995。Jauregui，HO，Ng，SF，Gann，K L和Waxman，D J.在成年大鼠肝细胞原代培养物中P-450 PB-4(IIB1)和P-450c(IA1)和相关的单加氧酶活性的异生素诱导。Xeno，21(9)：1091-106.1991.Niak，S，Trenlder，D，Santangini，H，Pan，J和Jauregui，H O.用于人工肝脏支持的猪肝细胞的分离和培养。CellTrans 5：107-115，1996。这限制了它们的用途。
采用现有细胞培养技术生长的肝细胞培养物丧失了特殊结构，包括穿孔，胆小管，并且丧失了双核形成。另外，培养的肝细胞具有在完整肝脏中看不到的特征和结构：它们扩散，并且变长，并且延长了应力纤维。在铺板之后不久，肝细胞减少了某些转录因子的表达，这些转录因子负责诱导肝脏特异性基因的转录。其例子包括HNF-4，HNF-3，C-EBPα和C-EBPβ。
完全分化的肝细胞的另一个特征是白蛋白的分泌。但是，在原代肝细胞培养物中，到第3天，白蛋白分泌显著减少，并且，到第5天，通过ELISA方法几乎检测不到。
在目前使用的培养基中培养的肝细胞，丧失了在铺板之后马上代谢异生素的能力。到培养的第3天，细胞色素P450基因表达大大减弱了。除了所述药物代谢酶的表达之外，诱导所述药物代谢酶表达的能力在培养过程中同样随时间大大减弱。
用于分离原代肝细胞的标准方法，是使用两个步骤的胶原灌注方法。不过，在该方法中，有可检测的活性氧和活性氮类(ROS/RNS)的产生。ROS/RNS对于分离的肝细胞来说具有病理学意义，并且体现为增强了的脂过氧化作用，蛋白修饰和DNA损伤的形式。
活性氧类和活性氮类能够在细胞中发挥重要作用。例如，对各种炎性刺激，肺内皮细胞，肺泡，和气道上皮细胞，以及活化的肺泡巨噬细胞作出反应，产生一氧化氮(NO)和超氧化物阴离子自由基(O2 -)。NO能调节肺血管和气道张力，并且在针对各种细菌的肺宿主防御方面发挥重要作用。不过，NO可能是细胞毒性的，这是通过抑制诸如线粒体顺乌头酸酶和核糖核苷酸还原酶的关键酶，通过硫醇基团的S-nitrosolation，或通过与它们的铁硫中心结合。另外，NO以接近扩散极限的速度与O2反应，以便形成强氧化剂过亚硝酸盐(ONOO-)，它能够对诸如表面蛋白A的各种肺蛋白上的关键的氨基酸进行硝化和氧化，并且抑制它们的功能。
一氧化氮是由身体内的多种类型的细胞产生的，用于细胞间交通(脑，心血管系统)或作为免疫或炎性反应系统的一部分(巨噬细胞，内皮细胞)。NO的化学性质在氧合生物学系统中是非常复杂的，这种复杂性表现在化学物南的数量以及平行的和连续的反应的数量方面。
在同样存在氧气的条件下，可能因为N2O3造成DNA损伤。在这种情况下，迅速形成了过亚硝酸盐，然后，在质子化之后，发生均裂，分裂成羟基和NO2。
肝细胞可以是用于对接触致癌物质的影响进行定量的有价值的系统。某些环境化学物质对人类健康造成了威胁。对这些成胁进行精确的评估，需要基于人类接触的定量数据。这样的数据目前是根据对空气，水，或食物中的化学物质的测定估算的。通常没有尝试过在人类血液，尿液或组织中进行直接测定，因为有关化合物通常是短寿命的，并且以低水平存在。可以将肝细胞用于对具有毒理学价值的化学物质进行定量，包括监测它们与人类蛋白的反应产物，包括致癌物质，诱变剂，和其他活性化学物质。还可将肝细胞用于对人类危险作更精确的评估，并且对相关联系作更精确的流行病学研究，例如，接触致癌物质和人类癌症之间的联系。
能够长时间存活或保持功能的肝细胞培养物对肝脏生物学家，毒理学家，和药物学研究者来说是有用的。因为培养的肝细胞具有短的半衰期，很多现象不能够进行适当的研究。不过，包括人类在内的动物会在它们的环境中遇到多种有毒物质。对所述有毒物质进行最初的和最有效的防御的是肝脏，它能代谢我们所摄入的所有试剂的80％以上。
起着清除有毒物质功能的细胞色素P450酶的诱导，是一种候选化合物是否能够在药物发现过程中继续发展的一个重要因素。更精确地预测P450诱导，是药物生产方案进行的一个步骤。在肝脏毒理学领域，在毒性的接触和表现之间存在明显的滞后，例如，黄曲霉毒素是由霉菌产生的有毒代谢物，可能需要很多天时间使它们在人体上表现出其作用，为了研究这种长时间的作用，能够长时间代谢异生素的肝细胞将是有用的。对确定它们的候选化合物的毒性感兴趣的公司不得不测试它们的肝脏毒性。使用分离的肝细胞仅提供了短期问题的指标。例如，如果毒性是在接触3天以上出现的话，现有的肝细胞培养物就不能检测所述毒性。
需要一种用于在培养物中长时间保持肝细胞的改进方法，以便用于药物学检测。针对用于治疗肝脏的任何药物最好都使用这种改进的肝细胞细胞培养模型进行测试。与它的短寿命的对应体相比，在长寿命的肝细胞模型中能够更好地模拟它的效能和有效性。
