CN105255825B - 一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法。所述分离消化液为含表面活性剂的酶溶液，所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液。所述分离方法包括用消化液振荡消化跟腱组织，所述消化液为含表面活性剂的酶溶液。本发明在消化硬度较大的组织块时，使用含有表面活性剂的消化液，降低振荡消化过程中细胞受到的剪切力，保证良好的细胞状态；振荡消化可以有效缩短消化时间，仅消化30分钟就可以得到小的跟腱组织块，消化效率高。

Description

一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法

技术领域

本发明涉及干细胞的分离培养领域，尤其涉及一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法。

背景技术

肌腱是连接骨骼与肌肉的强韧的纤维结缔组织。肌腱炎通常是指由于肌肉纤维过度使用，反复强烈牵拉而引起肌腱胶原纤维退行性病变，除了累及肌腱本身，还可以累及腱鞘。以往诊断常用肌腱炎来统称，但事实上肌腱炎并非单一的炎症，大多数情况下，常合并为受累肌腱胶原组织变性，因此现在通称为肌腱病。

肌腱病在高运动量的人群中常见，以局部疼痛、肿胀、功能障碍为临床特征，常见发病部位为肩袖、岗上肌、髌腱及跟腱。目前肌腱病的发病机制尚未完全研究清楚，国内外学者一致认为肌腱内细胞异常增生、细胞外基质的变化是肌腱病发病的基础。2007年美国学者从人和兔的肌腱中分离出一种具有自我更新能力的细胞，将其命名为肌腱干细胞(TDSCs)或肌腱祖细胞。2010年香港学者从鼠肌腱中也分离出肌腱干细胞。有学者提出肌腱干细胞的异常分化可能是肌腱病的发病基础。肌腱干细胞具有多向分化潜能和自我更新能力，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞。

股骨头坏死是骨科常见病、多发病，病程长且致残率高。如何有效地治疗成人股骨头坏死，防止疾病的进一步发展，保护股骨头，延缓髋关节置换的手术时间，是其治疗的重点。虽然目前保髋手术的方法很多，如髓芯减压、带血管蒂的腓骨移植、移植骨髓间充质干细胞、表面置换等，均取得一定疗效，但均具有一定的缺陷，不能完全达到人们的期望。肌腱干细胞具有明确的干细胞特性，适合修复股骨头坏死的病理过程，因此有望成为治疗股骨头坏死新的种子细胞。

原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞，有人把培养的第1代与传10代以内的细胞统称为原代细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物等的研究。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。在块状组织的原代分离中，现有技术主要是以机械研磨或酶消化法得到更小的组织块，再进行组织块培养，筛选出能生长出单一种类细胞集合的“细胞岛”，然后通过扩大培养、鉴定得到纯种细胞。这些方法主要针对硬度较小的组织，且需要处理的时间大多较长。这些方法在处理像跟腱这样有一定硬度的组织上效果尚差。如机械研磨法的研磨力度过大会导致目的细胞受损严重，而力度太小需要较长时间的研磨，最后一样得不到理想的细胞状态，分离率低。酶消化法的消化条件比较温和，但是消化时间很长。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法。

一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液，所述消化液为含表面活性剂的酶溶液。

优选地，所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液。

更优选地，所述消化液中I型胶原酶的浓度为1-5mg/mL。

更进一步优选地，所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mL。

优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。

更优选地，所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆。

优选地，所述表面活性剂的含量为10-30mg/mL。

一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离方法，用上述消化液振荡消化跟腱组织，所述消化液为含表面活性剂的酶溶液。

优选地，所述跟腱来源肌腱干细胞的原代分离方法，包括以下步骤：

S1、将跟腱组织碎块与上述消化液混合，100-175rpm消化20-40min；

S2、过滤获得单细胞悬液，250-500g离心5min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，转入培养皿中，于37℃，5％CO₂环境下培养，每3d补液一次，培养至细胞贴壁，贴壁细胞即为跟腱来源肌腱干细胞原代细胞。

