KR101683635B1 - 락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암세포의 대사과정을 교란함으로써, 암세포의 증식, 침윤, 전이 등의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 락테이트를 암세포내에서 해리시킬 수 있는 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물, 암 전이억제용 약학 조성물 및 암 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 락테이트 금속염은 부작용이 없으면서도, 암의 주된 에너지 생산경로인 해당과정을 교란시켜서, 암세포의 성장을 억제하고, 사멸을 유도할 뿐만 아니라 방사선 조사에 대하여 내성을 유도하는 인자의 발현을 억제하므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer comprising lactate metallic salts}
본 발명은 락테이트 금속염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 암세포의 대사과정을 교란함으로써, 암세포의 증식, 침윤, 전이 등의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 락테이트를 암세포내에서 해리시킬 수 있는 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물, 암 전이억제용 약학 조성물 및 암 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
2011년에 발표 된 자료에 의하면 2011년 우리나라에서는 연간 218,017건의 암이 발생되었는데 모든 암의 조 발생률은 인구 10만 명당 남자 439.2명 여자 431.0명 이었다. 그리고 발병 분위로는 위암, 대장암, 폐암, 간암, 유방암 순으로 많이 발병 하였는데 위 5대 암의 발병률은 모든 암의 발병률의 50% 이상을 차지 할 정도로 발생 빈도가 높다. 남자의 경우는 위암 대장암, 폐암, 간암 순으로 발병되었으며, 여자의 경우는 갑상선을 제외하고 유방암, 대장암, 위암, 폐암 순으로 발병 되었다. 우리나라 국민들이 평균수명 까지 생존할 경우 암에 걸릴 확률은 36.9%이고 남자는 5명 중 2명(38.1%) 여자는 3명 중 1명(33.8%)에서 암이 발생할 것으로 추정되고 있다. 세계 표준인구로 보정한 우리나라의 연령표준화발생률은 인구 10만 명당 295.1명으로 미국(318.0명)이나 호주(323.0명)보다는 낮았으나 OECD 평균(271.5명) 보다는 높은 수치를 나타내고 있다. 이에 따른 사망률은 2013년 자료를 기준으로(통계청) 대한민국 전체 사망자 중 28.3%인 75,334명이 암으로 사망하고 있으며 약 2~3년 기준으로 8.8%의 증가율로 사망률은 증가할 것으로 예측되고 있다. 따라서 높은 발병률과 사망률을 보이는 암을 치료하기 위해 전 세계적으로 다양한 치료방법이 시도되고 있지만, 아직까지는 적극적인 암 치료법으로 조기와 중기 암에서 가능한 수술치료, 항암제 요법 또는 방사선 치료법이 최우선으로 손꼽힌다.
수술을 통한 치료법의 과정을 진행하기 위해서 우선 진단을 통해 종양의 분류와 유형을 알게 되는데 대부분 생체검진을 통해 진단을 한다. 근치적 치료방법으로써 수술은 종양을 둘러싼 림프절과 원발병소 모두를 제거하는 것으로, 근치적 절제술이 이에 속하고 완치가 목표기 때문에 우선적으로 수행하게 된다. 절제술의 사망률은 1~3% 이하로 감소하였고 5년간 생존율은 50% 이상으로 높아졌지만 수술 받은 환자에서 재발하는 위험이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 그리고 수술방법은 급성 부작용으로써 합병증으로 인한 출혈, 장폐색, 혈관손상, 요관손상, 직장파열, 폐렴 폐색전증이 일어날 수 있으며 이에 따라 재수술을 해야 하기도 한다. 항암화학요법은 약물, 즉 항암제를 사용하여 암을 치료하는 것으로 전신에 퍼져 있는 암 세포에 작용하는 치료방법이다. 하지만 항암제는 대부분 암 세포의 빠른 성장을 억제하도록 만들어졌기 때문에 암 세포 보다는 덜 하지만 정상세포도 손상을 받게 된다. 정상세포 중에서도 빠르게 분열하거나 증식하는 혈액세포나 구강을 포함한 위장관의 상피세포, 머리카락세포, 생식세포 등이 영향을 많이 받게 되어 빈혈, 탈모, 생식기능의 장애를 일으키는 부작용이 존재한다. 심한 경우 골수의 기능을 떨어뜨려 치료 2~3주 이내 감염을 일으키고 패혈증으로 사망에 이르기도 한다. 방사선 조사를 이용한 치료방법은 방사선이 가진 에너지를 활용하여 암 조직의 사멸과정을 유도하는 치료방법을 일컫는다. 정상적인 생활을 영위하면서 치료받는 치료법 중에 하나지만 방사선의 고 에너지에 의한 부작용으로 국소 부위의 정상피부에 손상을 유도하기도 하고 전이성 암의 경우 암 줄기세포가 방사선에 내성을 보이면서 추후에 재발이나 전이가 발생하는 단점을 가지고 있다.
이러한 단점을 해결하기 위하여, 방사선조사를 이용한 치료를 수행할 때 화학치료나 유전자 치료를 병행하는 치료방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2002-0042606호에는 N-아세틸 파이토스핑고신 유도체와 다이메틸 파이토스핑고신 유도체를 함께 포함하는 방사선 치료 증진제 조성물이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2003-0055878호에는 세라마이드류 및 그 유도체와 스핑고신 인산화효소 억제제(sphingosine kinase inhibitor)인 다이메틸스핑고신을 함께 포함하는 방사선 민감제가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제620751호에는 페오놀(paeonol)및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 민감용 조성물이 개시되어 있다. 그러나 상기와 같이 방사선 치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들은 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료 시 나타나는 방사선 치료부의의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등의 부작용과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있고, 환경 자체가 면역 억제성 이므로 종양의 완전 근절이 어렵고, 재발 가능성이 높다는 위험성이 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, 암 질환의 치료에 쉽게 적용가능하고 정상 조직에 적게 영향을 주면서 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다. 최근 연구결과에 의하면, 암 세포는 고유의 특징을 가지고 있으며 그 특징을 잘 유지하며 지속적인 성장이 가능한 것으로 알려져 있다. 첫 번째로 분화신호를 지속적으로 유지하는 특징이 있는데 그 특징은 베타카테닌 신호의 유지에 의한 세포 분화, 생존이 잘 알려져 있다. 정상 세포는 베타카테닌 신호를 단백질 유비퀴티네이션 과정을 통해 과 생성을 억제하고 있지만 종양은 베타카테닌 분해과정을 회피하여 지속적으로 성장 신호를 유지한다. 두 번째로 세포의 에너지측면에서 암 세포는 글루코즈를 이용한 해당과정을 통해 젖산을 과량으로 생산하는 시스템을 가지고 고 효율의 에너지를 생산한다. 세 번째로 세포 사멸과정을 회피하는 특성을 가지고 있는데 관련 분자인 poly ADP ribose polymerase(PARP)가 활성화 되면 다양한 유전자 표적치료에 내성을 갖고 세포 사멸 기전을 회피하여 종양형성을 지속적으로 유지할 수 있다. 네 번째로 암은 침투나 전이 능력이 뛰어나고 신생혈관생성을 통해 스스로 살아가는 환경을 만들 수 있는 특징이 있다. 암이 성장을 지속하다 보면 종양 중심부위를 바탕으로 괴사가 일어나며 산소공급이 적어지게 되는데 이 때 증가하는 hypoxia inducible factor(HIF)-1α 가 상기 현상에 직접 또는 간접적으로 관여한다고 알려져 있다.
암을 치료하기 위해 이러한 암 특징들을 표적으로 하여 세포증식 및 전이억제 조절에 기반을 둔 많은 항암제가 개발되어 왔지만 성장신호를 매개하는 티로신키나아제나 저해제 등의 치료성적이 만족스럽지 못했고 약에 대한 내성의 문제도 나타났다. 복잡한 신호전달 경로의 네트워크에 의해 조절되는 암세포의 증식을 효과적으로 억제하는 방법을 찾아내는 것은 항암제 개발에 있어서 상당히 어려운 과제로 남아있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 암세포의 증식을 효과적으로 억제하여 암을 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, 암세포의 증식, 침윤, 전이 등의 작용을 효과적으로 억제할 수 있는 락테이트를 암세포내에서 해리시킬 수 있는 락테이트 금속염이 항암제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 전이억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
발명자들은 암세포의 증식 및 전이를 효과적으로 억제하여 암을 치료하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 암 세포의 대사경로에 주목하게 되었다. 암 세포에서는 포도당으로부터 에너지를 생성함에 있어, 다량의 산소를 사용하는 미토콘드리아 호흡연쇄를 통하지 않고, 산소를 사용하지 않는 해당과정을 활용한다. 락테이트는 암 대사과정에서 다량으로 생산되지만 락테이트의 산성으로 인한 암세포 생존의 비효율성 때문에 적정 농도의 락테이트를 제외한 나머지는 세포밖으로 보내는 특징을 보인다. 때문에, 암 환자에게 인위적으로 락테이트 금속염을 투여하여 암 세포내에 락테이트를 축적시킴으로써 암세포에게는 축적된 락테이트에 의하여 암 대사의 교란이 일어나거나, 암 생존에 호의적이지 않은 암 미세환경을 구성하게 되어 결과적으로는 치명적인 손상을 유발시킬 수 있을 것으로 가정하였다.
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이에, 상기 암 세포의 대사과정을 교란시키기 위한 물질로서 락테이트 금속염을 선택하였다. 이는 해당과정을 통하여 포도당이 피루브산으로 전환된 후 락테이트를 형성하기 때문에, 암세포내 락테이트의 농도를 미리 축적시키면, 해당과정이 둔화 또는 정지될 것이라고 예상하였기 때문이다. 그러나, 락테이트 자체는 체내에서 쉽게 분해될 수 있어 암세포에 효과적으로 전달되기 어려우므로, 세포외 환경에서는 쉽게 분해되지 않고, 세포내로 잘 유입된 후 분해될 수 있는 락테이트 금속염을 사용하는 것이 효과적일 것으로 예상하였다.