发明概述
本发明提供了能够长时间培养原代肝细胞，并且能保持它的功能和/或存活力三天以上的方法。该方法包括在存在抗氧化剂和第二种试剂的条件下对所述肝细胞进行铺板，其中，所述第二种试剂是(1)产生活性氧和活性氮类的酶的功能性抑制剂，或(2)直接抑制所述活性氧和活性氮类，或(3)增加细胞内谷胱甘肽。
在优选实施方案中，所述抗氧化剂是生育酚琥珀酸酯或羟基自由基清除剂。所述羟基自由基清除剂优选是甘露醇。
在另一种优选实施方案中，所述第二种试剂是谷胱甘肽前体或一氧化氮抑制剂。所述谷胱甘肽前体优选是2-氧-噻唑烷。所述一氧化氮抑制剂优选是NG-甲基精氨酸。
一种特别优选的组合是2-氧-噻唑烷和生育酚琥珀酸酯。
另一种特别优选的组合是NG-甲基精氨酸和甘露醇。
另一种特别优选实施方案提供了融合分子，该分子融合了所述抗氧化剂特性和能产生活性氧和活性氮类的酶的功能性抑制剂。
在一种优选实施方案中，本发明的方法是在分离和培养完整肝脏期间使用的。在另一种优选实施方案中，本发明的方法被用于分离和培养原代肝细胞。在另一种优选实施方案中，本发明的方法被用于分离和培养肝脏切片培养物。
本发明还提供了在药物开发期间使用具有改善了的长期功能的肝细胞筛选化合物的长期毒性的方法。所述长期功能超过三天时间，更优选超过五天时间，更优选至少一周时间，更优选至少两周时间，更优选至少一个月。
本发明还提供了使用具有改善了的长期功能的肝细胞筛选用于治疗肝脏的候选药物的方法。
本发明还提供了将具有改善了的长期功能的肝细胞用于生物人工肝脏装置的方法。
本发明还提供了使用具有改善了的长期功能的肝细胞生产蛋白的方法，所述蛋白包括在肝细胞中内源表达的蛋白，如TNF-α和肝细胞生长因子(HGF)。
本发明还提供了将具有改善了的长期功能的肝细胞用于开发乙型肝炎和丙型肝炎细胞培养物模型的方法。
本发明还提供了将具有改善了的长期功能的肝细胞用于肝细胞的冷冻贮藏的方法。
附图简述
图1表示CYP lA1诱导机制。
图2是表示对各种治疗的氧化还原作用的控制机制的表格。
图3是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理过的肝细胞中尿素合成的诱导倍数的曲线图。
图4是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理过的肝细胞中白蛋白分泌的诱导倍数的曲线图。
图5是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理过的肝细胞中诱导型CYP lAl活性的诱导倍数的曲线图。
图6是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理过的肝细胞中基础CYP lAl活性的曲线图。
图7是表示3-MC处理过的肝细胞中CYP1A1的Western印迹。
图8表示用各种试剂处理大鼠原代肝细胞的结果。
发明详述
本发明提供了培养原代肝细胞的方法，包括在存在抗氧化剂和第二种试剂的条件下对所述肝细胞进行铺板，其中，所述第二种试剂是(1)产生活性氧和活性氮类的酶的功能性抑制剂，或(2)直接抑制所述活性氧和活性氮类的试剂，或(3)增加细胞内谷胱甘肽的试剂。所述培养物的肝细胞具有四天以上时间的功能和/或超过一周的存活力。一种优选实施方案提供了2-氧-噻唑烷和生育酚琥珀酸酯的组合。另一种特别优选实施方案提供了NG-甲基精氨酸和甘露醇的组合。
通过本发明的方法培养的肝细胞具有长期功能。所述长期功能被定义为表现至少一种野生型分化功能，如细胞色素P450基因表达(有时被称为EROD活性)异生素代谢等和/或结构，如穿孔，胆小管，双核形成等至少三天时间。所述肝细胞优选表现出EROD活性。更优选表现出多种功能和结构。所述功能优选表现至少五天时间，更优选至少一周，更优选至少两周，更优选至少十六天，更优选至少三周，更优选至少一个月。更优选至少五十天，更优选至少两个月。存活力优选至少保持一周，更优选至少两周，更优选至少两周，更优选至少三周，更优选至少一个月，更优选至少两个月。
本发明还提供了融合分子，其中，所述抗氧化剂和所述第二种试剂存在于相同的分子中。
已知氧化应激产生和导致了多种疾病。有关与氧化应激相关的疾病和疾病状况的综述，参见Drugs of the Future，vol.13(10)，p.973(1988)和Molecular and Cellular Biochemistry，vol.84，p.199(1988)。
