KR100284758B1 - 굼뱅이(제조)에서분리한혈전용해성효소단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 굼뱅이 (제조)로부터 분리한 혈전 용해능을 갖는 효소 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 우리 나라 전통의 한약 재료인 제조의 추출물에서 얻은 혈전 용해성 효소 단백질 및 이를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 효소 단백질을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 경구로도 투여될 수 있어 혈전 관련 질환의 치료제 및 건강 보조 식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

굼뱅이(제조)에서 분리한 혈전 용해성 효소 단백질

본 발명은 굼뱅이 (제조)로부터 분리한 혈전 용해능을 갖는 효소 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 우리 나라 전통의 한약 재료인 제조의 추출물에서 얻은 혈전 용해성 효소 단백질 및 이를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 효소 단백질을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 경구로도 투여될 수 있어 혈전 관련 질환의 치료제 및 건강 보조 식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

혈액 순환 질환의 일종인 심혈관 질환 (cardiovascular disease)은 현대인에서 가장 흔한 질환 중 하나인 것으로 보고되고 있는데, 구체적으로는 심근 경색을 일으키는 관상동맥 질환 (coronary artery thrombosis)과 뇌졸증과 같은 발작 유발성 뇌혈관 질환 (cerebrovascular thrombosis), 그리고 폐색전 (pulmonary embolism)을 야기시키는 맥혈전증 (venus thrombosis) 등을 포함하는 질환의 일군이다 (Guytion, A. C., Textbook of Medical Physiology, 7th Eds., WB Saunders, Philadelphia, pp.76-86, 1986).

일반적으로, 혈액은 혈관 내에서는 몸속을 순환하지만 일단 혈관 밖으로 노출되면 급속히 응고된다. 혈관이 손상되면 출혈이 일어나는데 손상받은 혈관이 동맥 등의 큰 혈관인 경우 수술로서 출혈을 막아야 하지만 작은 손상인 경우는 혈관에서 자연히 지혈된다. 이러한 혈관 내부 표면은 내피세포로 둘러 쌓여 있어 이들 내피세포가 정상적인 경우에는 혈액 응고를 억제하는 작용을 하고 손상이 일어난 경우에는 신속하게 지혈하는 작용을 한다.

혈관 내피세포가 항응고 활성 (antithrombosis)을 갖는 이유는 그 표면이 혈소판의 표면과 같이 음전하를 띠고, 이들 세포에서 헤파란 설페이트 (heparan sulfate) 또는 트롬보모듀린 (thrombomodulin) 등과 같은 강력한 항혈액응고 인자가 분비되기 때문이다. 이 때 헤파란 설페이트는 안티트롬빈 Ⅲ (antithrombin Ⅲ)의 활성을 촉진시키고, 트롬보모듀린은 트롬빈의 효소 활성을 억제하는 동시에 프로테인 C (protein C)를 활성화하여 혈액의 응고를 방지한다.

또한 어떠한 요인에 의해 혈관이 손상되어 출혈이 일어나는 경우 생리적 방어기작으로 혈관내에 지혈 반응이 유발되어 혈액의 손실이 억제되는데, 먼저 혈액이 흘러 유출되는 것이 억제된 다음 혈액내에서 순환하는 혈소판이 모여서 점착하게 된다. 혈소판이 점착하여 응집하면 손상 부위에 플러그 (plug)가 형성되고 손상된 혈관 주변의 내피세포와 혈소판의 작용으로 트롬빈이 혈액응고 경로를 통해 폭발적으로 생성된다. 생체내의 생리적 상태에서 지혈 현상은 반드시 손상된 혈관 주변에서만 제한적으로 일어나고 다른 부위에는 영향을 주지 않는다.

지혈 과정이 완전히 끝나 혈관 조직의 재생이 이루어지면 본 과정을 통해 형성된 피브린 폴리머 (fibrin polymer)는 용해되어야 한다. 피브린 폴리머는 플라스민 (plasmin)이라는 물질에 의해 용해되는데, 플라스민은 혈전 용해계에서 플라스미노겐(fibrinogen)이 활성화되어 생성된 것이다. 이와 같이 플라스민은 피브린을 용해하는 효소로 작용하지만 혈액 응고에 중요한 피브리노겐을 분해하는 활성도 가지고 있어 자유 플라스민이 지나치게 다량 존재하면 혈액 응고 작용이 전체적으로 억제되어 생체에 미치는 위험성이 크다. 이러한 문제를 극복하기 위해 혈액내에는 플라스민에 대한 억제인자가 존재하고, 플라스미노겐 활성인자 (plasminogen activator)에 의한 플라스미노겐의 활성화도 피브린 클롯 (fibrin clot)이 형성된 곳에서만 일어나도록 플라스미노겐 활성 억제인자 (plasminogen activator inhibitor, PAI)가 정교하게 조절하고 있다.

