CN110055215A - 一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法 - Google Patents
一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110055215A CN110055215A CN201910369790.3A CN201910369790A CN110055215A CN 110055215 A CN110055215 A CN 110055215A CN 201910369790 A CN201910369790 A CN 201910369790A CN 110055215 A CN110055215 A CN 110055215A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- people
- mesenchymal stem
- human mesenchymal
- mescenchymal stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 59
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 24
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 114
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- 210000004195 gingiva Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 12
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 8
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 5
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 3
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 claims description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 3
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 29
- 230000008520 organization Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 8
- 238000007408 cone-beam computed tomography Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 6
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical group C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 102100034134 Activin receptor type-1B Human genes 0.000 description 1
- 102100034135 Activin receptor type-1C Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000799189 Homo sapiens Activin receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 101000799193 Homo sapiens Activin receptor type-1C Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 210000001621 ilium bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- 210000002050 maxilla Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法，其制备方法包括如下步骤：1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；2）原代人间充质干细胞的传代培养；3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中诱导培养高成骨分化能力人间充质干细胞。本发明通过小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向成骨分化能力，操作简单、生产成本低，制得的人间充质干细胞具有较高成骨分化能力，可起到细胞替代的作用，克服细胞移植来源少的问题，小分子药物SB431542安全可靠，可应用于颌骨组织缺损的骨修复，具有重要的医学价值。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞技术领域，尤其涉及一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法。
背景技术
