WO2012070966A1 - Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения - Google Patents

Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения Download PDF

Info

Publication number
WO2012070966A1
WO2012070966A1 PCT/RU2010/000692 RU2010000692W WO2012070966A1 WO 2012070966 A1 WO2012070966 A1 WO 2012070966A1 RU 2010000692 W RU2010000692 W RU 2010000692W WO 2012070966 A1 WO2012070966 A1 WO 2012070966A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzymes
pancreatitis
treatment
oligopeptides
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000692
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФЛРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Farber Boris Slavinovich
Farber Sof Ya Borisovna
Martynov Artur Viktorovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farber Boris Slavinovich, Farber Sof Ya Borisovna, Martynov Artur Viktorovich filed Critical Farber Boris Slavinovich
Priority to PCT/RU2010/000692 priority Critical patent/WO2012070966A1/ru
Publication of WO2012070966A1 publication Critical patent/WO2012070966A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • oligopeptides for the treatment of pancreatitis, gastric ulcer and other hyperenzymes based on a peptide enzyme inhibitor and method for their preparation
  • the invention relates to medicine, namely to gastroenterology and is intended for the treatment of pathologies of the pancreas, stomach and intestines of a person.
  • pancreatic enzymes In case of endocrine pancreatic insufficiency, particular importance is given to the administration of pancreatic enzymes, and preparations containing, in addition, bile salts, acids, and cellulase are recommended to prevent the appearance of unpleasant symptoms after eating.
  • Hydrolytic enzymes most often papain, bromelain, pancreatic enzymes in combination with cellulases
  • the main factor affecting the effectiveness of oral enzyme therapy is the inactivation of pancreatic enzymes and iodine by the action of gastric juice.
  • proteases In order to increase the local pH in the stomach to 4.0, it is recommended to combine the use of proteases with sodium bicarbonate or aluminum hydroxide.
  • Another approach to reduce the harmful effects of gastric contents on proteases is to obtain enzyme preparations in the enteric membrane.
  • the treatment of congenital enzymopathies, of which over 150 have been described in the last two decades, is an important problem of replacement therapy.
  • Such hereditary diseases as glycogenoses, lipidoses, mucopolysaccharidoses and other lysosomal diseases have been tried to be treated by intravenous administration of the corresponding native enzymes isolated from biological fluids and human tissues [ 4 ].
  • satisfactory results were not obtained, especially for lysosomal diseases characterized by pathological substrate accumulation in nerve cells.
  • the reason for the failure is the rapid removal of native enzymes from the bloodstream and capture by the liver, and mainly because of the insurmountability of the blood-brain barrier and the inability of enzymes to enter neuron lysosomes.
  • the clinical use of enzymes (proteases, collagenases and hyaluronidases) for the treatment of various purulent-inflammatory processes is based on their necrolytic, mucolytic and anti-edematous effects, on the ability to reduce the antibiotic resistance of microbial flora.
  • Proteases of animal and bacterial origin are used in surgery for the treatment of purulent diseases of soft tissues, bones (with osteomyelitis and purulent arthritis), lungs and pleura, and tuberculosis.
  • proteases are promising in purulent surgery of the maxillofacial region, in the treatment of periodontal tissues.
  • thrombolytic therapy Two main approaches to thrombolytic therapy are possible: 1) the use of plasminogen to plasmin activators, such as streptokinase and urokinase; 2) the use of proteases that have a direct fibrinolytic effect, such as plasmin itself, trypsin, chymotrypsin. In many cases, it is recommended to combine enzyme and anticoagulant therapy. In recent years, trinsin-like enzymes isolated from snake venom have been shown to be promising, in the presence of which fibrin clots are formed, mechanically less durable, and therefore more sensitive to lysis, a hemothrombin clot [1].
  • streptokinase and urokinase in the treatment of myocardial infarction and pulmonary embolism led to rapid and lasting improvement, however, allergic symptoms appeared after parenteral administration of streptokinase [1].
  • Proteolytic enzymes of various origins have proven effective in various vascular diseases, such as arterial thrombosis (peripheral and brain), superficial and deep thrombophlebitis [1].
  • the mechanism of action of trypsin and chymotrypsin in cases of pathological intravascular thrombosis is determined by their anti-inflammatory and decongestant action and the ability to activate the anticoagulant system of blood, which is reflected in an increase in plasma fibrinolytic activity under conditions of the practically unchanged coagulation system.
  • proteolytic enzymes it is very appropriate to mention the widespread use of their protein inhibitors. Indications for their use are: 1) congenital deficiency of proteinase inhibitors, in particular antitrypsin; 2) pathological activation of proteolytic processes associated with induced non-physiological release of proteases or the action of exogenous enzymes in microbial pathology.
  • protease inhibitors isolated from the pancreas and parotid glands, cattle lungs. These inhibitors effectively inhibit plasmin, plasmin activators, coagulation factors, kallikrein, trypsin, chymotrypsin, tissue and leukocyte proteinases [ 6 ]. Polyvalent protease inhibitors are used in clinical practice for fibrinolytic bleeding that occurs after surgical interventions, since, along with plasmin activity, they inhibit thromboplastin formation. The mentioned protein protease inhibitors are used in the treatment of sepsis, bacterial (endotoxic) shock, allergic reactions, acute and postoperative pancreatitis, mechanical and thermal injuries, arthroso-arthritis [ 7 ].
  • proteolysis inhibitors In myocardial infarction, proteolysis inhibitors have an anti-ischemic effect, reducing the necrotic zone and improving collateral circulation. In recent years, the antiviral efficacy of proteolysis inhibitors has been established in the clinic and experiment. However, to expand the scope of application of enzyme inhibitors, inhibitors with a wider spectrum of action, in particular, capable of inhibiting neutral, alkaline, and lysosomal proteinases, should be found. The use of enzymes in oncology occupies a special place. Attempts have been made to use proteases, nucleases, mucopolysaccharides with the aim of directly lysing the effect on cancer cells.
  • L-asparaginase This enzyme has become the standard drug for the treatment of lymphoblastic leukemia's [1].
  • toxicity especially allergenicity, and the rapid development of an enzyme-resistant one limit its use.
  • the discovery of the specific effect of L-asparaginase on cancer cells prompted the study of other enzymes that break down essential and non-essential amino acids. Antitumor activity was detected.
  • glutaminases glutaminases, arginases, arginine decarboxylases [1], as well as enzymes that reduce the level of certain essential amino acids, such as a-hydroxylase, lysine oxidase, histidase, phenylalanine ammoniac lyase [1].
  • the action of these enzymes is enhanced in the presence of amino acid antimetabolites by inhibiting biosynthetic pathways and changing amino acid concentrations.
  • the use of enzymes involved in the catabolism of folic acid, folate coenzymes or folate antagonists has been described. Folate coenzymes are necessary for the biosynthesis of purines and thymine. The most promising for folic acid degradation is use of carboxypeptidase G.
  • the enzyme in the experiment exhibits antitumor activity, in addition, it is effective in preventing the toxicity of the known dihydrofolate reductase-methotrexate inhibitor in the treatment of leukemia and brain cancer [1].
  • drugs which are natural physiologically active protein compounds (enzymes, their inhibitors and activators, hormones) have found their rightful place among the means of practical medicine.
  • the daily clinical use of enzymes is limited by both economic factors - their high cost and low availability, and their rapid inactivation in the body and various adverse reactions caused by them as foreign proteins (antigenicity, allergenicity, toxicity, etc.).
  • biocompatible enzyme-containing polymer particles biodegradable or simply temporarily implantable
  • An independent case is the use of immobilized enzymes in extracorporeal perfusion apparatus such as an artificial kidney, in dressings and drainage materials to accelerate the healing of wounds and burns and to modify the inner surface of blood vessel prostheses in order to reduce thrombosis.
  • the stabilization of therapeutic enzymes in some cases can be carried out without the use of polymer carriers, simply due to targeted chemical modifications of the protein globule with low molecular weight reagents or due to the introduction of intramolecular brackets from bifunctional reagents into the globule that impede the denaturation of the protein molecule [ 8 ].
  • This approach is especially important if the therapeutic enzyme must interact with the cell membrane receptor (for example, a thrombin-platelet pair) or penetrate into the cell (enzymes used to treat numerous hereditary enzyme deficiencies of the liver) to fulfill its function, and the presence of a polymeric carrier can drastically decrease the effectiveness of the enzyme preparation.