优选地，消化液中泊洛沙姆浓度为20mg/mL，I型胶原酶浓度为3mg/mL；在37℃、150rpm条件下消化30min。

优选地，所述完全培养基为含10％FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基。

优选地，在消化前需要预处理跟腱组织，即将跟腱组织用PBS清洗，剪切成约1mm×1mm×1mm大小的碎块。

优选地，步骤S1中500mg跟腱组织碎块与6mL消化液混合，步骤S2中用10mL完全培养基重悬细胞沉淀，转入10cm培养皿中，每3d补液5mL。

优选地，所述跟腱组织为人跟腱组织。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明在消化硬度较大的组织块时，使用含有表面活性剂的酶溶液作为消化液，表面活性剂可以降低振荡消化过程中细胞受到的剪切力，从而减少细胞所受到的物理损伤，保证良好的细胞状态；振荡消化可以有效缩短消化时间，仅消化30分钟就可以得到小的跟腱组织块，消化效率高。

附图说明

图1为本发明实施例1各实验组和对照组细胞岛数量图。

图2为原代细胞在培养皿中的形态图。

图3为原代细胞显微形态图。

图4为第3代细胞显微形态图。

图5为流式检测图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

主要试剂及仪器分别购自如下公司：I型胶原酶购自sigma公司，泊洛沙姆(F68)购自Gibco公司，FBS购自Gibco公司，L-DMEM购自Gibco公司，青霉素&链霉素购自sigma公司，离心机购自eppendorf公司，显微镜购自尼康公司，恒温培养箱购自SANYO公司。

实施例1、人跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法

人跟腱组织预处理：在无菌环境下用PBS清洗人跟腱组织3次，将5g人跟腱组织剪切成约1mm×1mm×1mm大小组织碎块；人跟腱组织来自腱断裂患者行跟腱缝合修补术时修剪的跟腱组织；

S1、将500mg人跟腱组织碎块与6mL消化液混合，37℃振荡消化30min；所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液，所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mL，表面活性剂的浓度和振荡转速按照表1所示设置；

S2、1500rpm离心10min终止消化，弃上清，10mL PBS重悬沉淀，用70μm滤器过滤获得单细胞悬液，300g离心5min，弃上清，用10mL完全培养基重悬细胞沉淀，500个/cm²细胞密度接种至直径10cm的培养皿中，于37℃，5％CO₂环境下培养8d细胞贴壁，弃去培养液，即得到人跟腱来源肌腱干细胞原代细胞；所述完全培养基为含10％FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基。显微镜下统计细胞岛的数量，结果如表2和图1所示。

所述表面活性剂为泊洛沙姆。泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，简称F68，此种表面活性剂为非离子表面活性剂，相比阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂而言对细胞毒性最低。

空白对照不添加消化液，不进行消化，直接用剪切后的组织块培养，命名为G0。以常规的3mg/mLⅠ型胶原酶37℃静置消化2h人跟腱组织碎块为对比例1，命名为G21。以3mg/mLⅠ型胶原酶37℃振荡消化30min人跟腱组织碎块为对比例2，命名为G22。实验组的消化液均含有表面活性剂和3mg/mLⅠ型胶原酶，振荡转速和表面活性剂浓度设计如表1所示，分别命名为G1-G20、G23-G26。

表1实验组的振幅和表面活性剂浓度设计

表2各对照组和实验组细胞岛数量

名称	细胞岛数量	名称	细胞岛数量	名称	细胞岛数量	名称	细胞岛数量
								G1	5	G2	6	G3	8	G4	9
G5	6	G6	9	G7	12	G8	11
								G9	9	G10	12	G11	18	G12	12
G13	7	G14	12	G15	13	G16	9
								G17	6	G18	7	G19	9	G20	6
G0	1	G21	17	G22	0	G23	0
								G24	0	G25	0	G26	0

由表2和图1可以看出，表面活性剂在振荡消化过程中对细胞有保护作用，可以减少细胞的损伤致死。在其他条件相同的情况下，随表面活性剂的含量的增加，细胞岛的数量先增加后降低，说明适当浓度的表面活性剂有利于细胞消化。在其他条件相同的情况下，随振荡转速的增加，细胞岛的数量先增加后减少，说明适当的振荡有利于消化，当振荡转速过大会损伤致死细胞。用含有表面活性剂的消化液消化的细胞，经过8d培养，具有细胞岛出现；用不含表面活性剂消化的细胞，经过8d培养，均无细胞岛出现，说明细胞全部死亡消失，进一步说明在震荡情况下消化不添加F68的保护，I型胶原酶会将细胞消化完全。