活性氧类和活性氮类在本领域中是众所周知的。例如，活性氧类包括，但不局限于超氧化物(O2)，羟基(OH)；过氧化物(RO2)，烷氧基(RO)，和过氧羟基(HO2)基团。活性氮类包括，但不局限于一氧化氮(NO)和二氧化氮(NO2)。
抗氧化剂起着清除自由基的作用，并因此预防对细胞的氧化破坏。起着氧化还原作用控制功能的治疗为本领域所熟知，并且包括，但不局限于生育酚琥珀酸酯；甘露醇，它能清除羟基自由基；ebselen，它能清除过亚硝酸盐和超氧化物阴离子；NOHA，它能产生一氧化氮；1400W，它能抑制诱导型一氧化氮合酶；n-乙酰基半胱氨酸，它能提高细胞内谷胱甘肽水平；PDTC，它能清除羟基自由基和超氧化物阴离子；以及葡糖胺。优选的抗氧化剂是生育酚琥珀酸酯和甘露醇。
除了所述抗氧化剂之外，本发明提供了第二种试剂，它可以是产生活性氧和活性氮类的酶的功能性抑制剂，或直接抑制所述活性物质的试剂，或增加细胞内谷胱甘肽的试剂。
谷胱甘肽在保护细胞系统免受氧化损伤方面起着重要作用。谷胱甘肽是解毒肽，它与异生素(异源化学物质或化合物)缀合，使所述异生素的亲水性更强，因此促进它们从身体内向外分泌。谷胱甘肽的合成涉及到两个步骤的反应：第一个步骤是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化的。谷胱甘肽合成酶能催化第二个反应。因此，在本文中，短语“细胞内谷胱甘肽的增加”或“细胞内谷胱甘肽的提高”意在表示所述谷胱甘肽三肽本身，以及决定它的合成以及与异生素缀合的酶。半胱氨酸是一种重要的氨基酸，并且是谷胱甘肽合成的速度限制物质。不过，在直接施用时，半胱氨酸可能是具有细胞毒性的。业已证实半胱氨酸药物前体在保护细胞系统免受各种形式的应激方面有效。对于那些有效的试剂来说，对于要通过酶促方式或非酶促方式切割的药物前体来说是必要的。一旦释放了半胱氨酸，就必须转化成谷胱甘肽，以便表现出治疗效果。
发挥半胱氨酸药物前体作用的一种类型的化合物是噻唑烷-4-羧酸酯(Cancer，Chemotherapy and Pharmacology，Vol.28，p.166(1991)和Arch.Gerontology and Geriatrics，vol.1，p.299(1982))。例如，业已报导了将某些作为半胱氨酸药物前体的2-取代的-噻唑烷-4-羧酸用作药物，用于推迟哺乳动物白内障的发作。不过，参考文献中所提到的取代基没有一种能够赋予所提到的2-取代的-噻唑烷-4-羧酸化合物的抗氧化或自由基清除特性。类似地，美国专利号4,868,114披露了通过让细胞与有效量的某些L-胱氨酸药物前体接触而刺激哺乳动物细胞中谷胱甘肽的生物合成的方法，并且美国专利号4,952,596披露了噻唑烷-4-羧酸化合物的N-酰基衍生物，它具有退热，抗炎，粘液溶解和止痛活性，此外，还具有治疗局部缺血病理学的活性，以及由氧化性自由基的超量产生所导致的病理学方面的活性。美国专利号5,846,988披露了具有与噻唑烷-4-羧酸酯部分融合的抗氧化剂苯酚部分的融合化合物，它被用作细胞保护剂。
优选的第二种试剂是NG-甲基精氨酸，它能抑制一氧化氮。
另一种优选的第二种试剂是2-氧-噻唑烷，它是半胱氨酸-药物前体，它起着谷胱甘肽前体的作用。因此，本发明还提供了优选的第二种试剂，它起着增加包括谷胱甘肽前体在内的细胞内谷胱甘肽的作用。
肝脏在清除多种有毒物质的能力方面是突出的。
对肝脏功能起着关键作用的是细胞色素P450酶，它采用一种化学机制改变并且催化有毒物质的清除。在它接触有毒试剂之后，肝脏通过诱导它们的表达调节所述酶。所述酶是我们生存所需要的。不过，它们还在用于治疗各种疾病的药物的某些组合中对疾病状态起着负面调节的作用。细胞色素P450酶的一种负面诱导作用，可以具有病理学上的副作用。一种例子是当人体摄取醇和大剂量的醋胺酚时P450酶的诱导，它可导致急性肝功能衰竭。
使用我们的培养方法，可以监测药物候选物的长期作用。目前，每年有超过140,000种药物候选物被投入体外试验，不过，只有很少量的候选物投入市场。先导化合物的失败主要是由于出乎预料的毒性以及长期效力的缺乏。与体内条件更为相似的细胞培养模型，能够大大加强并且促进管道药物的候选物测试。
用于培养肝细胞的改进的方法还可用于将所述肝细胞用在生物人工肝脏装置(BAL)上。在美国，肝脏疾病是突出的健康问题，通常有十分之一的病例会导致死亡。对患有急性或晚期肝脏疾病患者进行护理治疗的现有的标准是进行肝脏移植。使这种情况恶化的原因是，需要供体肝脏的患者的数量，比提供肝脏的供体的数量多出将近四倍。这种状态导致了超过二分之一的患者不能得到需要的肝脏。由于对丙型肝炎感染发病的预期的增加，对这种肝炎目前还没有疫苗或有效的治疗方法，估计，到2010年，对肝脏疾病治疗的需要将增加三倍。可以将BAL装置用在肝脏功能受损的患者身上，更像是将透析用于患有肾脏衰竭的患者。预计在下一个十年中，有效的生物人工肝脏装置的市场将会大大增加。这在很大程度上是由于肝炎感染在世界范围内增如。