  • intermolecular crosslinking of enzymes with bifunctional reagents such as glutaraldehyde is used, which can also be considered as immobilization of one enzyme molecule to another.
  • bifunctional reagents such as glutaraldehyde
  • such a modification of the enzyme leads to an increase in its stability and effectiveness, for example, such images were able to stabilize a-galactosidase used to treat Fabry disease.
  • the binding of enzymes to other proteins also gives a pronounced effect — conjugates of uricase or hemoglobin with albumin are able to circulate in the active state of IB blood several times longer than the corresponding native proteins.
  • the anticoagulant heparin can be used ["].
  • their molecular weight should not exceed 80-100,000, because otherwise they will be difficult to remove from the body after they perform their function, and the accumulation of - polymer carriers in the body can cause unpredictable complications.
  • the development of reactive synthetic polymers containing bonds capable of biodegradation which means that they do not accumulate in the body even with a high molecular weight [ 12 ].
  • the binding of therapeutic enzymes with soluble carriers is carried out by traditional chemical methods of immobilization, which are developed in detail.
  • the polymer – carrier bonds themselves can be both biodegradable — amide, ether, and biodegradable — urethane, azomethine, and others.
  • the principal effects achieved by binding of a therapeutic enzyme or other protein compound, for example, the hormone insulin are as follows: conformational stability and resistance to endogenous proteases; an increase in circulation time in the bloodstream due to an increase in the molecular weight of the conjugate and a slowdown in its excretion; the ability to regulate the body's immune response to a protein preparation; finally, the ability to receive drugs with a complex therapeutic effect.
  • hydrolytic enzymes include lysosomal pDN- acetylhexosaminidase used in the treatment of Tay – Sachs disease, for which it was shown that its immobilization on polyvinylpyrrolidone [ 15 ] leads to stabilization with respect to exogenous proteinases and to an increase in the duration of its action in the bloodstream of experimental animals.
  • Potential antitumor drugs - nucleases which also have antiviral activity, dramatically; improve their properties — stability and. biological activity — when bound to soluble amine derivatives of dextran by azo coupling.
  • Soluble preparations of immobilized enzymes can be used not only for intravenous administration;
  • carboxypeptidase G and arginase modified with dextran [ 16 ] when administered intraperitoneally to mice with grafted mastocytoma, have the ability to create a higher and longer-acting concentration of the active principle in the bloodstream than native enzymes.
  • immobilization of enzymes on soluble polymer carriers makes it possible to obtain more stable, active and safe therapeutic drugs.
  • the methods developed by immobilizing enzymes can be successfully transferred to other drugs of a protein nature — various physiologically active polypeptides such as pancreatic trypsin inhibitor and, most importantly, the hormone insulin.
  • microencapsulation eliminates the contact of the enzyme with biological fluids; relatively high concentrations of the enzyme can be included in the microcapsule, the achievement of which in the bloodstream when using the enzyme in its native form is impossible; various enzymes at the same time can be included in the microcapsule; the enzyme in microcapsules can be further stabilized by intra- or intermolecular crosslinking or modification with soluble polymers.
  • microencapsulated enzymes in clinical practice is the use of microencapsulated catalase described in [26] for the treatment of wounds in the human oral cavity resulting from acalasemia due to the accumulation of hydrogen peroxide released by bacteria.
  • the second oldest method for creating artificial cells is the incorporation of enzymes into liposomes — artificial phospholipid microbubbles. Enzymes included in liposomes are also protected from the inactivating effects of the environment, and liposomes themselves, consisting of natural compounds, are completely utilized in the body. Unlike microcapsules, however, liposomes have a unique ability to deliver drug inclusions inside the cells with which they interact by the mechanism of fusion or endocytosis.
  • Amyloglucosidase incorporated into liposomes has been successfully used to treat a patient with type II glycogenosis.
  • the cells of the reticulo-endothelial system, in particular the liver are a natural target for liposomes, it is clear that enzymes included in liposomes can be very effective in treating various enzyme deficiencies in the liver.
  • Liposomes the surface of which lends itself to various modifications, can be used as containers for the targeted transport of drugs, which is now understood to mean the ability of the introduced drug to accumulate in the affected area.
  • liposomes into the internal cavity of which various preparations are included and a vector compound capable of recognizing and specifically binding to the affected area (for example, an antibody against a specific component of the target area) is chemically attached to the outer membrane, and it is really selectively concentrated in a given place.
  • a vector compound capable of recognizing and specifically binding to the affected area for example, an antibody against a specific component of the target area
  • This approach can further expand the arsenal of enzyme therapy methods.
  • As containers for the inclusion of enzymes cell membranes, blood, for example membranes, can also be used.
  • Such drugs can be obtained in several ways. Firstly, they can be included in a solution of a synthetic biocompatible polymer, from which tablets or granules intended for implantation and capable of slowly isolating the included protein preparation will be formed (experiments were performed with trypsin, lysozyme, alkaline phosphatase, catalase, etc.) [ ]. The rate of release of the enzyme can be controlled by the density of the polymer matrix.
  • enzymes Being in a polymer matrix, the enzyme is protected from the effects of an aggressive biological environment, as a result of which such systems can be long-lasting. In this case, the unsolved problem remains the fate of the polymer implant after complete release of the active principle.
  • enzymes can be included in the molding process in the structure of various fibers and films used in surgery as suture, dressings or drainage materials. Due to the principle of gradual isolation, materials with proteolytic enzymes included have a high and long-lasting cleansing, draining and non-political activity, are able to serve without change for a long time and accelerate the healing process several times in comparison with traditional methods of therapy.
  • Preparations immobilized enzymes for local use can be obtained both on the basis of insoluble polymers, while the enzyme performs its function in the state associated with the carrier, and then is mechanically removed from the lesion site, and on the basis of biodegradable carriers, when the rate of release of the enzyme into the environment is determined by the speed destruction of the carrier with which the enzyme is bound covalently.
  • crosslinked dextran - Sephadex microbeads - preparations of thrombolytic enzymes with a given biodegradation rate were obtained and it was shown that fibrinolysin, streptokinase or urokinase immobilized in this way can be used for local deposition in the treatment of thrombosis [].
  • reactors based on immobilized enzymes are the following: the ability to avoid direct contact of the body with a foreign protein and thus reduce unwanted reactions to this protein; the possibility of multiple use of the reactor; the possibility of long-term treatment.
  • the disadvantages of such reactors include the incompletely solved problems of thrombosis or sorption of blood proteins on foreign surfaces. Extracorporeal perfusion using enzyme reactors is already widely used.
  • asparaginase which is included in a wide variety of reactors and is used to treat asparagine-dependent solid tumors, is described in most detail. In experiments on animals and humans, it was shown that the inclusion of immobilized asparaginase in the circulation system allows you to quickly and quantitatively remove asparagine from the blood.
  • New components with antitrypsin activity are known. These components are aldehyde analogues of peptides that specifically and rapidly inhibit mammalian pancreatic trypsin. The components are useful in the prevention and treatment of tissue disorders associated with pancreatitis [ 22 ].
  • the patent is based on a method for the synthesis of aldopeptides on the reaction of the formation of semicarbazones. The obtained peptides had the ability to block the function of trypsin and other proteolytic components, but also had a protective effect in protecting animals from the action of pancreatoxic substances that cause acute pancreatitis.
  • the disadvantage of the proposed patent is the fully synthetic nature of the proposed substances, they also do not have absolute specificity only for trypsin or only for chymotrypsin, react with most macromolecules in the body due to the presence of the semicarbazide group, and block the functions of many enzymes, including those necessary for the recovery of the body.
  • the completely synthetic nature of the patented drug poses a threat to a number of side effects: cumulation, lack of metabolism or the formation of toxic metabolites, carcinogenic and genotoxic properties. All these side effects are characteristic of semicarbazides and many of these derivatives are used as mitotic for the treatment of cancer, which indicates their extreme toxicity.
  • the basis of the invention is the task of developing a supramolecular ensemble of modified oligopeptides for the treatment of pancreatitis, gastric ulcer and other hyperperfermentaemia capable of inhibiting proteolytic enzymes and a method for its preparation.
  • the composition of the modified oligopeptides should quickly metabolized by the body without the formation of toxic metabolites, inhibit only one enzyme and do not affect the normal functioning of other enzymatic systems, do not be a xenobiotic, freely accumulate in the inflamed pancreas, penetrate not only into the intercellular fluid, but also into the cells. Quickly stop the inflammatory process caused by excessive secretion of proteolytic enzymes.