한편, 본 발명자들은 빈번하게 다량으로 투여될 수 있는 항암제의 특성상 체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분이 포함된 락테이트 금속염을 사용할 경우에는 상기 금속성분으로 인하여 부작용이 발생할 가능성이 있음을 고려하여, 다양한 락테이트 금속염 중에서 생체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분이 포함되지 않은 나트륨락테이트, 칼륨락테이트, 칼슘락테이트 등의 락테이트 금속염을 대상으로 락테이트에 대한 결합력과 암세포로의 락테이트 전달효율이 우수한 락테이트 금속염을 선발한 결과, 칼슘락테이트가 가장 높은 수준의 락테이트에 대한 결합력을 나타낼 뿐만 아니라 암세포로의 락테이트 전달효율이 가장 우수함을 확인하고, 상기 칼슘락테이트를 최종 선발하였다.
상기 선발된 칼슘락테이트를 암세포에 투여한 결과, 락테이트, 락테이트의 대사에 영향을 미치는 LDH-B(lactate dehydrogenase B), 피루브산 및 피루브산의 대사에 영향을 미치는 PDH(pyruvate dehydrogenase) 및 α-KG(α-ketoglutarate)의 세포내 수준이 증가하고; 암성장인자인 β-catenin, 세포내 DNA 손상을 억제하는 PARP, 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 영향을 미치는 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 세포내 수준이 감소하며; 암세포의 증식수준, 전이(운동)성 및 튜브형성 수준이 감소됨을 확인하였다.
아울러, 동물모델을 사용하여 상기 칼슘락테이트의 항암활성을 검증한 결과, 동물모델에서도 칼슘락테이트의 투여에 의하여 암세포의 성장이 억제됨을 확인하였다.
뿐만 아니라, 종래의 방사선 조사와 함께 병용투여될 경우에는, 종래에 사용된 방사선의 조사량을 감소시키면서도 동등한 수준의 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한, 기존에 잘 알려진 다양한 항암제와 병용하여 관련된 암 세포주에 투여 하였을 경우에도 단독처리에 의한 항암효과에 비해 병용투여될 경우, 기존에 사용되는 항암제의 농도를 감소시키면서도 더 높은 수준의 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이러한 항암활성을 나타내는 락테이트 금속염은 대부분 생체내에서 대사될 수 있기 때문에, 이들은 부작용이 없는 것으로 알려져 있으므로, 상기 락테이트 금속염은 안전성과 우수한 항암활성을 나타내는 암치료제 또는 건강식품의 유효성분으로서 사용될 수 있으며, 이러한 락테이트 금속염의 항암효과는 종래에 전혀 공지되어 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "락테이트 금속염(lactate metallic salts)"이란, 젖산(lactic acid)에 금속이온이 결합된 형태로 생성 또는 합성될 수 있는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 락테이트 금속염은 암세포내에 투여될 경우, 락테이트가 해리되어 암세포내 락테이트의 농도를 증가시키는 수단으로 사용되는데, 본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는 락테이트 금속염은 암세포의 대사과정을 교란시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 세포외에서는 안정된 형태의 화합물을 형성하고, 암세포내에서 락테이트를 해리하여 세포내 락테이트의 농도를 증가시킬 수 있는 칼슘락테이트(calcium lactate), 아연락테이트(zinc lactate), 마그네슘락테이트(magnesium lactate), 나트륨락테이트(sodium lactate), 칼륨락테이트(potassium lactate), 철락테이트(ferrous lactate), 크롬락테이트(Chromium lactate), 구리락테이트(copper lactate), 망간락테이트(manganese lactate) 등을 각각 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 다른 예로서, 세포외에서는 안정된 형태의 화합물을 형성하고, 암세포내에서 락테이트를 해리하여 세포내 락테이트의 농도를 증가시킬 수 있으며, 체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분을 포함하지 않는 칼슘락테이트, 나트륨락테이트, 칼륨락테이트 등을 각각 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 또 다른 예로서, 세포외에서는 안정된 형태의 화합물을 형성하며, 암세포내에서 락테이트를 해리하여 세포내 락테이트의 농도를 증가시킬 수 있고, 체내에서 용이하게 대사될 수 없는 금속성분을 포함하지 않으며, 암세포에 대한 전달효율이 우수한 칼슘락테이트를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 락테이트 금속염으로서 칼슘락테이트, 나트륨락테이트 및 칼륨락테이트를 모두 합성하고, 이들이 암세포내에서 락테이트를 해리시킬 수 있음을 확인하였으며, 이중에서도 가장 락테이트 전달효율이 우수한 칼슘락테이트를 사용하여 다양한 항암활성을 검증하였다.
그러나, 상기 칼슘락테이트는 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염의 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염이 칼슘락테이트로 제한되지는 않으며, 그 외의 다양한 락테이트 금속염이 본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있음은 자명하다.
상기 락테이트 금속염은 종래의 항암제와도 병용투여할 경우, 향상된 항암활성을 나타낼 수 있는데, 이는 종래의 항암제가 암 세포의 해당과정에 관여하는 기작을 갖지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물과 병용투여될 수 있는 항암제는 암 세포의 해당과정에 직접 작용하지 않는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 공지된 항암제인 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 메토트렉세이트(Methotrexate), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib) 뿐만 아니라, 항암활성을 나타낸다고 알려진 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase)의 억제제인 5-인단 설 폰아미드(5-indane sulfonamide, IS), 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter)의 억제제인 신남산(cinnamic acid, CA) 등이 될 수 있다.
또한, 상기 락테이트 금속염은 방사선 조사시에 암세포에 방사선에 대한 내성을 부여하는 PARP, HIF-1α 및 VEGF의 발현을 감소시키므로, 방사선 조사와 병용투여할 경우에는 방사선의 항암활성을 증진시켜서, 종래보다도 방사선의 조사량을 감소시키면서도, 동등한 수준의 항암활성을 나타내도록 할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 방사선의 조사량은 특별히 이에 제한되지 않으나 1일 2 내지 10Gy가 될 수 있는데, 상기 방사선은 1일 1회 조사될 수도 있고, 상기 선량을 나누어 여러 일에 걸쳐 조사될 수도 있다.
본 발명의 용어 "칼슘락테이트(calcium lactate)"란, 젖산칼슘 또는 유산칼슘이라고도 호칭되고, 칼슘이온이 락테이트에 결합된 형태의 화학식(C6H10O6Ca·5H2O)으로 표시되는 락테이트 금속염의 일종을 의미한다. 상기 칼슘락테이트는 상온에서 백색분말 또는 입상을 나타내고, 5%(w/v)의 용해도를 나타내며, 120℃로 가열할 경우 무수물을 형성하고, 체내의 이용율과 흡수율이 우수하며, 부작용이 알려져 있지 않아, 주로 식품의 칼슘강화제 또는 산도조절제로서 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 칼슘락테이트는 본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물의 유효성분인 락테이트 금속염의 일 예로서 사용될 수 있는데, 상기 락테이트에 결합된 칼슘은 정상세포 보다는 암세포에서 더욱 이용성이 높기 때문에, 상기 칼슘락테이트는 다른 종류의 락테이트 금속염 보다도 암세포에 대한 락테이트의 전달효율이 상대적으로 우수하다는 장점이 있다.
본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물에 의하여 치료될 수 있는 암은 대사과정의 교란에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 해당과정의 교란에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암, 흑색종 등의 고형암이 될 수 있고, 다른 예로서 락테이트 금속염의 처리에 의하여 증식, 침윤, 전이 등이 억제될 수 있는 대장암, 유방암, 흑색종 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 락테이트 금속염을 합성하기 위하여, 다양한 락테이트 금속염 중에서 생체내에 유해를 미칠 수도 있는 금속을 포함하지 않는 락테이트 금속염인 칼슘락테이트, 나트륨락테이트 및 칼륨락테이트를 각각 합성하고, 결합에너지 및 암세포로의 락테이트 전달효율을 비교한 결과, 칼슘락테이트가 가장 높은 수준의 락테이트에 대한 결합력을 나타낼 뿐만 아니라 암세포로의 락테이트 전달효율이 가장 우수함을 확인하고, 상기 칼슘락테이트를 최종 선발하였다(도 1).
상기 선발된 칼슘락테이트를 암세포에 처리하면, 암세포내의 칼슘농도(도 2) 및 락테이트농도(도 3)이 증가하고, 세포내 pH가 저하됨(도 4)을 확인하였다. 또한, 유전자의 해독수준에서 암성장인자인 β-catenin의 발현이 억제되고(도 5), β-catenin과 활성화된 β-catenin 모두 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 단백질 발현 수준이 감소함(도 6)을 확인하였다. 또한, 상기 칼슘락테이트는 유방암 세포주(도 8), 대장암 세포주(도 9), 흑색종 세포주(도 10)에서 세포내 DNA 손상을 억제하는 PARP의 단백질 발현 수준을 감소시키고; 세포내 락테이트의 대사에 영향을 미치는 LDH-B(lactate dehydrogenase B)의 단백질 발현 수준(도 11), 피루브산 수준(도 12), PDH(pyruvate dehydrogenase)의 단백질 발현 수준(도 13) 및 α-KG(α-ketoglutarate) 수준(도 14)을 증가시키며; 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 영향을 미치는 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준(도 15), VEGF(vascular endothelial growth factor) 수준(도 16) 및 HUVEC의 튜브형성 수준(도 17)을 억제하고; 대장암 세포주(도 18), 유방암 세포주(도 19) 및 흑색종 세포주(도 20)의 세포이동성을 억제하며; 유방암 세포주(도 21) 및 대장암 세포주(도 22)의 세포사멸율을 증가시키고; 대장암 세포주(도 23) 및 흑색종 세포주(도 24)의 군집형성능을 억제하며; 종래의 항암제와 병용투여할 경우, 항암효율을 증가시킴(도 25)을 확인하였다.