还可将肝细胞用于生产用于治疗和用于研究的蛋白，包括与肝细胞相关的蛋白，如TNFα和肝细胞生长因子(HGF)的生产。
可以将所述肝细胞用于乙型肝炎或丙型肝炎的培养模型中，这种模型是目前所不存在的。实际上，所述原代肝细胞培养物应当能够分析病毒性肝炎感染和复制。工业和学术科学家业已进行了多年的努力，以便开发出病毒性肝炎的体外模型。这种肝炎的体外模型能够促进抗病毒制剂的高处理量筛选，以及宿主细胞的遗传工程，以便研究宿主防御机制。
还可将所述培养的肝细胞用于肝细胞冷冻贮藏。人类肝细胞的可利用性目前是无法预测的。因此，有效的冷冻贮藏技术将对研究人员和临床医生等有所帮助。目前，肝细胞是以在塑料上铺板或冷冻保存的形式运输的，并且在小瓶中冷冻输送，不过，目前得到了最不理想的结果。肝细胞的这种现有的培养物应当避免短期功能和存活力的问题。
分析肝细胞功能
表征肝细胞功能的任何分析方法都可用于确定原代细胞的长期功能。肝细胞功能的分析方法为本领域所熟知，包括，但不局限于分析肝细胞酶的活性，测定由肝细胞表达的蛋白和化合物，以及测定肝细胞中表达的基因的表达水平。
肝细胞酶的分析方法为本领域所公知。肝细胞酶包括药物代谢酶，如CYP1A1，乌头酸酶，和其他细胞色素。优选的肝细胞酶是CYP1A1，包括基础活性，以及诱导活性。例如，CYP1A1的分析方法由例如Pierce等，1996披露。在本文中，EROD是乙氧基试卤灵O脱乙基酶活性，它又被称为p450 CYP1A1，它是一种重要的药物代谢酶，并且是原代肝细胞中一般药物代谢活性的标记。细胞色素包括细胞色素C(Clementi等，1996)，和细胞色素P-450同工酶，如P-450 PB-4(IIB1)和细胞色素P-450c(IA1)。
由肝细胞表达的蛋白和化合物包括，但不局限于尿素，白蛋白分泌，和CYP1A1。例如，白蛋白的分泌是完全分化的肝细胞的特征。可以用众所周知的标准ELISA分析方法测定白蛋白分泌，例如，参见Dunn等，1991。可以通过检测尿素向靛酚的转化测定尿素合成，参见Fawcepp等，1960。在肝细胞中表达的其他蛋白包括TNFα和肝细胞生长因子(HGF)。
在肝细胞中表达的基因包括转录因子，这些因子决定诱导肝脏特异性基因的转录。例子包括，HNF-4，HNF-3，C-EBPα和C-EBPβ。可以使用本领域众所周知的分析方法检测所述基因的表达水平，这些方法包括测量mRNA含量的Northern印迹，定量rtPCR，以及测定蛋白水平的Western印迹。
肝细胞培养物系统
本发明可使用任何肝细胞培养物系统，这些系统是本领域众所周知的。优选的肝细胞培养物系统包括原代肝细胞培养物，肝细胞细胞系，肝切片培养物，以及整个肝脏的外殖培养物。
肝细胞的任何来源都可以使用。用于原代培养的肝细胞可以是构成哺乳动物肝脏的任何细胞，并且所述细胞可以用本领域所公知的方法从动物的肝脏中分离。用于获得肝细胞的肝脏供体优选是哺乳动物或啮齿类物种的正常的或转基因动物供体，更优选是马，犬，猪，绵羊，或鼠物种。
对于诸如生物人工肝脏装置的某些用途来说，猪供体是目前优选的。由于便于操作较小的动物和肝脏器官，使用大约5kg-大约20kg之间的猪，优选大约8kg，不过，任何体形的供体都可用作肝脏器官的来源。包括人类在内的其他哺乳动物来源同样可以使用。
在本发明的另一种优选实施方案中，所述肝细胞是诱导过的。可以在从动物肝脏中分离之前对肝细胞进行体内诱导，或在分离所述肝细胞之后进行体外诱导。
体内诱导优选是通过直接向血流中注射，腹膜内注射或肌内注射，给动物供体施用至少一种诱导剂进行的；不过，诱导剂还可以使用其他途径给供体施用，如口服，经皮施用，或通过吸入施用。可以一次以单剂或用一定时间以不同诱导剂的独立的剂量施用一种或多种诱导剂。所述供体可以施用两种或两种以上诱导剂的组合，以便上调某些需要的解毒酶，从而制备具有定制的酶活性特征的肝细胞培养物。所述诱导剂的给药可以在一天内施用，或者用一段时间施用，如在从供体肝脏中分离肝细胞之前用几小时或几天时间施用。例如，诸如苯巴比妥的某些诱导剂在给供体注射之后是相对不稳定的分子，因此，如果在获得所述器官之前以多个间隔提供将更有效。药剂中的诱导剂的量取决于(1)所使用的诱导剂，(2)供体的物类，体形和性别，(3)至少一种诱导剂的施用方式，和(4)药剂施用的频率。通常，当所述诱导剂是通过一系列给药施用时，所述诱导剂的剂量可能较少。本领域技术人员能够成功地确定如何操纵所述用药参数，以便获得体内诱导的肝细胞培养物，将其用于本发明的方法。