  • the technology of the proposed drug should be simple, affordable, environmentally friendly, waste-free and contain a maximum of 3 stages.
  • the problem is solved by obtaining a composition of modified oligopeptides for the treatment of pancreatitis, gastric ulcer and other hyperenzymes with the ability to inhibit proteolytic enzymes, where the composition of chemically modified oligopeptides which are products of autologous hydrolysis for 0.2-48 hours of proteolytic enzymes is used as the main active ingredient with reversed charges of molecules.
  • trypsin, chymotrypsin, papain, pancreatin enzymes or a mixture of enzymes are taken, a solution is prepared and left for autolysis for 0.2-48 hours, then the structure of the obtained oligopeptides is chemically modified to replace the charges of the molecules with the opposite ones by acylation with succinic anhydride or alkylation with monochloracetic acid in the ratio of reagents 10-200% by weight of the modifier by weight of the protein taken into the reaction. Due to the effect of selective complementary hybridization, the obtained peptides interact only with their precursor enzymes, thereby inhibiting their function.
  • the low molecular weight of the obtained peptides and their resistance to hydrolytic enzymes makes it easy to penetrate biological membranes, absorbed from the intestine, and accumulate in the focus with a high concentration of target enzymes. These properties make it possible to use patentable peptides for the preparation of, among other things, oral dosage forms for the treatment of chronic pancreatitis and gastric ulcer.
  • An ensemble is a term from supramolecular chemistry.
  • the objects of supramolecular chemistry are supramolecular ensembles built spontaneously from complementary, i.e., having geometrical and chemical matching fragments, like
  • Example 1 Obtaining a trypsin inhibitor.
  • Example 2 The study of the antitrypsin activity of the obtained peptides.
  • an effective concentration was the dose of the peptide composition, which completely inhibits the proteolytic activity of trypsin.
  • 1% sodium caseinate phosphate buffer was used as a target protein for trypsin.
  • the concentration of soluble oligopeptides - hydrolysis products over time was determined spectrophotometrically at 280 nm and 260 nm.
  • the spectrophotometric method for determining protein is based on the ability of aromatic amino acids (tryptophan, tyrosine, and to a lesser extent phenylalanine) to absorb ultraviolet light with a maximum absorption at 280 nm.
  • the optical density at 280 nm is 1 when using a cuvette with a layer thickness of 10 mm.
  • concentration of the test protein in the solution should be from 0.05 to 2 mg / L.
  • the presence of nucleic acids and nucleotides (more than 20%) interferes with protein determination by this method.
  • the optical density of the same solution is measured at two wavelengths — 260 and 280 nm; the protein content X (mg / ml) is calculated according to the Kalkar formula:
  • the table shows the results of a study of the antitrypsin activity of a patentable peptide composition.
  • the effective concentration of succinyl peptides is 0.125 ng / ml at a trypsin concentration of 0.1 mg / ml.
  • the experiment also confirmed the effectiveness and dose-dependent nature of the composition used.
  • Example 3 The study of the effectiveness of the composition of the peptides in the treatment of animals with acute pancreatitis.
  • the studies used a model of acute pancreatitis in mice induced by intraperitoneal administration of cerulin [ 25 ].
  • Pancreatitis intensity correlated with blood amylase concentration in mice.
  • Pancreatitis was induced in mice weighing 16-20 g by intraperitoneal administration of cerulein in a single dose of 100 ⁇ g / kg of body weight. Cerulein was reintroduced at 6-hour intervals.
  • the resulting peptide composition was administered intraperitoneally to animals at a dose of 0.1 ml 1 ng / ml once a day for 3 days in a row.
  • the amylase concentration in the blood of animals was determined daily.
  • the patented composition was able to not only normalize the level of amylase in the blood of animals almost to the level of the control group, but also prevent their death. At 50% animal mortality in the control group, all animals survived in the experimental group. Thus, the patented peptide composition was therapeutic in a model of acute pancreatitis in mice.
  • the production technology of the drug consists of 3 simple stages, the raw material for production is industrially produced trypsin, all stages of production do not require new unique equipment or unique reagents. Invention can be quickly implemented on existing production lines and standardized unified equipment of pharmaceutical companies.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение может быть использовано для создания пероральных и парентеральных лекарственных средств в фармации и в медицине для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий. Суть изобретения: модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов, где в качестве основного действующего вещества используется смесь (ансамбль) химически модифицированных олигопептидов являющихся продуктами аутологичного гидролиза тех же протеолитических ферментов трипсина, химотрипсина и папаина, с измененными на противоположные зарядами молекул через ацилирование янтарным ангидридом и алкилирования монохлоруксусной кислотой. Полученная смесь (ансамбль) модифицированных олигопептидов быстро останавливает воспалительный процесс, вызванный избыточной секрецией протеолитических ферментов. Технология предлагаемого препарата простая, экономически доступная, экологически безвредная, безотходная и содержит 3 стадии. Полученные пептиды благодаря эффекту селективной комплементарной гибридизации взаимодействуют только со своими ферментами-предшественниками, тем самым ингибируя их функцию. Низкий молекулярный вес полученных пептидов и их устойчивость к гидролитическим ферментам позволяет легко проникать через биологические мембраны, всасываться из кишечника, накапливаться в очаге с высокой концентрацией ферментов- мишеней. Эти свойства позволяют использовать патентуемые пептиды для получения, в том числе, пероральных лекарственных форм для лечения хронических панкреатитов и язвенной болезни желудка.

Description

Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно, к гастроэнтерологии и предназначено для лечения патологий поджелудочной железы, желудка и кишечника человека.
Современный уровень техники
Применение ферментов и их ингибиторов в медицине и фармации. Применение ферментов и других физиологически активных веществ (ФАВ) белковой природы в терапии имеет давние традиции. Современная медицина все чаще использует высокоочищенные (препараты ФАВ белковой природы в самых различных отраслях клинической медицины в качестве перспективных средств медикаментозного лечения вследствие их /исключительно высокой активности и специфичности . В настоящее время наметились следующие основные направления энзимотерапии: 1) устранение дефицита ферментов с целью компенсации врожденной или приобретенной функциональной недостаточности; 2) удаление нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых осколков; 3) лизис тромбов; 4) комплексная терапия злокачественных новообразований; 5) детоксикация организма. Все эти аспекты более или менее широко рассматривались в течение последних десяти лет как в оригинальных статьях, так и в обзорных работах [ , , ]. Применение ферментов для заместительной терапии практикуется уже давно, причем необходимого увеличения количества фермента во внеклеточных жидкостях и пищеварительных соках достигают сравнительно легко. Для лечения расстройств пищеварения предложено множество препаратов, содержащих смесь ферментов животного и растительного происхождения, расщепляющих белки, жиры, углеводы, и другие компоненты. Мы не имеем возможности охватить обширную область расстройств пищеварения и обмена веществ, рассмотреть разнообразные показания для заместительной терапии и перечислить имеющиеся препараты. Эти вопросы подробно освещены [2], приведем лишь некоторые примеры. При эндокринной недостаточности поджелудочной железы особое значение придается введению панкреатических ферментов, а для предупреждения появления неприятных симптомов после еды рекомендуются препараты, содержащие, кроме того, желчные соли, кислоты, целлюлазы. Гидролитические ферменты (чаще всего папаин, бромелаин, панкреатические ферменты в сочетании с целлюлазами) с успехом применяются последние годы для растворения желчных безжировых камней. Главным фактором, влияющим на эффективность оральной ферментной терапии, является инактивация панкреатических ферментов иод действием желудочного сока. С целью повышения локального рН в желудке до 4,0 рекомендуется сочетать применение протеаз с бикарбонатом натрия или гидроокисью алюминия. Другим подходом, позволяющим уменьшить вредное воздействие содержимого желудка на протеазы, является получение препаратов ферментов в кишечно- растворимой оболочке. Лечение врожденных энзимопатий, которых за последние два десятилетия описано более 150, является важной проблемой заместительной терапии. Такие наследственные заболевания, как гликогенозы, липидозы, мукополисахаридозы и другие лизосомальные болезни, пытались лечить внутривенным введением соответствующих нативных ферментов, выделенных из биологических жидкостей и тканей человека [4]. Однако получить удовлетворительные результаты не удалось, особенно для лизосомальных болезней, характеризующихся патологическим накоплением субстрата в нервных клетках. Причина неудач в быстром выведении нативных ферментов из кровотока и захвате печенью и в основном в непреодолимости гематоэнцефалического барьера и невозможности проникновения ферментов в лизосомы нейронов. Клиническое применение ферментов (протеазы, коллагеназы и гиалуронидазы) для лечения различных гнойно-воспалительных процессов основано на их некролитическом, муколитическом и противоотечном действии, на способности снижать антибиотикорезистентность микробной флоры. Протеазы животного и бактериального происхождения используются в хирургии при лечении гнойных заболеваний мягких тканей, костей (при остеомиелитах и гнойных артритах), легких и плевры, при туберкулезе. Одной из важнейших областей применения протеиназ являются термические ожоги. Местная энзимотерапия при глубоких ожогах позволяет снизить летальность в токсемическом периоде, ускорить очищение и заживление раны, в большинстве случаев избегать пересадки кожи. Ферментная терапия эффективна в травматологии и ортопедии, она способствует сокращению сроков лечения переломов, вывихов, растяжения связок, разрывов мышц . Довольно широко в ортопедической клинике для лечения рубцов различного происхождения, контрактур и т. д. применяется гиалуронидаза. Весьма активно энзимотерапия используется в отоларингологии для лечения дифтерии, тонзиллита, ларингита, отита. В стоматологической практике протеазы являются многообещающими в гнойной хирургии -челюстно-лицевой области, в лечении тканей пародонта. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что области применения протеиназ для лечения воспалительной реакции практически безграничны. В медицинской энзимологии вряд ли существует проблема, которая исследовалась бы так же всесторонне и интенсивно, как проблема лизиса тромбов. Острые тромбоэмболии сосудов по- прежнему остаются основной причиной заболеваемости и смертности людей зрелого возраста. Мы не будем останавливаться на рассмотрении современных представлений о механизмах свертывания крови и фибринолиза, литература в этой области обширна и доступна [5]. Укажем лишь, что образование и лизис тромба представляют собой весьма сложный каскад протеолитических процессов, в котором ключевые позиции отводятся плазмину, тромбину и фибрину. Возможны два основных подхода к тромболитической терапии: 1) использование активаторов превращения плазминогена в плазмин, таких, как, стрептокиназа и урокиназа; 2) использование протеаз, оказывающих прямое фибринолитическое действие, таких, как сам плазмин, трипсин, химотрипсин. Во многих случаях рекомендуется сочетать ферментную и антикоагулянтную терапию. В последние годы как перспективные указываются ферменты тринсиноподобного типа, выделенные из яда змей, в присутствии которых образуются сгустки фибрина, механически менее прочные, и поэтому более чувствительные к лизису— гемотромбиновый сгусток [1]. Применение стрептокиназы и урокиназы при лечении инфаркта миокарда и легочной эмболии приводило к быстрому и стойкому улучшению, однако после парентерального введения стрептокиназы возникали аллергические симптомы [1]. Протеолитические ферменты различного происхождения оказались эффективными при различных заболеваниях сосудов, таких, как артериальные тромбозы (периферические и мозговые), поверхностный и глубокий тромбофлебит [1]. Механизм действия трипсина и химотрипсина в случаях патологического внутрисосудистого тромбообразования определяется их противовоспалительным и противоотёчным действием и способностью активировать антисвертывающую систему крови, что выражается в повышении фибринолитической активности плазмы в условиях практической неизменности показателей свертывающей системы. В связи с рассмотрением разнообразных примеров медицинского применения протеолитических ферментов весьма уместно упомянуть о широком использовании их белковых ингибиторов. Показаниями к их применению являются: 1) врожденный дефицит ингибиторов протеиназ, в частности антитрипсина; 2) патологическая активация протеолитических процессов, связанных с индуцированным нефизиологическим выбросом протеаз или действием экзогенных ферментов при микробной патологии.
Наибольшее распространение получили природные ингибиторы протеаз, выделенные из поджелудочной и околоушной желез, легких крупного рогатого скота. Эти ингибиторы эффективно ингибируют плазмин, активаторы плазмина, факторы свертывания крови, калликреин, трипсин, химотрипсин, тканевые и лейкоцитарные протеиназы [6]. Поливалентные ингибиторы протеаз применяют в клинической практике при фибринолитических кровотечениях, возникающих после хирургических вмешательств, поскольку наряду с плазминовой активностью они тормозят тромбопластинообразование. Названные белковые ингибиторы протеаз используют при лечении сепсиса, бактериального (эндотоксического) шока, аллергических реакций, острого и послеоперационного панкреатита, механических и термических травм, артрозо- артритов [7]. При инфаркте миокарда ингибиторы протеолиза оказывают антиишемическое действие, уменьшая некротическую зону и улучшая коллатеральное кровообращение . В последние годы установлена эффективность противовирусного действия ингибиторов протеолиза в клинике и эксперименте. Однако для расширения области применения ингибиторов ферментов следует изыскать ингибиторы с более широким спектром действия, в частности способных тормозить нейтральные, щелочные и лизосомальные протеиназы. Особое место занимает использование ферментов в онкологии. Предприняты попытки применить протеазы, нуклеазы, мукополисахариды с целью непосредственного лизирующего действия на раковые клетки. Введение их в опухоль дает выраженный эффект, парентеральное введение оказывает более слабое действие из-за наличия ингибиторов протеаз в сыворотке больных раком. Более перспективной в настоящее время считается область энзимотерапии неоплазии, основанная на учете особенностей в метаболизме раковых клеток и предполагающая применение ферментов, снижающих концентрацию метаболитов и питательных веществ в кровотоке и опухолевых клетках. Наиболее известным цитостатическим ферментным веществом такого типа является L-аспарагиназа. Этот фермент стал стандартным лекарственным средством для лечения лимфобластных лейкозо'в [1]. Однако токсичность, особенно аллергенность, и быстрое развитие резистентное к ферменту ограничивают его применение. Открытие специфического влияния L-аспарагиназы на раковые клетки побудило к исследованию других ферментов, расщепляющих заменимые и незаменимые аминокислоты. Была обнаружена противоопухолевая активность
глутаминазы, аргиназы, аргининдекарбоксилазы [1], а также ферментов, снижающих уровень отдельных незаменимых аминокислот, таких, как а-гидроксилаза, лизиноксидаза, гистидаза, фенилаланинаммиаклиаза [1]. Действие указанных ферментов усиливается в присутствии антиметаболитов аминокислот путем ингибирования биосинтетических путей и изменения концентрации аминокислот. В терапии рака описано использование ферментов, принимающих участие в катаболизме фолиевой кислоты, фолатных коэнзимов или фолатных антагонистов. Фолатные коферменты необходимы для биосинтеза пуринов и тимина. Наиболее многообещающим для деградации фолиевой кислоты является использование карбоксипептидазы G. Несмотря на заметную иммуногенность, фермент в эксперименте обнаруживает противоопухолевую активность, кроме того, он эффективен для предотвращения токсичности известного ингибитора дигидрофолатредуктазы-метотрексата при лечении лейкемии и рака мозга [1]. Таким образом, мы видим, что лекарственные препараты, представляющие собой природные физиологически активные белковые соединения (ферменты, их ингибиторы и активаторы, гормоны), обрели достойное место среди средств практической медицины. К сожалению, повседневное клиническое использование ферментов ограничено как экономическими факторами — их высокой стоимостью и малой доступностью, так и их быстрой инактивацией в условиях организма и вызываемыми ими как чужеродными белками различными побочными реакциями (антигенность, аллергенность, токсичность и т. п.) В значительной мере перечисленные препятствия могут быть устранены благодаря использованию ферментов в стабилизированном, иммобилизованном виде, тем более что усилиями инженерной энзимологии на сегодняшний день разработано значительное количество методов ковалентной и нековалентной фиксации ферментов на нерастворимых и растворимых носителях самой разной природы . В настоящее время принято выделять два принципиальных подхода к получению иммобилизованных терапевтических ферментов . При различных системных поражениях, когда присутствие терапевтического фермента необходимо в разных органах и тканях, целесообразно использовать тем или иным способом стабилизированные водорастворимые препараты иммобилизованных ферментов, обладающие повышенной стабильностью в физиологических условиях и замедленным выведением из организма. Сюда же будут относиться и различные ферментсодержащие искусственные клетки типа микрокапсул, теней эритроцитов или липосом. С другой стороны, для терапии локальных поражений, когда присутствие фермента требуется лишь в месте поражения, целесообразно создание биосовместимых ферментсодержащих полимерных частиц (биодеградируемых или просто временно имплантируемых), которые могут быть локализованы в определенном месте и оставаться там заданное время, непрерывно выделяя в окружающую среду терапевтический фермент, предпочтительно дополнительно стабилизированный. Самостоятельный случай представляет собой использование иммобилизованных ферментов в аппаратах для экстракорпоральной перфузии типа искусственной почки, в перевязочных и дренирующих материалах для ускорения заживления ран и ожогов и для модификации внутренней поверхности протезов кровеносных сосудов с целью понижения тромбообразования. Стабилизация терапевтических ферментов в ряде