생체 반응 기작에 의해 뇌혈관에 혈전이 생성되어 뇌혈전증이 일어나면 반신불수가 되고, 뇌의 미세한 혈관이 파열되어 뇌출혈이 일어나 뇌와 머리뼈 사이의 공간으로 출혈되는 거미줄막 출혈 등이 일어나면 생명에 치명적인 상태가 되며, 혈전에 의해 심장혈관이 막히면 심부전증이나 심장마비가 되므로 혈전(thrombus)을 치료하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다. 구체적으로 스트렙토키나제 (streptokinase)와 유로키나제 (urokinase) 같은 플라스미노겐 활성인자가 혈전을 제거하는데 유용한 것으로 알려져 이들을 정맥주사하여 혈전 용해계 (fibrinolytic system)를 활성화하는 치료법이 지난 30여년간 사용되어 왔다. 상기 두가지 약제는 실제로 혈전 용해에 상당히 효과가 있음이 많은 임상 예에서 이미 입증되었으나, 한편으로는 혈전에 대한 특이성이 없어 치료기간 동안에 전신출혈 (systemic haemorrhage)이 일어나는 등의 부작용이 보고되어 있다.

이외에도 1987년에는 유전공학적 방법에 의해 tPA (tissue-type plasminogen activator)가 개발되었는데, 이는 혈전과 직접 결합할 수 있어 혈전에 대한 선택성이 높으므로 처음에는 이상적인 혈전 용해제로 인식되었다. 그러나 임상에서 실제로 사용한 결과, 혈액내 반감기가 6분 정도로 매우 짧아 사용하기가 불편하고 스트렙토키나제 또는 유로키나제를 투여한 경우에서와 같은 부작용이 여전히 나타나는 문제점이 있었다.

따라서, 최근에는 이들 기존의 혈전 용해제의 문제점을 극복하는 더 나은 혈전 용해제를 제공하기 위한 시도가 매우 활발히 진행되고 있다. 그 대표적인 것으로 첫번째는 혈전 용해 활성이 강한 새로운 변이형 활성인자를 개발하는 것이며, 두번째는 자연 물질로부터 보다 우수한 혈전 용해능을 가지는 동물, 식물, 또는 미생물 유래의 새로운 혈전 용해제를 개발하는 것이다.

자연계의 여러 생물에서 존재하는 혈전을 용해할 수 있는 물질을 광범위한 탐색 기술을 활용하여 새로운 혈전 용해제로 개발할 수 있으므로 이러한 목적으로 수 많은 시도가 이루어졌다. 특히, 식물을 이용한 연구가 매우 활발하여 이미 TFPI (tissue factor pathway inhibitor)에 대한 많은 연구가 보고되어 있다. 구체적으로, 은행잎에서 추출한 성분이 혈류 순환을 원활하게 하는 것으로 알려져 이를 사용한 제제들이 개발되어 상품화되었다.

한편, 동물에서도 혈전을 용해하는 것으로 알려진 많은 물질이 존재한다고 보고되어 있다. 그 구체적인 예로 1989년 미국 머크 (Merck)사 연구소에서 흡혈박쥐의 침색조직에서 분리한 새로운 플라스미노겐 활성인자 (plasminogen activator) [Gardell, S. J. et al., (1991) Circulation, 84, 244-253], 뱀독에서 분리한 살모나제 (salmonase)[Chung, K. H. and Kim, D. S., (1991) Thromb. Haemost., 65, 953], 거머리에서 분리한 헤멘틴 (hementin), 그리고 지네에서 분리한 피브린 분해효소 (fibrinolytic enzyme) [Kim, K. Y. et al., (1993) Thromb. Haemost., 69, 839] 등을 새로운 혈전 용해제로 보고한 바 있다.

또한, 미생물에서도 여러가지 혈전 용해 물질이 확인되었다. 그 대표적인 것으로 β-헤모리틱 스트렙토코커스 (β-haemolytic streptococci)에서 분리된 스트렙토키나제 (streptokinase)가 있으며 그 외에도 1948년에 보고된 스테필로코커스(Staphylococcus)에 존재하는 스테필로키나제 (staphylokinase), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzae)에서 발견된 CA-7, 브리노라제 (brinolase), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)에서 발견된 피브리노리신 (fibrinolysin), 바실러스 속 (Bacillus sp.) 균주에서 발견된 피브린 분해효소 (fibrinolytic enzyme) 등이 혈전 용해제로 보고되어 있다 (김철호 등, 대한민국 특허출원 제 96-75523호).