또한, 동물모델을 사용하여 상기 칼슘락테이트의 항암활성을 시험한 결과, 마우스에 대장암 세포주를 이식하여 제작된 동물모델에서 PARP 분해활성이 증가하고(도 28), HIF-1α 및 VEGF의 발현이 억제되며(도 29 및 31), 종양의 성장이 억제되고(도 30, 32 및 34), 종양의 크기가 감소되며 혈관 형성 역시 감소되어 있음(도 33 및 35)을 확인하였다. 한편, 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용처리한 결과, 종양의 성장을 더욱 효과적으로 감소시킬 수 있음(도 37)을 확인하였다.
아울러, 다양한 암의 치료에 사용되는 각종 항암제들과 칼슘락테이트를 병용 처리한 경우에도, 상기 항암제를 단독으로 처리한 경우에 비하여, 종양의 성장을 더욱 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(도 38 내지 55).
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 암 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경구패치 등의 경구형 제형, 외용제, 외용패치제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 데포(depot), 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 경구패치제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용패치제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 락테이트 금속염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있는데, 상기 약학 조성물의 1회 투여량에 포함된 락테이트 금속염의 농도는 2.5 내지 25 mM이 될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 항암제 또는 항암활성을 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 암이 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 락테이트 금속염을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 암이 발병된 개체에 투여하여 암의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 암을 치료하는 방법에 있어서, 치료대상이 되는 암의 종류는 상술한 바와 동일하다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다.
본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 락테이트 금속염이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 락테이트 금속염과 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염은 종래의 항암제와도 병용투여할 경우, 향상된 항암활성을 나타낼 수 있는데, 이는 종래의 항암제가 암 세포의 해당과정에 관여하는 기작을 갖지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염과 공지된 항암제의 유효성분을 동시에 포함하는 항암제는 보다 효과적인 암 치료에 사용될 수 있다.
이때, 상기 락테이트 금속염, 공지된 항암제, 상기 암 치료용 약학 조성물이 적용될 수 있는 암질환, 투여량, 투여방법 등은 상술한 바와 동일하다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 전이억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염은 암 세포의 전이, 침윤, 신생혈관 형성, 튜브형성, 세포이동성, 군집형성능 등의 암세포의 전이를 유도할 수 있는 다양한 특성을 억제할 수 있으므로, 암 전이억제용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
이때, 전이억제의 대상이 되는 암은 앞서 정의한 바와 동일한데, 일 예로서, 상기 암 전이억제용 약학 조성물은 전이성 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전이암의 발병을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 제공하는 락테이트 금속염의 일종인 칼슘락테이트를 다양한 암세포에 처리하면, 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 영향을 미치는 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준(도 15), VEGF(vascular endothelial growth factor) 수준(도 16) 및 HUVEC의 튜브형성 수준(도 17)을 억제하고; 대장암 세포주(도 18), 유방암 세포주(도 19) 및 흑색종 세포주(도 20)의 세포이동성을 억제하며; 유방암 세포주(도 21) 및 대장암 세포주(도 22)의 세포사멸율을 증가시키고; 대장암 세포주(도 23) 및 흑색종 세포주(도 24)의 군집형성능을 억제함을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 락테이트 금속염을 유효성분으로 포함하는 암 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 락테이트 금속염은 대체로 생체내의 대사에 사용되어 왔고, 칼슘락테이트의 경우에는 부작용이 없다고 인정되어 공식적인 식품첨가물로서 사용되어 왔으므로, 상기 락테이트 금속염은 상식할 수 있으면서도 암의 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다. 이때, 상기 식품에 포함되는 상기 락테이트 금속염의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 다른 예로서 0.1 내지 1 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 일 예로서 100㎖를 기준으로 1 내지 10g, 다른 예로서 2 내지 7g의 비율로 포함될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
한편, 상기 락테이트 금속염을 암 개선용 식품 조성물을 이용하여 암 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 암을 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있는데, 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품 또는 국수가공식품의 형태인 건강기능성 식품으로 제조될 수 있다. 이때, 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 국수가공식품은 건면, 소면, 라면, 우동면, 냉면, 밀봉포장생면 등을 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "건강기능성 식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 암의 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 락테이트 금속염은 부작용이 없으면서도, 암의 주된 에너지 생산경로의 대사과정을 교란시켜서, 암세포의 성장을 억제하고, 사멸을 유도할 뿐만 아니라 방사선 조사에 대하여 내성을 유도하는 인자의 발현을 억제하므로, 보다 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 칼슘락테이트의 분자구조와 유사한 구조를 갖는 소듐락테이트 및 칼륨락테이트의 구조와 결합에너지를 비교한 개략도 및 도표이다.
도 2는 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 칼슘의 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다.
도 3은 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 락테이트의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 칼슘락테이트가 처리된 암세포의 내외환경에서 pH의 변화를 나타내는 그래프로서, 좌측은 세포외 환경의 pH 변화를 나타내고, 우측은 세포내 환경의 pH 변화를 나타낸다.
도 5의 상단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이고, 도 5의 하단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 총 β-catenin과 활성화된 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 7은 저산소조건에서 배양된 세포주에서, 해당과정의 초기에 작용하는 GLUT 1과 HK2의 mRNA 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 그래프 및 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 8은 사람의 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 발현되는 PARP 및 절단된 PARP의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 9는 칼슘락테이트, carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 처리한 대장암 세포주에서 PARP의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 10은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)에서 발현된 PARP 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 11은 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 LDH-B의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진(상단), 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주 자체의 형광흡광도를 나타내는 형광현미경 사진(하단좌측) 및 상기 LDH-B의 단백질 발현 수준에 따른 형광의 발색수준을 정량분석한 그래프이다.
도 12는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 피루브산의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 PDH의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진 및 상기 형광의 발색수준을 정량분석한 그래프이다.
도 14는 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 각 세포내의 α-KG의 농도변화를 나타내는 그래프이다.
도 15의 상단은 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이고, 도 15의 하단은 산소결핍조건(hypoxia)에서 0.5, 1.5 및 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 16은 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 VEGF의 mRNA 발현 수준(좌측) 및 단백질 발현 수준(우측)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 다양한 농도의 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 암 세포주의 배양상층액을 이용하여 배양된 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)에서, 상기 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 상기 HUVEC의 튜브형성 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다.
도 18은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 대장암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 19는 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 유방암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 20은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 흑색종 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 21은 유방암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 전이능력을 알 수 있는 운동성여부를 확인한 결과를 나타낸 사진(위)과 생존율의 변화를 나타내는 유세포 분석결과를 나타내는 그래프(아래)이다.
도 22는 구상체를 형성하는 대장암 줄기세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른, 구상체의 형태변화를 나타내는 현미경사진이다.
도 23은 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 대장암 세포주의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프(좌측:HCT-116, 중앙:HT-29, 우측:DLD-1)이다.
도 24는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 사람 흑색종 세포주의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 25는 칼슘락테이트와 carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 처리된 대장암 세포주의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 저부착능을 나타내는 배양용기에서 배양된 대장암 세포주의 생존율에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 27은 동물모델을 이용한 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
도 28은 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부 및 처리방법에 따른 PARP의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다.
도 29는 칼슘락테이트를 음수투여시킨 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다.
도 30은 2.5Mm 칼슘락테이트를 음수투여시킨 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 31은 칼슘락테이트를 암조직 주변에 주사한 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 사진이다.
도 32는 2.5mM 칼슘락테이트를 암조직 주변에 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 33은 동물모델에서 2.5mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다.
도 34는 25mM 칼슘락테이트를 목덜미 주변 피하에 직접 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 35는 동물모델에서 25mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다.
도 36은 동물모델을 이용한 방사선 조사 및 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
도 37a는 HT-29 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 37b는 HCT-116 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 38은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 39는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 40은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 41은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 42는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 43은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 44는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 제피티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 45는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 소라페닙을 사람 간암 세포주(Hep3B)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 46은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 이리노테칸을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 47은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 에를로티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 48은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 서니티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 49는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 5, 10 및 20nM 농도의 메토트렉세이트를 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 50은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 카보플라틴을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 51은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.6, 1.3 및 2.5nM 농도의 도세탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 52는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2, 4 및 8μM 농도의 라파티닙을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 53은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.3, 0.5 및 1nM 농도의 에버롤리무스를 사람 신장암 세포주(Caki-1)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 54는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.23, 0.45 및 1.8ug/ml 농도의 트라스트주맵을 트라스트주맵에 강한 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
도 55는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 옥살리플라틴을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락테이트 금속염의 제작
칼슘 카보네이트, 나트륨 카보네이트 또는 칼륨 카보네이트와, 락테이트를 반응시켜서 각각의 락테이트 금속염(칼슘락테이트, 나트륨락테이트 또는 칼륨락테이트)용액을 수득하고, 이들 각각을 여과, 건조 및 분쇄하여 분말상의 락테이트 금속염(칼슘락테이트, 나트륨락테이트 또는 칼륨락테이트)을 수득하였다. 이어, 상기 수득한 각각의 락테이트 금속염(칼슘락테이트, 나트륨락테이트 또는 칼륨락테이트)의 구조와 결합에너지를 분석하였다(도 1).