случаев может осуществляться без использования полимерных носителей, просто за счет целенаправленной химической модификации белковой глобулы низкомолекулярными реагентами или за счет введения в глобулу внутримолекулярных скобок из бифункциональных реагентов, затрудняющих денатурационное разворачивание молекулы белка [8]. Этот подход особенно важен, если терапевтический фермент для осуществления своей функции должен провзаимодействовать с рецептором клеточной мембраны (например, пара тромбин— тромбоцит) или проникнуть внутрь клетки (ферменты, применяемые для терапии многочисленных наследственных ферментных недостаточностей печени), а наличие полимерного носителя может резко снизить эффективность ферментного препарата. В ряде случаев применяют межмолекулярное сшивание ферментов бифункциональными реагентами типа глутарового альдегида, что можно также рассматривать как иммобилизацию одной молекулы фермента на другой. В ряде случаев такая модификация фермента приводит к повышению его стабильности и эффективности, например, таким образам удалось стабилизировать а-галактозидазу, применяемую для лечения болезни Фабри. Связывание ферментов с другими белками также дает выраженный эффект— конъюгаты уриказы или гемоглобина с альбумином способны в несколько раз дольше циркулировать в активном состоянии IB кровотоке, чем соответствующие нативные белки. Следует, однако, иметь в виду, что крупные белковые образования, имеющие большое количество участков, взаимодействующих с рецепторами различных клеток, могут в некоторых случаях захватываться, например, клетками печени с повышенной интенсивностью. Наиболее распространенным способам получения растворимых стабилизированных ферментных препаратов является их модификация растворимыми полимерами [9]. Наиболее удобны в качестве носителей полисахариды, в частности декстраны, из-за их высокой биосовместимости [10]. Для иммобилизации терапевтических ферментов могут использоваться и некоторые нетоксичные и неиммуногенные синтетические полимеры, например реакционноспособные производные поливинилпирролидона, полиэтиленгликоля, поливинилового спирта и др. Определенные перспективы открывает использование в качестве носителей природных соединений, которые сами по себе обладают полезной физиологической активностью или способны усиливать действие связанного с ними фермента. Так, для иммобилизации тромболитических ферментов может использоваться антикоагулянт гепарин ["]. При использовании подобных препаратов следует учитывать, что их молекулярная масса не должна превышать 80— 100 000, поскольку в противном случае будет затруднено их выведение из организма после выполнения ими своей функции, а накопление - полимерных носителей в организме может вызвать непредсказуемые осложнения. С этой целью в последние годы ведется разработка реакционноспособных синтетических полимеров, содержащих связи, способные к биодеградацйи, а значит, не накапливающихся в организме даже при большой молекулярной массе [12]. Связывание терапевтических ферментов с растворимыми носителями осуществляют традиционными химическими методами иммобилизации, которые подробно разработаны. При этом сами по себе связи полимер— носитель могут бытыкак бионеразрушаемыми — амидные, эфирные, так и биоразрушаемыми— уретановые, азометиновые и др. Принципиальные эффекты, достигаемые благодаря связыванию терапевтического фермента или другого белкового соединения, например гормона — инсулина, сводятся к следующим: повышение конформационной стабильности и устойчивости к действию эндогенных протеаз; увеличение времени циркуляции в кровотоке за счет увеличения молекулярной массы конъюгата и замедления его выведения; возможность регуляции иммунного ответа организма на белковый препарат; наконец, возможность получать препараты комплексного терапевтического действия. Возможность регуляции иммунного ответа организма на введение терапевтического фермента представляется чрезвычайно важной, поскольку многие перспективные ферментные препараты не могут применяться из-за вызываемых ими как чужеродными белками реакций организма. В то же время иммобилизация таких ферментов на природных или синтетических полимерах, например на полисахаридах или полиэтиленгликоле [13, 14], резко понижает иммунологические и аллергические реакции организма, по-видимому, за счет создаваемых матрицей носителя стерических препятствий взаимодействию антиген— антитело. С другой стороны, показано, что некоторые синтетические полиэлектролиты усиливают иммунный ответ на связанное с ними белковое соединение, что открывает возможности создания синтетических вакцин нового типа. Как уже отмечалось, наиболее широко применяемыми в клинической практике являются протеолитические ферменты. Поэтому неудивительно, что большое количество исследований посвящено получению их иммобилизованных производных. Показано, что конъюгаты с растворимыми носителями протеаз — субтилизина, трипсина, химотрипсина, террилитина и др. могут сохранять практически неизменной свою специфическую активность по низкой высокомолекулярным субстратам, в то же время обладая более высокой по сравнению с нативными предшественниками стабильностью по отношению к различным денатурирующим воздействиями увеличенным временем жизни в кровотоке. Препараты подобного типа уже нашли клиническое применение: в СССР впервые в мире в практику внедрена иммобилизованная на полисахаридном носителе стрептокиназа, успешно применяемая при лечении различных тромболитических заболеваний и не вызывающая побочных реакций. Из других гидролитических ферментов следует назвать лизосомальную p-D-N- ацетилгексозаминидазу, применяемую при лечении болезни Тея— Сакса, для которой было показано, что ее иммобилизация на поливинилпирролидоне [15] приводит к стабилизации по отношению к экзогенным протеиназам и к увеличению времени ее действия в кровотоке экспериментальных животных. Потенциальные противоопухолевые препараты — нуклеазы, обладающие также и противовирусной активностью, резко; улучшают свои свойства— стабильность и. биологическую активность— при связывании с растворимыми аминопроизводными декстрана методом азосочетания. Растворимые препараты иммобилизованных ферментов могут применяться не только для внутривенного введения; так, модифицированные декстраном карбоксипептидаза G и аргиназа [16] при внутрибрюшинном введении мышам с привитой мастоцитомой обладают способностью создавать более высокую и длительно действующую концентрацию активного начала в кровотоке, чем нативные ферменты. Можно было бы привести еще много примеров подобного рода, но все они сводились бы к одному— иммобилизация ферментов на растворимых полимерных носителях позволяет получать более стабильные, активные и безопасные терапевтические препараты. Более того, методы, выработанные при иммобилизации ферментов, могут быть успешно перенесены и на другие препараты белковой природы— различные физиологически активные полипептиды типа панкреатического ингибитора трипсина и, что особенно важно, гормона инсулина. Еще один перспективный метод применения модифицированных форм ферментов для лечения — это создание различного типа искусственных клеток. Исторически первым подходом к этой проблеме было микрокапсулирование ферментов, т. е. их включение в полимерные микрокапсулы, обеспечивающие надежное удержание и защиту фермента и свободное проникновение относительно низкомолекулярных субстратов и продуктов ферментативной реакции. Основные преимущества микрокапсулирования следующие: микрокапсула исключает контакт фермента с биологическими жидкостями; в микрокапсулу могут быть включены относительно высокие концентрации фермента, достижение которых в кровотоке при использовании фермента в нативном виде невозможно; в микрокапсулу могут включаться различные ферменты одновременно; фермент в микрокапсулах может быть дополнительно стабилизирован внутри- или межмолекулярным сшиванием или модификацией растворимыми полимерами. Учитывая к тому же, что сейчас имеются подходы к получению микрокапсул не только из синтетических полимеров (полиамидов, полиуретанов и т. п.), но и из природных или их аналогов (полимолочной кислоты и т. п.), т. е. снимается проблема утилизации материала оболочек микрокапсул в организме, подобного рода ферментные препараты представляются в высшей степени перспективными. Следует подчеркнуть, однако, что их применение ограничено случаем, когда терапевтический фермент должен действовать на растворимый субстрат относительно невысокого молекулярного веса. Первые успешные эксперименты по применению микрокапсулированных ферментов на животных были проведены с использованием уреазы (для понижения содержания мочевины в крови), каталазы (для лечения животных с каталазной недостаточностью) и аспарагиназы (для подавления роста аспарагинзависимых опухолей) . Первым примером использования микрокапсулированных ферментов в клинической практике является описанное в работе [26] применение микрокапсулированной каталазы для лечения в ротовой полости человека ран, образующихся при акаталаземии в результате накопления выделяемой бактериями перекиси водорода. Вторым по старшинству методом создания искусственных клеток является включение ферментов в липосомы— искусственные фосфолипидные микропузырьки. Ферменты, включенные в липосомы, также предохранены от инактивирующего воздействия внешней среды, а сами липосомы, состоящие из природных соединений, полностью утилизуются в организме. В отличие от микрокапсул, однако, липосомы обладают уникальной способностью доставлять включений в них препарат внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют по механизму слияния или эндоцитоза. Если учесть упомянутый ранее ряд заболеваний, связанных с недостаточностью внутриклеточных лизосомальных ферментов, то значение этого факта трудно