현재까지 혈전증 (thrombosis)의 치료에 널리 사용된 의약품인 스트렙토키나제 (streptokinase), 유로키나제 (urokinase) 그리고 tPA (tissue -type plasminogen activator) 등은 임상적으로 사용하기에 몇 가지의 문제점이 있었다. 구체적으로 상기 의약품은 우선 부작용의 위험이 크고, 가격이 매우 비쌀 뿐만 아니라, 유로키나제를 제외하고 경구 투여가 불가능하다. 따라서, 최근에는 혈관 주사로만 투여할 수 있는 혈전 용해제 이외에 직접 경구 투여하거나 혈관 주사와 병용하여 혈액내의 혈전 용해능을 증가시킬 수 있는 제제에 관심이 모아지고 있다. 구체적으로 경구 투여할 수 있는 혈전 용해제로 지렁이 (Lumbricus lubellus)에서 6가지의 혈전 용해성 효소가 분리되어 제약화되어 있다 [Nakajima, N. et al., (1993) Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1730; Mihara, H. et al., (1991) Jpn. J. physiol., 41, 461].

또한, 수미(Sumi) 등은 유로키나제를 장내에 투입하여 흡수시키면 혈액 내의 혈전 용해능이 현저히 증가한다고 보고하였다. 즉, 이는 장에서 흡수된 유로키나제가 간으로 운반되어 혈전을 용해하는 효소의 합성을 촉진함으로써 혈전 용해능이 증가함을 나타내는 것으로, 혈전 용해성 효소가 장내에 직접 투여되어도 혈액내의 혈전을 용해시킬 수 있음을 확인해 준다 [Sumi, H. et al., (1985) Enzyme, 33, 121 ; Sumi, H. et al., (1983) Acta Haemat., 70, 289 ; Sumi, H. et al., (1980) Thromb. Res., 20, 711].

또한, 일본의 전통 발효 식품인 시오가라 (shiokara)와 나토 (natto)에서 혈전 용해성 효소가 존재함이 알려져 직접 그 효소가 분리되었는데, 그 중 나토로부터 분리한 나토키나제 (nattokinase)라는 효소는 경구 투여하는 경우에도 생체 내의 혈전 용해능을 높일 수 있다고 보고가 있어, 현재 일본에서 나토(natto)가 혈전 용해능을 지닌 건강식품으로 제품화되고 그 판매량이 급증하고 있다 [Sumi, H. et al., (1987) Experimentia, 43, 1110 ; 須見洋行 (1990) Bioindustry, 7, 725].

제조 (굼뱅이)는 풍뎅이의 유충인 굼벵이를 건조한 것으로 전통적으로 어혈 혈전증에 사용되어 왔으며, 제조 추출물이 혈전을 치료하는 효과가 있음이 실험용 쥐에서 보고된 바 있었다 (안규석, 대한한의학회지, 11, 92-101, 1990).

이에 본 발명자들은 어혈 혈전 치료에 민족 의학적으로 사용되어 온 풍뎅이과 곤충인 굼뱅이의 추출물을 이용하여 혈전 용해능이 우수한 효소 단백질을 얻고자 노력한 결과, 이로부터 분자량이 다른 3가지의 혈전 용해성 효소 단백질을 분리하여 그의 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 제조 추출물로부터 분리한 혈전 용해성 효소 단백질 및 그의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1 은 본 발명의 제조 추출물 (B)이 가지는 피브린 분해 활성을 피브린 플레이트 측정 (fibrin plate assay) 방법으로 플라스민 (A, 1 U/ml)의 활성과 비교하여 나타낸 것이고,

도 2 는 본 발명에서 정제한 혈전 용해성 효소 단백질을 SDS-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 것이고,

화살표 : 표준 단백질의 분자량 표시; 레인 1 : 제조 추출물 (10μg);

레인 2 : 정제된 효소 단백질 (5μg; 분자량 75,000 달톤과 30,000 달톤);

레인 3 : 정제된 효소 단백질 (5μg; 분자량 45,000 달톤);

표준단백질 : 미오신 (200 kDa), 포스포릴레이즈 (97 kDa), 소혈청 알부민 (68 kDa), 오브알부민 (43 kDa), 카르보닉 안하이드레이즈 (29 kDa), β-락 토글로불린 (18 kDa).

도 3 은 상기 제조 추출물이 보온 시간에 따라 혈전 용해 활성이 증가됨을 37℃에서 보존한 다음 피브린 분해활성을 용해 면적(mm²)으로 측정하여 나타낸 것이고,

도 4 는 제조로부터 분리·정제한 분자량 75,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질의 보온 시간에 따른 혈전 용해 활성의 변화를 37℃에서 보존한 다음 피브린 분해활성을 용해 면적(mm²)으로 측정하여 나타낸 것이고,

도 5 는 제조로부터 분리·정제한 분자량 45,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질의 보온 시간에 따른 혈전 용해 활성의 변화를 나타낸 것이고,

도 6 은 제조로부터 분리·정제한 분자량 30,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질의 보온 시간에 따른 혈전 용해 활성의 변화를 나타낸 것이고,

도 7 은 상기 제조 추출물의 열 및 pH 에 대한 안정성을 여러 가지 pH 와 온도 조건에서 1시간 동안 보온한 다음 인산 완충용액 (pH 7.0)으로 중화시키고 잔존 효소 활성을 용해 면적으로 측정하여 나타낸 것이고,

(●) : 37℃ 보온; (○): 60℃ 보온; (□) : 80℃ 보온.