外伤、炎症、肿瘤切除以及先天性疾病造成的颌骨组织缺损是临床上常见的问题，目前主要通过骨修复方法进行治疗，包括自体骨、异体骨及异种骨移植，其中以自体骨移植为“金标准”。但目前常规的骨皮瓣修复、自体髂骨移植以及骨替代材料的修复方案都具有一定的缺陷，比如要增加额外的手术位点、自体骨骨量有限、异体骨免疫排斥反应以及修复材料在骨缺损中心处的低血管化，都不能较好地满足临床上的修复要求，且可能伴有各种并发症。研究表明，骨缺损的自行修复结果通常取决于缺损的范围以及缺损处的血供等情况，当缺损较大时，骨组织将不足以完全修复缺损，因此，对于大范围的颌骨组织缺损，骨修复往往无法达到预期疗效，需采用以纤维组织为主的修复方式。因此急需寻找新的治疗方法以达到更好的骨再生效果，解除常规骨修复失败给患者带来的痛苦。
间充质干细胞是一类具有自我复制、不断更新和多向分化能力的细胞，在特定条件下可分化为骨、软骨、肌肉或肌腱，为临床治疗各种创伤提供细胞来源，用间充质干细胞分化为真皮组织，可覆盖于烧伤创面。其中人间充质干细胞因具有较高的成骨潜能，且能够分化成各种其他的细胞类型，已成为颌面缺损再生修复技术中最常用的细胞，已有大量的医疗机构通过自体骨髓干细胞移植治疗大范围骨缺损的临床病例。研究表明，自体骨髓间充质干细胞复合骨粉植骨效果优于常规植骨，因此，目前间充质干细胞的来源主要为自体髂骨骨髓间充质干细胞，但自体髂骨骨髓间充质干细胞在体内主要通过旁分泌作用发挥生物学效应，而通过定向分化特定的细胞的效率低下，难以起到细胞替代的作用，导致目前以间充质干细胞为基础的组织工程技术应用于骨缺损的效果难以达到满意效果。
前期试验表明，小分子药物SB431542作为一种特异的TGF-β信号通路抑制剂，能够通过抑制ALK4/ALK5/ALK7而抑制TGF-β信号通路的表达，具有促进人间充质干细胞成骨的能力。因此，利用小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向的成骨分化能力，将解决了上述临床案例中细胞定向分化效率低下的问题，具有重要医学价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，本发明通过小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向的成骨分化能力，进而起到细胞替代的作用，克服细胞移植来源少的问题，该方法操作简单、生产成本低，安全可靠，生产出的间充质干细胞具有较强的成骨分化能力，具有重要的医学价值。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
1.1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；
1.2）原代人间充质干细胞的传代培养；
1.3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；
1.4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：将融合度为70-80％的人间充质干细胞置于添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中培养至形成具有较强成骨分化能力的人间充质干细胞膜片。
进一步地，步骤1）中的人间充质干细胞为人牙龈间充质干细胞，组织块法分离、培养人牙龈间充质干细胞包括如下步骤：
1.1）人牙龈间充质干细胞的获取：收集提取人牙龈组织，存储在无菌的50ml离心管中；
1.2）人牙龈间充质干细胞的分离与原代培养，具体包括以下步骤：
1.2.1）通过4℃医用保温箱将存储于50ml离心管中的牙龈组织转移至GMP级临床干细胞制备室，在生物安全柜中无菌取出牙龈组织；
1.2.2）将牙龈组织用含2%青链霉素的DPBS缓冲液(+Ca2+，+Mg2+)洗涤3次，5min/次；
1.2.3）使用显微剪将洗涤后的牙龈组织剪切为0.5cm×0.5cm的组织块，然后将组织块均匀接种于间充质干细胞完全培养基（DMEM+15%胎牛血清+1%青链霉素）中，并置于温度为37℃，体积分数为5% 的CO2培养箱中培养，以获得人牙龈间充质干细胞，并记为P0代，P0代人牙龈间充质干细胞培养72 h后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，之后每2天或3天更换一次新鲜培养液，倒置显微镜下观察细胞融合度。
进一步地，步骤2）中人间充质干细胞的传代培养为：待步骤1.2.3）中的P0代人牙龈间充质干细胞长至融合度为80%-90%时，加入Tryple消化，用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，终止消化后，按1:1～1:4的比例传代，记为P1、P2、P3等数代细胞。
进一步地，步骤3）中传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测包括以下五方面检测：
3.1）人牙龈间充质干细胞形态的形态学观察：利用倒置显微镜观察P2或P3代人牙龈间充质干细胞的形态，筛选出细胞形态均一、均呈现成纤维形态，符合间充质干细胞形态特点的人牙龈间充质干细胞；
3.2）人牙龈间充质干细胞表面标志物的鉴定：利用流式细胞仪检测鉴定步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞表面标志物，筛选出与间充质干细胞表面标志物通用标准一致的人牙龈间充质干细胞；
3.3）人牙龈间充质干细胞的多能性分化检测：利用商业化人牙龈间充质干细胞成骨诱导试剂盒、人牙龈间充质干细胞成脂诱导试剂盒和人牙龈间充质干细胞成软骨诱导试剂盒对步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞分别进行成骨、成脂和成软骨分化能力鉴定，筛选出具有成骨、成脂和成软骨分化能力的人牙龈间充质干细胞；
3.4）微生物检测：对步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞的上清进行细菌、真菌、支原体和病毒检测，其中支原体采用支原体IST试剂盒检测、病毒通过PCR检测、细菌和真菌通过营养液培养检测，筛选出无细菌、真菌、支原体和病毒感染的人牙龈间充质干细胞；