переоценить. В липосомы с той или иной эффективностью включали подавляющее большинство применяемых в клинике ферментов— данные такого рода исчерпывающе описаны в монографии [ ]. Там же приведены данные по первым успешным экспериментам с липосомально инкапсулированными ферментами в клинике: включенная в липосомы глюкоцереброзидаза в отличие от нативного фермента, который не способен проникнуть в клетки, оказалась весьма эффективна для лечения пациента с болезнью Гоше, связанной с нарушением нормального метаболизма глюкоцереброзидов, накапливающихся в клетках ретикуло-эндотелиальной системы. Включенная в липосомы амилоглюкозидаза была успешно применена для лечения пациента с гликогенозисом II типа. Если учесть, что клетки ретикуло-эндотелиальной системы, в частности печени, представляют собой природную мишень для липосом, то ясно, что включенные в липосомы ферменты могут оказаться весьма эффективны в лечении различных ферментных недостаточностей печени. Липосомы, поверхность которых поддается различным модификациям, могут использоваться в качестве контейнеров для направленного транспорта лекарств, под которым сейчас принято понимать способность введенного лекарственного препарата накапливаться именно в зоне поражения. В ряде экспериментальных работ показано, что липосомы, во внутреннюю полость которых включены различные препараты, а к наружной мембране химически присоединено векторное соединение, способное опознавать и специфически связываться с зоной поражения (например, антитело против специфического компонента зоны-мишени), действительно избирательно концентрируются в заданном месте. Этот подход может еще более расширить арсенал методов ферментной терапии. В качестве контейнеров для включения ферментов могут применяться и оболочки клеток ,крови, например мембраны
18
или тени эритроцитов [ ]. Путем частичного гемолиза эритроцитов и их последующего заполнения желаемым содержимым с полным восстановлением целостности мембраны в них были включены самые разнообразные ферменты, и при этом было показано, что - включенные ферменты значительно повышают время своего, нахождения в кровотоке в активном состоянии (эксперименты проводили а мышах и обезьянах). Описана также попытка использования включенной в эритроциты глюкоцереброзидазы для лечения пациента с болезнью Гоше [,9]. Для лечения локальных, а не системных заболеваний, по- видимому, нужно создавать препараты иммобилизованных ферментов, которые могут быть локализованы в требуемом месте и способны к выделению в окружающую среду активного фермента с заданной скоростью, каким образом может быть создано локальное депо ферментного препарата в организме. В результате можно достичь высокой местной концентрации препарата, тогда как его общая доза будет ничтожна .по сравнению со случаем применения нативного фермента в виде раствора. Такие препараты могут быть получены несколькими способами. Во-первых, они могут быть включены в раствор синтетического биосовместимого полимера, из которого затем будут отформованы таблетки или гранулы, предназначенные для имплантации и способные медленно выделять включенный белковый препарат (опыты проводились с трипсином, лизоцимом, щелочной фосфатазой, каталазой и др.) [ ]. Скорость выхода фермента может регулироваться плотностью полимерной матрицы. Находясь в полимерной матрице, фермент защищен от воздействия агрессивной биологической среды, в результате чего подобные системы могут быть длительно функционирующими. В этом случае нерешенной проблемой остается судьба полимерного имплантата после полного выхода активного начала. Во-вторых, ферменты могут быть включены в процессе формования в структуру различных волокон и пленок, применяемых в хирургии в качестве шовных, перевязочных или дренирующих материалов. Благодаря принципу постепенного выделения материалы с включенными протеолитическими ферментами обладают высокой и длительной очищающей, дренирующей и неполитической активностью, способны служить без смены в течение длительного времени и в несколько раз ускорять процессы заживления по сравнению с традиционными методами терапии. Препараты иммобилизованных ферментов для локального применения могут быть получены как на основе нерастворимых полимеров, при этом фермент осуществляет свою функцию в связанном с носителем состоянии, а затем механически удаляется из очага поражения, так и на основе биодеградируемых носителей, когда скорость выхода фермента в окружающую среду определяется скоростью разрушения носителя, с которым фермент связан ковалентно. С использованием микрогранул сшитого декстрана — сефадекса — были получены препараты тромболитических ферментов с заданной скоростью биодеградации и было показано, что иммобилизованные таким образом фибринолизин, стрептокиназа или урокиназа могут быть использованы для локального депонирования при терапии тромбозов [ ]. Эффективная тромболитическая терапия при этом в эксперименте на животных достигалась при использовании общих доз фермента, на два порядка меньших, чем при традиционных методах терапии. Подобного рода препараты могут быть депонированы практически в любом органе и несомненно перспективны для клинического применения. Еще одна большая область применения ферментов в медицине, которая открылась только в результате разработки методов их иммобилизации,— это использование иммобилизованных ферментов в различных экстракорпоральных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических жидкостей. Частным случаем этого общего подхода является создание ферментных реакторов, которые могут использовать как тромбобезопасные протезы кровеносных сосудов. Основными преимуществами реакторов на основе иммобилизованных ферментов являются следующие: возможность избежать непосредственного контакта организма с чужеродным белком и таким образом уменьшить нежелательные реакции на этот белок; возможность многократного использования реактора; возможность проведения долговременного лечения. К недостаткам таких реакторов следует отнести не до конца решенные проблемы тромбообразования или сорбции белков крови на чужеродных поверхностях. Экстракорпоральная перфузия с использованием ферментных реакторов уже применяется достаточно широко. Наиболее подробно описано применение аспарагиназы, включенной в самые разнообразные реакторы и используемой для терапии аспарагинзависимых твердых опухолей. В экспериментах на животных и на человеке показано, что включение иммобилизованной аспарагиназы в систему циркуляции позволяет быстро и количественно удалить из крови аспарагин. Подобные же системы с иммобилизованной уриказой или L-фенилаланин-аммиак-лиазой могут применяться для общей детоксикации организма благодаря способности понижать уровень мочевой кислоты, в крови животных с гиперурикемией и уровень фенилаланина при фенилкетонурии. В заключение следует отметить, что возможности и перспективы использования в медицине ферментов и ихингибиторов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, и можно не сомневаться, что именно на этом пути медицину ждет создание новых и высокоэффективных методов лечения.
Известны новые компоненты, обладающие антитрипсиновой активностью. Эти компоненты представляют собой альдегидные аналоги пептидов, специфично и быстно ингигирующие панкреатический трипсин млекопитающих. Компоненты полезны в предотвращении и лечении тканевых нарушений, ассоциированных с панкреатитами [22]. В основе патента лежит метод синтеза альдопептидов на реакции образования семикарбазонов. Полученные пептиды обладали способностью блокировать функцию трипсина и других протеолитических компонентов, но и обладали протективным эффектом в защите животных от действия панкреатоксичных веществ, вызывающих острый панкреатит. Недостатком предлагаемого патента является полностью синтетический характер предлагаемых веществ, также они не обладают абсолютной специфичностью только к трипсину или только к химотрипсину, реагируют с большинством макромолекул в организме благодаря наличию семикарбазидной группировки, блокирует функции многих ферментов, в том числе необходимых для выздоровления организма. Полностью синтетический характер патентуемого препарата создает угрозу целого ряда побочных эффектов: кумуляции, отсутствию метаболизма или образование токсичных метаболитов, канцерогенных и генотоксических свойств. Все эти побочные эффекты характерны для семикарбазидов и многие из этих производных применяются как митозные для лечения рака, что свидетельствует об их чрезвычайной токсичности. Именно благодаря этой группировке реакция между патентуемыми пептидами и ферментами идет очень быстро, что не позволит препарату накапливаться селективно в очаге воспаления при остром панкреатите. Препарат был недостаточно эффективен при уже развившемся панкреатите и обладал только протективными свойствами. Метод синтеза предлагаемых семикарбазидов многостадийный, включает множество стадий и дорогостоящий.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать супрамолекулярный ансамбль модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гипергиперферментемий способную ингибировать протеолитические ферменты и способ ее получения. Композиция модифицированных олигопептидов должна быстро метаболизироваться организмом без образования токсичных метаболитов, ингибировать только один фермент и не влиять на нормальное функционирование других ферментативных систем, не быть ксенобиотиком, свободно накапливаться в воспаленных тканях поджелудочной железы, проникать не только в межклеточную жидкость, но и внутрь клеток. Быстро останавливать воспалительный процесс, вызванный избыточной секрецией протеолитических ферментов. Технология предлагаемого препарата должна быть простой,экономически доступной, экологически безвредной, безотходной и содержать максимум 3 стадии.