도 1은 칼슘락테이트의 분자구조와 유사한 구조를 갖는 소듐락테이트 및 칼륨락테이트의 구조와 결합에너지를 비교한 개략도 및 도표이다. 도 1에서 보듯이, 칼슘락테이트는 나트륨락테이트 및 칼륨락테이트에 비하여 상대적으로 높은 수준의 결합에너지를 나타냄을 확인하였다.
이하에서는 상대적으로 높은 수준의 결합에너지를 나타내는 칼슘락테이트를 사용하여 실험을 수행하였다.
실시예 2: 종양 미세환경에 미치는 칼슘락테이트의 효과
칼슘락테이트를 암 세포에 처리한 후, 세포내 칼슘의 농도변화, 락테이트의 농도변화 및 pH 변화를 분석하여, 칼슘락테이트의 유입수준을 예측하였다.
실시예 2-1: 칼슘수준의 변화
암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 5 x 105 세포수의 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 각각 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 암세포에 10μM의 Fluo-3/AM 칼슘 염색약 및 25% Pluronic F-127을 처리하고 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 형광프로브를 가하고, 공초점 현미경으로 촬영하였다(도 2). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않은 암세포를 사용하였다.
도 2는 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 칼슘의 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다. 도 2에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리한 암세포 내에서 칼슘의 농도가 증가함을 확인하였다.
실시예 2-2: 락테이트수준의 변화
상기 실시예 2-1에서 배양된 세포를 다시 3mM(low) 또는 11mM(normal) 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양하고, 배양이 종료된 세포에 초음파를 처리하여 파쇄하였으며, 상기 파쇄물에 포함된 락테이트의 농도를 락테이트 분석 키트(AbCam, Cambridge, MA)를 이용하여 측정하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않은 암세포를 사용하였다.
도 3은 칼슘락테이트(CaLa)의 처리여부에 따른, 암 세포내 락테이트의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 배지에 포함된 글루코즈의 농도에 상관없이 칼슘락테이트를 처리한 암세포 내에서 락테이트의 농도가 증가하였고, 이는 고농도의 글루코즈를 포함하는 배지에서 배양할 경우 더욱 명확하게 나타남을 확인하였다.
실시예 2-3: 암세포 내외환경에서 pH 의 변화
상기 도 2 및 3의 결과로부터, 암세포에 칼슘락테이트를 처리할 경우, 상기 칼슘락테이트가 암세포내로 유입됨을 확인하였으므로, 상기 유입된 칼슘락테이트에 의하여 암세포의 내외환경의 pH가 변화되는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 배양된 세포를 대상으로, 세포외 pH는 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 세포의 배지를 대상으로, pH 측정장치를 이용하여 측정하고, 세포내 pH는 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 세포를 대상으로, pH 탐지 키트(life technologies, CA)를 이용하여 측정하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않은 암세포를 사용하였다.
도 4는 칼슘락테이트가 처리된 암세포의 내외환경에서 pH의 변화를 나타내는 그래프로서, 좌측은 세포외 환경의 pH 변화를 나타내고, 우측은 세포내 환경의 pH 변화를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 경우, 세포외 배지의 pH는 변화되지 않았으나, 세포내 pH는 저하되어 산성을 나타냄을 확인하였다. 상기 도 4의 좌측그래프에서 보듯이, 칼슘락테이트 자체는 암 세포 외부의 pH를 변화시키지 않았으나, 상기 칼슘락테이트가 암세포내부로 유입된 경우에는 pH를 저하시켰으므로, 상기 칼슘락테이트의 유입으로 인하여 암세포내 환경이 산성으로 변화되었음을 알 수 있었다.
실시예 3: 암 성장인자의 발현에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 2의 결과로부터, 칼슘락테이트가 암세포의 내부환경을 변화시킬 수 있음을 확인하였으므로, 이러한 변화로 인하여 암세포의 성장이 변화되는지의 여부를 확인하기 위하여, 대장암 또는 유방암 세포주에서 칼슘락테이트의 처리에 따른 암성장인자의 하나인 β-catenin의 발현 수준의 변화를 유전자 및 단백질 발현 수준에서 확인하였다.
실시예 3-1: 대장암 세포주에서 β- catenin 의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이 트의 효과
사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)를 대상으로 0, 1.5 또는 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하여, 배양된 각각의 암세포를 수득한 다음, 이에 포함된 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준에서 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 β-catenin의 발현 수준을 비교하였다.
먼저, mRNA 발현 수준을 비교하기 위하여, 상기 각 암세포를 RNeasy® mini 키트를 사용하여 총 RNA를 추출한 후, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 β-catenin 유전자를 수득한 다음, 이의 수준을 전기영동을 통해 비교하였다(도 5의 상단). 이때, 내부대조군으로는 액틴을 사용하였다.
β-catenin F: 5'-AAAATGGCAGTGCGTTTAG-3'(서열번호 1)
β-catenin R: 5'-TTTGAAGGCAGTCTGTCGTA-3'(서열번호 2)
ACTIN F: 5'-AAC-TGGAACGGTGAAGGT-3'(서열번호 3)
ACTIN R: 5'-CCTGTAACAACGCATCTCAT-3'(서열번호 4)
도 5의 상단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 5의 상단에서 보듯이, β-catenin의 mRNA 발현 수준에서는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 차이가 나타나지 않았다.
다음으로, 단백질 발현 수준을 비교하기 위하여, 상기 각 암세포를 파쇄하고, 이를 전기영동한 다음, 1차 항체로 항-β-catenin 항체를 사용하고, 2차 항체로 항-토끼 IgG 결합체를 사용하며, 분석프로그램으로 Image-J 프로그램을 사용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 5의 하단). 이때, 내부대조군으로는 액틴을 사용하였다.
도 5의 하단은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)에서 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 5의 하단에서 보듯이, β-catenin의 mRNA 발현 수준과는 달리 단백질 발현 수준에서는 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 β-catenin 단백질 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
따라서, 암세포에 유입된 칼슘락테이트는 암세포의 내부환경을 변화시키고, 이로 인하여 유전자의 해독수준에서 암성장인자인 β-catenin의 발현이 억제됨을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 유방암 세포주에서 β- catenin 의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 사람의 유방암 세포주(MCF-7) 및 다른 암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지)37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 사람의 유방암 세포주(MDA-MB-231)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 수행하여, 단백질 발현 수준에서 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 β-catenin과 활성화된 β-catenin의 발현 수준을 비교하였다(도 6).
도 6은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 총 β-catenin과 활성화된 β-catenin의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6에서 보듯이, β-catenin과 활성화된 β-catenin 모두 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 단백질 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 4: 암 영양학( energetics )에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 2를 통해 암 세포주에 칼슘락테이트를 처리하면, 암 세포주 내의 락테이트의 농도가 증가함을 확인하였으므로, 상기 증가된 락테이트로 인하여 락테이트를 합성하는 해당과정에 변화가 발생하는 지의 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)를 정상 산소조건(normoxia) 또는 저산소조건(hypoxia)에서 배양하고, 상기 저산소조건에서 배양된 세포주에 칼슘락테이트를 처리한 다음, 이들 배양된 각 세포주에서 발현되는 GLUT 1과 HK2의 발현 수준을 mRNA 발현 수준 및 단백질 발현 수준에서 비교하였다(도 7).
도 7은 저산소조건에서 배양된 세포주에서, 해당과정의 초기에 작용하는 GLUT 1과 HK2의 mRNA 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 그래프 및 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 7에서 보듯이, 저산소조건에서는 해당과정의 초기에 작용하는 GLUT 1과 HK2의 발현 수준이 증가되어 해당과정이 활성화되지만, 이러한 활성화된 해당과정은 칼슘락테이트의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.
실시예 5: 칼슘락테이트에 의한 암 유전자의 안정화 분석
칼슘락테이트의 처리에 의하여 유전자 손상 시 복구의 염기 절제 경로의 일부로 DNA의 무결성의 유지에 중요한 역할을 하고 있는 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 발현 수준이 변화되는 지의 여부를 확인하였다.
실시예 5-1: 유방암 세포주에서 PARP 의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람의 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)를 0, 2.5 또는 5.0mM의 칼슘락테이트를 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하여, 배양된 각각의 암세포를 수득한 다음, 이에 포함된 PARP의 단백질 발현 수준에서 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 발현 수준의 변화를 분석하였다(도 8). 이때, 상기 발현 수준의 변화는 1차 항체로 항-PARP 항체를 사용하고, 2차 항체로 항-토끼 IgG 결합체를 사용하며, 분석프로그램으로 Image-J 프로그램을 사용한 웨스턴 블럿 분석을 통해 분석하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 8은 사람의 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 발현되는 PARP 및 절단된 PARP의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 8에서 보듯이, 칼슘락테이트의 처리농도가 증가할 수록 각 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB-231)에서 PARP의 단백질 발현 수준이 감소되고, 특히, MCF-7 세포주에서는 절단된 PARP의 단백질 발현 수준이 증가됨을 확인하였다. 이는 칼슘락테이트가 단순히 암세포주에서 해당과정을 중지시키는 수준으로 영향을 미치는 것이 아니라, 상기 해당과정을 중지시켜서 암세포에 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 역할을 수행할 수 있으므로, 항암제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 대장암 세포주에서 PARP 의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람의 대장암 세포주(HCT-116)에 5mM의 칼슘락테이트, carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 24시간 동안 처리한 다음, 상기 대장암 세포주에서 발현되는 PARP의 단백질 발현 수준을 비교하였다(도 9). 이때, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 암세포주를 사용하였다.