3.5）致瘤性检测：取一定量步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞注射到雄性SPF级裸鼠颈部皮肤，饲养12周，观察小鼠状态及有无肿瘤形成，确定细胞的可适用性，保证临床输注安全，筛选出无致瘤性的人牙龈间充质干细胞。
进一步地，步骤4）的人间充质干细胞为经步骤3）的质量控制与安全性评价体系检测符合间充质干细胞形态特点、表面标志物与间充质干细胞表面标志物通用标准一致、具有成骨、成脂和成软骨分化能力及无微生物和致瘤性的处于对数生长期的人牙龈间充质干细胞。
进一步地，步骤4）的高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养为：倒置显微镜下观察权利要求5所述的人牙龈间充质干细胞的融合度，在细胞生长至融合度为70-80%时，弃培养基洗涤，Tryple消化制成细胞悬液，以5×103个细胞/每孔的密度接种于12孔板，添加含有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基，诱导培养基每3天更换一次，连续培养14天形成具有较强成骨分化能力的人牙龈间充质干细胞膜片，在培养21天后，利用茜素红染色，显微镜下观察并拍照，以鉴定诱导的高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞的成骨分化能力。
进一步地，所述成骨诱导培养基为含有15%胎牛血清、1.8mM磷酸二氢钾、0.1mM维生素C、10^-8 M地塞米松的α-MEM培养基。
进一步地，所述小分子药物SB431542的浓度为1μM。
一种高成骨分化能力人间充质干细胞，由上述一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法制备产生。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法通过小分子药物SB431542对人间充质干细胞进行成骨诱导分化，使其具有定向的成骨分化能力，该方法操作简单、生产成本低，小分子药物SB431542安全可靠，该方法制备的高成骨分化能力人间充质干细胞可解决现有的人间充质干细胞定向分化效率低下而无法发挥细胞替代作用的问题，满足骨修复大范围颌骨组织缺损时所需的自体骨骨量需求，为间充质干细胞的临床转化应用提供新的技术支持。
附图说明
图1为人牙龈间充质干细胞原代分离培养不同时间的细胞形态，其中：A为P0代培养0天细胞形态，B为P0代培养5天细胞形态，C为P0培养10天细胞形态，D为P1代细胞形态；
图2为茜素红染色结果图，其中：a1为空白组染色结果，a2为对照组染色结果，a3为实验组染色结果；
图3为CBCT影像，其中：b1为自体骨组的CBCT影像，b2为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的CBCT影像，b3为hGMSCs/Bio-Oss®组的CBCT影像，b4为Bio-Oss®组的CBCT影像；
图4为Micro CT影像，其中：c1为自体骨组的Micro CT影像，c2为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的Micro CT影像，c3为hGMSCs/Bio-Oss®组的Micro CT影像，c4为Bio-Oss®组的Micro CT影像；
图5为骨密度柱状图，其中：d1为自体骨组的骨密度，d2为Bio-Oss®组的骨密度，d3为hGMSCs/Bio-Oss®组的骨密度，d4为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的骨密度；
图6为CT值柱状图，其中：e1为自体骨组的CT值，e2为Bio-Oss®组的CT值，e3为hGMSCs/Bio-Oss®组的CT值，e4为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的CT值；
图7为H&E染色结果图，其中：f1为自体骨组的染色结果，f2为Bio-Oss®组的染色结果，f3为hGMSCs/Bio-Oss®组的染色结果，f4为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的染色结果，B指代骨，NB指代新生骨，CT指代结缔组织；
图8为Masson染色结果图，其中：g1为自体骨组的染色结果，g2为Bio-Oss®组的染色结果，g3为hGMSCs/Bio-Oss®组的染色结果，g4为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的染色结果，B指代骨，NB指代新生骨，CT指代结缔组织；
图9为新生骨体积比柱状图，其中：h1为自体骨组的新生骨体积比，h2为Bio-Oss®组的新生骨体积比，h3为hGMSCs/Bio-Oss®组的新生骨体积比，h4为Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组的新生骨体积比。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。
实施例1
一种高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞制备方法，包括如下步骤：
1）组织块法分离、培养人牙龈间充质干细胞
1.1）人牙龈间充质干细胞的获取：本实施例中使用的人牙龈间充质干细胞源自人牙龈组织，人牙龈组织来源于南京市口腔医院健康病史的患者， 与患者签署知情同意书后，收集提取患者的牙龈组织，存储在无菌的50ml离心管中；
1.2）人牙龈间充质干细胞的分离与原代培养，具体包括以下步骤：