可以使用本领域所公知的任何诱导剂。诱导剂表示能够增强或上调肝细胞功能的试剂，特别是与解毒相关的酶，特别是与解毒相关的细胞色素P450或共轭反应。如果所述诱导剂能够保持或改善其他肝细胞的细胞功能则也是有用的，所述功能包括代谢功能，如氨清除，和合成功能，如白蛋白和转铁蛋白生产。
诱导剂选自下列一组，包括，但不局限于：β-萘黄酮(BNF)，苯巴比妥，3-甲基胆蒽(3MC)，乙醇，地塞米松，芳氯物1254，2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑，吩噻嗪，氯丙嗪，isosafole，γ-氯丹，烯丙基异丙基乙酰胺(AIA)，反式-氧化茋，开篷，丙酮，异烟肼，吡啶，吡唑，4-甲基吡唑，孕烯醇酮16-α-腈(PCN)，三乙酰夹竹桃霉素(TAO)，克霉唑，clofirate，氯丁扎利，二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(DEHP)，或单-(20乙基己基)邻苯二甲酸酯(MEHP)。特别优选的诱导剂是3-甲基胆蒽，β-萘黄酮(BNF)，和苯巴比妥。3-甲基胆蒽是最优选的诱导剂。
在分离肝细胞之前，可以在体内使用一种或多种诱导剂，以便上调所述酶促活性。在分离之前，可以给供体施用单一诱导剂一次或多次。诱导剂可以是组合的，就是说它是在同一时间的混合物或鸡尾酒，或顺序的，即在不同的时间独立施用的混合物，在施用时，能够上调目标酶的特性。所述剂量中所包含的诱导剂的量应当足以诱导肝细胞提高它们的功能性代谢活性，而又不会高到对肝脏器官或供体来说是致命的。给供体提供诱导剂的时间应当足够长，以便导致酶促解毒活性的上调，优选在分离之前至少大约24小时。
所述诱导剂和其他试剂的剂量披露于美国专利号6,394,812中。
如果受体患者需要针对其中解毒酶活性表达低的适应征的肝脏辅助治疗，可以用具有肝细胞特征的细胞分离物的混合物制备肝脏辅助装置，所述肝细胞具有上调了的多种酶活性，以便获得最大程度的解毒活性，并且提供用于治疗急性衰竭的定制的培养物。
为了分离原代肝细胞，可以使用本领域所公知的任何方法。优选的方法是两个步骤的胶原酶灌注分离方法。
例如，在诱导阶段之后，可以使用Seglen肝细胞分离方法的改进方法分离肝细胞，参见Seglen，P O.分离的大鼠肝细胞的制备。参见Methods in Cell Biology(D M Prescott，ed.)vol.13.Academic Press(NY，N.Y.)，1976，该文献被收作本文参考。对所述动物进行麻醉，剖开，并且在暴露的肝脏上插管，并且用冷的乳酸化Ringers溶液进行原位灌注，然后切除肝脏，以便漂洗肝组织中的血液和多余的诱导剂。将切除的肝脏转移到生物学安全的室内，在这里，在无菌条件下完成所述方法的其余步骤。然后用热的，优选37℃的EDTA快速灌注所述器官，以消化提供肝脏的物理结构的细胞外基质，然后用37℃的1mg/ml胶原酶灌注，直到消化看上去已完成(平均消化时间为大约22分钟)。然后通过添加补充了牛血清的冷却的Hank′s平衡的盐溶液(HBSS)终止进一步的消化。肝脏基质的消化从所述基质结构中释放出细胞和细胞聚集物，以便产生细胞悬浮液。将未消化的组织和胆囊切除，并且让其余的组织通过200微米和100微米的不锈钢筛网，以便释放细胞和细胞聚集物。通过离心并且倾倒漂洗介质将所述细胞悬浮液洗涤二次，并且优选在第三次漂洗之后，将细胞沉淀重新悬浮在介质中。此时，细胞可以在培养基中培养或者在冷冻贮藏介质中冷冻保存，进行长期保存以供将来使用。
所述细胞作为细胞悬浮液或在适合动物细胞或组织培养的表面上铺板培养，如培养皿，烧瓶，或滚瓶，它们能够进行肝细胞培养和维持。可以将所述细胞掺入生物反应器中，以悬浮液形式或在诸如培养珠或纤维的培养基质或在平面或膜上铺板的形式。所述细胞能够在它上面生长的合适的细胞生长基质，可以是任何生物学相容的材料，细胞可以附着在它上面，并且提供要形成的细胞基质结构的附着方式。可以用作细胞生长表面的材料如玻璃，不锈钢，聚合物，包括聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚偏乙烯，聚二甲基硅氧烷，含氟聚合物，以及氟化乙烯丙烯，以及硅基质，包括熔融石英，多晶硅，或硅晶体。为了增强细胞贴着或功能，或这两者，可以对所述细胞生长表面材料进行化学处理或修饰，使其带静电荷，或用诸如细胞外基质成分或肽的生物物质涂敷。在一种实施方案中，所述肝细胞是在放置在培养表面，如涂层或凝胶形式的胶原上的细胞外基质的表面内或表面上培养的。在另一种实施方案中，所述肝细胞是在液体可渗透的膜或气体可渗透的膜上培养的。存在于肝脏中的其他细胞也可以掺入诱导过的肝细胞中，如内皮细胞；Kupfer细胞，特化的巨噬细胞样细胞，和成纤维细胞。肝细胞与一种或多种上述或其他类型细胞的共培养物可能是优化肝细胞功能所需要的。