도 8 은 제조로부터 분리·정제한 분자량 75,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질의 열 및 pH 에 대한 안정성을 여러 가지 pH 와 온도 조건에서 1시간 동안 보온한 다음 인산 완충용액 (pH 7.0)으로 중화시키고 잔존 효소 활성을 용해 면적으로 측정하여 나타낸 것이고,

(●) : 37℃ 보온; (○): 60℃ 보온; (□) : 80℃ 보온.

도 9 는 제조로부터 분리·정제한 분자량 45,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질의 열 및 pH 에 대한 안정성을 여러 가지 pH 와 온도 조건에서 1시간 동안 보온한 다음 인산 완충용액 (pH 7.0)으로 중화시키고 잔존 효소 활성을 용해 면적으로 측정하여 나타낸 것이고,

(●) : 37℃ 보온; (○): 60℃ 보온; (□) : 80℃ 보온.

도 10 은 제조로부터 분리·정제한 분자량 30,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질의 열 및 pH 에 대한 안정성을 여러 가지 pH 와 온도 조건에서 1시간 동안 보온한 다음 인산 완충용액 (pH 7.0)으로 중화시키고 잔존 효소 활성을 용해 면적으로 측정하여 나타낸 것이고,

(●) : 37℃ 보온; (○): 60℃ 보온; (□) : 80℃ 보온.

도 11 은 상기 제조 추출물이 혈전 용해 활성을 보이는 최적 pH 를 나타낸 것이고,

도 12 는 제조로부터 분리·정제한 분자량 75,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질이 혈전 용해 활성을 보이는 최적 pH 를 나타낸 것이고,

도 13 은 제조로부터 분리·정제한 분자량 45,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질이 혈전 용해 활성을 보이는 최적 pH 를 나타낸 것이고,

도 14 는 제조로부터 분리·정제한 분자량 30,000 달톤 (20μg)인 혈전 용해성 효소 단백질이 혈전 용해 활성을 보이는 최적 pH 를 나타낸 것이고,

도 15 는 본 발명의 혈전 용해성 효소 단백질이 피브린을 분해하는 양상을 전자현미경 (배율 ×200 배)으로 관찰하여 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제조 추출물로부터 각각 분자량이 75,000 달톤, 30,000 달톤 및 45,000 달톤인 3가지의 혈전 용해성 효소 단백질을 제공한다. 상기 효소 단백질은 보온 시간에 따라 혈전 용해 활성이 증가하고, pH 7.0 - 8.5 범위에서 최적 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 제조 추출물을 원심분리하고 그의 상등액을 암모늄 설페이트로 침전시킨 다음 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 침투 크로마토그래피 등을 수행하여 상기 혈전 용해성 효소 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 혈전 용해성 효소 단백질의 일부 또는 전부를 유효 성분으로 하는 혈전 관련 질환의 치료제용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 경구로 투여될 수 있고, 관상동맥 질환, 맥혈전증 및 뇌혈관 질환 등의 치료에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 혈전 용해성 효소 단백질의 일부 또는 전부를 유효성분으로 하는 건강 보조 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 우리 나라에서 전통적으로 한방 의료 및 민족의학적 분야에 사용되어 왔던 굼벵이의 제조 추출물을 이용하여 혈전 용해능을 가지는 효소 단백질을 분리한다.

본 발명은 우선 혈전 용해능을 가지는 제조 추출물을 얻기 위하여, 생산된지 1년이 경과된 신선한 제조 분말을 파쇄하여 저온에서 인산 완충용액으로 여과 추출하고 원심분리하여 그 상등액을 분리하였다. 이 상등액을 이용하여 혈전 용해 효소의 활성측정방법에 따라 그의 활성을 측정함으로 상기 제조 추출물에 존재하는 혈전 용해성 효소 단백질을 확인하였다.

구체적으로 효소의 활성은 피브린 플레이트 상에서의 용해 면적으로 측정하고, 이 때 대조군으로는 잘 알려진 혈전 용해제인 플라스민 (plasmin)을 사용하였다. 그 결과, 상기 효소 단백질은 플라스민과 비교하여 약 5배의 높은 혈전 용해능을 가지고 있었다 (도 1 참조).

본 발명은 상기 혈전 용해능을 가지는 효소 단백질을 얻기 위하여, 상기 제조 추출물의 상등액을 암모늄 설페이트로 침전시킨 다음 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 침투 크로마토그래피 등을 수행하여 정제한다. 구체적으로 본 발명은 DEAE-토요펄 (DEAE-toyopearl) 및 TSK 겔 3000xL 컬럼 등을 이용한 크로마토그래피 등으로 혈전 용해성 효소 단백질을 정제한다.