1.2.1）通过4℃医用保温箱将存储于50ml离心管中的牙龈组织转移至GMP级临床干细胞制备室，在生物安全柜中无菌取出牙龈组织；
1.2.2）将牙龈组织用含2%青链霉素的DPBS缓冲液(+Ca2+，+Mg2+)洗涤3次，5min/次；
1.2.3）使用显微剪将牙龈组织剪切为0.5cm×0.5cm的组织块，然后将组织块均匀接种于间充质干细胞完全培养基（DMEM+15%胎牛血清+1%青链霉素）中，并置于温度为37℃，体积分数为5% 的CO2培养箱中培养，以获得人牙龈间充质干细胞，并记为P0代，P0代人牙龈间充质干细胞培养72 h后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，之后每2天或3天更换一次新鲜培养液，倒置显微镜下观察细胞融合度；
2）人牙龈间充质干细胞的传代培养
待P0代人牙龈间充质干细胞长至融合度为80%-90%时，加入Tryple消化，用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，终止消化后，按1:3的比例传代，记为P1、P2、P3等数代细胞；
图1所示为P0代人牙龈间充质干细胞分培养不同时间的细胞形态，结果显示，P0代人牙龈间充质干细胞培养5-7天后，可见短梭形细胞从组织块中爬出，培养10-12天后细胞融合度达80%，细胞消化传代，细胞大小形态均一，呈梭形贴壁生长；
3）人牙龈间充质干细胞的质量控制与安全性体系检测
对P3代人牙龈间充质干细胞的质量控制与安全性体系检测，具体包括以下五方面检测：
3.1）P3代人牙龈间充质干细胞形态的形态学观察：利用倒置显微镜观察到P3代人牙龈间充质干细胞的形态较为均一、均呈现成纤维形态，符合间充质干细胞形态特点；
3.2）P3代人牙龈间充质干细胞表面标志物的鉴定：利用流式细胞仪检测鉴定到其高表达CD73、CD90和CD105，大于95%，低表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，小于2%，与间充质干细胞表面标志物通用标准一致；
3.3）P3代人牙龈间充质干细胞的多能性分化检测：利用商业化人牙龈间充质干细胞成骨诱导试剂盒（上海觅拓，上海）、人牙龈间充质干细胞成脂诱导试剂盒（上海觅拓，上海）和人牙龈间充质干细胞成软骨诱导试剂盒（上海觅拓，上海）分别进行P3代人牙龈间充质干细胞的成骨、成脂和成软骨分化能力鉴定，具体诱导和染色操作步骤参照说明书，其中，成骨分化能力通过茜素红染色鉴定，成脂分化能力通过油红O染色鉴定；成软骨分化能力通过切片检测，确定P3代人牙龈间充质干细胞具有成骨、成脂和成软骨分化能力；
3.4）微生物检测：对P3代人牙龈间充质干细胞的上清进行细菌、真菌、支原体和病毒检测，其中支原体采用支原体IST试剂盒检测、病毒通过PCR检测、细菌和真菌通过营养液培养检测，检测结果表明P3代人牙龈间充质干细胞无细菌、真菌、支原体和病毒感染；
3.5）致瘤性检测：取一定量的P3代人牙龈间充质干细胞注射到雄性SPF级裸鼠颈部皮肤，饲养12周，观察小鼠状态及有无肿瘤形成，确定细胞的可适用性，保证临床输注安全，确保P3代人牙龈间充质干细胞无致瘤性；
4）高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞的诱导培养
选择步骤3）中检测符合间充质干细胞形态特点、表面标志物与间充质干细胞表面标志物通用标准一致、具有成骨、成脂和成软骨分化能力及无微生物和致瘤性的处于对数生长期的P3代人牙龈间充质干细胞，倒置显微镜下观察细胞融合度，在生长至融合度为70-80%时，弃培养基洗涤，Tryple消化制成细胞悬液，以5×103个细胞/每孔的密度接种于12孔板，添加含有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基，诱导培养基每3天更换一次，连续培养14天形成具有较强成骨分化能力的人牙龈间充质干细胞膜片，在培养21天后，利用茜素红染色，显微镜下观察并拍照，以鉴定诱导的高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞的成骨分化能力。
实施例中，成骨诱导培养基为含有15%胎牛血清、1.8mM磷酸二氢钾、0.1mM维生素C、10^-8 M地塞米松的α-MEM培养基；
实施例中，小分子药物SB431542的浓度为1μM。
实施例2
采用实施例1所述方法制得的高成骨分化能力的人牙龈间充质干细胞，如图2所示，通过茜素红染色法鉴定显示，在培养21天后，与空白组a1和对照组a2相比，实验组a3染色最深，显微镜下观察钙结节显著增多，表明添加1μM小分子药物SB431542的实验组a3成骨分化能力较空白组a1和对照组a2显著增强，进一步地，暗示小分子药物SB431542具有促进人牙龈间充质干细胞成骨的能力。
其中，空白组a1为间充质干细胞培养基培养的人牙龈间充质干细胞，对照组a2为成骨诱导培养基培养的人牙龈间充质干细胞，实验组a3为添加1μM小分子药物SB431542的成骨诱导培养基。
实施例3
将实施例2中的高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞应用于颌面大范围骨缺损的小型猪
1）试验对象及处理：选择猪龄、大小和健康状况一致的广西巴马小型猪3只，作为三次重复处理，在每只猪的上颌骨内制造4个柱状骨缺损（深度为0.5cm、直径为1.2cm）；
2）骨修复材料：自体骨组（自体骨）、Bio-Oss®/hGMSCs/SB组（1μM小分子药物SB431542诱导后的人牙龈间充质干细胞复合Bio-Oss®骨粉）、hGMSCs/Bio-Oss®组（人牙龈间充质干细胞复合Bio-Oss®骨粉）和Bio-Oss®组（Bio-Oss®骨粉）；