在一种实施方案中，可以将体内诱导过的肝细胞接种到被用作或整合在LAD中的生物反应器中。某些LAD设计是以空心纤维盒设计为基础的，其中，将所述肝细胞接种到空心纤维的空腔内，或接种到空心纤维的外面。起着培养基质作用的空心纤维允许液体或气体通过空心纤维转运。其他LAD设计采用了平面培养基质。位于两个胶原凝胶层之间的肝细胞培养物披露于授予Dunn等的美国专利号5,602,026和5,942,436中。使用平面培养基质的另一种设计披露于Bader等的美国专利号5,658,797和国际PCT公开号WO 96/34087中。某些平面基质可以进行显微造型，以便能够以共同培养物的形式在基质上的不同部位同时培养两种或两种以上类型的细胞，正如由Bhatia等所披露的。上述披露了培养基质和方法，以及它们作为生物反应器装置用于治疗需要肝脏辅助的患者的用途的专利的内容，被收作本文参考。
用于培养肝细胞的优选的生物反应器设计采用了气体可渗透的，液体不可渗透的膜，它限定了生物反应器腔室的两个区域。将肝细胞接种在液体培养基中培养的膜的表面上，同时不仅在培养基中，而且还跨所述膜进行加氧和其他气体转运。在另一种实施方案中，对所述膜进行处理，以便改善细胞的附着作用，如通过改变所述膜的电荷，通过电晕放电，或通过用细胞外基质成分，肽，细胞粘附分子或其他化学物质处理所述膜或进行包被。用于所述膜的优选包被物是胶原。
在培养时，所述细胞优选与细胞培养基接触一定时间，以便保持它们的代谢活性和最佳的肝细胞功能。虽然它们的浓度不同，细胞培养基以葡萄糖，氨基酸，维生素和无机离子，以及其他基础培养基成分的形式提供了细胞的基础营养来源。培养基通常包括养分基础，还补充了一种或多种其他成分，如氨基酸，生长因子，激素，抗细菌剂和抗真菌剂。在肝细胞分离之后用于该方法的一种优选的培养基包括：Williams′E培养基，新生牛血清(NBCS)，葡萄糖，胰岛素，胰高血糖素，氢化可的松，HEPES，上皮生长因子(EGF)，和谷氨酰胺。在一种更优选的实施方案中，补充了本发明的抗氧化剂和第二种试剂的培养基包括：Williams′E培养基，补充了最多1％的新生牛血清(NBCS)，4.5g/l葡萄糖，0.5U/ml胰岛素，7ng/ml胰高血糖素，7.5.mu.g/ml氢化可的松，10mM HEPES，20ng/ml EGF，和200mM谷氨酰胺。肝细胞培养领域的技术人员可以确定要使用的上述培养基成分或它们的功能性等同物的其他浓度。
用于培养肝细胞的另一种优选的培养基利用了业已添加了pleiotrophin(PTN)，胎牛血清(FBS)和烟酰胺或它们的类似物的培养基。更优选的是，所述培养基还包括抗坏血酸或它的类似物(例如L-抗坏血酸磷酸盐)。还向该培养基的基础培养基中添加了上述抗氧化剂和第二种试剂。
例如，在日本专利申请号133985/1996中披露的培养方法的一种实施方案中，肝细胞是在混合培养基中培养的，该培养基包括含有FBS和烟酰胺或它们的类似物的培养基，所述成分作为肝细胞的集落形成成分，以及3T3细胞的条件培养基(CM)，作为肝细胞的生长促进因子，其中，向所述现有用途的培养基中添加PTN取代3T3细胞的CM。
化合物PTN是一种肝素结合蛋白，并且它作为生长因子和神经细胞的营养因子的作用是已知的。某些研究者业已报导了它们促进诸如成纤维细胞，内皮细胞，上皮细胞等的体细胞分裂的作用，不过，还报导了与所述作用相反的作用，因此，PTN对体细胞的作用尚未确定(The Journal of Biological Chemistry，Vol.267，No.36，pp.25889-25897，1992)。
化合物PTN是作为重组人PTN通过商业渠道(R & D SystemsInc.)获得的，并且还可将这种商业产品用于本发明的方法中。使用披露于美国专利号6,136,600中的分离和纯化方法，还可以从按照与日本专利申请133985/1996相同的方法制备的3T3细胞的CM或从其他动物细胞的培养上清液中获得。另外，来自3T3细胞的PTN可以通过使用PTN的一部分已知的氨基酸序列作为探针，从现有的cDNA文库中分离PTN的编码序列，然后在合适的宿主载体系统中表达该编码序列而获得。