상기 과정으로 본 발명은 75,000 달톤, 45,000 달톤 및 30,000 달톤의 분자량을 가지는 특이적으로 혈전 용해능이 탁월한 효소 단백질을 얻는다 (도 2 참조).

본 발명의 효소 단백질의 의약품 또는 식품 산업에서의 유용성을 조사하기 위하여, 용혈 활성 (hemolytic activity)을 조사한다. 구체적으로 제조 추출물 및 정제된 효소 단백질은 플레이트 상에서 사람 혈액을 분해하지 않아 용혈 활성이 전혀 없는 것으로 판단되었다.

또한 상기 효소 단백질의 특성을 조사하기 위하여, 이를 보온하면서 그 효소 활성의 변동을 피브린 플레이트법 등으로 측정하였다. 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6 에서 알 수 있는 바와 같이 제조 추출물의 혈전 용해 활성은 보온 시간에 따라 계속 증가하고, 52일째에 최대 활성을 보였고, 정제된 효소 단백질은 약 12- 14 일 범위에서 안정한 혈전 용해 활성을 나타내었다.

또한, 제조 추출물 및 상기 효소 단백질의 pH 의존성과 온도 의존성을 조사한 결과, 제조 추출물의 혈전 용해 활성은 30℃에서 30일간 보온하여 0℃에서 30분간 가열한 경우 pH 6 - 7 범위에서 활성이 남아 있으나, 80℃에서 30분간 가열한 경우에는 활성은 완전히 사라짐을 확인하였다. 한편 정제된 효소 단백질은 분자량이 45,000 달톤인 효소, 70,000 달톤인 효소 및 30,000 달톤인 효소의 순서로 고온에서 pH 안정성을 나타내었다 (도 7-10 참조). 구체적으로, 상기 효소 단백질은 pH 7.0 - 8.5 범위에서 최적 혈전 용해 활성을 나타낸다 (도 11-14 참조).

또한, 본 발명은 제조 추출물 및 상기 효소 단백질의 기존 저해제에 대한 특성을 피브린 플레이트법으로 검토하였다. 구체적으로, 저해제로 아포티닌 (Apotinin), p-니트로페닐-p-구아니디노벤조에이트 (p-nitrophenyl-p-guanidino benzoate, NPGB), 디이소프로필 플루오르포스페이트 (diisopropyl fluorophosphate, DFP), N-토실-라이실클로로메탄 (N-tosyl-lysylchloromethane, TLCK), p-클로로머큐리벤조산 (p-chloromercuribenzoic acid, PCMB), 트랜스-4-아미노메틸 사이클로헥산카르복실산 (trans-4-aminomethyl cyclohexanecarboxylic acid, t-AMCHA), 소이빈 트립신 억제제 (soybean trypsin inhibitor, SBTI), 소태아 피브리노겐 (bovine fibrinogen) 등을 사용하여 시험한 결과, 표 1-4 에서 보는 바와 같이 상기 효소 단백질은 SBTI 과 아프로티닌에 의해서 강하게 저해를 받았고, DFP 와 t-AMCHA 에 의해서는 약간 저해를 받았으며, PSMB 와 TLCK 에 의해서는 거의 저해 효과가 나타나지 않았다. 상기 결과를 분석한 결과, 본 발명의 효소 단백질은 주요 성분이 세린 프로테아제 (serine protease) 계통임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 효소 단백질이 작용하는 양상을 전자현미경으로 관찰하여, 피브린이 고농도의 효소 단백질에 의해 침식되는 형태로 분해되는 것을 확인하였다 (도 15 참조).

본 발명은 상기의 특성을 가지는 효소 단백질의 일부 또는 전부를 유효 성분으로 하는 혈전 관련 질환 치료제용 약학적 조성물 및 건강 보조 식품을 제공한다. 이 때 혈전 관련 질환에는 관상동맥 질환, 맥혈전증 및 뇌혈관 질환 등을 포함한다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 효소 단백질의 유효 투여량은 하루에 10,000 내지 2,500,000 U 가 바람직하다.

본 발명의 효소 단백질의 약제학적인 이용에서는 약제학적인 분야에서 공지된 방법에 의해 제조 생산될 수 있으며, 적절한 부형제를 사용하여 정제, 캡슐제, 산제, 액제, 현탁제, 주사제 등의 제형으로 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>혈전 용해능을 가지는 효소 단백질의 확인

본 발명은 혈전 용해능을 가지는 제조 추출물로부터 혈전 용해성 효소 단백질을 확인하기 위하여, 생산한지 1년이 된 신선한 제조 분말 50 g 을 한국, 동국대학교 한방병원에서 구입하고 이를 라운드 플라스크에 넣어 4℃ 저온 챔버안에서 20 mM 인산 완충용액 (pH 6.0) 50 ml 을 넣고 2시간씩 3회 반복하여 총 150 ml 을 여과 추출하였다. 다음 상기 추출액을 시료로 하여 원심분리하고 펠렛을 제거한 상등액을 사용하여 하기에 기술한 효소 활성측정방법을 수행하였다. 이 때 상기 추출액은 장기 보존을 위하여 여과하여 동결 건조시킴으로 농축하고 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 2>혈전 용해성 효소의 활성측정방법

본 발명은 혈전 용해성 효소의 활성측정방법으로 피브린 플레이트 (fibrin plate)법을 사용하였다.