其中，实施例2中制备的高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞即为1μM小分子药物SB431542诱导后的人牙龈间充质干细胞，其与Bio-Oss®骨粉的复合比例为5×107个高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞混合300μg Bio-Oss®骨粉；
3）骨修复处理：将上述自体骨组、Bio-Oss®/hGMSCs/SB组、hGMSCs/Bio-Oss®组和Bio-Oss®组分别植入1只广西巴马小型猪的4个柱状骨缺损处缝合，另两只广西巴马小型猪作相同的骨修复处理；
4）四组骨修复材料的修复效果检测：骨修复处理2个月后，通过锥形束CT（Cone BeamComputer Tomography，CBCT）、微型CT （Micro Computer Tomography，Micro CT）、骨密度仪、 H&E染色、Masson染色、ImageJ软件对Masson染色的半定量分析来确定各组骨修复材料的骨缺损修复效果，检测结果如图3-8所示：
如图3和图4所示，CBCT及Micro CT影像显示，所有骨缺损位点均有不同程度骨组织再生表现，其中自体骨作为金标准，自体骨组（b1/c1）的骨缺损基本修复；Bio-Oss®/hGMSCs/SB（b2/c2）组可见高密度影，大量新生骨形成，原缺损区域与宿主骨之间的间隙模糊，骨改建良好；hGMSCs/Bio-Oss®组（b3/c3）和Bio-Oss®组（b4/c4）仍可见大量透射影，与宿主骨之间的界限仍较清晰；
如图5和图6所示，骨密度仪测定结果显示，自体骨组（d1/e1）修复的骨密度和CT值最高，Bio-Oss®/ hGMSCs/SB组（d4/e4）的骨密度和CT值相较于hGMSCs/Bio-Oss®组（d3/e3）和Bio-Oss®组（d2/e2），最接近自体骨组，显著高于hGMSCs/Bio-Oss®组和Bio-Oss®组；
如图7和图8所示，H&E和Masson染色结果显示，自体骨组（f1/g1）显示成熟骨样结构，Bio-Oss®/ hGMSCs/SB（f4/g4）组见大块均质的新生骨样组织，hGMSCs/Bio-Oss®组（f3/g3）见少量新生骨样组织及大量结缔组织，Bio-Oss®组（f2/g2）见大量纤维结缔组织，新生骨极少；
如图9所示，根据ImageJ软件定量分析结果显示，Bio-Oss®/hGMSCs/SB组（h4）的新生骨量最接近自体骨组（h1），显著高于hGMSCs/Bio-Oss®组（h3）及单纯Bio-Oss®组（h2）；
综上所述，小分子药物SB431542诱导产生的人牙龈间充质干细胞具有较高的成骨分化能力，对广西巴马小型猪的骨缺损修复效果最接近自体骨组，较hGMSCs/Bio-Oss®组和Bio-Oss®组修复效果更佳，适合大力推广应用于骨缺损修复。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1.1）组织块法分离、培养原代人间充质干细胞；
1.2）原代人间充质干细胞的传代培养；
1.3）传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测；
1.4）高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养：将融合度为70-80％的人间充质干细胞置于添加有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基中培养至形成具有较强成骨分化能力的人间充质干细胞膜片。
2.根据权利要求1所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤1）中的人间充质干细胞为人牙龈间充质干细胞，组织块法分离、培养人牙龈间充质干细胞包括如下步骤：
1.1）人牙龈间充质干细胞的获取：收集提取人牙龈组织，存储在无菌的50ml离心管中；
1.2）人牙龈间充质干细胞的分离与原代培养，具体包括以下步骤：
1.2.1）通过4℃医用保温箱将存储于50ml离心管中的牙龈组织转移至GMP级临床干细胞制备室，在生物安全柜中无菌取出牙龈组织；
1.2.2）将牙龈组织用含2%青链霉素的DPBS缓冲液(+Ca2+，+Mg2+)洗涤3次，5min/次；
1.2.3）使用显微剪将洗涤后的牙龈组织剪切为0.5cm×0.5cm的组织块，然后将组织块均匀接种于间充质干细胞完全培养基（DMEM+15%胎牛血清+1%青链霉素）中，并置于温度为37℃，体积分数为5% 的CO2培养箱中培养，以获得人牙龈间充质干细胞，并记为P0代，P0代人牙龈间充质干细胞培养72 h后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，之后每2天或3天更换一次新鲜培养液，倒置显微镜下观察细胞融合度。
3.根据权利要求1所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤2）中人间充质干细胞的传代培养为：待步骤1.2.3）中的P0代人牙龈间充质干细胞长至融合度为80%-90%时，加入Tryple消化，用倒置相差显微镜观察细胞消化情况，终止消化后，按1:1～1:4的比例传代，记为P1、P2、P3等数代细胞。
4.根据权利要求1所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤3）中传代人间充质干细胞的质量控制与安全性评价体系检测包括以下五方面检测：
3.1）人牙龈间充质干细胞形态的形态学观察：利用倒置显微镜观察P2或P3代人牙龈间充质干细胞的形态，筛选出细胞形态均一、均呈现成纤维形态，符合间充质干细胞形态特点的人牙龈间充质干细胞；
3.2）人牙龈间充质干细胞表面标志物的鉴定：利用流式细胞仪检测鉴定步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞表面标志物，筛选出与间充质干细胞表面标志物通用标准一致的人牙龈间充质干细胞；