도 9는 칼슘락테이트, carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 처리한 대장암 세포주에서 PARP의 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 9에서 보듯이, 상기 물질을 단독으로 처리할 경우에는 칼슘락테이트를 처리한 경우에만, PARP 단백질 발현 수준이 감소하였으나, 이들을 조합하여 처리하면, 칼슘락테이트를 처리하지 않을 경우에도 PARP 단백질 발현 수준이 감소하였고, 칼슘락테이트와 조합하여 처리할 경우에는 PARP 단백질이 더욱 낮은 수준을 나타내며, 상기 3가지 물질을 조합하여 처리하면, 세포내에서 PARP 단백질이 검출되지 않음을 확인하였다.
실시예 5-3: 흑색종 세포주에서 PARP 의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
암세포 배양배지(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양된 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)에 각각 0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 10mM의 칼슘락테이트를 12시간 동안 처리하고, 상기 흑색종 세포주에서 발현되는 PARP의 단백질 발현 수준을 비교하였다(도 10).
도 10은 다양한 농도의 칼슘락테이트가 처리된 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)에서 발현된 PARP 단백질 발현 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 10에서 보듯이, 흑색종 세포주 역시 칼슘락테이트의 처리농도가 증가하면, PARP의 단백질 발현 수준이 감소함을 확인하였다.
실시예 6: 암 세포내 락테이트 관련 대사과정에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 2 및 4의 결과로부터, 암 세포주에 칼슘락테이트가 유입되면, 세포내 락테이트의 농도가 증가하고, 해당과정을 통한 에너지 공급이 정상적으로 수행되지 않을 수 있음을 확인하였다.
이에, 상기 칼슘락테이트의 처리로 인하여 락테이트의 세포내 대사에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 6-1: LDH -B( lactate dehydrogenase B)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘 락테이트의 효과
락테이트를 피루브산으로 전환시키는 효소인 LDH-B(lactate dehydrogenase B)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양하였다. 상기 배양된 암 세포주에 4%의 파라포름알데히드를 처리하여 고정하고, 항-토끼 LDHB 항체를 15 시간 동안 처리하였다. 이어, PBS로 세척하고, 비오틴이 결합 된 2차 항체를 처리한 다음, 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, FITC와 결합된 스트렙타비딘을 처리하여, 형광염색을 수행한 다음, 형광현미경으로 촬영하였다(도 11). 이때, 대조군으로는 정상 산소공급조건의 암세포주(N-control) 또는 산소결핍조건의 암세포주(H-control)를 사용하였고, 각 세포의 핵은 DAPI를 이용하여 염색하였으며, 촬영된 사진은 Xenogen In Vivo Imaging System 100 시리즈 및 Living imaging 소프트웨어(Xenogen사)를 사용하여 분석하였다.
도 11은 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 LDH-B의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진(상단), 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주 자체의 형광흡광도를 나타내는 형광현미경 사진(하단좌측) 및 상기 LDH-B의 단백질 발현 수준에 따른 형광의 발색수준을 정량분석한 그래프이다. 도 11에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 세포에서는 LDH-B의 단백질 발현 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
실시예 6-2: 피루브산의 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6-1의 결과로부터, 암 세포내 LDH-B의 단백질 발현 수준이 칼슘락테이트의 처리에 의하여 증가함을 확인하였으므로, 상기 LDH-B에 의해 생성되는 피루브산의 세포내 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 5 x 105 세포수의 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 24시간동안 처리하고, 초음파를 처리하여 세포를 파쇄하고, 10 kDa 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 수득한 여과액을 피루브산 분석 키트(Abcam, Cambridge, MA)에 적용하여, 상기 여과액에 포함된 피루브산의 농도를 측정하였다(도 12).
도 12는 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 피루브산의 농도변화를 나타내는 그래프이다. 도 12에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 세포에서는 피루브산의 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
실시예 6-3: PDH ( pyruvate dehydrogenase )의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테 이트의 효과
상기 실시예 6-2의 결과로부터, 암 세포내 피루브산 수준이 칼슘락테이트의 처리에 의하여 증가함을 확인하였으므로, 상기 피루브산을 TCA 회로로 전이시키는 효소인 PDH(pyruvate dehydrogenase)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 항-토끼 LDHB 항체 대신에 항-토끼 PDH 항체를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 6-1의 방법을 수행하여, 칼슘락테이트가 처리된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 PDH 단백질 발현 수준을 측정하였다(도 13).
도 13은 칼슘락테이트의 처리에 따른 암 세포주내의 PDH의 단백질 발현 수준의 변화를 나타내는 형광현미경 사진 및 상기 형광의 발색수준을 정량분석한 그래프이다. 도 13에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리된 세포에서는 PDH의 단백질 발현 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
실시예 6-4: α- KG (α- ketoglutarate )의 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6-3의 결과로부터, 암 세포내 PDH 단백질 발현 수준이 칼슘락테이트의 처리에 의하여 증가함을 확인하였으므로, 상기 PDH 단백질에 의하여 활성화되는 TCA 회로에서 생성되는 α-KG(α-ketoglutarate)의 세포내 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다. 이때, 상기 α-KG는 배지내 글루타민에 의하여 합성될 수도 있기 때문에, 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주를 대상으로 하였다.
즉, 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 5 x 105 세포수의 암 세포주에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 24시간 동안 처리한 다음, 초음파를 처리하여 세포를 파쇄하고, 10 kDa 필터로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 수득한 여과액을 α-Ketoglutarate 분석 키트(BioVision, Exton, PA)에 적용하여, 상기 여과액에 포함된 α-KG의 농도를 측정하였다(도 14).
도 14는 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주에 칼슘락테이트의 처리함에 따른 각 세포내의 α-KG의 농도변화를 나타내는 그래프이다. 도 14에서 보듯이, 정상배지 또는 글루타민이 결여된 배지에서 배양된 암 세포주 모두에서 칼슘락테이트를 처리하면, 이들 세포내 α-KG의 수준이 급격하게 증가함을 확인하였다.
상기 실시예 6-1 내지 6-4의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트가 처리된 암세포에서는 락테이트를 피루브산을 전환시키는 LDH-B, 상기 LDH-B에 의해 생성되는 피루브산, 상기 피루브산을 TCA 회로로 전이시키는 PDH(pyruvate dehydrogenase) 및 상기 PDH 단백질에 의하여 활성화되는 TCA 회로에서 생성되는 α-KG의 수준이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 7: 암 세포의 전이(metastasis), 침윤(invasion) 및 신생혈관 형성(angiogenesis) 인자의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 6의 결과로부터 칼슘락테이트가 처리된 암세포에서는 α-KG의 수준이 증가함을 알 수 있었으므로, 상기 α-KG에 의해 단백질의 발현 수준이 조절되는 암 세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 미치는 인자의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 7-1: HIF -1α( hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
암세포의 전이인자로 알려진 HIF-1α(hypoxia inducible factor 1α)의 단백질 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)를 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 각 암 세포주를 대상으로, 항-HIF-1α 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 15의 상단).
도 15의 상단은 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 15의 상단에서 보듯이, HIF-1α는 산소결핍조건(hypoxia)에서 발현되지만, 이러한 산소결핍조건에서도 칼슘락테이트가 처리되면 발현되지 않음을 확인하였다.
이에, 산소결핍조건(hypoxia)에서 상기 칼슘락테이트를 다양한 농도(0.5, 1.5 및 2.5mM)로 처리하면서 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)를 배양할 경우, 암세포의 핵에서 HIF-1α의 발현 수준의 변화를 측정하였다(도 15의 하단).
도 15의 하단은 산소결핍조건(hypoxia)에서 0.5, 1.5 및 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 HIF-1α 단백질 발현 수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 15의 하단에서 보듯이, 상기 칼슘락테이트는 농도의존적으로 HIF-1α의 발현 수준을 억제함을 확인하였다.
실시예 7-2: VEGF ( vascular endothelial growth factor )의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과
상기 실시예 7-1의 결과로부터 칼슘락테이트는 농도의존적으로 HIF-1α의 발현 수준을 억제함을 확인하였으므로, 상기 HIF-1α에 의하여 발현이 조절되는 암세포 침윤인자로 알려진 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 발현 수준에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 산소결핍조건(hypoxia)에서 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하고 24시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 각 암 세포주를 대상으로, VEGF mRNA 발현 수준 및 단백질 발현 수준을 분석하였다(도 16). 이때, 대조군으로는 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 칼슘락테이트를 처리하지 않고 배양된 사람 대장암 세포주를 사용하였다.
도 16은 정상 산소공급조건(normoxia) 또는 산소결핍조건(hypoxia)에서 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않고 24시간동안 배양된 사람 대장암 세포주(HCT-116 및 HT-29)에서 발현되는 VEGF의 mRNA 발현 수준(좌측) 및 단백질 발현 수준(우측)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 16에서 보듯이, 산소결핍조건(hypoxia)에서는 VEGF의 수준이 급격히 증가하였으나, 이에 칼슘락테이트를 처리하면, 증가된 VEGF의 수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 7-3: 사람의 혈관 내피세포( HUVEC )의 튜브형성( tube formation )을 유발시키는 암세포 유래 인자에 미치는 칼슘락테이트의 효과
신생혈관 형성능에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하기 위하여, 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)의 튜브형성능을 유발시킬 수 있는 암세포에서 분비되는 인자에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 1%의 FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양된 암 세포주에 0.5, 1, 1.5 및 2.5mM의 칼슘락테이트를 24시간 동안 처리하면서 배양하고, 이로부터 각각의 배양상층액을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 배양상층액에 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)를 접종하고 배양하면서, 세포의 형태변화를 분석하였다(도 17). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않고 배양된 암세포주의 배양액을 이용하여 배양된 HUVEC를 사용하고, 비교군으로는 HUVEC의 성장 억제제인 설포라판(Sulforaphane)을 처리하여 배양된 HUVEC를 사용하였다.