구체적으로 하기 과정은 아스트럽과 뮬러쯔 방법 [Astrup and Mullertz, (1952) Arch. Biochem. Biophys., 40, 346-359]을 크게 수정한 것으로, 먼저 50 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)으로 피브리노겐 (fibrinogen)이 최종농도가 1% 로 완전히 용해된 용액 5 ml 를 준비하고, 여기에 트립틱 소이 아가(tryptic soy agar) 5 ml 를 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합용액에 100 NIH U/ml 농도의 트롬빈 용액 0.1 ml 를 첨가한 다음 트립틱 소이 아가 15 ml 을 첨가하여 미리 고화시킨 페트리 디쉬 (petri dish) 위에 붓고 실온에서 5 내지 10분간 방치하여 고화시켰다. 다음 토요 멤브레인 디스크 (toyo membrane disk) 위에 시료용액 100μl 를 놓고 37℃에서 24시간 동안 보온한 후 15% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 부가하여 이 때 생성되는 투명환(clear zone)으로 혈전 용해 활성을 확인하였다. 대조군으로는 혈전 용해성 효소로 잘 알려진 정제된 플라스민 (plasmin) 1 U/ml 을 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 효소 단백질은 비교 사용한 플라스민보다 약 5배 높은 혈전 용해능을 나타냄을 확인하였다 (도 1 참조).

<실시예 3>혈전 용해능을 가지는 효소 단백질의 분리· 정제

상기 실시예 1 에서 얻은 제조 추출물을 15,000 x g 에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하고 여기에 30 - 70% 에 해당되는 암모늄 설페이트를 처리하여 침전시킨 다음, 다시 15,000 x g 에서 30분간 원심분리하여 침전물을 얻고 이를 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 8.5)으로 투석시켰다. 투석한 시료는 DEAE-토요펄 M650 (DEAE-toyopearl M650, 토-소제품, 일본) 및 TSK 겔 3000xL (토-소제품, 일본) 컬럼을 통과시키고 혈전 용해 활성을 갖는 효소 단백질을 분리·정제하여 효소의 특성을 조사하였다. 이 때 단백질은 280 nm 에서 흡광도를 측정하거나 소혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 표준물질로 한 로우리 (Lowry) 방법을 사용하여 정량하였다 [Lowry, O. H. et al., (1952) J. Biol. Chem., 193, 265-275].

마지막으로 분리·정제된 혈전 용해 활성을 가진 효소 단백질을 전기영동방법으로 분석하였다 (도 2 참조). 이 때 단백질의 전기영동은 램리 방법 [Laemli, U. K., (1970) Nature, 227, 680]으로 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하였다. 도 2 에서 레인 1 은 조추출물 (crude extract)이며, 레인 2 는 정제된 혈전 용해성 효소 단백질 중 분자량 75,000 과 30,000 달톤인 것을, 레인 3 은 정제된 혈전 용해성 효소 단백질 중 분자량 45,000 달톤인 것을 나타낸다.

<실시예 4>용혈 활성 측정

본 발명의 효소 단백질의 의약품 또는 식품 산업에서의 유용성을 조사하기 위하여, 용혈 활성 (hemolytic activity)이 있는지에 관한 시험을 실시하였다. 실시예 2 및 실시예 3 의 방법에 따라 제조된 제조 추출물 및 분리·정제된 효소 단백질을 플레이트에 놓고 여기에 사람 혈액을 첨가하여 관찰한 결과, 혈액이 분해되지 않고 그대로 유지되었다. 따라서, 상기 제조 추출물 및 효소 단백질은 용혈 활성이 전혀 없는 것으로 판단되었다.

<실시예 5>제조 추출물 및 정제된 효소 단백질의 혈전 용해 활성의 변화 특성

상기 제조 추출물의 혈전 용해 활성 상의 특성을 알아보기 위하여, 제조 추출물을 0.5% NaN₃용액 내에서 시간별로 56일간 추출물을 37℃에서 보온하면서 그 활성의 변동을 피브린 플레이트법으로 측정하였다. 도 3 에서 알 수 있는 바와 같이 혈전 용해 활성은 이 기간 동안 계속 증가하여 52일째에 최대 활성을 보였다. 이 결과는 혈전 용해에 관여하는 효소가 시간이 경과함에 따라 활성화되고 있음을 나타내는 것으로, 최 등 (최의성 등, 과학기술처 특정연구개발보고서, 1996)이 보고한 지렁이 추출물에서와 같은 특성을 보였다. 그러나 상기에서 정제된 효소 단백질은 혈전 용해 활성이 약 12 - 14일 범위까지 안정한 것으로 나타났다 (도 4-6 참조).