Поставленная задача решается путем получения композиции модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий, обладающих способностью ингибировать протеолитические ферменты, где в качестве основного действующего вещества используется композиция химически модифицированных олигопептидов являющихся продуктами аутологичного гидролиза в течение 0,2-48 часов протеолитических ферментов с измененными на противоположные зарядами молекул. Для этого берут ферменты трипсин, химотрипсин, папаин, панкреатин или смесь ферментов, готовят раствор и оставляют для аутолиза на 0,2-48 часов, затем химически модифицируют структуру полученных олигопептидов с заменой зарядов молекул на противоположные путем ацилирования янтарным ангидридом или алкилирования монохлоруксусной кислотой в соооношении реагентов 10- 200% по массе модификатора от массы взятого в реакцию белка. Полученные пептиды благодаря эффекту селективной комплементарной гибридизации взаимодействуют только со своими ферментами-предшественниками, тем самым ингибируя их функцию. Низкий молекулярный вес полученных пептидов и их устойчивость к гидролитическим ферментам позволяет легко проникать через биологические мембраны, всасываться из кишечника, накапливаться в очаге с высокой концентрацией ферментов- мишеней. Эти свойства позволяют использовать патентуемые пептиды для получения в том числе пероральных лекарственных форм для лечения хронических панкреатитов и язвенной болезни желудка.
Нами использован ансамбль из олигопептидов - продуктов аутологического гидролиза ферментов, но с измененными на противоположные зарядами молекул.
Ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии— супрамолекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно
самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке [23,24] Лучший вариант осуществления изобретения
Пример 1. Получение ингибитора трипсина.
1,0 г трипсина растворяют в 100 мл нейтрализованной до рН=7,5 дистиллированной воды для образования 1% раствора, оставляют на 48 часов при 37 0 С для аутолиза, затем к полученной смеси пептидов добавляют 2,0 г янтарного ангидрида, перемешивают до полного его растворения. Раствор полученных пептидов разливают в 5 мл флаконы, лиофилизируют и используют в качестве ингибитора трипсина.
Пример 2. Изучение антитрипсиновой активности полученных пептидов.
Для определения минимальной эффективной концентрации препарата готовили его двукратные разведения. Эффективной концентрацией являлась доза пептидной композиции, полностью ингибирующая протеолитическую активность трипсина. В качестве белка мишени для действия трипсина использовали 1% казеинат натрия фосфатном буфере при рН 8,0. Концентрацию растворимых олигопептидов - продуктов гидролиза с течением времени определяли спектрофотометрически при 280 нм и 260 нм. В раствор 1% казеина добавляли раствор трипсина в соотношении фермент-белок 1 :100, через каждые 5 минут отбирали по 1 мл образцов, добавляли такой же объем 1% трихлоруксусной кислоты, образовавшийся осадок белка отделяли центрифугированием, а концентрацию образовавшихся после гидролиза растворимых пептидов определяли спектрофотометрически. Спектрофотометрический метод определения белка основан на способности ароматических аминокислот (триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм. Условно принято считать, что при концентрации белка в растворе, равной I мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали растворитель препарата. Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05 до 2 мг/л. Определению белка данным методом мешают присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов (более 20 %). В этом случае оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух длинах волн— 260 и 280 нм; содержание белка X (мг/мл) рассчитывают по формуле Калькара:
Ж = 1 ,45* Омо— 0,74. ?s6fl* Чем больше было растворимых пептидов в растворе, тем активнее был трипсин, Ингибирование трипсина должно было привести к уменьшению концентрации растворимых пептидов.
В таблице приведены результаты изучения антитрипсиновой активности патентуемой композиции пептидов.
Таблица 1.- Зависимость активности трипсина от разведения добавленных
ингибиторов сукцинилпептидов
Figure imgf000017_0001
Как видно из таблицы эффективной концентрацией сукцинилпептидов является 0,125 нг/мл при концентрации трипсина 0,1 мг/мл. Также эксперимент подтвердил эффективность и дозозависимый характер применяемой композиции.
Пример 3. Изучение эффективности композиции пептидов в лечении животных с острым панкреатитом. В исследованиях была использована модель острого панкреатита у мышей, индуцированного внутриперитонеальным введением церулина [25]. Интенсивность панкреатита коррелировала с концентрацией амилазы в крови у мышей. Панкреатит был индуцирован у мышей весов 16-20 г путем внутрибрюшинного введения им церулеина в однократной дозе 100 мкг/кг веса тела. Повторно вводили церулеин с интервалом в 6 часов. Для проверки гипотезы об эффективности препарата именно в лечении панкреатитов, полученную композицию пептидов вводили животным внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл 1 нг/мл 1 раз в день 3 дня подряд. Ежедневно определяли концентрацию амилазы у крови животных.
Таблица 2.- Показатели эффективности патентуемой пептидной композиции на
модели панкреатита у мышей
Figure imgf000018_0001
* Р<0,01
Как видно из представленных в таблице 2 данных, патентуемая композиция оказалась способной не только нормализовать уровень амилазы в крови у животных почти до уровня контрольной группы, но и предотвратить их гибель. При 50% смертности животных в контрольной группе, в опытной группе выжили все животные. Таким образом, патентуемая композиция пептидов обладала терапевтической эффективностью на модели острого панкреатита у мышей.
Промышленная применимость изобретения
Технология производства препарата состоит из 3 простых стадий, сырьем для производства является промышленно производимый трипсин, все стадии производства не требуют нового уникального оборудования или уникальных реактивов. Изобретение может быть быстро внедрено на существующих производственных линиях и стандартизованном унифицированном оборудовании фармацевтических компаний.
Использованные источники информации
1 Enzymes as drugs/Ed. J. S. Holcenberg, J. Roberts. N. Y. etc.: Wiley and sons, 1981. 455 p.
2 Enzyme therapy in genetic diseases/Ed. R. J. Desnick. N. Y.: Alan Liss, 1980. Vol. 2. 450 p
3 Wiseman A. Enzymes in therapy— theory and practice.— In: Topics in enzyme and fermentation biotechnology. N. Y. etc., 1980, vol. 4, p. 9— 24.
4 Enzyme therapy of lysosomal storage diseases/Ed. J. M. Tager et al. Amsterdam: North- Holland, 1974
5 Barlow G. H. Enzymes of clot lysis.— In: Methods in enzymology. N. Y. etc., 1976, vol. 45, p. 239—280.
6 Vogel R., Trautschold L, Werle E. Natural proteinase inhibitors. N. Y.: Acad, press, 1958. 1 12 P-
7 Fritz H. Proteinase inhibitors in severe inflammatory processes (septic shock and experimental endotoxaemia): Biochemical, pathophysiological and therapeutic aspects.— In- Protein degradation in health and disease. Amsterdam: Excerpta Medica, 1980, p. 351— 379.
8 Torchilin V. P., Martinek K. Enzyme stabilization without carriers.— Enzyme Microbiol.
Technol., 1979, l, p. 74—82.
9 Torchilin V. P. Immobilized enzymes and the use of immobilization principles for drug targeting.— In: Targeted drugs. N. Y. etc., 1983, p. 127— 152.
10 Marshall J. J., Rabinowttz M. L. Enzyme stabilization by covalent attachment of
carbohydrate.— Arch. Biochem. and Biophys., 1975, 167, p. 777— 779.
1 1 Torchilin V. P., Il'ina E. V., Streltsova Z. A. et al. Enzyme immobilization on heparin.— J. Biomed. Mater. Res., 1978, 12, p. 585—590.