도 17은 다양한 농도의 칼슘락테이트를 처리하여 배양된 암 세포주의 배양상층액을 이용하여 배양된 사람의 혈관 내피세포(HUVEC)에서, 상기 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 상기 HUVEC의 튜브형성 수준을 비교한 결과를 나타내는 형광사진이다. 도 17에서 보듯이, 우수한 튜브형성능을 나타내는 대조군에 비하여, 칼슘락테이트가 처리된 암 세포주의 배양상층액을 사용하여 배양된 HUVEC는 칼슘락테이트의 농도가 증가함에 따라 튜브형성능이 감소하며, 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리한 암세포주의 배양상층액에서 배양된 HUVEC는 설포라판을 처리한 비교군과 유사한 수준으로 튜브형성능이 감소됨을 확인하였다. 상기 HUVEC는 암세포에서 분비되는 인자에 의하여 혈관형성이 유도되므로, 상기 칼슘락테이트는 혈관형성을 유도하는 인자의 작용을 농도의존적으로 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 실시예 7-1 내지 7-3의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 암세포의 전이인자로 알려진 HIF-1α 및 암세포 침윤인자로 알려진 VEGF의 발현을 억제하고, 혈관신생을 유도하는 인자의 작용을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 8: 암 세포주의 전이( metastasis ) 및 침윤( invasion )에 미치는 칼슘 락테이트의 효과
상기 실시예 7의 결과로부터, 칼슘락테이트는 암세포의 전이인자로 알려진 HIF-1α 및 암세포 침윤인자로 알려진 VEGF의 발현을 억제하고, 혈관신생을 유도하는 인자의 작용을 억제하는 효과를 확인하였으므로, 실제로 암세포의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 암세포의 이동능력 분석을 통하여 확인하고자 하였다.
실시예 8-1: 대장암 세포주의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과
중간에 500㎛ 두께의 ibidi culture insert가 삽입된 형태의 배양용기에 4 x 105 세포수의 대장암 세포주 HCT-116을 접종하여 배양하면서, 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리한 다음 다시 24시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 insert를 제거하고, 12시간 동안 추가로 배양하면서, 상기 insert가 제거된 부위로 암세포가 이동하는 수준을 JuLi Br, Live cell analyzer(NanoEnTek Inc, South Korea)를 사용하여 분석하였다(도 18). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않고 배양한 대장암 세포주를 사용하였다.
도 18은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 대장암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 18에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리한 대장암 세포주는 세포의 전이능력이 감소하였으나, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군의 대장암 세포주는 세포의 전이능력이 유지됨을 확인하였다.
실시예 8-2: 유방암 세포주의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과
대장암 세포주 대신에 유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB231)를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 8-1과 동일한 방법을 수행하여, 유방암 세포주의 이동성에 대한 칼슘락테이트의 효과를 확인하였다(도 19).
도 19는 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 유방암 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 19에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군의 유방암 세포주에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 유방암 세포주는 상대적으로 낮은 수준의 세포주 전이능력을 나타냄을 확인하였다.
실시예 8-3: 흑색종 세포주의 전이 및 침윤에 미치는 칼슘락테이트의 효과
대장암 세포주 대신에 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)를 사용하고, insert 제거후 24시간 동안 추가로 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 8-1과 동일한 방법을 수행하여, 흑색종 세포주의 이동성에 대한 칼슘락테이트의 효과를 확인하였다(도 20).
도 20은 칼슘락테이트의 처리여부에 따른, 흑색종 세포주의 전이능력을 알 수 있는 운동성 여부를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 20에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군의 흑색종 세포주에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 흑색종 세포주는 상대적으로 낮은 수준의 세포주 전이능력을 나타냄을 확인하였다.
상기 실시예 8-1 내지 8-3의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 대장암, 유방암, 흑색종 등의 모든 암세포의 세포 전이능력을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9: 암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트의 효과
유방암 세포주, 대장암 세포주 및 흑색종 세포주의 생존능력에 대한 칼슘락테이트의 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 9-1: 유방암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트의 효과
유방암 세포주(MCF-7 및 MDA-MB231)에 2.5mM의 칼슘락테이트를 처리하거나 또는 처리하지 않은 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이전의 각 유방암 세포주와 배양이 종료된 각 유방암 세포주에 5㎕의 FITC Annexin V와 5㎕의 PI를 처리하고 15분 동안 실온에서 반응시킨 다음, FACS Calibur(BD Bioscience, USA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하여, 이들의 염색수준을 평가함으로써, 암세포의 사멸율을 측정하였다(도 21).
도 21은 유방암 세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른 전이능력을 알 수 있는 운동성여부를 확인한 결과를 나타낸 사진(위)과 생존율의 변화를 나타내는 유세포 분석결과를 나타내는 그래프(아래)이다. 도 21에서 보듯이, MCF-7 세포주는 칼슘락테이트를 처리하기 전에는 9.63%의 세포사멸율을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 이후에는 33.8%의 세포사멸율을 나타내었고, MDA-MB231 세포주는 칼슘락테이트를 처리하기 전에는 10.17%의 세포사멸율을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 이후에는 13.05%의 세포사멸율을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 상기 유방암 세포주에 칼슘락테이트를 처리하면, 세포사멸율이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 9-2: 대장암 줄기세포주의 형태변화에 미치는 칼슘락테이트의 효과
사람 대장암 줄기세포주를 줄기세포 배양배지(1% 페니실린/스트렙토마이신 및 50배의 B27을 포함하고, DMEM 배지와 F12 배지가 1:1로 혼합된 배지)에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양하였다. 상기 배양된 대장암 줄기세포주에 칼슘락테이트를 처리하고 줄기세포가 형성하는 구상체(sphere)의 형태가 변화되는지의 여부를 확인하였다(도 22). 이때, 대조군으로는 칼슘락테이트를 처리하지 않고, DMSO를 처리한 것을 사용하였다.
도 22는 구상체를 형성하는 대장암 줄기세포주에 칼슘락테이트를 처리함에 따른, 구상체의 형태변화를 나타내는 현미경사진이다. 도 22에서 보듯이, 칼슘락테이트가 처리되지 않은 대조군에서는 구상체가 유지되었으나, 칼슘락테이트를 처리하면 구상체의 형태가 파괴되어 대장암 줄기세포의 생존능이 감소됨을 확인하였다.
실시예 9-3: 암 세포주의 군집형성능에 미치는 칼슘락테이트의 효과
먼저, 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)를 다양한 농도(0, 0.5, 1.5 또는 2.5 mM)의 칼슘락테이트를 포함하는 고체배지에 접종하여 10일 동안 배양하고, 배양이 종료된 후, 세포를 고정시킨 다음, 헤마톡실린으로 염색하여 군집이 형성된 암세포의 수를 계수하였다(도 23).
도 23은 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 대장암 세포주의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프(좌측:HCT-116, 중앙:HT-29, 우측:DLD-1)이다. 도 23에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 모든 대장암 세포주는 260 내지 360개의 군집을 형성하였으나, 칼슘락테이트의 처리농도가 증가함에 따라 군집의 수가 감소하였고, 2.5 mM의 칼슘락테이트를 처리한 경우에는 100 내지 120개의 군집을 형성함을 확인하였다.
다음으로, 사람 흑색종 세포주(SKMEL-02 및 SKMEL-28)를 다양한 농도(1, 2.5 또는 5 mM)의 칼슘락테이트를 포함하는 고체배지에 접종하여 배양하는 것을 제외하고는, 상기와 동일한 방법을 수행하여, 군집이 형성된 암세포의 수를 계수하였다(도 24).
도 24는 칼슘락테이트의 처리농도에 따른 사람 흑색종 세포주의 군집형성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다. 도 24에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 사람 흑색종 세포주는 105 내지 168개의 군집을 형성하였으나, 칼슘락테이트의 처리농도가 증가함에 따라 군집의 수가 감소하였고, 5 mM의 칼슘락테이트를 처리한 KMEL-28 세포주에서는 군집이 아예 소멸하였으며, 5 mM의 칼슘락테이트를 처리한 SKMEL-02 세포주에서는 약 49개의 적은 군집을 형성하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 대장암 및 흑색종세포주의 군집형성능을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 9-4: 암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테이트와 항암활성을 나타내는 물질을 조합처리한 효과
5mM의 칼슘락테이트 또는 항암활성을 나타낸다고 알려진 물질(1mM의 IS(5-indane sulfonamide) 또는 5mM CA(cinnamic acid))을 각각 개별적으로 또는 조합하여 포함하는 고체배지를 각각 제작하고, 상기 제작된 각 고체배지에 사람 대장암 세포주인 HCT-116을 접종하고 10일 동안 배양한 다음, 세포의 생존율을 비교하였다(도 25).
도 25는 칼슘락테이트와 carbonic anhydrase의 억제제인 5-indane sulfornamide(IS) 또는 락테이트의 이동경로인 MCT-4의 억제제인 cinnamic acid(CA)를 개별적으로 또는 조합하여 처리된 대장암 세포주의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 25에서 보듯이, 칼슘락테이트 또는 항암활성을 나타낸다고 알려진 물질(IS 또는 CA)을 개별적으로 처리한 대장암 세포주는 그의 생존율이 약 60% 수준으로 감소하였고, 상기 칼슘락테이트 및 항암활성을 나타낸다고 알려진 물질을 조합하여 처리한 대장암 세포주는 그의 생존율이 약 10 내지 30% 수준으로 더욱 감소됨을 확인하였다.