<실시예 6>제조 추출물 및 효소 단백질의 혈전 용해 활성의 pH 의존성 및 온도 의존성

제조 추출물 및 효소 단백질의 혈전 용해 활성에 있어서 pH 의존성과 온도 의존성을 조사하여 그 차이를 비교하였다 (도 7-10 참조). 구체적으로 30℃에서 30일간 보온한 제조 추출물을 0.5% NaN₃용액내에서 37℃로 30분간 가열한 다음 pH 3.0 - 12.0 범위에서 혈전 용해 활성들을 조사하였다.

그 결과 60℃에서 30분간 가열한 경우 pH 6 - 7 범위에서 활성이 남아 있으나, 80℃에서 30분간 가열한 경우에는 활성은 완전히 사라졌다. 이와 같은 결과는 미하라 등이 밝힌 지렁이 추출물의 혈전 용해 활성성분들의 특성과 매우 유사하였다 [Mihara, H. et al., (1991) Jpn. J. Physiol., 41, 461-464]. 한편 상기에서 정제한 효소 단백질은 분자량 45,000 달톤, 75,000 달톤, 30,000 달톤의 효소 순서로 고온에서 pH 의존적인 안정성을 나타냈다.

<실시예 7>제조 추출물 및 효소 단백질의 혈전 용해 활성의 최적pH

제조 추출물 및 효소 단백질의 혈전 용해 활성에 있어서 최적pH 를 조사하기 위하여, 상기 실시예 6 과 동일한 과정으로 시험한 결과, 제조 추출물의 혈전 용해 활성은 pH 7.0 - 8.5 범위에서 최적 활성을 나타내므로 최적 pH 범위가 넓음을 알 수 있었다 (도 11 참조). 한편 상기에서 정제한 효소 단백질 중 분자량 75,000 달톤의 효소는 pH 8.0 에서 (도 12 참조), 45,000 달톤의 효소는 pH 7.0 - 8.0 에서 (도 13 참조), 30,000 달톤의 효소는 pH 8.0 에서 (도 14 참조)에서 최적 pH 를 나타냈다.

<실시예 8>제조 추출물 및 효소 단백질의 혈전 용해 활성에 대한 저해제

제조 추출물 및 상기 효소 단백질의 혈전 용해 활성에 있어서 기존 저해제들을 이용하여 저해 특성을 피브린 플레이트법으로 검토하였다. 상기 혈전 용해성 효소의 저해제 시험에는 아포티닌 (Apotinin), p-니트로페닐-p-구아니디노벤조에이트 (p-nitrophenyl -p-guanidinobenzoate, NPGB), 디이소프로필 플루오르포스페이트 (diisopropyl fluorophosphate, DFP), N-토실-라이실클로로메탄 (N-tosyl-lysylchloromethane, TLCK), p-클로로머큐리벤조산 (p-chloromercuri benzoic acid, PCMB), 트랜스-4-아미노메틸 사이클로헥산카르복실산 (trans-4- aminomethyl cyclohexanecarboxylic acid, t-AMCHA), 소이빈 트립신 억제제 (soybean trypsin inhibitor, SBTI), 소태아 피브리노겐 (bovine fibrinogen) 등이 사용되었고 이들은 모두 시그마사 제품 (미국)이었다.

일반적으로, 제조 추출물의 혈전 용해 활성은 피브린 플레이트 상에서 약 20시간 경과한 후에 검출되지만 약 50일 정도 보온한 시료의 경우는 활성이 너무 강하여 1시간 정도에서도 혈전 용해 활성이 검출되었다. 표 1 은 제조 추출물의 혈전 용해 활성에 대한 각종 저해제의 저해 효과를 나타낸 것으로, 저해 활성 반응은 총 1 ml 용액에 50μl의 제조 추출물 (약 300μg 단백질), 1 - 10 mM 의 각각의 저해제 그리고 0.1 M 인산 완충용액 (pH 7.0)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 남아 있는 혈전 용해 활성을 피브린 플레이트법으로 측정하였다. 각 결과는 3번 실험한 평균치를 나타내고, 저해 활성도는 대조군으로 저해제 무첨가군을 0% 로 하여 계산한 것이다.

저해제	농도	저해 활성 (%)
SBTI	10 mg/ml	87
아프로티닌	100 kIU/ml	76
DFP	10 mM	25
t-AMCHA	10 mg/ml	23
PCMB	5 mM	0
TLCKb	5 mM	0

한편 표 2, 표 3 및 표 4 는 상기에서 정제된 분자량 75,000 달톤, 45,000 달톤 및 30,000 달톤의 각 효소 단백질의 혈전 용해 활성에 대한 각종 저해제의 저해 효과를 상기와 같은 방법으로 나타낸 것이다.