添加了PTN，FBS，抗坏血酸或它们的类似物和烟酰胺或它的类似物的培养基，是含有表皮生长因子和DMSO的特殊的DMEM培养基。表皮生长因子(EGF)和DMSO对于集落形成来说不是必需的，不过，优选将它们添加到所述培养基中，因为它们具有促进集落形成的作用。通过低速离心获得的级份，除了肝细胞之外，还包括内皮细胞，Kupffer′s星形细胞，星形细胞，胆管上皮细胞，并且被认为提供了具有特殊环境的肝细胞，并且所述烟酰胺或它的类似物，抗坏血酸或它的类似物和DMSO能抑制所述非实质细胞的生长，因此，使它能选择性地培养并且增殖实质肝细胞。例如，添加到所述培养基中的这些成分的量，可以是大约0.1ng/ml-10.mu.g/ml的PTN，5-30％的FBS，0.1-1.0mM的抗坏血酸或它的类似物，1-100ng/ml的EGF，1-20mM的烟酰胺或它的类似物，以及0.1-2％的DMSO。培养是在5％CO2气体中，低于2个大气压下，在大约37℃下进行的。
在另一种优选实施方案中，在分离之后对肝细胞进行冷冻贮藏保存，直到需要掺入到生物反应器中。细胞悬浮液，细胞单层，以及工程化组织结构的冷冻贮藏是冷冻贮藏领域所公知的。可以将冷冻贮藏用于长期保存，库存，和运输。在需要的时候，将所述培养物从冷冻保存物中取出，解冻，漂洗冷冻防腐剂，并且做好使用的准备。
在分离之后或者在从冷冻贮藏保存物中取出之后，在一种优选实施方案中，所述体内诱导的肝细胞优选掺入到生物反应器中，并且在其中培养。可以使用来自用一或多剂相同的诱导剂或多种诱导剂诱导过的单一分离物的肝细胞。在另一种实施方案中，在生物反应器中与从体内诱导的供体中分离的肝细胞一起培养从未诱导过的供体获得的肝细胞。在另一种实施方案中，将来自通过相同的诱导剂或至少两种不同的诱导剂诱导过的两个或两个以上供体分离物的肝细胞在相同的生物反应器中组合在一起。如果所述生物反应器具有多个培养室或区，来自业已用不同的诱导剂预先处理过的不同供体的肝细胞可以分离，不过，它们是同时使用的，以便实现所述生物反应器的总体功能。将具有不同酶活性特征的体内诱导的肝细胞培养物组合在被用作LAD的生物反应器，对于用所述生物反应器中的培养物进行治疗的患者来说是有利的。在一种实施方案中，所述生物反应器可能包括若干种具有不同的体内诱导的肝细胞培养物的分离物，以便给患者提供上调的酶的完整的特征，从而获得最大程度的解毒活性。另一种实施方案是这样一种方案，其中，可以用接种了具有某些选定的酶促活性的一种或多种体内诱导的肝细胞的分离物接种过的生物反应器治疗患者，它能够增强或取代某些酶促活性水平，其中，患者的肝脏能表达低水平的某些解毒酶。
可以将所述生物反应器用于培养所述细胞，以便生产细胞产物或对诸如通常由肝脏代谢的毒素的物质产生功能性作用。所述生物反应器可以用作肝脏辅助装置或作为它的整体部分，用于治疗需要肝脏辅助的患者。具有上调了的酶促活性的肝细胞可用于被用作肝脏辅助装置的各种类型的生物反应器中。适合这一目的的生物反应器包括悬浮装置，空心纤维，径流表面和平面基质，如细胞培养物。
业已在体内诱导过的肝细胞，可用于治疗需要肝脏辅助的患者，所述肝细胞是在生物反应器中培养的，生物反应器被用作肝脏辅助装置或整合在该装置上。通常，肝细胞灌注培养基和患者血浆或血液，是通过该装置在独立的流通回路中循环的。所述流通回路通过膜彼此接触，以便进行气体，毒素和白蛋白的交换，不过，还提供了肝细胞和患者之间的免疫学屏障。
应用
对于肝脏生物学家，毒理学家，和药理学研究者来说，改进的肝细胞是有用的。因为所述培养的肝细胞的短的半衰期，使用标准方法一直不能够适当地研究很多现象。
因此，本发明提供了在药物开发期间使用具有改善了的长期功能的肝细胞筛选具有长期毒性的化合物的方法。P450酶的诱导是候选化合物在药物发现过程中是否能进一步开发的重要因素。更精确地预测P450诱导是药理学生产方法继续进行的一个步骤。在肝脏毒理学领域，在接触和毒性出现之间存在显著的滞后。培养原代肝细胞的标准方法只得到了能保持功能几天时间的细胞；不过，很多试剂不会马上表现出它们的毒性作用。例如，黄曲霉毒素，它是由霉菌产生的一种有毒代谢物，需要很多天时间才能在人体上表现出它的作用。因此，本发明的肝细胞可用于研究代谢的异生素的较长时间的长期作用。
目前，每年有超过140,000种药物候选物被投入体外试验，不过，只有很少几种能够上市。先导化合物的失败在很大程度上是由于出乎预料的毒性，以及效力的缺乏。其表现更类似于体内条件的细胞培养模型，将大大加强并且促进管道药物的候选物测试。在药物开发期间可以将本发明的肝细胞用于确定候选化合物的毒性，必须测定所述化合物的肝脏毒性。这一目的可以在分离的肝细胞上实现，不过，如果所述毒性是在超过三天的长时间接触之后出现，现有的肝细胞培养方法不能够检测所述毒性。使用本发明的肝细胞，可以监测药物候选物的长期作用。
本发明还提供了用具有改善了的长期功能的肝细胞筛选用于治疗肝脏的候选药物的方法。用于治疗肝脏的药物可以在本发明肝细胞的长期培养物中更好地测试；所述肝细胞的改善了的功能提供了对效能，有效性，和毒性的改善了的测试。