3.3）人牙龈间充质干细胞的多能性分化检测：利用商业化人牙龈间充质干细胞成骨诱导试剂盒、人牙龈间充质干细胞成脂诱导试剂盒和人牙龈间充质干细胞成软骨诱导试剂盒对步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞分别进行成骨、成脂和成软骨分化能力鉴定，筛选出具有成骨、成脂和成软骨分化能力的人牙龈间充质干细胞；
3.4）微生物检测：对步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞的上清进行细菌、真菌、支原体和病毒检测，其中支原体采用支原体IST试剂盒检测、病毒通过PCR检测、细菌和真菌通过营养液培养检测，筛选出无细菌、真菌、支原体和病毒感染的人牙龈间充质干细胞；
3.5）致瘤性检测：取一定量步骤3.1）中的人牙龈间充质干细胞注射到雄性SPF级裸鼠颈部皮肤，饲养12周，观察小鼠状态及有无肿瘤形成，确定细胞的可适用性，保证临床输注安全，筛选出无致瘤性的人牙龈间充质干细胞。
5.根据权利要求1或4所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤4）的人间充质干细胞为经步骤3）的质量控制与安全性评价体系检测符合间充质干细胞形态特点、表面标志物与间充质干细胞表面标志物通用标准一致、具有成骨、成脂和成软骨分化能力及无微生物和致瘤性的处于对数生长期的人牙龈间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤4）的高成骨分化能力人间充质干细胞的诱导培养为：倒置显微镜下观察权利要求5所述的人牙龈间充质干细胞的融合度，在细胞生长至融合度为70-80%时，弃培养基洗涤，Tryple消化制成细胞悬液，以5×103个细胞/每孔的密度接种于12孔板，添加含有小分子药物SB431542的成骨诱导培养基，诱导培养基每3天更换一次，连续培养14天形成具有较强成骨分化能力的人牙龈间充质干细胞膜片，在培养21天后，利用茜素红染色，显微镜下观察并拍照，以鉴定诱导的高成骨分化能力人牙龈间充质干细胞的成骨分化能力。
7.根据权利要求6所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述成骨诱导培养基为含有15%胎牛血清、1.8mM磷酸二氢钾、0.1mM维生素C、10^-8 M地塞米松的α-MEM培养基。
8.根据权利要求6所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述小分子药物SB431542的浓度为1μM。
9.一种高成骨分化能力人间充质干细胞，其特征在于，所述人间充质干细胞由权利要求1-8所述的一种高成骨分化能力人间充质干细胞的制备方法制备产生。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910369790.3A CN110055215A (zh) | 2019-05-06 | 2019-05-06 | 一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910369790.3A CN110055215A (zh) | 2019-05-06 | 2019-05-06 | 一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110055215A true CN110055215A (zh) | 2019-07-26 |
Family
ID=67322305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910369790.3A Pending CN110055215A (zh) | 2019-05-06 | 2019-05-06 | 一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110055215A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112370573A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-19 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种软骨膜片及其制备方法 |
| CN112697563A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-04-23 | 朱灏 | 一种人间充质干细胞诱导分化成骨的染色鉴定方法 |
| CN113413489A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-21 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105013016A (zh) * | 2015-07-29 | 2015-11-04 | 西安芙金细胞科技有限公司 | 一种骨缺损再生修复组织工程骨及其构建方法与应用 |
| CN108588026A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 南京鼓楼医院 | 高表达il10的临床级间充质干细胞的制备方法及其用途 |
-
2019
- 2019-05-06 CN CN201910369790.3A patent/CN110055215A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105013016A (zh) * | 2015-07-29 | 2015-11-04 | 西安芙金细胞科技有限公司 | 一种骨缺损再生修复组织工程骨及其构建方法与应用 |