저해제	농도	저해 활성 (%)
SBTI	5 mg/ml	98
아프로티닌	25 kIU/ml	86
DFP	2 mM	35
t-AMCHA	1 mg/ml	21
PCMB	1 mM	0
TLCKb	1 mM	0

저해제	농도	저해 활성 (%)
SBTI	5 mg/ml	88
아프로티닌	25 kIU/ml	92
DFP	2 mM	31
t-AMCHA	1 mg/ml	28
PCMB	1 mM	3
TLCKb	1 mM	2

저해제	농도	저해 활성 (%)
SBTI	5 mg/ml	88
아프로티닌	25 kIU/ml	92
DFP	2 mM	27
t-AMCHA	1 mg/ml	32
PCMB	1 mM	5
TLCKb	1 mM	7

표 1, 표 2, 표 3 및 표 4 에서 보는 바와 같이, 제조 추출물 및 효소 단백질의 혈전 용해 활성은 SBTI 과 아프로티닌에 의해서 강하게 저해를 받았고, DFP 와 t-AMCHA 에 의해서는 약간 저해를 받았다. 그러나 PSMB 와 TLCK 에 의해서는 거의 저해 효과가 나타나지 않았으며 상기 결과는 DFP 에서의 결과를 제외하고는 지렁이 추출물에서의 결과와 비슷하였다(Mihara, H. et al., (1991) Jpn. J. Physiol., 41, 461-464). 따라서 제조 추출물 및 효소 단백질에서 혈전 용해 활성을 갖는 주요 성분은 주로 세린 프로테아제 (serine protease) 계통인 것을 알 수 있었다.

<실시예 9>혈전 용해성 효소의 피브리노겐 (fibrinogen) 분해 과정의 전자현 미경적 관찰

본 발명의 혈전 용해성 효소 단백질이 작용하는 양상을 전자현미경으로 관찰하기 위하여, 피브리노겐 (fibrinogen)과 제조 추출물 또는 상기 효소 단백질을 섞어 1시간 동안 반응시킨 다음 분해물을 제올사(Jeol, 일본)의 전자현미경으로 조사한 결과 피브린이 고농도의 제조 추출물 또는 상기 효소 단백질에 의해 침식되는 형태로 분해되는 것을 확인하였다 (도 15 참조).

상기에서 살펴 본 바와 같이. 제조 추출물에서 분리·정제된 혈전 용해성 효소 단백질은 기존의 혈전 용해제인 플라스민보다 훨씬 높은 혈전 용해능을 지니고 용혈 활성을 전혀 나타내지 않으므로, 기존의 혈전 용해제가 주로 정맥 주사로 투여되는 것과 비교하여 경구로도 투여될 수 있어 혈관 주사제와 병용하여 사용될 수 있는 탁월한 잇점이 있다. 또한, 임상적으로 사용되는 경구 투여 약제 이외에 건강 보조 식품으로도 개발될 수 있다.

Claims (11)

1. 제조 추출물로부터 분리한 혈전 용해능을 갖는 효소 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 보온 시간에 따라 혈전 용해 활성이 증가하고, pH 7.0 - 8.5 범위에서 최적 활성을 나타내는 효소 단백질.
3. 제 1항에 있어서, 효소 단백질은 분자량이 75,000 달톤인 것을 특징으로 하는 효소 단백질.
4. 제 1항에 있어서, 효소 단백질은 분자량이 30,000 달톤인 것을 특징으로 하는 효소 단백질.
5. 제 1항에 있어서, 효소 단백질은 분자량이 45,000 달톤인 것을 특징으로 하는 효소 단백질.
6. 제조 추출물을 원심분리하고 그의 상등액을 암모늄 설페이트로 침전시킨 다음 투석하여 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 침투 크로마토그래피로 혈전 용해성 효소 단백질을 얻는 정제 방법.
7. 제 6항에 있어서, 제조 추출물은 제조 분말을 파쇄한 다음 저온에서 20mM 인산 완충용액 (pH 6.0)으로 여과 추출하여 얻는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
8. 제 1항의 효소 단백질의 일부 또는 전부를 유효 성분으로 하는 혈전 관련 질환 치료제용 약학적 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 혈전 관련 질환은 관상동맥 질환, 맥혈전증 및 뇌혈관 질환을 포함하는 혈전 관련 질환 치료제용 약학적 조성물.
10. 제 8항에 있어서, 경구로 투여할 수 있는 혈전 관련 질환 치료제용 약학적 조성물.
11. 제 1항의 효소 단백질의 일부 또는 전부를 유효 성분으로 하는 건강 보조식품.

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