실시예 9-5: 세포부착능이 감소된 암 세포주의 생존능력에 미치는 칼슘락테 이트의 효과
저부착능을 나타내는 6웰 플레이트에 사람 대장암 세포주(HCT-116, HT-29 및 DLD-1)를 접종하여 배양하면서, 다양한 농도(0, 1.5 또는 2.5 mM)의 칼슘락테이트를 처리한 다음, 세포의 생존율을 비교하였다(도 26).
도 26은 저부착능을 나타내는 배양용기에서 배양된 대장암 세포주의 생존율에 미치는 칼슘락테이트의 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 26에서 보듯이, 저부착능을 나타내는 배양용기에 배양할 경우에도 칼슘락테이트를 처리하지 않으면, 세포사멸율이 매우 낮은 수준(약 5%)을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리하면, 세포사멸율이 급격히 증가됨(약 90%)을 확인하였다.
상기 실시예 9-1 내지 9-5의 결과를 종합하면, 칼슘락테이트는 대장암, 흑색종 등의 모든 암세포의 생존율을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 10: 동물모델을 이용한 칼슘락테이트의 항암효과 검증
실시예 10-1: 동물모델을 이용한 실험군의 설정
RPMI1640 배지에서 배양한 다음, PBS에 희석시킨 대장암 세포(HT-29)를 Balb/c 종의 마우스의 옆구리 피하에 이식하고, 상기 마우스에서 약 5mm가 되도록 대장암 세포가 성장할 때까지 사육한 다음, 30일 동안 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군(control); 2.5mM의 칼슘락테이트를 음수투여한 실험군 1(peroral, P.O); 종양부위에 2.5mM의 칼슘락테이트를 주사한 실험군 2(intra tumor, I.T) 및 25Mm의 칼슘락테이트를 피하주사한 실험군 3(subcutaneous, S.C)을 각각 설정하였다(도 27).
도 27은 동물모델을 이용한 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
실시예 10-2: PARP 의 발현 수준 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군, 실험군 1 또는 실험군 2의 마우스로부터 각각의 대장암조직을 적출하고, 이로부터 발현된 암 유전자의 안정화에 기여하는 PARP 및 절단된 PARP의 발현 수준을 비교하였다(도 28).
도 28은 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부 및 처리방법에 따른 PARP의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다. 도 28에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 서로 다른 방법으로 칼슘락테이트를 처리한 실험군에서는 PARP의 분해활성이 증가함을 확인하였다.
실시예 10-3: 칼슘락테이트를 음수투여시킨 동물모델에서 HIF-1α 및 VEGF의 발현 수준 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 1의 마우스로부터 각각의 대장암조직을 적출하고, 이로부터 발현된 종양의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 관여하는 HIF-1α와 VEGF의 발현 수준을 비교하였다(도 29). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 29는 칼슘락테이트를 음수투여시킨 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 사진이다. 도 29에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 1에서는 HIF-1α 및 VEGF의 발현이 억제됨을 확인하였다.
실시예 10-4: 칼슘락테이트를 음수투여시킨 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 1의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 30).
도 30은 2.5Mm 칼슘락테이트를 음수투여시킨 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 30에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군은 최종적으로 종양부피가 약 1200 ㎣ x 103을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 1은 최종적으로 종양부피가 약 480 ㎣ x 103을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 칼슘락테이트는 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-5: 칼슘락테이트를 주사한 동물모델에서 HIF - 1α 및 VEGF의 발현 수준 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 2의 마우스로부터 각각의 대장암조직을 적출하고, 이로부터 발현된 종양의 전이, 침윤 및 신생혈관 형성에 관여하는 HIF-1α와 VEGF의 발현 수준을 비교하였다(도 31). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 31은 칼슘락테이트를 암조직 주변에 주사한 동물모델의 종양조직에서 추출된 단백질에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 HIF-1α 또는 GAPDH의 발현 수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 사진이다. 도 31에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 2에서는 HIF-1α 및 VEGF의 발현이 억제됨을 확인하였다.
실시예 10-6: 칼슘락테이트를 주사한 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 2의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 32).
도 32는 2.5mM 칼슘락테이트를 암조직에 직접 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 32에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군은 최종적으로 종양부피가 약 1200 ㎣ x 103을 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 2는 최종적으로 종양부피가 약 490 ㎣ x 103을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 칼슘락테이트는 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-7: 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 2의 마우스에서 형성된 종양조직의 형태를 비교하였다(도 33).
도 33은 동물모델에서 2.5mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다. 도 33에서 보듯이, 2.5mM 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에서 촬영된 종양은 그의 크기가 훨씬 크며 종양 표면에 혈관 형성이 증가되어 있고, 실험군에서 촬영된 종양은 그의 크기가 매우 감소되어 있으며 혈관 형성 역시 감소되어 있음을 확인하였다.
실시예 10-8: 칼슘락테이트를 피하 주사한 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 3의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 34).
도 34는 25mM 칼슘락테이트를 목덜미 주변 피하에 직접 주사한 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리여부에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 34에서 보듯이, 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군은 최종적으로 종양부피가 약 2,300㎣를 나타내었으나, 칼슘락테이트를 처리한 실험군 3은 최종적으로 종양부피가 약 80㎣를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 25mM 칼슘락테이트는 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-9: 동물모델에서 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화
상기 실시예 10-1에서 설정된 대조군 또는 실험군 3의 마우스에서 형성된 종양 조직의 형태를 비교하였다(도 35).
도 35는 동물모델에서 25mM 칼슘락테이트의 처리에 따른 종양형태의 변화를 나타내는 사진이다. 도 35에서 보듯이, 25 mM 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군에서 촬영 된 종양은 그의 크기가 훨씬 크며 종양 표면에 혈관 형성이 증가되어 있고, 실험군 3에서 촬영된 종양은 그의 크기가 매우 감소되어 있으며 혈관 형성 역시 감소되어 있음을 확인하였다.
따라서, 상기 실시예 10-1 내지 10-9의 결과를 종합하면, 동물모델에서 2.5mM 내지 25mM 농도의 칼슘락테이트가 우수한 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 11: 방사선 조사와 칼슘락테이트의 병용투여를 통한 대장암 치료효과
상기 실시예 10-2, 10-3 및 10-5에서 칼슘락테이트의 처리에 따라 PARP, HIF-1α 및 VEGF의 발현이 감소함을 확인하였는데, 상기 인자는 방사선 치료에 대한 저항성을 부여하는 특성을 나타내므로, 상기 인자가 칼슘락테이트에 의해 감소될 경우, 방사선 치료에 대한 효율이 증가될 것으로 예상하고, 이를 검증하였다.
실시예 11-1: 동물모델을 이용한 실험군의 설정
마우스의 옆구리 피하에 대장암 세포(HT-29 또는 HCT-116)를 이식하고, 상기 각 마우스에서 약 5mm의 크기로 대장암세포가 성장할 때까지 사육한 다음, 30일 동안 칼슘락테이트를 처리하지 않은 대조군(control); 2.5mM의 칼슘락테이트를 주사한 실험군 11(intra tumor, I.T), 2.0 mm 알루미늄 필터를 장착 한 X-RAD 320 X-ray 조사기(300 kVp)를 사용하여 2Gy의 방사선을 5회 조사한 실험군 12(IR) 또는 2Gy의 방사선을 5회 조사함과 동시에 2.5mM의 칼슘락테이트를 주사한 실험군 13(CaLa+IR)을 각각 설정하였다(도 36).
도 36은 동물모델을 이용한 방사선 조사 및 칼슘락테이트의 실험일정을 도식적으로 나타낸 개략도이다.
실시예 11-2: 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용처리한 동물모델에서 종양크기의 변화
상기 실시예 11-1에서 설정된 대조군 또는 각 실험군의 마우스로부터 시간의 경과에 따라 대장암조직의 부피를 측정하고, 이를 비교하였다(도 37a 및 37b).
도 37a는 HT-29 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 37b는 HCT-116 대장암 세포주를 옆구리에 이식하여 제작한 암발병 동물모델에 방사선 조사와 칼슘락테이트를 개별적으로 또는 병용처리하였을 때, 시간의 경과에 따른 종양부피의 변화를 나타내는 그래프이다.
상기 도 37a 및 37b에서 보듯이, 이식된 대장암 세포에 상관없이, 방사선 조사 및 칼슘락테이트를 전혀 처리하지 않은 대조군에 비하여, 방사선 조사 및 칼슘락테이트 처리를 개별적으로 또는 조합하여 처리한 실험군에서는 종양의 성장이 억제됨을 확인하였고, 상기 실험군 중에서도 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용투여한 실험군 13이 종양의 성장을 가장 낮은 수준으로 저하시킴을 확인하였다.
이러한 결과는, 칼슘락테이트의 처리에 의하여 방사선에 대한 저항성을 부여하는 인자의 발현을 억제시킬 수 있음을 입증하는 것으로서, 칼슘락테이트와 방사선 조사를 병용투여할 경우, 보다 적은 선량으로 방사선을 조사하여도 항암치료의 효율을 증진시킬 수 있을 것으로 분석되었다.
따라서, 암의 치료에 있어서, 칼슘락테이트를 단독으로 처리할 수도 있으나, 방사선 조사와 칼슘락테이트를 병용투여하면 더욱 향상된 항암치료효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 12: 공지된 항암제와 칼슘락테이트의 병용처리
상기 실시예 9-4 에서 칼슘락테이트와 항암활성을 나타내는 물질의 병용처리에 의하여 암 세포의 생존 능력이 단독처리에 비해 감소함을 확인하였는데, 상기 결과를 바탕으로 공지된 항암제와 칼슘락테이트의 병용처리가 다양한 암 세포주에 미치는 치료효과를 검증하였다.
실시예 12-1: 이매티닙(Imatinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1, 2.5 및 5μM의 이매티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1, 2.5 및 5μM) Imatinib과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 활용하였다(도 38 및 39).