| CN108588026A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 南京鼓楼医院 | 高表达il10的临床级间充质干细胞的制备方法及其用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 张文: "SB431542调控牙龈间充质干细胞成骨分化修复小型猪颌骨缺损", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》 * |
| 张蓉等: "骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究", 《中国美容医学》 * |
| 石安源等: "SB431542对人牙龈间充质干细胞体外成骨分化的影响", 《口腔生物医学》 * |
| 芮云峰等: "晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112370573A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-19 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种软骨膜片及其制备方法 |
| CN112697563A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-04-23 | 朱灏 | 一种人间充质干细胞诱导分化成骨的染色鉴定方法 |
| CN113413489A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-21 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统 |
| CN113413489B (zh) * | 2021-06-23 | 2022-06-10 | 重庆医科大学附属口腔医院 | 一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110055215A (zh) | 一种高成骨分化能力人间充质干细胞及其制备方法 | |
| CN101914490A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞无血清培养基及其培养方法 | |
| CN104560872A (zh) | 牙齿来源间充质干细胞体外分离与培养方法 | |
| CN109745341A (zh) | 四氧化三铁超顺磁性纳米颗粒刺激干细胞外泌体成骨 | |
| CN109234229A (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN113318274A (zh) | 一种水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN104250655A (zh) | Bmp-2/vegf165双基因修饰的骨髓间充质干细胞及其制备方法 | |
| CN106244533A (zh) | 牙龈间充质干细胞的原代分离方法 | |
| CN107287156A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用 | |
| CN105754934B (zh) | 牙髓干细胞、制备方法及其相关骨组织工程材料 | |
| CN108066750A (zh) | 干细胞及其分泌物用于治疗皮肤烧烫伤的新用途 | |
| CN105861429A (zh) | 一种牙髓间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法 | |
| CN104031881B (zh) | 一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN109628388A (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| CN108949682A (zh) | 一种牙髓间充质干细胞的制备、培养及纯化方法 | |
| CN106282101A (zh) | 一种促进人羊膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及应用 | |
| CN106978395A (zh) | 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN108066824A (zh) | 一种制备表皮缺损治疗药物的新方法 | |
| CN103013910A (zh) | 人退变椎间盘软骨终板干细胞、制备方法及其应用 | |
| CN102002479A (zh) | 一种脐带血间充质干细胞及其制备方法和用途 | |
| CN101486992B (zh) | 抑制破骨细胞生成的间充质干细胞及其制备方法与应用 | |
| CN105112367B (zh) | 一种间充质干细胞表皮分化诱导剂及其应用方法 | |
| CN103881969A (zh) | 一种可用于临床治疗的人膝关节软骨细胞体外扩增方法 | |
| CN106540244A (zh) | 一种犬间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 | |
| CN106282233A (zh) | 腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190726 |