由表2和图1还可以看出，G11和G21无明显差异，即使用本发明方法采用终浓度为20mg/mL的泊洛沙姆在37℃、150rpm消化30分钟，就可以达到常规方法消化2小时的效果，用时减少了3/4，大大缩短了消化时间，降低时间成本。

实施例2、人跟腱来源肌腱干细胞形态学观察

对本发明跟腱来源肌腱干细胞原代分离方法分离人跟腱来源肌腱干细胞的过程、原代培养过程中，以及对分离得到的人跟腱来源肌腱干细胞的传代培养过程中的细胞形态进行显微观察。从人跟腱组织消化获得的有核细胞，细胞呈克隆样生长。原代培养可见多个散在分布的簇状细胞集落，呈由中心向外辐射样贴壁生长(图2)，细胞形态不规则，以多角形为主，细胞核聚集于中心，细胞质形成的突起向外呈放射状(图3，40倍图)，符合人跟腱来源肌腱干细胞的形态特征。细胞传代后，可见两种形态细胞：圆形巨噬样细胞和长梭形成纤维样细胞。第3代细胞生长至90％融合后，细胞形态均一，呈细长纺锤形、成纤维细胞样生长(图4，100倍图)。

实施例3、流式细胞仪检测细胞免疫表型

对实施例1中G11组分离得到的人跟腱来源肌腱干细胞在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行传代，传代培养基为含体积分数10％FBS的L-DMEM培养基。取P3代细胞进行细胞免疫表型检测，具体方法为：收集约2×10⁶个P3代细胞，1500rpm离心4min后弃去上清，Buffer溶液重悬，吸取100μL细胞悬液加入Ep管内，加入抗CD90、CD44、CD106、CD34避光孵育30min。1500rpm离心4min后弃去上清。每样品管加入300μL Buffer溶液重悬，上机检测。

流式细胞方法对细胞表面抗原鉴定的结果进一步显示人跟腱来源肌腱干细胞具有明确的干细胞特性，超过99％和91％的细胞干细胞表面标记物CD90、CD44呈阳性表达，而CD34、CD106呈阴性表达。

本发明通过流式细胞仪检测到分离细胞的MSCs特异性表面标记物CD44和CD90呈阳性表达，与文献报道的小鼠及兔来源干细胞一致，与BMSCs表面标记物相似。而CD34、CD106的表达呈阴性，表明本发明方法提取的是非血液细胞来源，且未受其污染。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液，其特征在于，所述消化液由含表面活性剂的I型胶原酶溶液组成；

所述消化液中I型胶原酶的浓度为1-5mg/mL；

所述表面活性剂为泊洛沙姆，且所述表面活性剂的含量为10-30mg/mL。

2.根据权利要求1所述的跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液，其特征在于，所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mL。

3.一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离方法，其特征在于，用权利要求1-2任一项所述的消化液振荡消化跟腱组织；

所述消化液振荡消化跟腱组织的振荡转速为100-175rpm，消化时间为20-40min。

4.根据权利要求3所述的跟腱来源肌腱干细胞原代分离方法，其特征在于，所述跟腱来源肌腱干细胞的原代分离方法，包括以下步骤：

S1、将跟腱组织碎块与上述消化液混合，100-175rpm消化20-40min；

S2、过滤获得单细胞悬液，250-500g离心5min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，转入培养皿中，于37℃，5％CO₂环境下培养，每3d补液一次，培养至细胞贴壁，贴壁细胞即为根据来源肌腱干细胞原代细胞。

5.根据权利要求4所述的跟腱来源肌腱干细胞原代分离方法，其特征在于，消化液中泊洛沙姆浓度为20mg/mL，I型胶原酶浓度为3mg/mL；在37℃、150rpm条件下消化30min。