本发明还提供了将具有改善了的长期功能的肝细胞用在生物人工肝脏装置上的方法。预计在下一个十年中，对有效的生物人工肝脏装置的需要将会大大增加，这在很大程度上由于世界范围内的肝炎感染的增加。
本发明还提供了将具有改善了的长期功能的肝细胞用于生产蛋白的方法，包括在肝细胞中内源表达的蛋白，如TNF-α和肝细胞生长因子(HGF)，用于治疗和研究目的。
实施例1：在新分离的肝细胞中的活性氧和氮类的调节，及其对肝细胞表型和功能的影响。
为了研究不同化合物对肝细胞功能和表现型的影响，按照本领域众所周知的方法分离肝细胞，并且在胶原夹心结构中培养。通过添加2nM 3-甲基胆蒽(3-MC)诱导肝细胞。通过EROD分析方法测定CYP1A1，参见Pearce等，1996的描述。通过ELISA测定白蛋白分泌，参见Dunn等，1991的描述。使用本领域众所周知的技术进行Western印迹分析，使用CYP1A1的抗体。
在图1中示出了CYP lA1的诱导机制。图2是表示各种治疗的氧化还原作用控制机制的表格。
图3是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理并且培养16天时间的肝细胞中尿素合成的诱导倍数的曲线图。
图4是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理并且培养8天时间的肝细胞中白蛋白分泌的诱导倍数的曲线图。
图5是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理并且培养16天时间的肝细胞中诱导型CYP1A1活性的诱导倍数的曲线图。
图6是表示与未处理过的对照组相比，在用各种化合物处理并且培养14天时间的肝细胞中基础CYP1A1活性的曲线图。
图7是表示3-MC处理过的肝细胞中，培养8天，12天和16天时间的CYP1A1的Western印迹。
以上实验表明，抗氧化剂在原代肝细胞中增强CYPlA1的诱导性方面是有效的。NFkB核转运对于肝细胞功能来说是重要的。一氧化氮的效果(通过抑制一氧化氮或提供一氧化氮检测)是可检测的，但是是很有限的。在抗氧化剂类型中，清除羟基自由基或增加细胞内谷胱甘肽在保持P450功能方面是最有效的。葡糖胺保护P450功能的机制正在研究之中，并且可以像抗氧化剂那样起作用，这种观点是基于以下发现：在激活的巨噬细胞中，葡糖胺能抑制NO合成。
实施例2：大鼠原代肝细胞
分析了用本发明方法制备的大鼠原代肝细胞的功能。如图8所示，测定了在处理过的和未处理过的大鼠原代肝细胞中EROD活性的平均增加倍数。所述数量是平均值，超过1.2的水平是显著的。EROD是乙氧基试卤灵O脱乙基酶活性，它又被称为p450 CYPlAl，它是一种重要的药物代谢酶，并且是原代肝细胞中普通药物代谢活性的标记。
实施例3：小鼠原代肝细胞
还检验了使用本发明方法的小鼠原代肝细胞的功能。通过使用OTZ和生育酚琥珀酸酯，使用本发明的方法，我们能够在分离之后，维持哺乳动物肝细胞超过50天时间，并且将EROD活性保持这么长的时间。参见图9。在未处理过的组中几乎没有EROD活性，而在处理组中具有3.5倍的活性。试验重复进行了四次，示出了平均值。
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17.Dunn et al.，Biotechnol.Prog.，7(3)：238-245(1991).
本文所披露的所有文献都被收作本文参考。

Claims (8)

1.一种用于培养原代肝细胞的方法，包括在存在抗氧化剂和第二种试剂的条件下对原代肝细胞进行铺板，其中，所述第二种试剂是(1)产生活性氧类和活性氮类的酶的功能性抑制剂，(2)直接抑制所述活性氧类和活性氮类的试剂，或(3)增加细胞内谷胱甘肽的试剂，其中，所述原代肝细胞能够保持功能至少5天时间。
2.如权利要求1的方法，其中，所述抗氧化剂是生育酚琥珀酸酯或羟基自由基清除剂。
3.如权利要求2的方法，其中，所述羟基自由基清除剂是甘露醇。
4.如权利要求1的方法，其中，所述第二种试剂是谷胱甘肽前体或一氧化氮抑制剂。
5.如权利要求4的方法，其中，所述谷胱甘肽前体是2-氧-噻唑烷。
6.如权利要求4的方法，其中，所述一氧化氮抑制剂是NG-甲基精氨酸。
7.如权利要求1的方法，其中，所述抗氧化剂和第二种试剂是2-氧-噻唑烷和生育酚琥珀酸酯。
8.如权利要求1的方法，其中，所述抗氧化剂和第二种试剂是NG-甲基精氨酸和甘露醇。
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