12 Kopecek J. Biodegradation of polymers for biomedical use.— In: IUPAC Macromolecules. Oxford; New York, 1982. 320 p.
13 Abuchowski A., McCoy I R, Palczuk N. C. et al Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase.— J. Biol. Chem., 1977, 252, p. 3582—3586.
14 Newmark A., Abuchowski A. Murano G. Preparation an properties of adducts
of streptokinase and streptokinase-plasmin complex with polyethylene glycol and
pluronic polyol F38.— J Appl Bochem., 1982, 4, p. 185—189.
15 Geiger В., Specht B. U. von, Arnon R. Stabilization of human p-D-N-Acetylhexosaminidase A towards proteolytic inactivation by coupling it to poly(N-vinylpyrrolidone).— Europ. J.
Biochem., 1977, 73, p. 141—147. 16 Sherwood R. F., Baird J. K., Atkinson T. et al. Enhanced plasma persistence of therapeutic enzymes by coupling to soluble dextran.— Biochem. J., 1977, 164, p. 461— 464.
17 Liposomes in biological systems/Ed. G. Gregoriadis, A. C. Allison. N. Y.: Wiley and sons, 1980. 360 p.
18 Ang E., Glew R. Ihler G. Enzyme loading of nucleated chicken erythrocytes.— Exp. Cell Res., 1977, 104, p. 430^134.
19 Dale G. L., Beutler E. Enzyme replacement therapy in Gaucher's disease: A rapid, high-yield method for purification of glucocerebrosidase.— Proc. Nat Acad. Sci. US, 1976, 73, p. 4672— 4674.
20 Hanger R., Folkman J. Polymers for the sustained release of proteins.— Nature, 1976, 263, p. 797—799.
21 Chazov E. L, Mazaev A. V., Lebedev B. S. et al. Experimental study of biosoluble drugs.— Thrombus lysis with biosoluble immobilized fibrinolysin in experiment.— Thrombosis Res., 1978, 12, p. 809— 816.
22 US Patent 5714580 Trypsin inhibitors//T. Brunck, M. Pepe, D. Pearson,T. Webb
23 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240
24 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)
25 Niederau C, Ferrell LD, Grendell JH. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 1985
May;88(5 Pt 1): 1 192-204.

Claims

Формула изобретения
1. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов, отличающийся тем, что в качестве основного действующего вещества используется смесь (ансамбль) химически модифицированных олигопептидов являющихся продуктами аутологичного гидролиза ферментов с измененными на противоположные зарядами молекул.
2. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1, отличающиеся тем, что в качестве фермента используют трипсин.
3. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 , отличающиеся тем, что в качестве фермента используют химотрипсин.
4. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п.
1, отличающиеся тем, что в качестве фермента используют папаин.
5. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 , отличающиеся тем, что в качестве ферментов используют смесь трипсина, химотрипсина, папаина в любых соотношениях.
6. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1, отличающиеся тем, что в качестве ферментов берут аутолизированный панкреатин животного происхождения.
7. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 , отличающиеся тем, что в качестве ферментов берут аутолизированный панкреатин генно-инжинерного происхождения.
8. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. п. 2-7, отличающиеся тем, что заряд молекул олигопептидов-продуктов аутолиза ферментов меняют путем их избыточного ацилирования янтарным ангидридом.
9. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. п. 2-7, отличающиеся тем, что заряд молекул олигопептидов-продуктов аутолиза ферментов меняют путем их избыточного алкилирования монохлоруксусной кислотой.
10. Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. п. 8-9., отличающиеся тем, что заряд молекул олигопептидов-продуктов аутолиза ферментов меняют путем их избыточной модификации при степени модификации равной 10-200% от массы взятого в реакцию белка.
1 1. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов, отличающийся тем, что берут ферменты, оставляют для аутолиза на 0,2-48 часов, затем химически модифицируют структуру полученных олигопептидов с заменой зарядов молекул на противоположные.
12 Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 1 , отличающиеся тем, что в качестве фермента используют трипсин.
13. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. П ., отличающиеся тем, что в качестве фермента используют химотрипсин.
14. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 1 , отличающиеся тем, что в качестве фермента используют папаин.
15. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 1 , отличающиеся тем, что в качестве ферментов используют смесь трипсина, химотрипсина, папаина в любых соотношениях.
16. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 1 , отличающиеся тем, что в качестве ферментов берут аутолизированный панкреатин животного происхождения.
17. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п. 1 1 , отличающиеся тем, что в качестве ферментов берут аутолизированный панкреатин генно-инжинерного происхождения.
18. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п.п.12-17, отличающийся тем, что заряд молекул олигопептидов-продуктов аутолиза ферментов меняют путем их избыточного ацилирования янтарным ангидридом.
19. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п.п.12-17, отличающийся тем, что заряд молекул олигопептидов-продуктов аутолиза ферментов меняют путем их избыточного алкилирования монохлоруксусной кислотой.
20. Способ получения модифицированных олигопептидов для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов по п.п.12-17., отличающийся тем, что заряд, молекул олигопептидов-продуктов аутолиза ферментов меняют путем их избыточной модификации при степени модификации равной 10-200% от массы взятого в реакцию белка.
PCT/RU2010/000692 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения WO2012070966A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000692 WO2012070966A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000692 WO2012070966A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012070966A1 true WO2012070966A1 (ru) 2012-05-31

Family

ID=46146098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000692 WO2012070966A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2012070966A1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869457A (en) * 1991-03-11 1999-02-09 Rijksuniversiteit Te Groningen Modified proteins and their use for controlling viral infections

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869457A (en) * 1991-03-11 1999-02-09 Rijksuniversiteit Te Groningen Modified proteins and their use for controlling viral infections

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PUBMED Database accession no. 6901613 *
LARGMAN C ET AL.: "Inhibition of human pancreatic elastase 2 by peptide chloromethyl ketones", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 614, no. 1, 10 July 1980 (1980-07-10), pages 113 - 20 *
MARTYNOV A. V. ET AL.: "New approach to design and synthesis of therapeutic and preventive drugs, taking into account interspecies polymorphism of receptors (metod of precisionpartial modification)", ANNALS OF MECHNICOV INSTITUTE, 2007, pages 5 - 13 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Torchilin Immobilized enzymes in medicine
US5705153A (en) Glycolipid enzyme-polymer conjugates
US5288489A (en) Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment
HU185223B (en) Process for preparing an enzymatic derivative containing a binary complex of streptokynase and plasminogen
US20080050389A1 (en) Compositions and methods for prevention and treatment of uncontrolled formation of intravascular fibrin clots
US20070292404A1 (en) Antimicrobial polymer conjugates
JP2008516965A (ja) 膵機能不全を治療するための、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼを含有する組成物
JPH04505326A (ja) プラスミノーゲン活性化剤とフィブリン断片との血栓ターゲットの錯体
Torchilin Immobilised enzymes as drugs
JP2690944B2 (ja) 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するタンパク質の高濃度溶液
KR20050047506A (ko) 섬유소용해성의 금속단백질분해효소를 이용하여유치도관의 폐색을 처리하는 방법
CZ2013891A3 (cs) Farmaceutická kompozice obsahující směs proenzymů a enzymů
EP1459738B1 (en) Pharmaceutical composition having thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties
Swenson et al. α-Fibrinogenases
WO2012070966A1 (ru) Модифицированные олигопептиды для лечения панкреатитов, язвенной болезни желудка и других гиперферментемий на основе пептидного ингибитора ферментов и способ их получения
JP2688603B2 (ja) 血栓溶解剤
US20120197003A1 (en) Modified oligopeptides for the treatment of pancreatitis, stomach ulcers, and other hyperenzymemias based on enzyme peptide inhibitors and methods for obtaining them
Khelfi Therapeutic enzymes used for the treatment of non-deficiency diseases
US5458632A (en) Implantable device and materials
RU2677343C2 (ru) Способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами
Torchilin et al. Long acting thrombolytic immobilized enzymes
US20020031518A1 (en) Plasminogen fragment having activity to inhibit tumor metastasis and growth and process for preparing same technical field
Torchilin et al. Chemical aspects of enzyme stabilization and modification for use in therapy
KR100284758B1 (ko) 굼뱅이(제조)에서분리한혈전용해성효소단백질
JP3806471B2 (ja) 腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片および該断片の調製方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10860018

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10860018

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1