도 38은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이고; 도 39는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 이매티닙을 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 38 및 39에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1, 2.5 및 5μM)의 이매티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군(control)에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 이매티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 이매티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12- 2: 5 -FU(5- Fluorourasil )와 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 2.5, 5 및 10μM의 5-FU를 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(2.5, 5 및 10μM) 5-FU와 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29와 HCT-116)를 활용하였다(도 40 및 41).
도 40은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이고; 도 41은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 5-FU를 사람 대장암 세포주(HCT-116)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 40 및 41에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(2.5, 5 및 10μM)의 5-FU를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 5-FU와 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 5-FU를 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다
실시예 12-3: 파클리탁셀(Paclitaxel)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 유방암 세포주(MCF-7)와 사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.63, 1.3 및 2.5nM의 파클리탁셀을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.63, 1.3 및 2.5nM) 파클리탁셀과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 유방암(MCF-7) 및 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 42 및 43).
도 42는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 42에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 파클리탁셀의 낮은 농도(0.63, 1.3 및 2.5nM)를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 파클리탁셀과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 파클리탁셀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
도 43은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.63, 1.3 및 2.5nM 농도의 파클리탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 43에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.63, 1.3 및 2.5nM)의 파클리탁셀을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 파클리탁셀과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 파클리탁셀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-4: 제피티닙(Gefitinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1.3, 2.5 및 5μM의 제피티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1.3, 2.5 및 5μM) 제피티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 44).
도 44는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 제피티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 44에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1.3, 2.5 및 5μM)의 제피티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 제피티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 제피티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-5: 소라페닙(Sorafenib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 간암 세포주(Hep3B)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1, 2.5 및 5μM의 소라페닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1, 2.5 및 5μM) 소라페닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 간암 세포주(Hep3B)를 활용하였다(도 45).
도 45는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1, 2.5 및 5μM 농도의 소라페닙을 사람 간암 세포주(Hep3B)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 45에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1, 2.5 및 5μM)의 소라페닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 소라페닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 소라페닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-6: 이리노테칸(Irinotecan)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.5, 1 및 2μM의 이리노테칸을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.5, 1 및 2μM) 이리노테칸과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29)를 활용하였다(도 46).
도 46은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 이리노테칸을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 46에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.5, 1 및 2μM)의 이리노테칸을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 이리노테칸과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 이리노테칸을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-7: 에를로티닙(Erlotinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.5, 1 및 2μM의 에를로티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.5, 1 및 2μM) 에를로티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 47).
도 47은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 에를로티닙을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 47에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.5, 1 및 2μM)의 에를로티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 에를로티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 에를로티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-8: 서니티닙(Sunitinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.5, 1 및 2μM의 서니티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.5, 1 및 2μM) 서니티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29)를 활용하였다(도 48).
도 48은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.5, 1 및 2μM 농도의 서니티닙을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 48에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.5, 1 및 2μM)의 서니티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 서니티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 서니티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-9: 메토트렉세이트(Methotrexate)와 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 5, 10 및 20nM의 메토트렉세이트를 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(5, 10 및 20nM) 메토트렉세이트와 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 49).
도 49는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 5, 10 및 20nM 농도의 메토트렉세이트를 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 49에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(5, 10 및 20nM)의 메토트렉세이트를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 메토트렉세이트와 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 메토트렉세이트를 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-10: 카보플라틴(Carboplatin)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 2.5, 5 및 10μM의 카보플라틴을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(2.5, 5 및 10μM) 카보플라틴과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 50).
도 50은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2.5, 5 및 10μM 농도의 카보플라틴을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 50에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(2.5, 5 및 10μM)의 카보플라틴을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 카보플라틴과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 카보플라틴을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-11: 도세탁셀(Docetaxel)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 폐암 세포주(A549)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.6, 1.3 및 2.5nM의 도세탁셀을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.6, 1.3 및 2.5nM) 도세탁셀과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 폐암 세포주(A549)를 활용하였다(도 51).
도 51은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.6, 1.3 및 2.5nM 농도의 도세탁셀을 사람 폐암 세포주(A549)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 51에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.6, 1.3 및 2.5nM)의 도세탁셀을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 도세탁셀과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 도세탁셀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-12: 라파티닙(Lapatinib)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 유방암 세포주(MCF-7)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 2, 4 및 8μM의 라파티닙을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(2, 4 및 8μM) 라파티닙과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 유방암 세포주(MCF-7)를 활용하였다(도 52).
도 52는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 2, 4 및 8μM 농도의 라파티닙을 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 52에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(2, 4 및 8μM)의 라파티닙을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 라파티닙과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 라파티닙을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-13: 에버롤리무스(Everolimus)와 칼슘락테이트의 병용처리
사람 신장암 세포주(Caki-1)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.3, 0.5 및 1nM의 에버롤리무스를 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.3, 0.5 및 1nM) 에버롤리무스와 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 신장암 세포주(Caki-1)를 활용하였다(도 53).
도 53은 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.3, 0.5 및 1nM 농도의 에버롤리무스를 사람 신장암 세포주(Caki-1)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 53에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(0.3, 0.5 및 1nM)의 에버롤리무스를 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 에버롤리무스와 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 에버롤리무스를 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-14: 트라스트주맵 ( Trastuzumab , Herceptin )과 칼슘락테이트의 병용처리
트라스트주맵에 항암제 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)를 RPMI1640 배지(1% fetal bovine serum+500ng/ul epithelial growth factor)가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 0.23, 0.45 및 18㎍/㎖의 트라스트주맵을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(0.23, 0.45 및 18㎍/㎖) 트라스트주맵과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 유방암 세포주(MCF-7)를 활용하였다(도 54).
도 54는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 0.23, 0.45 및 1.8㎍/㎖ 농도의 트라스트주맵을 트라스트주맵에 강한 내성을 보이는 사람 유방암 세포주(MCF-7)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 54에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹에서는 대조군에 비해 군집형성 능력이 감소되었으나, 여러 농도(0.23, 0.45 및 18㎍/㎖)의 트라스트주맵을 단독 처리한 그룹은 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 거의 차이가 없는 것을 확인하였다. 그러나, 0.23, 0.45 및 18㎍/㎖ 농도의 트라스트주맵과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 트라스트주맵을 단독으로 처리하여 항암제 효과가 없었던 그룹에 비해 군집형성 능력이 보다 낮은 수준을 나타내도록 억제됨을 확인하였다.
실시예 12-15: 옥살리플라틴(Oxaliplatin)과 칼슘락테이트의 병용처리
사람 대장암 세포주(HT-29)를 RPMI1640 배지가 담긴 6웰 플레이트 각각에 1 X 103개의 세포를 분주하고 하루가 지난 후 배지를 새로 교체해준 뒤 2.5mM 칼슘락테이트 또는 1.3, 2.5 및 5μM의 옥살리플라틴을 단독으로 처리하거나 다양한 농도의(1.3, 2.5 및 5μM) 옥살리플라틴과 2.5mM 칼슘락테이트를 병용처리한 뒤 세포의 군집형성 능력을 비교하였다. 대조군으로는 아무 약물도 처리하지 않은 사람 대장암 세포주(HT-29)를 활용하였다(도 55).
도 55는 2.5mM 농도의 칼슘락테이트와 1.3, 2.5 및 5μM 농도의 옥살리플라틴을 사람 대장암 세포주(HT-29)에 단독으로 또는 병용 처리하여 군집숫자의 감소(왼쪽 그래프) 및 개별 군집의 형성 억제 정도를(오른쪽 사진) 비교한 결과이다. 도 55에서 보듯이, 칼슘락테이트를 단독으로 처리한 그룹 및 낮은 농도(1.3, 2.5 및 5μM)의 옥살리플라틴을 단독 처리한 그룹에서 대조군에 비해 암 세포의 군집형성 능력이 억제되는 것을 확인하였으며, 옥살리플라틴과 칼슘락테이트를 병용처리한 경우 옥살리플라틴을 단독으로 처리한 그룹에 비해 군집형성 능력이 더 억제됨을 확인하였다.
이러한 결과는, 칼슘락테이트와 공지된 항암제를 병용투여할 경우, 종래의 항암제를 보다 적은 용량으로 투여하여도 항암치료의 효율을 증진시킬 수 있음을 암시하는 것으로 분석되었다.
따라서, 암 세포에 락테이트 금속염을 단독으로 처리하여도 항암활성을 나타낼 수 있으나, 락테이트 금속염과 공지된 항암제를 병용투여하면 더욱 향상된 항암치료효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 트라스트주맵의 결과에서 보듯이, 공지된 항암제에 대한 암세포의 민감성을 더욱 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
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Claims (18)

  1. 칼슘 락테이트를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    방사선 조사 또는 항암제와의 병용치료에 사용되는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 방사선은 1일 2 내지 10Gy의 조사량으로 암환자에게 조사하면서, 상기 약학 조성물과 병용처리되는 것인 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 항암제는 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 메토트렉세이트(Methotrexate), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib), 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase)의 억제제 및 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter)의 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암제인 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 패치, 캡슐제, 환제, 정제, 데포(depot) 또는 좌제의 형태로 제형화되는 것인 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 칼슘 락테이트를 유효성분으로 포함하는 암 전이억제용 약학 조성물.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 전이성 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 췌장암, 갑상선암, 피부암, 골수암, 림프종, 자궁암, 자궁경부암, 신장암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전이암의 발병을 억제하는 것인 조성물.
  16. 칼슘 락테이트를 유효성분으로 포함하는 암 개선용 식품 조성물.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서,
    과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품 또는 국수가공식품의 형태인 건강기능성 식품으로 제조되는 것인 조성물.
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